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Neue Konzepte für das Protein-Engineering am Beispiel von Enzymen mit alpha/beta-Hydrolasefaltung
(2010)
Trotz einer sehr großen funktionellen Diversität, zeichnen sich die Enzyme innerhalb der α/β-Hydrolasefaltung-Superfamilie durch eine sehr hohe strukturelle Homologie aus, weshalb man annimmt, dass sich deren Vertreter über divergente Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Unter Zuhilfenahme von Methoden des Protein-Engineerings sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob es möglich ist, Enzyme innerhalb dieser Superfamilie ineinander umzuwandeln. Als Modelenzyme dienten eine Esterase aus Pseudomonas fluorescens (PFE) und eine Epoxidhydrolase aus Agrobacterium radiobacter (EchA). Nach der Etablierung geeigneter Analysemethoden für Esteraseaktivität und Epoxidhydrolaseaktivität wurden mittels verschiedener Sequenz- und Strukturalignments Aminosäuren identifiziert, die essentiell für den jeweiligen Reaktionsmechanismus sind. Diese wurden nachfolgend mittels positionsgerichteter Mutagenese in die jeweiligen Enzyme eingefügt und die entsprechenden Mutanten auf die jeweilige Aktivität hin untersucht. Leider zeigte weder die PFE Epoxidhydrolaseaktivität, noch die EchA Esteraseaktivität. Anschließend wurden über weitere Strukturvergleiche ganze Bereiche in Epoxidhydrolasen identifiziert, die möglicherweise von Wichtigkeit für die Funktionalität des Enzyms sind. Es wurden also ganze Bereiche der PFE durch solche der EchA ersetzt und auf diese Weise drei Chimär-Enzyme hergestellt. Diese Chimären wurden mittels Coexpression von Chaperonen hergestellt und anschließend aufgereinigt. Eines dieser Chimärenzyme zeigte eindeutig Epoxidhydrolaseaktivität. Es wird angenommen, dass der Eingangsbereich ins aktive Zentrum der PFE im Wildtyp-Enzym versperrt war und dieser durch den Austausch eines Loops geöffnet wurde. Weiterhin wurde ein Ansatz entwickelt, Esteraseaktivität in der EchA zu generieren. Dieser basiert auf einem strukturbasierten Sequenzalignment, das es erlaubt Aminosäuren zu identifizieren, die sich in Epoxidhydrolasen und Esterasen unterscheiden. Leider führte dieser Ansatz bisher noch nicht zum Erfolg, weshalb weitere Untersuchungen nötig sind. Im zweiten Teil der Arbeit ging es darum, Mutantenbibliotheken für die fokussierte, gerichtete Evolution möglichst klein, aber qualitativ hochwertig herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ebenfalls ein strukturbasiertes multiples Sequenzalignment herangezogen, das es erlaubt die Aminosäureverteilung an verschiedenen Positionen des Enzyms in einer riesigen Anzahl strukturell verwandter Enzyme zu bestimmen. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Aminosäuren an definierten Positionen sehr häufig sind und welche eher selten. Von solchen Resten, die sehr selten sind, wird angenommen, dass sie negative Auswirkungen auf die strukturelle Integrität des Proteins haben und deshalb von der Natur nicht berücksichtigt wurden. Diese Annahme wurde zur Herstellung von Proteinbibliotheken ausgenutzt. In einer fokussierten, gerichteten Evolution wurden einmal 3 und einmal 4 Aminosäuren der PFE simultan und zufällig durch Aminosäuren ersetzt, die sehr häufig in 2800 verwandten Sequenzen an diesen Positionen vorkommen. Die auf diese Weise generierten Bibliotheken wurden einmal auf eine verbesserte Thermostabilität (für die 3 Positionen) und einmal auf eine verbesserte Enantioselektivität untersucht (4 Positionen). Hierbei wurde zusätzlich die Auswirkung der Mutationen auf die Substratspezifität untersucht. Als Vergleichsbibliotheken wurden ebenfalls einmal alle 20 proteinogenen Aminosäuren eingefügt und einmal nur solche, die sehr selten im Alignment auftauchen. Das Ergebnis war in beiden Fällen eine sehr viel bessere Bibliothek, wenn nur solche Reste vertreten waren, die auch in der Natur bevorzugt vorkommen. Dies galt sowohl in Bezug auf die Anzahl aktiver Klone in jeder Bibliothek, als auch auf die Chance eine verbesserte Variante zu finden (stabiler bzw. selektiver). Die besten Mutanten der Bibliotheken hatten im Vergleich zum Wildtyp einen 8°C höheren Schmelzpunkt bzw. einen bis 18fach höheren E-Wert (bei 50facher katalytischer Effizienz). Weiterhin konnten die Substratspezifität um den Faktor 4.300 verändert werden.
The aim of this thesis was to validate a method called OSCARR for One-pot, Simple Cassette Randomization and Recombination for focused directed evolution, which had been developed by Dr. Hidalgo. It is based upon the megaprimer PCR method using outer primers differing in TM and including asymmetric cycles before the addition of the forward primer to generate more mutated megaprimer. As mutation-carrying primers, spiked oligonucleotides are employed. These spiked oligonucleotides are designed using an algorithm and have strictly defined composition of nucleotides at each position. An OSCARR library of the Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) of approximately 8000 clones was generated and screened for altered chain-length selectivity. Two mutants with higher activity towards medium chain length p-nitrophenyl esters were identified, both carried the mutation F126I, which causes the substrate entrance tunnel to be widened, thus facilitating access of bulkier substrates to the active site. One mutant carried the additional mutation G120S which completes a catalytic tetrad which is observed mainly in proteases. F126I had a stronger influence on chain-length specificity, so the further amino acids which form the “bottleneck” to the active site were mutated to further widen the entrance, and mutants with improved activity were found. The bottleneck mutants which consist of single, double, triple and quadruple mutants which are mostly combinations of F126L, F144L, F159L and I225L were then assayed for altered enantioselectivity against chiral acids and secondary alcohols. For substrates 1-phenyl-1-propyl acetate (2), 1-phenyl-2-propyl acetate (3) and 1-phenyl ethyl acetate (4), mutants with increased enantioselectivity were found. I225L plays a crucial role, as it is vital for enantioselectivity against 3, but destroys selectivity against 2, both facts obvious from the comparison of the triple mutant without I225L (mutant T3) and the corresponding quadruple mutant including I225L (mutant Q). However, the single mutant I225L alone does not possess high selectivity against 3, so synergistic effects play an important role. The PFE I wild type already possesses a good enantioselectivity in the hydrolysis of 4, but all mutants which were analyzed in detail surpass the wild type. The program YASARA was then used to calculate docking solutions for both enantiomers of 2 and 3 into the wild type and the best mutant. The results revealed that the mutants’ widened bottleneck allows the phenyl moiety of the substrates to point towards the access tunnel, while only (R)-2 does so in the wild type. Residues 126 and 144 do not come very close to the substrate and are more likely to influence substrate diffusion. Another goal was to find a way to confer promiscuous amidase activity upon the PFE I. In the search for structural homologues, a close structural neighbour with amidase activity was found. The --lactamase from Aureobacterium sp. was named after its activity toward the Vince lactam 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one. Biocatalysis experiments with the PFE I and its mutants revealed an excellent enantioselectivity against the ( )-lactam. Specific activities were determined for purified proteins, and the activity of some mutants was within the same order of magnitude as lactamase’s activity.