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Zusammenfassung Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist das wichtigste nicht-lysosomale proteolytische System für den Abbau intrazellulärer Proteine. Die Inhibition des UPS kann dosisabhängig den apoptotischen Zelltod oder die Induktion einer protektiven Stressantwort auslösen. In der therapeutischen Anwendung der Proteasominhibition sind neben der Wirksamkeit auch exakte Kenntnisse der Wirkungsweise essentiell, um die primären Effekte durch die Proteasominhibition besser zu erfassen und die initialen Effekte der Vermittlung dieser zellulären Reaktion besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurden Methoden der Proteom- und Transkriptomebene kombiniert, um komplexe zelluläre Veränderungen von Endothelzellen nach Proteasomhemmung zu charakterisieren. Weiterhin wurde mittels Immunpräzipitation Ubiquitin-bindender Proteine untersucht, welche Substrate des Proteasoms nach Proteasomhemmung in Endothelzellen stabilisiert werden. Primäre humane Endothelzellen (Huvec) wurden als Modell gewählt und mit niedrigen bzw. hohen Dosierungen des Proteasominhibitors MG132 behandelt. Das Expressionsprofil wurde in einer Zeitkinetik innerhalb der ersten 6h mittels Affymetrix Chipanalysen bestimmt. Die differentielle Proteinexpression nach zwei Stunden Proteasomhemmung wurde im Gesamtzelllysat durch 2D Gelelektrophorese und anschließende Silberfärbung visualisiert. Dabei konnten mehr als 20 regulierte Proteine identifiziert werden, welche zuvor nicht direkt im Zusammenhang mit der Vermittlung einer protektiven Stressantwort nach niedrig dosierter Proteasomhemmung bekannt waren. Durch Korrelation mit den parallel durchgeführten Expressionsarrays konnte die Regulation dieser Proteine als unabhängig von der Transkription erfasst werden. Die funktionelle Annotation der Daten zeigte dabei eine Anreicherung von Proteinen der zellulären Stressantwort, der intrazellulären Signaltransduktion und des oxidativen Stresses. Diese waren differentiell reguliert nach niedrig bzw. hoch dosierter Proteasominhibition. Während die niedrig dosierte Proteasominhibition ein protektives Genmuster zeigte, induzierten hohe Dosen den apoptotischen Zelltod. Auch konnte, in Abhängigkeit vom Grad der Proteasominhibition, ein deutlicher Anstieg der freien Radikale innerhalb der Zellen nachgewiesen werden, was auf die Vermittlung der Apoptose durch freie Radikale hinweist. Mit DJ-1, Peroxiredoxin-1 und -6 wurden mehrere Sensorproteine für oxidativen Stress identifiziert. Um, neben der Proteom- und Transkriptomanalyse, auch gezielt Substrate der Proteasominhibition zu identifizieren und als mögliche Mediatoren der protektiven Stressantwort zu identifizieren, wurden Gesamtzelllysate mittels Ubiquitin-Immunpräzipitation getrennt und Ubiquitin-bindende Proteine per Massenspektrometrie identifiziert. Dabei konnte ein Set von 22 Proteinen identifiziert werden, welche spezifisch nach 2h an der Ubiquitin-spezifischen Matrix gebunden wurden. In diesem Set finden sich vor allem RNA bindende Proteine, Bestandteile des UPS und ribosomale Proteine. Um gezielt transkriptionelle Mediatoren der protektiven Stressantwort nach partieller Proteasominhibition zu identifizieren, wurde eine Subproteom-Analyse mit nukleären Extrakten von Huvec durchgeführt. Nach Visualisierung mittels DIGE-Labeling und quantitativer Auswertung konnten 361 regulierte Spots nach 2 stündiger Proteasominhibition erfasst werden. Von diesen Spots konnten 319 per MALDI-MS identifiziert werden und 152 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden. Die funktionelle Auswertung ergab eine deutliche Überrepräsentation von RNA-bindenden und Splicing-relevanten Proteinen. Auch konnte für HnRNP A1, einem RNA-bindenden Protein, eine funktionelle Methylierung sowie eine Veränderung der subzellulären Lokalisierung nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Regulation des zellulären Splicings hin. In parallel dazu angefertigten Exon-sensitiven Affymetrix Arrays wurden über 600 Gene mit differentiell regulierten Exons identifiziert, welche vor allem Gene mit Rezeptor- und Transportproteinen kodieren. Auch eine erhöhte Anzahl von Genen mit Methyltransferase-/Kinaseaktivität wurde identifiziert. Insbesondere die Methyltransferasen, welche auch bei der posttranslationalen Modifikation von HnRNP A1 eine Rolle spielen, zeigten dabei eine signifikante Regulation unter niedrig dosierter Proteasominhibition. Zusammengefasst tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse dazu bei, einen detaillierten Überblick über die initialen Prozesse niedrig dosierter Proteasominhibition in Endothelzellen zu geben. Die Daten deuten dabei auf eine schnelle Adaptation der Zellen nach partieller Proteasomhemmung mittels Aktivierung einer anti-oxidativen Stressantwort sowie durch Regulation von Splicingvorgängen hin, die letztendlich in einem veränderten Expressionsprofil der Endothelzellen münden. Mit diesem systematischen Ansatz und der Kombination von Proteom- und Transkriptomanalyse konnten dabei einzelne Targets für die Mediation einer protektiven zellulären Stressantwort nach partieller Proteasomhemmung identifiziert werden.

Massenspektrometrie hat sich zur Methode der Wahl für die globale relative und absolute Proteinquantifizierung entwickelt. Da das vorhandene Methodenspektrum in der Anzahl der zu analysierenden Proben limitiert ist und bei der Vermeidung von Vorfraktionierungstechniken keine globale Analyse erlaubt, war es das Ziel dieser Dissertation das Methodenspektrum anhand von anschaulichen Beispielen zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien zu erweitern. Dazu erstreckt sich diese Arbeit von der Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten der Isotopen markierten relativen Quantifizierungsmethode, über die Entwicklung eines globalen markierungsfreien relativen Quantifizierungsansatzes bis zur globalen absoluten Quantifizierung und weiter im speziellen der Stöchiometrie-Aufklärung eines Proteinkomplexes. Die Kombination aus 14N/15N metabolischer Markierung mit der GeLC-MS Technik erlaubt eine robuste relative Quantifizierung auf globaler Ebene. Durch die Verwendung eines internen 15N-markierten Referenzextraktes wurde eine bisher nicht erreichte zeitliche Auflösung von zehn Zeitpunkten bei der Untersuchung eines Nährstoffwechsels zwischen den bevorzugten Kohlenstoffquellen, Glukose und Malat, des Gram positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erreicht. Dieses Experiment zeigte klar, dass die Anpassung an Malat als zweite Kohlenstoffquelle sehr schnell passiert. Im Gegensatz dazu findet die Anpassung an Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle mit einer zeitlichen Verschiebung von ca. 45 Min. statt. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Anpassung an Malat hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene geschieht und die Anpassung an Glukose auf transkriptioneller Ebene stattfindet. Die geringe Reproduzierbarkeit von Vorfraktionierungstechniken beschränkt ihre Anwendung während einer markierungsfreien Quantifizierung. Die eingeschränkte Kombinationsmöglichkeit mit Vorfraktionierungstechniken führt zu einer geringeren Anzahl an identifizierten und quantifizierten Proteinen, was durch den Einsatz von Ausschlusslisten mit optimierten Messparametern in wiederholten Messungen mit einer eindimensionalen Chromatographie ausgeglichen wurde. Im Vergleich zu einer einfachen Wiederholung der Messung konnte die Anzahl an identifizierten Peptiden um 32 % gesteigert werden. Der Ausschlusslistenansatz konnte anschließend erfolgreich für eine markierungsfreie globale Proteinquantifizierung der Stickstoffmonoxid (NO) Stressantwort des humanpathogenen Stapylococcus aureus eingesetzt werden. Die Ergebnisse wurden mittels paralleler Quantifizierung mit 14N/15N metabolischen Markierung verifiziert. Mit dem Ansatz wurden fast 50 % des gesamten Proteoms identifiziert und 70 % davon konnten mit einem zu dem Markierungsexperiment vergleichbaren Ergebnis quantifiziert werden. Die Proteomsignatur der NO-Stressantwort zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu der von Antibiotika, die wie NO zu DNA-Strangbrüchen führen. Auch bei der absoluten Proteinquantifizierung kann nicht ohne Weiteres eine Vorfraktionierung eingesetzt werden. Durch die Verwendung einer „multiplexed LC-MS“ (LC-MSE) Methode wurde fast die Hälfte aller zytosolischen Proteine von B. subtilis mit einer hohen durchschnittlichen Sequenzabdeckung von 40 % identifiziert. Die Hi3-Methode ermögliche zusätzlich die absolute Quantifizierung fast aller identifizierten Proteine, die über fast vier Größenordnungen nachgewiesen werden konnten. Die Zuverlässigkeit des Ansatzes wurde für sechs Proteine mit der gut etablierten AQUA-Technik bestätigt. Mit der Hi3-Methode wurden zum einen absolute Proteomsignaturen für unterschiedliche Nährstoffsituationen erstellt, was auch Einblicke in die Regulation der Expression von Aminosäure-Biosynthese und –abbau-Enzyme ermöglichte. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Konzentration von ribosomalen und weiteren Wachstumsraten-abhängig benötigten Proteinen sich bei niedrigen Wachstumsraten nicht unterscheidet und erst ab einer Wachstumsrate von 0,8 Std.-1 linear ansteigt. Die vergleichsweise hohe Standardabweichung der Hi3-Methode (~30 %) erschwert ihre Anwendung bei der Bestimmung von nicht gradzahligen Protein-Komplex-Stöchiometrien. Deswegen wurde zur Analyse des RNA-Polymerase-Komplexes von B. subtilis der AQUA-Ansatz gewählt, der sich durch eine sehr geringe Standardabweichung auszeichnet (< 10 %). Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, welches auf einer mTRAQ-Markierung der Referenzpeptide und des verdauten Komplexes beruhte. Es war so möglich die bekannte Stöchiometrie des Kernkomplexes RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 zu bestätigen und zusätzlich die zwei ω-Unterheiten und die σ-Faktoren σA und σB absolut zu bestimmen. Die Menge an σB im Komplex nahm nach Glukose-Hunger und Ethanol-Stress auf bis zu 5 % zu und es konnte gezeigt werden, dass sich die Menge einer ω-Unterheit (YloH) sich im gleichen Maße im Komplex ändert, wie die Menge an σA.