Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (7)
Language
- German (7)
Has Fulltext
- yes (7)
Is part of the Bibliography
- no (7)
Keywords
- Bauchspeicheldrüsenkrebs (7) (remove)
Institute
- Klinik und Poliklinik für Innere Medizin Abt. Gastroenterologie, Endokrinologie und Ernährungsmedizin (7) (remove)
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Tumorentitäten mit geringen therapeutischen Möglichkeiten. Neue Erkenntnisse über relevante Signalwege in der Tumorprogression und Metastasierung sind daher von hoher Relevanz für den klinischen Alltag. Die vorliegende Arbeit untersuchte den Einfluss der Humanen neutrophilen Elastase (HNE) auf humane Pankreaskarzinomzelllinien über den Protease-aktivierten Rezeptor 2 (PAR-2).
In Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot konnte gezeigt werden, dass PAR-2 von verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien exprimiert wird. Die HNE ist ein bekannter Aktivator dieses Rezeptors, wobei der zugrunde liegende Mechanismus einzigartig im Vergleich zu anderen Proteasen wie bspw. Trypsin ist. Im Folgenden wurden die grundlegenden Tumorcharakteristika wie gesteigerte Proliferation, Migration und Unabhängigkeit von externen Wachstumsfaktoren in verschiedenen Verfahren untersucht. Hierfür wurden neben der HNE das synthetische PAR-2- Aktivierungspeptid (SLIGKV) bzw. reverse Peptid (VKGILS) genutzt. Dabei zeigten sich signifikante Steigerungen von Migration und Proliferation im Scratch- bzw. MTT-Assay für HNE und SLIGKV, jedoch nicht für VKGILS. Auch nach kombinierter Inkubation mit HNE und VKGILS konnte kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle festgestellt werden, was einen PAR-2-abhängigen Wirkmechanismus der HNE belegt. Eine Ausnahme bildet hierbei die Zelllinie Patu-89888T bezogen auf den Scratch-Assay. Dieser und weitere Unterschiede stellen die Komplexität der Interaktionen in verschiedenster Weise dar.
Des Weiteren zeigte die Inkubationen mit HNE und SLIGKV vergleichbare Ergebnisse im Western Blot bezüglich einer Aktivierung des MAP/Erk- und des PI3K/Akt-Signalweges.
Darüber hinaus steigern sowohl HNE als auch SLIGKV die Sekretion von Vascular endothelial growth factor wie mittels ELISA demonstriert werden konnte.
Abschließend kann also davon ausgegangen werden, dass die Effekte die HNE auf Pankreaskarzinomzelllinien in bedeutendem Maße über PAR-2 vermittelt werden. Hierbei werden verschiedene Signalkaskaden stimuliert, die letztendlich zu einer gesteigerten Proliferation, Migration und VEGF-Sekretion der Zellen führen. Sowohl eine Inhibition des PAR-2 als auch der HNE könnten daher neue mögliche Therapieoptionen darstellen.
Das Pankreasadenokarzinom (PDAC) ist aufgrund seiner hohen Letalität die vierthäufigste Todesursache unter den Krebserkrankungen in der westlichen Welt. PDAC ist durch eine erhebliche desmoplastische Stromareaktion mit geringer Vaskularisierung gekennzeichnet, so dass die Karzinomzellen ständigem Nährstoffmangel und Hypoxie ausgesetzt sind. In gesunden Zellen wird die Autophagie, welche konstitutiv auf einem basalen Niveau aktiv ist, als Reaktion auf umweltbedingte Stressfaktoren als Recyclingmechanismus aktiviert, um die Zellen mit Nährstoffen zu versorgen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Basalautophagie in den Karzinomzellen so hoch war, dass eine zusätzliche Aktivierung durch Mangelzustände nur schwach oder überhaupt nicht möglich war. Als Ursache hierfür ist die fehlende Sensitivität von mTOR zu nennen, wodurch eine verminderte Reaktion auf Nährstoffmangel oder Hypoxie bedingt ist. Ebenso sind Mutationen im KRAS-Gen, welche den RAS-Signalweg konstitutiv aktivieren, dafür verantwortlich, die Autophagie auch unter normalen Bedingungen zu steigern, so dass eine zusätzliche Induktion kaum möglich ist. Diese erhöhte Basalautophagie ist für die gesteigerte Proliferationsrate der Karzinomzellen sowie für die Versorgung der Zellen mit Aminosäuren notwendig. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich Karzinomzellen durch einen uneinheitlichen oxidativen/ glykolytischen Stoffwechsel auszeichnen, wobei die oxidative Phosphorylierung eine größere Bedeutung innehat. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Proliferation der Karzinomzellen unter OXPHOS-Inhibitoren unterdrückt wurde. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Aufrechterhaltung der oxidativen Phosphorylierung der Schlüsselmechanismus ist, über den Autophagie und Nährstoffversorgung zum Zellwachstum beitragen. Dies stellt einen Widerspruch zur Warburg-Hypothese dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen auf, dass der Mechanismus der Autophagie ein therapeutisches Target für eine unterstützende Therapie im Pankreaskarzinom darstellt, welches in nachfolgenden Arbeiten weiterführend evaluiert werden muss.
Das Ziel des Projektes war die Untersuchung der erworbenen Chemotherapie-Resistenz des Pankreaskarzinoms gegenüber den Zytostatika 5FU und Gemcitabin in Hinblick auf eine potentielle Regulation durch microRNAs.
Im ersten Schritt wurden Zelllinien mit einer intrinsischen Sensitivität identifiziert. Sieben etablierte Zelllinien des Pankreaskarzinoms (BXPC-3; COLO 357; PATU8988-S; PATU8988-T; CAPAN-1; MIA-PaCa-2; PANC-1) wurden mit Hilfe einer Annexin-V/DAPI-Färbung auf eine 5FU- oder Gemcitabin-induzierte Apoptose untersucht. Vier Zelllinien mit einer intrinsischen Sensitivität (BXPC-3; COLO 357; PATU8988-S; PATU8988-T) konnten identifiziert werden. Es folgte die Etablierung einer sekundären Chemotherapie-Resistenz in diesen sensitiven Zelllinien und die Bestätigung durch einen Proliferationsassay. Um die Hypothese einer veränderten microRNA-Expression in den sekundär resistenten Zelllinien zu untermauern, wurde die Expression der microRNAs miR-21, miR-200b und miR-214 untersucht. Eine veränderte Expression wurde gefunden und eine microRNA-Transkriptom-Analyse folgte. Diese deckte eine aberrante Expression von neun microRNAs (miR-7-5p; miR-23a-3p; miR-24-3p; miR-100-5p; miR-125b- 5p; miR-301a- 3p; miR-3158-5p; miR-3621; miR-3940- 5p) auf. Die Validierung dieser microRNAs via RTPCR zeigte eine Überexpression von miR-100 und miR-125b in allen resistenten Tumorzellen. Dies ist die erste Studie, welche valide Beweise für die Beteiligung beider microRNAs an der erworbenen Resistenz gegen 5FU und Gemcitabin zeigt. Für die Evaluation ihrer biologischen Rolle wurde die miR-100 oder miR-125b durch eine transiente Transfektion in den resistenten Zellen inhibiert. Eine Einschränkung der Viabilität und ein Anstieg der Caspasen 3 und 7 konnte nach Applikation der Zytostatika gesehen werden. Durch einen Proliferationsassay konnte eine langfristige Inhibition des Tumorzellwachstums, des Metabolismus und der Viabilität nach dem Knock-down der microRNAs bewiesen werden. Ein Zytotoxizitäts-Assay zeigte, dass die microRNA-Inhibition zu einer Wiederherstellung von Sensitivität und Dosis-Wirkungs-Beziehung gegenüber 5FU oder Gemcitabin führt. Es ist somit gezeigt, dass die miR-100 und miR-125b eine entscheidende Rolle in der Ausbildung einer sekundären Antimetabolit-Resistenz spielen. Ob diese microRNAs als Zielmolekül einer zukünftigen Antitumortherapie oder als Screeningparameter genutzt werden können, müssen weitere Studien zeigen.
In der durchgeführten Studie untersuchten wir die Wertigkeit der endosonographisch gestützten Feinnadelaspiration unter der Fragestellung eines Malignoms bei suspekten Läsionen im Pankreas. In einem Zeitraum von 2.5 Jahren wurden bei 204 Patienten 232 endosonographische Punktionen unter Fragestellung einer Pankreasneoplasie durchgeführt. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse bestätigen die endosonographisch gestützte Feinnadelpunktion als hilfreiches diagnostisches Verfahren in der Abklärung suspekter Läsionen im Pankreas als sehr spezifisches Verfahren. Im Vergleich eines Histopathologen mit einem ausgewiesenen Zytopathologen ergaben die Untersuchungen keinen signifikanten Unterschied im Befundergebnis. Dieses deutet darauf hin, dass bezüglich des zu erhebenden Befundes mehr die Qualität des gewonnenen Probenmaterials als die besondere Expertise des Befunders maßgeblich das Ergebnis einer sicheren und korrekten Diagnose bestimmt. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse, dass durch eine Umstellung der Probenfixierung von Luft auf Formalin, das Befundergebnis nicht negativ beeinflusst wird. Mehr noch ergab sich bei einer Formalinfixierung eine geringgradig jedoch nicht signifikant gesteigerte Befundausbeute. So kann bei der endosonographisch gestützten Feinnadelaspiration die Formalinfixierung genutzt werden, ohne dass hierdurch eine Reduzierung der Befundausbeute eintritt. Die Umstellung der Probenfixierung hin zur Formalin-fixierten Zelle bedeutet für den Allgemeinpathologen keine relevante Beeinträchtigung der Befunderstellung. Hingegen wird die Prozedur der Feinnadelpunktion im Handling, zeitlichen Ablauf und Kostenblock durch Wegfall eines Onsite-Zytopathologen vereinfacht und verkürzt
Das Pankreasadenokarzinom zeichnet sich durch aggressives Wachstum, frühe Metastasierung, späte Diagnosestellung und vermindertes Ansprechen auf zytostatische Therapien aus. Ziel der vorliegenden Arbeit ist zum Einen die Etablierung und Validierung eines Ganzkörper-Fluoreszenz-basierten Nachweises von Tumorwachstum und Metastasierung im Mausmodell als mögliche Basis für darauf aufbauende präklinische Pankreaskarzinom-Studien. Zum Anderen werden Vor- und Nachteile im Vergleich zum Schnittbildverfahren eines 7-Tesla-Kleintier-MRT untersucht. Nach stabiler Transfektion der murinen Adenokarzinom-Zelllinie Panc 02 mit eGFP-, RFP- und Lumineszenz-Expressionsvektoren wurde deren Fluoreszenz-/Lumineszenz-, Proliferations- und Apoptoseverhalten in vitro evaluiert. Nach orthotoper Injektion in den Pankreaskopf wurde das Tumorwachstum und Metastasierungsverhalten in vivo über einen Zeitverlauf von 21 Tagen mittels Ganzkörper-Fluoreszenz-Imaging und MRT untersucht. Ergänzend erfolgten im Anschluss entsprechende Analysen zu Proliferation und Apoptose in situ anhand der explantierten histologisch und immunhistochemisch aufgearbeiteten Organe. Die murine Panc 02 Adenokarzinom-Zelllinie konnte mit einer Proliferationsrate von 88,4 % bei 0 % Apoptose in vitro als besonders aggressiv wachsende Adenokarzinom-Zelllinie charakterisiert werden. Die Ergebnisse änderten sich auch in situ kaum. Während das Fluoreszenz-Imaging hochspezifisch, kostengünstig, untersucherunabhängig und einfach auswertbar progredientes lokales Tumorwachstum mit deutlicher peritonealer Metastasierung nachweisen konnte, zeigte das MRT eine bessere anatomisch-topographische Auflösung ohne Interferenz mit Haut, Haaren und Narbengewebe bei jedoch geringerer Sensitivität und Spezifität. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Kryo-Histologie konnte anschließend ein Tumornachweis bis auf Einzelzellebene erbracht werden. Zwischen den beiden bildgebenden Verfahren des Ganzkörper-Fluoreszenz-Imagings und MRTs konnte ein komplementäres Bild aufgezeigt werden.
Das Pankreaskarzinom hat auf Grund der frühzeitigen Metastasierung und seiner erst in fortgeschrittenen Stadien auftretenden klinischen Symptomatik meist eine infauste Prognose. Bei inoperablen Tumoren und Rezidiven kann durch die derzeit etablierten Therapieverfahren meist nur ein Überlebensvorteil von wenigen Wochen erreicht werden. Aus diesem Grunde stehen supportive Therapiemöglichkeiten, insbesondere mit dem Ziel der Lebensqualitätsverbesserung, im Vordergrund. Der Einfluss von L-Carnitin auf körpereigene Stoffwechselprozesse ist eingehend unter-sucht. Die Rolle von L-Carnitin im Rahmen einer Tumortherapie wurde trotz diesem physiologisch klar definierten Hintergrund bislang noch nicht ausreichend belegt. Im Rahmen einer randomisierten, placebokontrollierten, multizentrischen, prospek-tiven, doppelt-verblindeten Studie wurde bei 72 Patienten mit fortgeschrittenem Pankreaskarzinom untersucht, ob die Therapie mit L-Carnitin einen Einfluss auf den Krankheitsverlauf hat. Initial wurde hierbei auf Grund der physiologischen Ansatz-punkte besonderes Augenmerk auf den Ernährungszustand und die Lebensqualität gelegt. In beiden Punkten konnte durch die vorgelegte Studie belegt werden, dass L-Carnitin einen positiven Effekt sowohl auf die Lebensqualität, als auch auf den Ernährungszustand von Patienten mit fortgeschrittenem Pankreaskarzinom zeigt. Die Unterschiede in beiden Gruppen waren signifikant und konnten der Therapie mit L-Carnitin zugesprochen werden. Darüber hinaus konnte die vorliegende Studie überraschenderweise zeigen, dass unter der Therapie mit L-Carnitin das Überleben deutlich verlängert ist und die Krankenhausverweildauer gesenkt wird. Betrachtet man das Überleben, so erreichten die vorliegenden Daten keine Signifikanz, sind aber mit dem Ergebnis einer Chemotherapie vergleichbar und dieser zum Teil sogar überlegen. Aufgrund der im Vergleich zu anderen Therapien geringen Nebenwirkungen bietet L-Carnitin eine überragende supportive Therapieoption bei Patienten mit fortgeschrittenem Pankreaskarzinom.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung einer unterschiedlichen Expression von p120ctn Exon A und p120ctn Exon B am Beispiel von Patienten mit einem duktalen Pankreaskarzinom. Die Differenzierung der unterschiedlichen p120ctn Isoformen erfolgte mittels Antikörper gegen p120ctn Exon A und p120ctn Exon B. Auch über eigens hergestellte p120ctn GFP Fusionsproteine konnte die Sensitivität und Spezifität der Antikörper in der Immunfluoreszenz und im Western Blot gezeigt werden. In der Auswertung der Expression von p120ctn wurden die jeweiligen Patienten einem dominanten p120ctn Exon A oder p120ctn Exon B Expressiontyp zugeordnet. Im Vergleich der Überlebenszeiten fand sich eine deutlich schlechtere Überlebenswahrscheinlichkeit bei der Dominanz von p120ctn Exon A. Auch bei der Betrachtung von transfizierten Patu 8889S Zellen im Scratch Assay zeigte sich eine vermehrte Migration bei p120ctn Exon A transfizierten Zellen. Ebenso ist die Proliferation am Beispiel von transfizierten Hek293 Zellen mit p120ctn Exon A erhöht. Verbunden ist dies mit einer Umverteilung von p120ctn ins Zytosol und in den Kern besonders bei p120ctn Exon A Dominanz. Dies führt über die geringere Membranbindung zur Behinderung der Clusterbildung der Cadherine, zum eingeschränkten Transport von E-Cadherin und zu einem vermehrten Abbau von E-Cadherin. Stattdessen ist p120ctn vermehrt in Zytosol zu finden mit Modulation des Zytoskelettes. Dies führt zu der vermehrten Migration. Im Zellkern kommt es über die Bindung von p120ctn an den Transkriptionsfaktor Kaiso zur Regulation der Wnt Signalkaskade. Diese ist essentiell für die Embryonalentwicklung und bei auch vielen malignen Tumoren aktiv. Über die Kaiso Konzentration wird die Wnt Signalkaskade verstärkt oder inhibiert. Eine zunehmende p120ctn Lokalisation im Kern führt letztlich zu einer Aktivierung der Wnt Kaskade. Da die nukleäre Lokalisation besonders bei p120ctn Exon Dominanz ausgeprägt war, könnte dies die erhöhte Proliferation von p120ctn Exon A transfizierten Zellen erklären. Ob die Lokalisation von p120ctn den entscheidenden Einfluss hat oder ob es noch spezifische Bindungspartner für die Isoformen gibt, ist Gegenstand weiterer Untersuchungen.