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Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II ist eine antikörpervermittelte Immunreaktion. Nur ein Teil der HIT-Patienten entwickelt allerdings lebensbedrohliche Komplikationen wie Thrombosen. Faktor V Leiden, die Prothrombin G20210A-Mutation und der Methylentetrahydrofolatreduktase(MTHFR)-C677T-Polymorphismus gelten als genetische Risikofaktoren für die Entstehung von Thrombosen. In der vorliegenden Arbeit wird der Stellenwert der drei Mutationen als mögliche Risikofaktoren für die Entstehung HIT-assoziierter Thrombosen untersucht. In der Gruppe aller untersuchten HIT-Patienten ließ sich keine signifikant erhöhte Inzidenz der Faktor-V-Leiden-Mutation, des Prothrombin G20210A und des MTHFR-C677T-Polymorphismus im Vergleich zu Kontrollgruppen nachweisen. Auch bei den einzelnen Untergruppen der mit thrombembolischen Komplikationen symptomatischen HIT-Patienten zeigte sich kein Zusammenhang zwischen dem Vorliegen der Mutationen mit venösen oder arteriellen HIT-assoziierten Thrombosen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß keine der drei untersuchten Mutationen ein herausragender Risikofaktor für die Manifestation thrombembolischer Komplikationen bei HIT-Patienten darstellt.
Aktivierung von humanen Thrombozyten durch Staphylococcus aureus und seine Sekretionsprodukte
(2008)
Die Ansichten über die Funktion der Thrombozyten unterliegen derzeit einem Wandel. Neben dem Verschluss von Endothelläsionen spielen sie eine Rolle in der Pathologie der Artherosklerose, der Endokarditis und weiterer Erkrankungen und es existieren Hinweise auf eine Beteiligung bei der Immunantwort über die Expression von CD40L (Elzey et al., 2003). Ihre übermäßige Aktivierung und damit ihr Verbrauch bei der DIC sind noch nicht endgültig aufgeklärt. Zu dieser schwerwiegenden Komplikation im Gerinnungssystem kann es unter anderem durch eine Bakteriämie bzw. Sepsis mit dem grampositiven Erreger Staphylococcus aureus kommen, der in jüngster Zeit durch eine weit reichende Resistenzentwicklung in den Mittelpunkt der Forschung gerückt ist. Die Sepsis ist mit einer Letalität von 30 – 50% trotz modernster Intensivmedizin weiter ein ernstes Problem und grampositive Erreger wie S. aureus verursachen einen großen Anteil der Fälle (Moerer et al., 2004). Die Interaktion von Thrombozyten und S. aureus wurde bisher immer unter dem Aspekt des direkten Kontakts dieser Zellen untersucht, jedoch scheint auch eine Betrachtung der Sekretionsprodukte und ihrer Auswirkungen auf Thrombozyten wegweisend, denn nicht immer ist bei Auftreten von septischen Gerinnungskomplikationen eine Bakteriämie nachweisbar. In dieser Arbeit sollte daher die thrombozytenaktivierende Wirkung von Sekretionsprodukten von S. aureus untersucht werden, es sollte eine Annäherung an die Identität dieser Substanzen erfolgen und es sollte geklärt werden, ob der menschliche Organismus Abwehrmechanismen gegen diesen spezifischen Angriffsweg besitzt. Dazu wurden 20 kommensale und 20 invasive (aus Blutkulturen gewonnene) Isolate von S. aureus sowie die Laborstämme RN6390, RN6911 (RN6390Δagr) und ALC136 (RN6390ΔsarA) bis zur stationären Wuchsphase kultiviert und ihr zellfreier Kulturüberstand untersucht. Das Sekretom von RN6390 und seiner regulatordefizienten Mutanten ist bekannt (Ziebandt et al., 2001). Die Thrombozytenaggregation wurde größtenteils in einem einfachen Funktionstest mit gewaschenen Thrombozyten gemessen. Weitere Tests wurden mit gewaschenen Erythrozyten durchgeführt. 60% der Isolate sezernieren thrombozytenaggregationsauslösende Substanzen, dabei ist die Herkunft des Isolats (kommensal oder invasiv) und die im Kulturüberstand enthaltene Gesamtproteinmenge nicht entscheidend. 35% der Isolate sezernieren ausreichend hämolysierende Substanzen, dies ist ebenfalls unabhängig von ihrer Herkunft. Die zellaktivierenden Substanzen waren hitzeempfindlich, daher konnten Zellwandbestandteile wie Lipoteichonsäure oder Peptidoglykane als Verursacher ausgeschlossen werden. Mittels PCR wurden die genetischen Anlagen der verschiedenen Hämolysine der Isolate untersucht. Die thrombozytenaggregierende und hämolysierende Wirkung von alpha-Toxin konnte in dieser Arbeit nachvollzogen werden (Bhakdi et al., 1991). Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass verschiedene Protease-Typen von S. aureus an der Thrombozytenaggregation beteiligt sind. Diese Ergebnisse konnten bei der Untersuchung von RN6390 und seiner Mutanten bestätigt werden. Die aggregationsauslösenden Substanzen sind positiv durch den globalen Genregulator agr reguliert. Eine Koinkubation mit Serum, aus Serum gewonnenen IgG und IgG-Präparationen führte zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung der Aggregation ausgelöst durch bakterielle Kulturüberstände. Insgesamt handelt es sich bei der durch Sekretionsprodukte von S. aureus ausgelösten Thrombozytenaggregation um ein multifaktorielles Geschehen, welches zur Pathogenese der Gerinnungsstörungen bei einer Sepsis oder Infektion beitragen kann. Die Aggregation kann durch im Serum enthaltene IgG in vitro gehemmt werden. In weiteren Untersuchungen muss die genaue Identität dieser Antikörper gefunden werden. Dies kann als neuer Ansatzpunkt in der Behandlung der Gerinnungskomplikationen während eine S. aureus- Sepsis dienen, zusätzlich zu bisherigen Strategien der Substitution und medikamentösen Intensivtherapie.
Die Neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAIT) ist eine erworbene hämorrhagische Diathese durch thrombozytäre Antikörper. Die Immunisierung der Mutter findet nach Übertritt von kindlichen Thrombozyten bereits während der ersten Schwangerschaft statt. Mütterliche Anti-Thrombozyten-IgG-Antikörper führen nach diaplazentarem Übertritt zu einem Abbau der kindlichen Plättchen im retikulo-endothelialen System. 75% aller Fälle von NAIT sind durch Anti-HPA1a-Antikörper verursacht (HPA1a/b-Polymorphismus). Dieser Polymorphismus wird durch das GPIIIa-Gen des thrombozytären GPIIb/IIIa-Rezeptors ausgebildet. Immunologische Toleranz ist die immunologische Hyposensibilität gegenüber einem Antigen. Eine Form ist die orale Toleranz (OT), bei der es durch orale Zufuhr eines Antigens zu einer spezifischen Suppression der zellulären und humoralen Immunantwort kommt. Denkbar wäre auch eine immunologische Toleranz gegenüber dem GPIIIa-Polymorphismus. Das Fernziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer transgenen zweikeimblättrigen Pflanze (Tabak/Karotte) zur oralen Toleranzinduktion im Menschen gegenüber dem HPA1a/b-Polymorphismus. Es wurde die Expression des humanen Glykoproteins GPIIIa in transgenem Tabak als Modellpflanzen systematisch untersucht. Die full-length cDNA von GPIIIa wurde schrittweise verändert und sowohl als native humane Form und als Konstrukt mit geändertem pflanzlichen Signalpeptid und einer Rückhaltesequenz in Pflanzenzellenassays getestet (Protoplastierung). Als subzelluläre Kompartimente der Versuche dienten je nach Konstrukt das Zytosol oder das Endoplasmatische Retikulum der Pflanzenzelle. Die Protoplastenassays erbrachten keinen Nachweis eines rekombinanten Proteins mit GPIIIa-spezifischen mono- und polyklonalen Antikörpern, ein RNA-Nachweis war methodisch nicht möglich. Allerdings konnte die erfolgreiche Transformation durch ein fluoreszierendes Kontrollprotein (GFP) bestätigt werden. Schließlich wurde der HPA1a-Polymorphismus in einem Proteinfragment mit einer Länge von 66 Aminosäuren in einem artifiziellen Gen rekonstruiert. Die Sequenz enthielt zusätzlich einen optimierten Pflanzenpromotor, spezifische sekretorische Signal-, tag- und Rückhaltepeptide und wurde in toto an die Pflanzenkodonusage angepasst. Mit dem Konstrukt wurde eine Tabakpflanzenlinie als Modell stabil transformiert. In den Pflanzen konnte die Integration und vollständige Transkription des synthetischen Gens mit der RT-PCR nachgewiesen werden. Die transgenen Pflanzen wurden mit GPIIIa- und tag-spezifischen Antikörpern mit unterschiedlichen Methoden (Western-Blot, ELISA) untersucht. Es wurden Versuchen zur Immunpräzipitation und Rekonstitution der Disulfidbrückenstruktur im Epitop durchgeführt. In keiner Pflanze konnte rekombinantes GPIIIa-Epitop detektiert werden. Auch der Nachweis eines unreifen Proteins anhand des c-terminalen tag-Peptides gelang nicht. Auffallend war in den Tabakzellen eine starke Kreuzreaktion eines inerten Proteins mit polyklonalen GPIIIa-Antikörpern auf Höhe der Bande des humanen GPIIIa. Es ist denkbar, daß Tabakpflanzen bereits ein GPIIIa-ähnliches Protein ausbilden und bei der Synthese von artfremden humanen GPIIIa das unreife Protein einer Degradation unterziehen oder es zu einem Gene-silencing kommt.
Untersuchung zur Assoziation von Antikörpern gegen PF4/Heparin-Komplexe mit Parodontalerkrankungen
(2010)
Ziel dieser Fall-Kontroll-Studie war es, zu evaluieren, ob eine Assoziation zwischen dem Vorliegen einer Parodontitis und dem Vorhandensein von PF4/Heparin-Komplex Antikörpern besteht. PF4 ist ein Chemokin, welches vermehrt durch Thrombozyten bei deren Aktivierung ausgeschüttet wird. PF4 kann Komplexe mit negativ geladenen Molekülen bilden. Die Prototypreaktion ist die Formation von PF4/Heparin-Komplexen. Mit Heparin behandelte Patienten können gegen diese Komplexe Antikörper bilden, die zur komplexen Aktivierung der Blutgerinnung mit erhöhtem Risiko zu thrombembolischen Ergeignissen führen können. Diese Antikörper konnten aber auch in nicht mit Heparin behandelten Patienten nachgewiesen werden. Daraus entwickelte sich die Hypothese, dass parodontale Infektionen/Entzündungen möglicherweise über die Aktivierung der Thrombozyten und vermehrte Freisetzung von PF4 die Formation von PF4-Komplexen und Antikörperbildung induzieren könnten. Das Serum von 937 Blutspendern mit einem Alter von 40 - 60 Jahren wurde auf PF4/Heparin-Komplex Antikörper der Klassen IgG, IgA und IgM (ELISA) untersucht. Zu den 99 positiv getesteten Blutspendern (40 Fallprobanden, mittleres Alter 47,9 Jahre) wurden 40 Kontrollprobanden (mittleres Alter 48,1 Jahre) nach Alter (±2 Jahre), Geschlecht, Rauch- und Bildungsstatus gematcht. Die klinischen Parameter waren Zahnzahl, Sondierungstiefe, Attachmentverlust und Bluten nach Sondieren. 50% der Probanden waren männlich, 35% Nichtraucher, 25% ehemalige Raucher und 40% Raucher. 80% (15%) der Probanden haben ein mittleres (hohes) Bildungsniveau. Die Probanden der Fallgruppe hatten einen schlechteren parodontalen Gesundheitszustand als die Kontrollgruppe. Das Risiko eines positiven PF4/Heparin-Komplex-Antikörper-Status’ war 2 bis 7-fach erhöht bei schweren mittleren Sondierungstiefen wie auch bei moderatem und schwerem mittleren Attachmentverlust. Die vorliegende Untersuchung zeigte, dass parodontal erkrankte Probanden ein höheres Risiko für das Auftreten von anti-PF4/Heparin Antikörpern aufwiesen als parodontal gesündere Probanden. Parodontitis könnte mit dem Auftreten von natürlichen anti-PF4/Heparin-Komplex Antikörpern assoziiert sein. Um einen möglichen kausalen Zusammenhang zu evaluieren, sind weitere Studien mit größerem Stichprobenumfang und longitudinalem Design erforderlich.
Relevanz der prätransfusionellen Anti-Human-Globulin-Kreuzprobe bei unauffälligem Antikörpersuchtest
(2011)
Die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten ist eine Basistherapie der Medizin. Gefürchtete Transfusionsrisiken für den Patienten sind immunhämolytische Reaktionen auf Grund AB0-inkompatibler Erythrozytenkonzentrate oder irregulärer Alloantikörper. Präventiv werden vor jeder geplanten Transfusion deshalb die Blutgruppenmerkmale des Patienten bestimmt und sein Plasma in einem hochsensitiven Verfahren auf irreguläre erythrozytäre Antikörper untersucht (Antikörpersuchtest). Prätransfusionell verpflichtend ist in Deutschland dabei auch die serologische Anti-Human-Globulin-Kreuzprobe, wobei das Restrisiko einer immunologischen Unverträglichkeit zwischen Patientenplasma und Blutkonserve trotz zuvor negativer Antikörpersuche ausgeschlossen werden soll. Bei einer reaktiven Kreuzprobe nach unauffälligem Antikörpersuchtest sind insbesondere die Folgeuntersuchungen sehr zeitaufwändig. Die Patientenversorgung kann dann in hohem Maße verzögert werden, was im Falle einer dringenden Transfusionsindikation zur Gefahr für den Patienten werden kann. In Notfallsituationen wird aus diesem Grund auf die Kreuzprobe verzichtet. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Kreuzprobe nach negativer Antikörpersuche überhaupt die Sicherheit der Transfusion erhöht und über den Notfall hinaus noch sinnvoll erscheint. In der vorliegenden Arbeit wurden die Ergebnisse der Anti-Human-Globulin- Kreuzproben ausgewertet, die im zuvor durchgeführten Antikörpersuchtest negativ reagiert hatten. Über einen Zeitraum von 8 Jahren wurden unterschiedliche serologische Verfahrensweisen (Kreuzprobe im konventionellen Röhrchentest versus Gelkartentechnik, Antikörpersuche mit 2 versus 3 erythrozytären Suchzellen) untersucht. Zwischen 2000 und 2007 wurden 312.275 Kreuzproben bei 53.512 Patienten durchgeführt. Davon waren 566 Kreuzproben nach negativer Antikörpersuche bei 296 Patienten reaktiv. Nach Umstellung der Kreuzprobentechnik vom Röhrchen- auf die Gelkartentechnik im Jahr 2003 erhöhte sich der Anteil reaktiver Kreuzproben trotz negativer Antikörpersuche von 0,05% (Röhrchentest) auf 0,25% (Gelkarte) erheblich (p<0,001). Ursache für die Reaktivität waren in 15% irreguläre Anti-A1-Antikörper, nur in 1,8% wurden andere irreguläre Alloantikörper gefunden. Hingegen konnten in über 80% der reaktiven Kreuzproben gar keine oder keine klinisch relevanten Ursachen (Autoantikörper beim Spender oder Patienten) gefunden werden. Insgesamt wurden in 0,0032% (10 von 312.275 Kreuzproben) irreguläre Alloantikörper primär durch die Kreuzprobe aufgedeckt. Theoretisch/statistisch wäre demnach eine von 31.228 Transfusionen mit einem potentiellen immunologischen Inkompatibilitätsrisiko verbunden gewesen, würde die biologische Relevanz aller detektierten Alloantikörper unberücksichtigt bleiben. Bei Betrachtung jedoch der biologisch relevanten Antikörper hätte das Risiko für eine immunologisch inkompatible Transfusion nur bei einer von 78.069 Transfusionen bestanden. Nachdem in der Antikörpersuche (unter Verwendung der sensitiven Gelkartentechnik) die Anzahl der Suchzellen von 2 auf 3 erhöht wurde, sind keine biologisch relevanten Alloantikörper mehr übersehen worden. Ähnliche Untersuchungen haben in anderen Ländern bereits dazu geführt, dass nach einer negativen Antikörpersuche auf die serologische Kreuzprobe verzichtet wird. Diese Option sollte auch in Deutschland eröffnet werden.
Mouse strain-specific stress susceptibility in BALB/c and C57BL/6 mice in psychological stress
(2011)
Eine der häufigsten unerwünschten Nebenwirkungen nach Applikation von unfraktionierten- und auch niedermolekularen Heparinen ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II. In einer prospektiven klinischen Kohortenstudie im Zeitraum von März 1996 bis Dezember 1997 wurde die Inzidenz der HIT- Antikörper bei 502 Patienten unter perioperativer Thromboseprophylaxe mit unfraktioniertem oder niedermolekularem Heparin nach elektiven Hüft- oder Knieoperationen erfasst. 231 Patienten erhielten unfraktioniertes und 271 Patienten niedermolekulares Heparin zur perioperativen Thromboseprophylaxe appliziert. Vor allem Frauen im Alter zwischen dem 60. und 80. Lebensjahr nach einem operativen Eingriff sind hinsichtlich thromboembolischer Komplikationen besonders gefährdet. Eine manifeste HIT II wurde bei 5,19% der Patienten unter postoperativer UFH-Thromboseprophyaxe nach Hochrisikooperation nachgewiesen, jedoch bei keinem NMH-Patienten. Deutlich mehr Männer als Frauen entwickeln Antikörper gegen Heparin-Plättchenfaktor 4- Komplexe, ohne dass sich thromboembolische Komplikationen oder eine manifeste HIT II entwickeln. Insgesamt beträgt die Inzidenz der HIT– Antikörper im HIPA unter UFH-Prophylaxe 3,1% versus NMH- Prophylaxe 2,8%; im ELISA unter UFH-Prophylaxe 10% versus NMH-Prophylaxe 4,6%. Bisher wurde noch nicht untersucht, ob stationär nachgewiesene HIT- Antikörper im poststationären Bereich einen Einfluss auf die Entwicklung thromboembolischer Komplikationen haben. Die Studie zeigt, dass 1,29% der UFH-Patienten und 1,4% der NMH -Patienten poststationär im Studienzeitraum von 6 Monaten nach der Hospitalisierung wegen einer thromboembolischen Komplikation behandelt wurden. Diese Patienten waren jedoch HIT- Antikörper negativ. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass postoperativ nachgewiesene Heparinantikörper trotz fortgeführter prophylaktischer Heparinapplikation, hauptsächlich NMH, kein erhöhtes Risiko darstellen, poststationär thromboembolische Komplikationen hervorzurufen. Maßnahmen hinsichlich eines stationären Screenings auf HIT-Antikörper und gegebenenfalls eine frühzeitige Umstellung auf eine alternative Antikoagulation sind demzufolge nicht notwendig. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem serologischen Nachweis von HIT-Antikörpern. Im Rahmen der Vorbereitung der obengenannten klinischen Studie fiel auf, dass Testergebnisse HIT-Antikörper positiver Seren bei wiederholten Untersuchungen im gleichen Testverfahren (HIPA oder PF4/Heparin-ELISA) nach mindestens zweijähriger Lagerung der Seren bei -70°C nicht vollständig reproduzierbar waren. Dies ist von Bedeutung, da verschiedene Studien zur Erfassung der Inzidenz der HIT-Antikörper mit gelagerten Seren durchgeführt wurden. Durch Modifizierung herkömmlicher Testsysteme wurde eine Möglichkeit gefunden, vergleichbare Testergebnisse der Patientenseren vor und nach Lagerung zu erzielen. Ein vermutlich blockiertes Antigen konnte sich durch den verlängerten Inkubationsprozess lösen und nun wieder am Testsystem angreifen. Alle Seren wurden nach Lagerung von 2 Jahren bei –70°C mit dieser Modifikation des Polyanionen-ELISA untersucht. Um eine HIT II frühzeitig zu erkennen, empfiehlt es sich, weiterhin postoperativ engmaschig die Thrombozytenzahlen zu kontrollieren und beim Auftreten von thromboembolischen Komplikationen unter Heparintherapie mit und ohne Thrombozytopenie eine HIT-Diagnostik (Kombination eines funktionellen Testes mit einem antigenspezifischen Test) durchzuführen. Beim Nachweis von HIT-Antikörpern muß Heparin abgesetzt werden und eine alternative Antikoagulation, z.B. durch Orgaran, Hirudin oder Argatroban durchgeführt werden. Durch den Einsatz der neueren Antikoagulantien, wie Fondaparinux, Rivaroxaban oder Dabigatran im Bereich der postoperativen Thromboseprophylaxe wird die HIT II möglicherweise an Bedeutung verlieren.
Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparintherapie. Dabei erfolgt zwischen dem Protein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin eine Komplexbildung, welche wichtig für die krankheitsauslösende Bildung des Antigens ist. Von PF4 existiert eine beim Menschen vorkommende Variante, Plättchenfaktor 4 Variante 1 (PF4var1). Bei PF4 und PF4var1 handelt es sich um Proteine non-alleler Gene. Die Proteine unterscheiden sich an 3 Stellen ihrer Aminosäuresequenz. PF4var1 ist weniger positiv geladen, wodurch die Wechselwirkung mit Heparin beeinflusst wird. Die veränderte Sequenz beeinflusst die Eigenschaften der Proteine. So weist PF4var1 stärkere chemotaktische und anti-angiogenetische Eigenschaften auf als PF4. Auch bei den Signalpeptiden der beiden Proteine liegt eine Änderung vor. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst mit PF4 bzw. PF4var1 kodierendem Gen transformierte humane embryonale Nierenzellen in unterschiedlichen Nährmedien kultiviert. Die Zelllinien wurden hinsichtlich der Produktion, Expression und Sekretion der Proteine PF4 bzw. PF4var1 untersucht. Die angewendeten Untersuchungs¬methoden zur Expression (FACS) bzw. zur Sekretion (ELISA) ermöglichten den Nachweis der Proteine. Eine Differenzierung zwischen PF4 und PF4var1 ist hiermit nicht möglich. Allerdings zeigte die Sequenzierung der Aminosäurestrukturen und der DNA das spezifische Vorliegen von entweder PF4 oder PF4var1. Zur Herstellung von Antikörpern gegen PF4var1 werden große Mengen an PFvar1 benötigt. Da, auch nach Einsatz des Minifermenters, durch die humanen Zellen keine ausreichende Proteinproduktion möglich war, wurde E. coli mit der genetischen Information für PF4 transformiert. Gleiches wurde mit PF4var1 durchgeführt. Hierdurch ist eine Proteinproduktion in größerem Maßstab möglich. Zur Aufreinigung der Proteine mussten spezielle Pufferlösungen eingesetzt werden. Für PF4var1 wurden neu entwickelte Puffer eingesetzt. Derart aufgereinigte Proteine konnten in ESI-ToF-Experimenten erfolgreich unterschieden werden. Durch die hier vorgestellten methodischen Fortschritte dürfte es in nächster Zeit möglich sein neue Erkenntnisse des Zusammenspiels zwischen PF4var1 und HIT zu erlangen.
Plättchenfaktor 4 (PF4, CXCL4) ist ein 7.8 kDa stark positiv geladenes Protein, das zur Familie der CXC-Chemokine gehört. PF4 wird als Tetramer in den alpha-Granula von Thrombozyten gespeichert und bei deren Aktivierung freigesetzt. Seine biologische Funktion ist weitgehend unbekannt. Allerdings spielt PF4 eine wichtige Rolle bei der Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT), einer der häufigsten immunologisch bedingten Arzneimittelkomplikationen, die Blutzellen betreffen. PF4 und Heparin bilden Komplexe, die Neoepitope generieren und die Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern induzieren. Resultierende Immunkomplexe aktivieren Thrombozyten Fc-Rezeptor-vermittelt und führen zu einer paradoxen Thrombinbildung. Die Folgen können Thrombozytopenie und lebensbedrohliche Thrombosen sein. Die pathogenen Antikörper sind nicht spezifisch für Heparin und erkennen auch PF4 gebunden an andere Polyanionen. Die Immunantwort der HIT zeigt einige Besonderheiten. Bereits bei erstmaliger Heparinexposition treten anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgG bereits nach 4-6 Tagen auf. Dies kann keine primäre Immunantwort sein, da bei dieser IgG-Antikörper erst deutlich später gebildet werden. Damit muss eine Vorimmunisierung mit natürlich auftretenden PF4/Polyanion-Komplexen stattgefunden haben. Eine mögliche Quelle wären negativ geladene Strukturen, die auf bakteriellen Zelloberflächen vorkommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Bindung von PF4 an Zelloberflächen zu charakterisieren und insbesondere die Frage zu klären, ob PF4 auf der Bakterienoberfläche Komplexe bildet. Zunächst erfolgte die Etablierung einer durchflusszytometrischen Analysemethode zur Messung der PF4-Bindung an Thrombozyten in Abhängigkeit von antikoagulatorischen Polyanionen. Die PF4-Bindung war nicht von der antikoagulatorischen Wirksamkeit der Polyanionen abhängig, sondern von der negativen Ladungsdichte. Geringe Konzentrationen von Heparin haben die PF4-Bindung an Thrombozyten verstärkt, wohingegen hohe Konzentrationen die PF4-Bindung inhibierten. Auch mit PF4 exprimierenden HEK-Zellen konnte eine ladungsabhängige Bindung von PF4 nachgewiesen werden. Als nächstes wurde die Bindung von PF4 an Bakterien untersucht. PF4 hat auch hier, konzentrations- und ladungsabhängig, an Gram-positive und Gram-negative Bakterien gebunden. Mittels der Adsorptions-Elutions-Technik konnte dann gezeigt werden, dass es durch die Bindung von PF4 an Bakterien zur Ausbildung PF4/Heparin-ähnlicher Epitope kommt, welche von anti-PF4/Heparin-Antikörpern aus Patientenserum erkannt werden. Mit einem Phagozytoseassay wurde dann nachgewiesen, dass die durch PF4 vermittelte Bindung der anti-PF4/Heparin-Antikörper an Bakterien die Phagozytose durch polymorph nukleäre Zellen (PMN) fördert. Dass dieser Abwehrmechanismus tatsächlich in vivo bedeutsam ist, konnte in dem Maus-Sepsis-Modell Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) gezeigt werden. Die 6-8 Wochen jungen Mäuse entwickelten ab 3 Tagen nach der CASP-Operation anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM und ab 14 Tagen der Klasse IgG. Dieser Antikörperverlauf passt zur Immunreaktion nach erstmaligem Antigenkontakt und beweist, dass Bakterienkontakt im Rahmen der Sepsis eine primäre Immunisierung gegen PF4/Heparin induzieren kann. Jedoch ist die Sepsis, eine lebensbedrohliche Erkrankung, viel zu selten um das Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern in der Normalbevölkerung (18.8% anti-PF4/Heparin IgM, 6.1% anti-PF4/Heparin IgG) und bei 50% der Patienten nach kardiochirurgischem Eingriff erklären zu können. Eine häufiger auftretende, chronische, bakterielle Infektion ist die Parodontitis. Im Rahmen der SHIP-Studie (Study of Health in Pomerania) konnte dann gezeigt werden, dass der Parodontitis-Status mit dem Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern korreliert. Unterstützend konnte gezeigt werden, dass PF4 auch von parodontalpathogenen Bakterien gebunden wird und darüber die Bindung von anti-PF4/Heparin-Antikörpern ermöglicht wird. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine bislang unbekannte Funktion von PF4 in der anti-bakteriellen Wirtsabwehr. Gleichzeitig wurde die Frage geklärt, warum Patienten, die das erste Mal Heparin erhalten bereits an Tag 4-6 IgG-Antikörper gegen PF4/Heparin bilden. Somit konnte ein wichtiger Beitrag zur pathophysiologischen Erklärung einer der derzeit häufigsten immunvermittelten, unerwünschten Arzneimittelwirkungen geleistet werden. Hinsichtlich der biologischen Bedeutung von PF4 ist von besonderer Wichtigkeit, dass PF4 ladungsabhängig an viele verschiedene Bakterienspezies bindet. Damit sind Antikörper gegen PF4/Polyanion-Komplexe nicht spezifisch für eine Bakterienspezies, sondern können eine Form der Wirtsabwehr darstellen, bei der eine IgG-Spezifität eine Vielzahl von PF4-markierten Bakterien bindet. Es wäre denkbar, dass es sich hierbei um ein grundlegendes, evolutionär altes Abwehrprinzip handelt, dass möglicherweise auch bei anderen immunvermittelten Erkrankungen Relevanz hat.
Im Rahmen dieser Arbeit standen Kulturüberstände von je 20 S. aureus-Stämmen von gesunden Probanden und von an einer Sepsis erkrankten Patienten zur Verfügung. Die verwendeten Kulturüberstände waren in Vorarbeiten unter anderem hinsichtlich ihrer Superantigeneigenschaften gut charakterisiert worden. Mittels eines Assays zur Bestimmung der procoagulatorischen Aktivität von Monozyten konnte nachgewiesen werden, dass S. aureus-Überstände konzentrationsabhängig eine TF-Aktivierung auf Monozyten induzieren. Dieser Effekt war nicht davon abhängig, ob es sich um ein Isolat gesunder Spender oder erkrankter Patienten handelte, auch die Menge an produziertem FXa durch einen Stamm aus Rachenabstrichen oder Blutkulturen unterschied sich nicht. Monozyten verschiedener Spender reagierten unterschiedlich auf den gleichen Kulturüberstand. Die Superantigen-Eigenschaften der Kulturüberstände nahmen keinen Einfluss auf die prokoagulatorische Aktivität von Monozyten. Sechs Kulturüberstände waren nicht in der Lage eine PCA zu induzieren, daher erfolgten verschiedene Untersuchungen zu Ermittlung der Zellvitalität. Im MTT-Test zeigte sich ein konzentrationsabhängiger zytotoxischer Effekt der Überstände, allerdings betrug der Anteil vitaler Zellen stets über 60 %. Ergänzende durchflusszytometrische Messungen konnten jedoch zeigen, dass Monozyten teilweise nur noch sporadisch nachweisbar waren. Um die prokoagulatorischen Eigenschaften der Sekretionsprodukte von S. aureus genauer zu charakterisieren, kamen der Laborstamm RN6390 und seine isogenetischen agr(-)- und sar(-)-Mutanten zum Einsatz. Der Wildtyp RN6390 sowie dessen Mutanten induzierten in hohen Konzentrationen eine geringere Faktor Xa-Generierung auf Monozyten als nur mit Medium behandelte Zellen. Während sich durch den Wildtyp und die agr(-)-Mutante auch in höheren Verdünnungsstufen keine PCA von Monozyten induzieren ließ, war dies mit der sar(-)-Mutante möglich. Dieses Aktivierungsmuster ließ sich auf ausgeprägte zytotoxische Eigenschaften zurückführen, sodass es nicht möglich war, den für die Faktor Xa-Generierung verantwortlichen Faktor genauer zu charakterisieren. Als eine mögliche Monozyten aktivierende Komponente untersuchten wir Peptidoglykan im Faktor Xa-Assay. Bereits geringste Konzentrationen von Peptidoglykan konnten eine PCA induzieren. In den Kulturüberständen selbst konnten wir PG semiquantitativ nachweisen. Ob Peptidoglykane allein oder in Synergie mit anderen Sekretionsfaktoren von S. aureus die TF-Aktivierung auslösen, ließ sich mit dieser Arbeit nicht abschließend klären.
Einführung Das humane Neutrophilen-Antigen HNA-3a steht in ursächlichem Zusammenhang mit der Entstehung transfusions- assoziierter Lungeninsuffizienz und weiteren Erkrankungen. Die Isolierung des Antigens ermöglichte eine Identifizierung und den Aufbau von routinemäßig durchführbaren Testverfahren. Zielsetzung 1. Etablieren eines Nachweisverfahrens und Screening von Blutspendern auf HNA-3a. 2. Aufreinigung der aHNA-3a-Antikörper aus dem Plasma immunisierter Blutspender. 3. Biotinylierung des Antigens und Koppelung an verschiedene Festphasen. 4. Immunpräzipitation. 5. Detektion mittels Gelelektrophorese und Immunoblotting. Material und Methode Mit Agglutinationstests und Durchflußzytometrie wurde das Screening durchgeführt. Um das Antigen nach einer Isolierung nachweisen zu können, erfolgte eine Biotinylierung der Oberflächen-Proteine. Die Isolierung erfolgte mittels Immunpräzipitation, 1-D–Gel- elektrophorese und einen Nachweis im Western-Blot mit konjugiertem Streptavidin. Ergebnisse Im Screening wurden mehrere HNA-3a-negative Spender identifiziert. Die Häufigkeit des Antigens lag bei 98,5 %. Die Biotinylierung beeinflusste die verwendeten Verfahren nicht bemerkbar. Bei der Immunpräzipitation mit HNA-3a-positiven Granulozyten, die mit aHNA- 3a-Plasma inkubiert wurden, stellte sich reproduzierbar eine Bande zwischen 90 und 105 kDa dar. Diskussion Da die Ergebnisse reproduzierbar waren, konnte davon ausgegangen werden, dass es sich bei der Bande, die bei der Immunpräzipitation mit aHNA-3a Plasma und HNA-3a positiven Lysaten spezifisch ist, um das das Epitop HNA-3a tragende Protein handelt. Für eine Identifizierung des Antigens konnte die Bande aus dem Gel ausgeschnitten werden und mit weitergehenden Methoden charakterisiert werden. Exakt dieses Vorgehen führte zu der erfolgreichen Identifizierung des Epitops HNA-3a.