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Salivary glands provide secretory functions, including secretion of xenobiotics and among
them drugs. However, there is no published information about protein abundance of drug transporters
measured using reliable protein quantification methods. Therefore, mRNA expression and absolute
protein content of clinically relevant ABC (n = 6) and SLC (n = 15) family member transporters in the
human parotid gland, using the qRT-PCR and liquid chromatography-tandem mass spectrometry
(LC−MS/MS) method, were studied. The abundance of nearly all measured proteins ranged between
0.04 and 0.45 pmol/mg (OCT3 > MRP1 > PEPT2 > MRP4 > MATE1 > BCRP). mRNAs of ABCB1,
ABCC2, ABCC3, SLC10A1, SLC10A2, SLC22A1, SLC22A5, SLC22A6, SLC22A7, SLC22A8, SLCO1A2,
SLCO1B1, SLCO1B3 and SLCO2B1 were not detected. The present study provides, for the first time,
information about the protein abundance of membrane transporters in the human parotid gland,
which could further be used to define salivary bidirectional transport (absorption and secretion)
mechanisms of endogenous compounds and xenobiotics.
Bei ersten Betrachtungen zum Zelltransport nahm man an, dass Stoffe passiv über die Zellmembran diffundieren. Nach weiteren Forschungen musste dies revidiert werden. Heute weiß man, dass dies fast nur über spezielle Proteine möglich ist. Diese Proteine sind Kanäle und Transporter welche aufgrund ihrer Funktion eine Schlüsselposition in der zellulären Homöostaste darstellen. Sie sorgen für die Aufnahme und den Ausstrom fast aller wichtigen Substanzen.
Im Jahr 2007 wurde die Entdeckung eines neue Zelltransporters, TETRAN (Tetracycline transporter-like protein), veröffentlicht. In ersten Untersuchungen zeigte sich ein bevorzugter Transport von NSAIDs über die Zellmembran. NSAIDs haben bei unterschiedlichen Personen abweichende Wirkungen bzw. Nebenwirkungen deren Gund bis heute noch nicht endgültig geklärt ist.
In dieser Arbeit konnten polymorphe TETRAN überexprimierende Zellen erzeugt werden und der Nachweis unterschiedlich starker Expression des Proteins in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Unter anderem zeigte sich eine gute Expression in Plazentagewebe. Welches auch wegen guter Verfügbarkeit zur Reihensequenzierung von 25 Proben genutzt wurde. Es zeigten sich 28 Synonyme und 85 Veränderungen im Gencode welche Einfluss auf die Primärsequenz des Proteins haben. Diese wurden alle in einer berechneten Grafik des Proteins zusammengefasst und dargestellt. In drei Situationen bildete sich anstatt des Wechsels einer Aminosäure ein Stopcodon. Dies trat jedoch nie homozygot auf. So das immer ein vollständiges Protein vorhanden war. In Anlehnung an vergleichbare Studien könnte dies mit ein Grund der differenten Wirkung von NSAIDs sein. Umfangreichere Beweise können in weiteren Studien noch folgen.
Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport.
Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt.
Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden.
Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.
Das P-Glykoprotein stellt ein wichtiges membranäres Transportprotein zum Schutz des Organismus vor Xenobiotika sowie toxischen endogenen Metaboliten dar und ist an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion von Blut-Gewebe-Schranken beteiligt. Außerdem beeinflussen Pgp-vermittelte Transportvorgänge die Pharmakokinetik einiger Arzneimittel. Eine Modulation der Pgp-Funktion ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Interaktionen zweier unterschiedlicher Substanzen, des mit der AD assoziierten Beta-Amyloids und des Arzneistoffes Heparin, mit dem Pgp zu untersuchen und die modulatorischen Fähigkeiten auf die Aktivität des Effluxtransporters in einem Zellsystem zu bewerten. Dafür stand eine polar wachsende, mit humanem MDR1-transfizierte Zelllinie zur Verfügung, die sich zur Untersuchung des transepithelialen Transportes eignete. Bei der Durchführung der funktionellen in-vitro-Assays ließen sich eine signifikant verstärkte Akkumulation, ein signifikant inhibierter apikaler Efflux von Rh123 und die signifikant verminderte ATP-abhängige Rh123-Aufnahme in Membranvesikel in Gegenwart von UFH sowie LMWH im Pgp-überexprimierenden Epithelzellmodell nachweisen. Ein direkter Transport markierter Heparine konnte ebenso gezeigt werden. Als Kontrolle dienten zum Einen parentale LLC-PK1, zum Anderen zeigten vergleichende Betrachtungen bekannter Pgp-Modulatoren wie Verapamil oder CsA in diesen Transportversuchen ähnliche Ergebnisse. Neben inhibitorischen Effekten der Aβ-Peptide auf die Pgp-Funktion konnte ein direkter aktiver Pgp-vermittelter Transport von synthetischem Aβ1-40 und Aβ1-42 gezeigt werden. Sowohl in polarisierten Zellmonolayern aus MDR1-transfizierten LLC-Zellen, die als in-vitro-Modell für das vaskuläre Endothel der Blut-Hirn-Schranke dienen, als auch in aus den Zellen isolierten Membranvesikeln konnte ein vektorieller bzw. ATP-abhängiger Transport der fluoreszenzmarkierten Peptide nachgewiesen werden. Eine Beteiligung des Pgp wurde anhand der Minderung des Transportes durch den spezifischen Inhibitor CsA verifiziert. Damit stellen sowohl die Heparine als auch die Beta-Amyloide nicht nur Inhibitoren des Pgp-vermittelten Transportes dar, sondern können selbst zum breiten Spektrum der affinen Pgp-Substrate gezählt werden. Sie bewirken eine nachgewiesene pharma-kologische Modulation der Pgp-Aktivität und bieten Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen der komplexen Funktionen des Transportproteins.
Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist außerdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in Blutplättchen nachgewiesen und kann zelltypabhängig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellulär lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den δ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von Überträgersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. Änderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit δ-storage pool Defekt beobachtet wurden, können zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation möglicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass Adaptormoleküle über eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als mögliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-Molekül ein PDZ-Motiv sowie eine mögliche Bindungsstelle für Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Dafür erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschließende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als mögliche Bindungspartner identifiziert werden. Während eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 über seine PDZ-Domäne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als mögliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen Leukämiezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden Kofärbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgeführt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 – in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellulären Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine Änderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellulär. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgeführt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als mögliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein möglicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beiträgt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu begünstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.
Exogenous glucocorticoids increase the risk for osteoporosis, but the role of endogenous glucocorticoids remains elusive. Here, we describe the generation and validation of a loss- and a gain-of-function model of the cortisol producing enzyme 11β-HSD1 (HSD11B1) to modulate the endogenous glucocorticoid conversion in SCP-1 cells — a model for human mesenchymal stem cells capable of adipogenic and osteogenic differentiation. CRISPR-Cas9 was successfully used to generate a cell line carrying a single base duplication and a 5 bp deletion in exon 5, leading to missense amino acid sequences after codon 146. These inactivating genomic alterations were validated by deep sequencing and by cloning with subsequent capillary sequencing. 11β-HSD1 protein levels were reduced by 70% in the knockout cells and cortisol production was not detectable. Targeted chromosomal integration was used to stably overexpress HSD11B1. Compared to wildtype cells, HSD11B1 overexpression resulted in a 7.9-fold increase in HSD11B1 mRNA expression, a 5-fold increase in 11β-HSD1 protein expression and 3.3-fold increase in extracellular cortisol levels under adipogenic differentiation. The generated cells were used to address the effects of 11β-HSD1 expression on adipogenic and osteogenic differentiation. Compared to the wildtype, HSD11B1 overexpression led to a 3.7-fold increase in mRNA expression of lipoprotein lipase (LPL) and 2.5-fold increase in lipid production under adipogenic differentiation. Under osteogenic differentiation, HSD11B1 knockout led to enhanced alkaline phosphatase (ALP) activity and mRNA expression, and HSD11B1 overexpression resulted in a 4.6-fold and 11.7-fold increase in mRNA expression of Dickkopf-related protein 1 (DKK1) and LPL, respectively. Here we describe a HSD11B1 loss- and gain-of-function model in SCP-1 cells at genetic, molecular and functional levels. We used these models to study the effects of endogenous cortisol production on mesenchymal stem cell differentiation and demonstrate an 11β-HSD1 dependent switch from osteogenic to adipogenic differentiation. These results might help to better understand the role of endogenous cortisol production in osteoporosis on a molecular and cellular level.
Osteoporosis, a complex chronic disease with increasing prevalence, is characterised by reduced bone mineral density (BMD) and increased fracture risk. The high heritability of BMD suggests substantial impact of the individual genetic disposition on bone phenotypes and the development of osteoporosis. In the past years, genome-wide association studies (GWAS) identified hundreds of genetic variants associated with BMD or osteoporosis. Here, we analysed 1103 single nucleotide polymorphisms (SNPs), previously identified as associated with estimated BMD (eBMD) in the UK Biobank. We assessed whether these SNPs are related to heel stiffness index obtained by quantitative ultrasound in 5665 adult participants of the Study of Health in Pomerania (SHIP). We confirmed 45 significant associations after correction for multiple testing. Next, we analysed six selected SNPs in 631 patients evaluated for osteoporosis [rs2707518 (CPED1/WNT16), rs3779381 (WNT16), rs115242848 (LOC101927709/EN1), rs10239787 (JAZF1), rs603424 (PKD2L1) and rs6968704 (JAZF1)]. Differences in minor allele frequencies (MAF) of rs2707518 and rs3779381 between SHIP participants (higher MAF) and patients evaluated for osteoporosis (lower MAF) indicated a protective effect of the minor allele on bone integrity. In contrast, differences in MAF of rs603424 indicated a harmful effect. Co-localisation analyses indicated that the rs603424 effect may be mediated via stearoyl-CoA desaturase (SCD) expression, an enzyme highly expressed in adipose tissue with a crucial role in lipogenesis. Taken together, our results support the role of the WNT16 pathway in the regulation of bone properties and indicate a novel causal role of SCD expression in adipose tissue on bone integrity.
In Germany, around 5.7 million people suffer from osteoporosis. Osteoporosis is characterised by a reduced bone mineral density that leads to an increased risk of fractures. The 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (11β-HSD1) is an important regulator of local cortisol metabolism. It converts biologically inactive cortisone to biologically active cortisol, but can also catalyse the reverse reaction. 11β-HSD1 is strongly expressed in liver, but 11β-HSD1 expression and activity were also reported in bone. Moreover, polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 (the gene encoding for 11β-HSD1) are associated with bone mineral density (BMD) and risk of fractures.
This work aimed to confirm and refine the associations between polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 and BMD, and to identify the underlying molecular and cellular mechanisms. To this end, analyses were performed on three different levels:
i) studies in humans, to confirm and refine the association of polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 with BMD, suppressed cortisol levels (PDC) and stiffness index,
ii) cellular analyses, to identify the role of 11β-HSD1 in differentiation of the immortalised human mesenchymal stem cell line SCP-1,
iii) molecular genetic analyses, to reveal the effect of intron 5 polymorphisms on transcriptional regulation.
Fine-mapping analyses of already existing clinical data from 452 osteoporosis patients (HSD study) did not point to another intron 5 SNP as being causative for the observed clinical association. A second prospective clinical study (OsteoGene) was performed to confirm the association of rs11811440 and rs932335 with PDC levels and BMD. A trend to decreased PDC levels and increased BMD was observed in homozygous carriers of the minor A-allele of rs11811440 in patients above the age of 65 years. Pooled analyses of the HSD and the OsteoGene studies revealed a significant association of the minor A-allele with increased Z-scores of the left femoral neck. No associations of rs11811440 and rs932335 with stiffness index, BMI and fat depots were detected the general population using data from the SHIP study.
To analyse the effect of 11β-HSD1 on differentiation of mesenchymal stem cells, HSD11B1 overexpressing and HSD11B1 knockout SCP-1 cells were generated. HSD11B1 was stably overexpressed in SCP-1 cells using targeted chromosomal integration. The successful overexpression was shown by 243-fold increased HSD11B1 mRNA expression levels and a 9 fold increased 11β-HSD1 activity, compared to the wildtype cells. Knockout cells were generated by CRISPR-Cas9 mediated gene editing targeting exon 2 and exon 5 of HSD11B1. Using next generation sequencing, the clones 1C4 and 2D10 were confirmed to carry two inactive HSD11B1 alleles and were chosen for further analyses. mRNA expression was unchanged in both knockout clones. However, a clear enzyme activity was detected in the 2D10 clone, whereas no cortisol production was detected in the 1C4 clone. SNaPshot analyses revealed the presence of wildtype cells in the 2D10 clone that became predominant with increased passages. Therefore, further analyses were focused on the 1C4 clone only. The protein expression in the 1C4 clone decreased to 30% of the expression of the wildtype cells.
HSD11B1 expression and cortisol production were compared between wildtype, knockout and overexpressing SCP-1 cells under three differentiation conditions: adipogenic, osteogenic with 1α,25-dihydroxyvitamin D3 and osteogenic with dexamethasone. HSD11B1 expression increased upon adipogenic differentiation and in the presence of cortisone in the wildtype and the overexpressing, but not in the knockout cells. Also, the cortisol production from cortisone increased over time in the overexpressing and the wildtype cells, but not in the knockout cells. The increase was dependent on the differentiation used between 3-fold and 9-fold higher in the overexpressing than in the wildtype cells.
The generated and validated overexpressing and knockout cell lines were used to analyse the influence of 11β-HSD1 on adipogenic and osteogenic differentiation. Upon adipogenic differentiation, the overexpressing cells accumulated significantly more lipid droplets than the wildtype cells. The accumulation of lipid droplets was not abolished in the knockout. However, when dexamethasone was substituted by cortisone, the knockout cells accumulated less lipid droplets than in the presence of dexamethasone, supporting the involvement of 11β-HSD1 in adipogenic differentiation. Expression of the adipogenic markers FABP4 and LPL increased upon adipogenic differentiation, but a distinct influence of the presence or absence of HSD11B1 on the FABP4 and LPL expression was not detected. Upon osteogenic differentiation with 1α,25-dihydroxyvitamin D3, ALP activity increased only in the knockout cells (more than 5-fold). Accordingly, the strongest increase in ALPL expression was detected also in the knockout cells. Both, ALP activity and gene expression were independent of cortisone. Addtionally, BGLAP expression was increased upon osteogenic differentiation. Unexpectedly, in the presence of cortisone, BGLAP expression increased in the overexpressing cells. Expression of the Wnt inhibitor DKK1 also increased in the overexpressing cells in the presence of cortisone indicating a decreased osteogenic differentiation. Moreover, expression of the adipogenic markers FABP4 and LPL increased in the overexpressing cells in the presence of cortisone indicating a switch from osteogenic to adipogenic differentiation. Upon osteogenic differentiation with dexamethasone, ALP activity and matrix mineralisation was lowest in the overexpressing cells.
Finally, the effects of the SNPs rs11811440, rs11119328, rs1000283 and rs932335 in intron 5 of HSD11B1 on transcriptional regulation were analysed by reporter gene assays and electrophoretic mobility shift assays. All four SNPs are genetically linked and are localized within evolutionary conserved regions. The minor C-allele of rs932335 significantly increased luciferase activity. In contrast, the major G-allele of rs932335 showed strong protein binding. However, no transcription factor binding sites were identified at the SNP sites. Additionally, bioinformatics analyses of publicly available RNA-Seq data of adipose tissue and liver confirmed the absence of alternative splicing. Alignment of HSD11B1 intron 5 to the Rfam database predicted the presence of non-coding RNAs (ncRNAs) in intron 5. However, none of the ncRNAs overlapped with the SNP sites.
In conclusion, 11β-HSD1 was shown to be involved in adipogenic differentiation and peripheral cortisol production by 11β-HSD1 promotes a switch from osteogenic to adipogenic differentiation. Moreover, among osteoporosis patients, homozygous carriers of the minor A-allele of rs11811440 have increased Z-scores of the femoral neck. Furthermore, HSD11B1 knockout and overexpressing cell lines were successfully generated and validated. These cell lines could be a useful tool in future analyses of the role of peripheral cortisol activation by 11β-HSD1 in differentiation of mesenchymal stem cells.
In vielen wissenschaftlichen Studien konnte die Bedeutung des NO-cGMP-PKG-Signalweges für die Regulation der Spannung von glatten Muskelzellen gezeigt werden. Im Mittelpunkt standen dabei oftmals die Guanylatzyklase, die Proteinkinase G oder zelluläre Kalziumkanäle und deren Bedeutung für die Muskeltätigkeit. In der vorliegenden Arbeit sollte über Modulatoren der zelluläre cGMP-Spiegel in glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten verändert und durch Messung der Kontraktionsstärken dessen Einfluss auf das Kontraktionsverhalten nachgewiesen werden. Dabei sollte sowohl die Auswirkung von cGMP-Veränderungen auf die Spannung bei maximaler Stimulation als auch auf die Sensitivität für Phenylephrin untersucht werden. Nach Inkubation der Aorten mit einem cGMP-Modulator und Stimulation mit Phenylephrin wurden die Kontraktionen von Aortenringen über Schreiber direkt aufgezeichnet. Als Modulatoren wurden das Urikosurikum Probenecid, der Phosphodiesterasehemmer Sildenafil und der Inhibitor der löslichen Guanylatzyklase ODQ eingesetzt. Ein besonderer Fokus sollte darauf gelegt werden, inwiefern die Hemmung der MRP-Transportproteine 4 und 5 durch Probenecid- und Sildenafilinkubation auf den cGMP-Spiegel und damit die Spannung der glatten Muskelzellen auswirkt. In den Aufzeichnungen der Kontraktionen zeigte sich unter ODQ-Einfluss eine deutlich gesteigerte Spannung in g pro g Aortengewebe (Mw=2761,44*; SEM=236,4; n=9) bei maximaler Stimulation mit Phenylephrin im Vergleich zur Kontrolle (1515,15; 186; n=9). Unter Vorinkubation mit Sildenafil konnten sowohl mit der geringeren Konzentration von 1 µM (689,15*; 163,3; n=5) als auch bei 50 µM (187,17*; 154,5; n=5) signifikant niedrigere Spannungen festgestellt werden. In höherer Konzentration kommt neben der Inhibition der PDE auch der hemmende Einfluss von Sildenafil auf die MRP-Transporter zum Tragen. Auch nach der Inkubation mit Probenecid konnte sowohl mit 10 µM (783,70; 150,7; n=5) als auch mit 100 µM (693,64*; 128,4; n=5) eine verminderte Kontraktion der Gefäße festgestellt werden. Die Untersuchung der Sensitivität der Aorten auf Phenylephrin über Vergleiche der EC50-Werte ergab, dass insgesamt durch den Einsatz von cGMP-Modulatoren keine Veränderungen der Sensitivität verursacht werden. Schlussfolgernd ergibt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit, dass glatte Gefäßmuskulatur über cGMP-Modulatoren hinsichtlich der Maximalspannungen beeinflussbar ist und dass der cGMP-Transport über MRP 4 und 5 für die Kontraktion von glatten Muskelzellen physiologisch bedeutsam zu sein scheint, was neue Möglichkeiten des medikamentösen Eingreifens in die Gefäßregulation eröffnen könnte.