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In Deutschland gibt es ca. 3 Millionen Kontaktlinsenträger und pro Jahr ca. 12000 kontaktlinsen-assoziierte Keratitiden. Die Hauptursache dieser Keratitiden ist die mangelnde Compliance der Kontaktlinsenträger hinsichtlich einer adäquaten Kontaktlinsenhygiene. Leider sind jedoch die gängigen Reinigungsmethoden, besonders die am häufigsten angewandte chemische Reinigung mit den so genannten All-in-One-Lösungen besonders anfällig für Hygienefehler (Austauschrhythmen, Einwirkzeiten, mechanische Vorreinigung).
In dieser Arbeit wurde nun ein neues Desinfektionsverfahren getestet, das weitestgehend unabhängig von der Compliance der Anwender ist. Dazu setzten wir UVC-Strahlung ein und bestrahlten damit weiche Monatslinsen. Wir verwendeten zwei unterschiedlich dimensionierte Prototypen (UVC-Bestrahlungsgerät, LED-UVC-Bestrahlungsgerät). Wir testeten das Verfahren anhand der Vorschriften der Europäischen Norm EN ISO 14729. Diese Norm regelt die mikrobiellen Anforderungen und Prüfverfahren für Produkte und Systeme zum Hygienemanagement von Kontaktlinsen. Sie verlangt zwei verschiedene Test. Der Stand Alone Test ist die Pflegemitteldirektprüfung. Dabei wird das neue Desinfektionsverfahren an einer Keimaufschwemmung getestet. Der Regimen Test ist die Prüfung des Verfahrens anhand der eigenen Pflegeanleitung. Das Verfahren muss dazu an 5 Testkeimen (Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Fusarium solani) getestet werden.
Parallel zur UVC-Bestrahlung testeten wir noch vier handelsübliche All-in-One-Lösungen (Perfect Aqua Plus (MPG&E), Opti-Free Replenish (Alcon), All-in-One light (Sauflon Pharmaceuticals), Solo Care Aqua (Ciba Vision)) und verglichen dann die Ergebnisse.
Die Versuche bewiesen, dass die UVC-Bestrahlung sehr gut geeignet ist, um weiche Kontaktlinsen zu desinfizieren. Es reichten nur 30 s (UVC-Bestrahlungsgerät) bzw. 2 Stunden (LED-UVC-Bestrahlungsgerät) Bestrahlung aus um die geforderte Log-Reduktion von 3-5 Logstufen bei allen 5 Testorganismen zu erreichen.
Leider mussten wir feststellen, dass die All-in-One-Lösungen deutlich schlechter abschnitten und die Norm somit zum größten Teil nicht erfüllten, wenn man auf den Schritt der manuellen Vorreinigung verzichtete.
Zusammenfassend ist also zu sagen, dass die UVC-Bestrahlung eine sehr gute Alternative für die mikrobielle Reinigung von Kontaktlinsen, im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren, darstellt und dass ihre Wirksamkeit dabei weitestgehend unabhängig von der Compliance der Anwender ist.
Das Gram-positive Bakterium Staphylococcus aureus besiedelt die menschliche Haut und die oberen Atemwege, z.B. die Nase. Aus noch unbekannten Gründen können die Bakterien gelegentlich einen pathogenen Charakter entwickeln und Krankheiten wie Furunkulose, Pneumonien oder Sepsis verursachen. Dieses pathogene Potenzial in Verbindung mit dem Auftreten von zahlreichen Antibiotika-Resistenzen in vielen klinisch relevanten S. aureus-Stämmen stellt ein Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Deshalb ist es notwendig, potenzielle Effekte der bakteriellen Produkte, die die eukaryotischen Wirtszellen relevanter Organsysteme beeinflussen könnten, zu erforschen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, spezifische Elemente der frühen Signaltransduktion, der Genregulation und der physiologischen Antworten von humanen immortalisierten Atemwegsepithelzellen (S9) auf Kontakt mit Staphylococcus aureus-Zellkulturüberständen sowie rekombinant hergestellten individuellen Virulenzfaktoren (Hämolysin A (Hla, ein porenformendes Toxin) und Hämolysin B (Hlb, ein Enzym mit Sphingomyelinase-Aktivität)) zu untersuchen. Diese Ansätze dienen dazu, Hinweise auf die Identität sezernierter Stoffwechselprodukte von S. aureus zu erhalten, die in den eukaryotischen Wirtszellen zu direkten Abwehr- oder Vermeidungsreaktionen (angeborene Immunität) oder zu Bakterien-induziertem „Fehlverhalten“ führen, das möglicherweise (Mit-)Ursache der Pathogenität einiger Stämme des Bakteriums ist. Quantitative Western-Blot-Analysen mit löslichen Proteinextrakten von S9-Zellen offenbarten dabei eine Aktivierung der Erk-Typ-MAPK, der p38 MAPK und der Akt1/3, aber keine Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) oder Akt2 infolge der Behandlung mit steril-filtrierten S. aureus-Überständen aus der exponentiellen Wachstumsphase (OD540nm = 1), der stationären Wachstumsphase (OD540nm = 10) bzw. nach der Behandlung mit rekombinant hergestellten S. aureus Hämolysinen (rHla, rHlb). Analysen der Produkte sogenannter „früher Gene“ zeigten eine moderate Erhöhung der Expression von c-Jun und Egr-1, und eine stärkere Erhöhung der Expression von c-Fos nach der Behandlung der S9-Zellen mit den bakteriellen Überständen oder rekombinanten Toxinen (rHla, rHlb). Da Atemwegsepithelzellen bei Kontakt mit potenziell pathogenen Bakterien bzw. sekretorischen Faktoren dieser Bakterien Chemokine zur Rekrutierung von Neutrophilen sekretieren, (speziell IL-8), wurde ein Multiplex-Assay-System eingesetzt, mit dem es möglich war, 11 verschiedene Zytokine im Kulturüberstand der S9-Zellen nach Behandlung der Zellen mit den bakteriellen OD10-Überständen bzw. rekombinanten Hla oder Hlb zu analysieren. Die S9-Zellen reagierten dabei auf die Behandlung mit dem Überstand, Hla oder Hlb mit der Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8, IFN-γ und IL-6, und diese Zytokin-Expression wurde teilweise vermittelt über die Signalwege der Erk-Typ-MAPK und der p38 MAPK. Weiter konnte gezeigt werden, dass Atemwegsepithelzellen infolge der Behandlung mit bakteriellem Überstand bzw. Hla Zellformveränderungen unterliegen und ihre Integrität verlieren. Dieses könnte parazelluläre Wege im Epithel öffnen, und so den Bakterien ermöglichen, ins Innere des Wirtskörpers vorzudringen.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen, überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt. Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest (Sytox-Assay) und mittels Immunfluoreszenzfärbung analysiert. Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen: (1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft. Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose, Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden. (2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass der Zelltod durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern. Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden basierte.
Staphylococcus aureus, einer der häufigsten Erreger von Pneumonien, Endokardien und Sepsen (Frank et al. 2010), gehört bei nahezu einem Drittel der Bevölkerung zur normalen Nasenschleimhautflora (van Belkum et al. 2009) und kann unter bestimmten Risikobedingungen, vor allem in nosokomialer Umgebung, weiter in die unteren Atemwege vordringen und sich dort vermehren (van Belkum et al. 2009, Ahmed et al. 2015). Da das respiratorische Epithel von einer dicken, viskösen Mukusschicht bedeckt ist (Knowles & Boucher 2002), die Bakterien aufgrund ihrer Größe kaum durchdringen können, liegt die Hypothese nahe, dass es die sehr viel kleineren, löslichen Virulenzfaktoren der Bakterien sind, die den Mukus überqueren und einen ersten Pathogen-Wirt-Kontakt herstellen können. Das lösliche, porenbildende α-Hämolysin (Hämolysin a, Hla) ist einer der Haupt-Virulenzfaktor von S. aureus (Spaulding 2012). Studien hatten gezeigt, dass Hla auch in sublytischer Konzentration zu einer Auflösung der Zell-Zell- (Inoshima et al 2012) und Zell-Matrix-Kontakte (Hermann et al. 2015) humaner Atemwegsepithelzellen führte und so eine Lückenbildung im Zellverband induzierte. In vivo könnten solche Hla-vermittelten Prozesse dazu beitragen, dass eine erste Schädigung des Epithels erfolgt und die Überwindung der epithelialen Barriere für S. aures erleichtert wird. Die vorliegende Arbeit konnte in einem ersten Teil zeigen, dass diese Unfähigkeit von humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o- und S9), nach Inkubation mit rHla den epithelialen Zusammenhalt aufrecht zu erhalten und entstandene parazelluläre Lücken durch aktive Migration zu schließen, auf eine rHla-induzierte Hyperphosphorylierung des fokalen Kontaktproteins Paxillin an Tyrosin 118 (und damit erhöhten Turnover der fokalen Kontakte) und Hypophosphorylierung des Actin-depolymerisierenden Faktors Cofilin an Serin 3 (und damit verstärkten Abbau von Stressfasern) zurückzuführen war. Der Hla-Effekt konnte so in fünf Prüfgrößen quantifizierbar erfasst werden: (1) Verlust des epithelialen Zusammenhalts, (2) Reorganisation des Actinzytoskeletts, (3) Auflösung fokaler Kontakte, (4) Hyperphosphorylierung von Paxillin und (5) Hypophosphorylierung von Cofilin. Im zweiten Teil der Arbeit wurden diese Prüfgrößen herangezogen, um den Mechanismus der Hla-Wirkung genauer aufzuklären. Durch Einsatz einer nichtporenbildenden Mutante rHla-H35L und dem Porenblocker IB201 konnte zunächst gezeigt werden, dass für die schädigenden Effekte auf den epithelialen Zusammenhalt der Zellen Ausbildung einer funktionellen Hla-Pore notwendig war und nicht Bindungsereignisse der Monomere, der Vorpore oder der Pore allein den Hla-Effekt auslösen konnten. Um die porenabhängigen Ereignisse zu untersuchen, wurden Ionenströme durch die Hla-Pore identifiziert und mit Ionomycin (erzeugt einen Calciumeinstrom) und Gramicidin (erzeugt einen Natriumeinstrom und Membrandepolarisierung) nachgebildet. Beide Ionenströme zusammen konnten den Hla-Effekt nahezu vollständig erzeugen. Die Ergebnisse wiesen darüber hinaus darauf hin, dass die Hla-erzeugten ionalen Veränderungen an der Membran unterschiedliche Signalveränderungen in der Zelle vermittelten: Calciumaktivierte Signalwege schienen vor allem für die beobachtete Paxillin-Phosphorylierung verantwortlich zu sein, während ein Natriumeinstrom zu einer Cofilin-Dephosphorylierung führte. Die genaue Signaltransduktion zwischen Einstrom der Ionen und (De-)Phosphorylierungsereignissen erfordert jedoch noch eine genauere Aufklärung. Des Weiteren konnte die Modellierung der Ionenströme den Hla-Effekt nicht komplett nachbilden, sodass wahrscheinlich zusätzliche porenabhängige Signalwege nach Hla-Behandlung (z.B. Verlust von ATP, Baaske & Richter et al. 2016) aktiviert werden.
Auf den inneren und äußeren Oberflächen des Menschen existieren zahlreiche Mikrohabitate mit limitiertem Sauerstoffangebot. Vor allem während infektiöser Vorgänge kann aufgrund einwandernder Neutrophile die Sauerstoffkonzentration im menschlichen Gewebe auf unter 1% sinken. Eine rasche Anpassung an das vorherrschende Sauerstofflevel und die Nutzung effizienter alternativer Atmungsformen oder des Gärungsstoffwechsels sind deshalb entscheidend für das mikrobielle Überleben im menschlichen Wirt. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die anaerobe Genexpression von Staphylococcus aureus sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen näher untersucht. Die sich in vier Teile gliedernde Arbeit befasst sich zunächst mit einer eingehenden Beschreibung der anaeroben Adaptation und Physiologie von S. aureus auf Ebene des Transkriptoms, der Proteinsynthese und des extrazellulären Metaboloms. Die Identifikation eines konservierten Sequenzmotivs (inverted repeat) vor zahlreichen anaerob induzierten Genen war Ausgangspunkt für die Untersuchung der entsprechenden regulatorischen Vorgänge im zweiten Teil dieser Arbeit. Diese führten letztlich in Kooperation mit Arbeitsgruppen aus den USA, Schweden und Deutschland (AG R. Proctor, Universität Wisconsin; AG C. von Wachenfeldt, Universität Lund; AG C. von Eiff, Universität Münster; AG M. Lalk, Universität Greifswald) zu der Identifikation des Rex Proteins (SACOL2035) als zentraler Regulator der anaeroben Genexpression in S. aureus. Neben der Rex-abhängigen Expressionskontrolle wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Friedrich Götz (Universität Tübingen) auch der Einfluss des Zwei-Komponenten¬systems NreBC auf die Genexpression in S. aureus näher untersucht. Auf Ebene des Transkriptoms, Proteoms und Metaboloms konnte so die essentielle Bedeutung des NreBC-Systems für die Expression der dissimilatorischen Nitrat- und Nitritreduktasen in S. aureus nachgewiesen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Einordnung des anaeroben Proteinsynthese¬musters (Proteomsignatur) in den Kontext zahlreicher anderer stressinduzierter Proteomsignaturen von S. aureus. Die aus diesem komplexen Vergleich gewonnenen Ergebnisse geben detaillierte Einblicke in die Spezifitäten und Gemeinsam¬keiten der Proteinsynthese von S. aureus als Reaktion auf oxidativen Stress (H2O2, Diamid und Paraquat), nitrosativen Stress (NO), Sauerstofflimitation in An- und Abwesenheit von Nitrat, Hitzestress (48°C) sowie subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen (Puromycin, Mupirocin). Für die Bereitstellung der entsprechenden Daten wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein mySQL-basiertes System entwickelt, das die Visualisierung der Daten mit komplexen Abfrage- und Filtermöglichkeiten verknüpft (http://www.aureolib.de). Im letzten Teil gibt diese Arbeit schließlich einen Überblick über die Leistungen und Möglichkeiten der Proteomanalyse hinsichtlich physiologischer und infektionsrelevanter Fragestellungen. Besondere Beachtung findet hier die Aufklärung und Struktur des bereits erwähnten Rex Modulons.
Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium. Häufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zählt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hämolytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und Oberflächenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulären Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms nicht grundsätzlich ändert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verstärkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur für die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adhäsine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich während der exponentiellen Wachstumsphase für die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte für clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergänzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestätigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulärer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazelluläre Enzyme die Erschließung von Nährstoffquellen in extremen Habitaten begünstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die Überlebensfähigkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion näher zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchführung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch für die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgeführt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunächst zu einer Integrin-vermittelten Adhäsion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus führte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen führt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
Das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus kann verschiedene, zum Teil lebensbedrohliche Erkrankungen wie Hautinfektionen (Furunkel, Karbunkel), Lungen-entzündung, Osteomyelitis (Knochenmarksentzündung), Endokarditis (Entzündung der Herzinnenhaut) und Sepsis auslösen. Dabei gehört S. aureus zu den häufigsten Erregern von Krankenhausinfektionen, sogenannten Nosokomialinfektionen. Deren Behandlung mittels Antibiotika stellt aufgrund von multiplen Antibiotikaresistenzen von S. aureus eine immer größere Heraus¬forderung dar, da dieser fähig ist, sich rapide an verändernde Umweltbedingungen anzu¬passen. Die Interaktion des pathogenen Bakteriums mit seiner Umwelt und seinem Wirt ist insbesondere durch den Proteinbestand, der auf der Zelloberfläche exponiert ist, bestimmt. S. aureus exprimiert ein Arsenal an Zellober-flächen-gebundenen Virulenzfaktoren, die zur Kolonisierung und Infektion von humanem Gewebe führen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung von Massen¬spektrometrie-basierten Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung der Zellober¬flächen¬-assoziierten Proteine von S. aureus. Dabei ist es gelungen, durch die Gel-freien und GeLC-MS/MS-basierten Methoden Biotinylierung und Trypsin-Behandlung 77% aller be-kannten Oberflächenproteine und zwei Drittel aller nach außen ragenden Membran-veran-kerten Lipoproteine von S. aureus zugänglich zu machen. Bei der Biotinylierung handelt es sich um eine Methode, bei der die Oberflächenproteine von intakten Zellen mit einem membranimpermeablen Reagenz markiert und anschließend über Affinitäts¬chroma-tographie aufgereinigt werden. Dagegen erfolgt bei der Trypsin-Behandlung die proteo-lytische Abspaltung der Oberflächen-exponierten Protein¬domänen. Erstmalig ist durch Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen, dem sogenannten 14N/15N-metabolischen Labeling, auch eine relative Quantifizierung der Oberflächenproteine von S. aureus möglich. Bei der Analyse des Oberflächenproteoms von wachsenden und nicht-wachsenden S. aureus Zellen konnten mittels Biotinylierung 146 Oberflächenproteine identifiziert werden. Durch relative Quantifizierung wurde gezeigt, dass Zelloberflächen-assoziierte Adhäsine von S. aureus, wie der Fibrinogen-bindende clumping Faktor B, vorzugsweise während des Wachstums exprimiert werden, während nicht-wachsende Zellen erhöhte Mengen an clumping Faktor A aufweisen. Desweiteren war die Menge an immunodominanten Antigen B auf der Zelloberfläche in der stationären Phase mehr als 10-fach erhöht. Bei dieser Arbeit wurde erstmalig das Gesamt¬proteom des Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus COL, bestehend aus cytosolischem, extra¬zellulärem, Membran- und Oberflächenproteom, um¬fassend identifiziert und quantifiziert (Becher et al., 2009). Um die Pathogenität von S. aureus näher zu erforschen, wurde das Oberflächenproteom des Wildtyps mit dem einer sigB-Mutante verglichen. Der alternative Sigma-Faktor SigmaB kontrolliert ein großes Regulon bestehend aus etwa 300 Genen, von denen viele in die Virulenz von S. aureus involviert sind. Durch Kombination von 14N/15N-metabolischen Labeling, Biotinylierung und GeLC-MS/MS konnten 98 Oberflächen-proteine quantifiziert werden. Von den 49 Proteinen, die in der sigB-Mutante verändert vorlagen, waren 21 schon als SigmaB-abhängig oder durch SigmaB beeinflusst bekannt. In dieser Arbeit konnten weitere 28 Oberflächenproteine erstmalig als SigmaB-abhängig beschrieben werden. Die Gruppe der Zelloberflächen-assoziierten Proteine und Virulenz-faktoren, die durch SigmaB beeinflusst werden, wurde so erweitert (Hempel et al., 2010). Durch Trypsin-Behandlung wurden insgesamt 63 Oberflächen¬proteine beim Vergleich vier verschiedener S. aureus Stämme identifiziert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Oberflächenproteom verschiedener S. aureus Stämme extrem variabel ist. Weniger als 10% der identifizierten Oberflächenproteine aller vier Stämme stimmten überein (Dreisbach et al., 2010). Eine optimale Analyse der Oberflächen¬proteine von S. aureus wird durch eine Kombination von Biotinylierung und Trypsin-Behandlung erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass Sortase-Substrate insbesondere durch Trypsin zugänglich sind, während Lipoproteine optimal durch Biotinylierung analysiert werden können. Das Protokoll zur Trypsin-Behandlung wurde modifiziert, stark vereinfacht und ist auch zur Quantifizierung von Oberflächen¬proteinen geeignet. Durch Kombi¬nation beider Methoden mit 14N/15N-metabolischen Labeling konnten 221 Oberflächen¬proteine identifiziert und 158 quantifiziert werden. Hierbei wurde S. aureus unter Eisenmangel-bedingungen untersucht. In den Körperflüssigkeiten von Säugetieren herrschen Eisenmangelbedingungen, und diese fungieren als wichtiges Wirtssignal für die Bakterien um Virulenzproteine zu exprimieren. Unter diesen infektionsrelevanten in vitro Bedingungen wurden insbesondere Zelloberflächenproteine wie die eisenabhängigen Häm-bindenden Proteine IsdA, IsdB, IsdC und IsdD, sowie lipidver¬ankerte Eisen-bindende Proteine stark induziert gefunden (Hempel et al., unpublished).
Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verläufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. Für die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunächst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabhängig werden z.B. Adhäsine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunächst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulären Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium für die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulären Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschließende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhängigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm für pI 4-7; 11cm u. 18cm für pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Größe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen Färbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzfärbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten für den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden für das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte Veränderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur für Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgeführt. Der Datenvergleich der extrazellulären Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulären Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Veränderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationär und spät stationär) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationären Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
Staphylococcus (S.) aureus ist vor allem bekannt als einer der Haupterreger nosokomialer Infektionen weltweit. Die Mechanismen, mit denen S. aureus und das Immunsystem des Wirtes miteinander interagieren sind komplex und bis heute nicht vollständig verstanden. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, bekannte Virulenzfaktoren von S. aureus und Proteine, deren Funktion für das Bakterium bisher unbekannt ist, hinsichtlich ihrer Immunogenität und ihrer Fähigkeit, Interaktionen mit Zellen und Plasmafaktoren des humanen Blutes einzugehen, zu charakterisieren. Die Entwicklung und Anwendung eines für den Organismus S. aureus spezifischen Proteinmikroarray war eines der Hauptziele dieser Arbeit, welches unter der Bezeichnung Staph-Toxin-Ag verwirklicht wurde. Der Array trug bis zu 62 S. aureus-Antigene und zeigte sich als geeignet zur Charakterisierung und Quantifizierung von Antikörperantworten in verschiedenen humanen und murinen Wirtsproben, wie Blutplasma und -serum sowie anderen extrazellulären Flüssigkeiten wie Nasensekret und Bauchwasser von gesunden und infizierten Probanden. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ wurde der Staph-Toxin-Ag dazu verwendet, Interaktionen von S. aureus-Proteinen zu humanen Blutplasmaproteinen zu identifizieren – Faktor H, Fibronektin, Fibrinogen, Plasminogen und Vitronektin. Der Staph-Toxin-Ag wurde in zwei unabhängigen globalen Studien angewendet, welche die S. aureus spezifischen Antikörperantworten von gesunden humanen Probanden untersuchten, darunter Träger und Nicht-Träger von S. aureus. In der ersten Studie wurden die IgG-Antworten in den Blutplasmen, in der zweiten Studie die Antikörperantworten der Klassen IgG und IgA, hier in den Nasensekreten der Probenaden charakterisiert. In beiden Studien wurde wie erwartet eine enorme Heterogenität der detektierten Antikörperantworten innerhalb der Kohorten beobachtet, die unabhängig vom Trägerstatus bestand. Vergleichende Analysen der IgA- mit den IgG-Antworten in den Nasensekreten konnten den Grad der Heterogenität noch einmal deutlich erhöhen. Für keinen der untersuchten Probanden stimmten die S. aureus-Antigen-Muster beider Antikörperklassen vollständig überein. Für die untersuchten S. aureus-Träger wurden im Durchschnitt höhere Antikörperlevel nachgewiesen als für die Nicht-Träger. Statistische Analysen (Mann-Whitney U-Test) der gemessenen IgG- bzw. IgA-Level identifizierten insgesamt zehn Antigene, gegen die die Testgruppe der Träger im Vergleich signifikant höhere Antworten zeigte. Für das virulenzassoziierte Protein IsaA (Immunodominant staphylococcal Antigen A) wurden die beschriebenen Unterschiede in beiden globalen Studien und für beide untersuchten Antikörperklassen identifiziert. Die stärksten und häufigsten Antikörperantworten konnten gegen Proteine aus zwei funktionellen Gruppen – die nicht-egc-Superantigene (SEB, SEC, TSST-1) und die Komplement- und Koagulationsinhibitoren (SCIN, Efb, Sbi, SSL-7, SACOL1169) – detektiert werden. Mindestens 60 % der untersuchten Probanden zeigten spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten gegen Komplementinhibitoren. Hingegen konnten für Superantigene vor allem Antikörperspezifitäten der Klasse IgG detektiert werden. Für den Komplementinhibitor Sbi (S. aureus Binder of IgG) wurde eine Lücke in den IgG-Antworten beobachtet. Beide funktionelle Gruppen werden folglich bei der Invasion des Wirtes von S. aureus in vivo exprimiert. Komplementinhibitoren sind darüber hinaus offensichtlich für S. aureus von besonderer Relevanz bei der Kolonisierung der Naseschleimhaut. Zahlreiche neue Erkenntnisse konnten gewonnen werden zu Proteinen, die von S. aureus sekretiert werden, deren Funktion für das Bakterium jedoch bisher unbekannt ist. Gegen zehn dieser Proteine wurden mithilfe des Staph-Toxin-Ag spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten nachgewiesen, besonders häufig gegen die Antigene SACOL0479, SACOL0480, SACOL0985 und SaurJH1_2034. Dies zeigte, dass diese Proteine durch S. aureus in vivo synthetisiert werden und dass sie immunogen wirken. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ konnten für 20 der sekretierten Proteine mit unbekannter Funktion Interaktionen mit humanen Blutplasmafaktoren nachgewiesen werden. In durchflusszytometrischen Analysen mit humanem Vollblut wurden für sieben Proteine – SACOL0021, SACOL0742, SACOL0908, SACOL0985, SACOL1788, SACOL1802 und SACOL2197 – spezifische Bindungen an PMNs (Polymorphonuclear Leukocytes) und/oder Monozyten gezeigt. In der vorliegenden Dissertation wurden mithilfe immunologischer und durchflusszytometrischer Methoden potentielle neue Virulenzfaktoren, Vakzinkandiaten sowie diagnostische Biomarker identifiziert. Neben der wissenschaftlichen Anwendung ist der Proteinarray Staph-Toxin-Ag durch seine Eigenschaften prädestiniert für einen Einsatz als Screening-Methode in der diagnostischen Medizin.