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Identifikation von Tumor-assoziierten Proteinen in Oropharynxkarzinomen mittels Proteomanalyse
(2021)
Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich stellen weltweit die sechsthäufigste Tumorerkrankung dar. Symptome treten meist erst in fortgeschrittenen Tumorstadien auf und verhindern somit eine frühe Diagnosestellung. Die Inzidenz- und Mortalitätsraten stagnieren seit Jahrzehnten auf stabilem Niveau. Um potentielle Biomarker und mögliche neue therapeutische Ansätze zu identifizieren, wurden in dieser Arbeit verschiedene Gewebeproben von Tumorpatienten untereinander und mit Plattenepithelproben von Nichttumorpatienten hinsichtlich veränderter Proteinexpressionen verglichen. Mittels 2D-DIGE und MALDI-TOF-MS/MS konnten aus 930 Spots 1874 Proteine identifiziert werden, die einer reprimierten oder induzierten Expression unterlagen. Für die statistische Auswertung lagen nach Abzug der Duplikate 591 Proteine vor. Einige der bereits in der Literatur in Zusammenhang mit Oropharynxkarzinomen beschriebene Biomarker, konnten allerdings nur indirekt über die Ingenuity Pathway Analyse detektiert werden.
Neben bekannten Tumormarkern, wie SCCA, CEA und Hitzeschockproteinen sowie etablierten Therapieansätzen, wie zum Beispiel EGFR und PD-1, wurden andere potentielle Biomarker gefunden, die teilweise in der Literatur schon in Zusammenhang mit Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs beschrieben wurden und sich möglicherweise als diagnostisches Werkzeug eignen könnten.
Annexin A1 agiert vermutlich als Tumorsuppressor und seine Expression zeigte sich in Tumorgewebeproben signifikant reprimiert, im Vergleich zu gesunden Plattenepithelien. Vor diesem Hintergrund eignet sich Annexin A1 womöglich als früher diagnostischer Biomarker. Stathmin, ein Regulator des Zellzyklus, war in der vergleichenden Analyse der Tumorgewebe gegenüber der Nichttumorgewebe hochreguliert. Ein denkbarer Einsatzort für dieses Protein wäre das Monitoring des Therapieansprechens, da in der Literatur vor allem in fortgeschrittenen Karzinomen von hohen Expressionsleveln berichtet wurde. Neben dem Einsatz als diagnostisches Werkzeug müsste eine Eignung als Ansatz für eine individualisierte Therapie überprüft werden. Der Zellzyklus und seine Regulatoren sind essentielle Angriffspunkte in der Karzinogenese und stellen ein mögliches Ziel von neuen Therapien dar.
14-3-3 wurde als eine von drei Isoformen der 14-3-3 Proteinfamilie identifiziert und wies eine induzierte Expression auf, die spezifisch für die Tumorgewebe war. Bislang wurde 14-3-3 noch nicht im Zusammenhang mit Oropharynxkarzinomen beschrieben und könnte sich als möglicher Biomarker in der Diagnostik etablieren. Die Isoform 14-3-3 und dessen Expression scheint mit Chemotherapieresistenzen assoziiert zu sein und bietet die Möglichkeit, Patienten mit Chemotherapieversagen früh zu identifizieren. Ein Ansatzpunkt für die zielgerichtete Therapie dieser Patientengruppe müsste in weiterführenden Studien geprüft werden. HPV spielt eine wesentliche Rolle in der Karzinogenese von Oropharynxkarzinomen. Die molekularen Grundlagen, Therapieplanung und Outcome unterscheiden sich erheblich von HPV-negativen Oropharynxkarzinomen. In dieser Arbeit wurde kein HPV-Status erhoben. Für weiterführende Arbeiten wäre die HPV-Erhebung ein grundlegender Baustein.
Um Mortalität und Lebensqualität von Patienten mit Oropharynxkarzinomen zu verbessern, sind eine frühe Diagnosestellung und eine zielgerichtete Therapie notwendig. Wesentlich um dieses Ziel zu erreichen, sind weiterführende Studien, die potentielle Biomarker in der klinischen Erprobung voranbringen.
Zusammenfassung Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist das wichtigste nicht-lysosomale proteolytische System für den Abbau intrazellulärer Proteine. Die Inhibition des UPS kann dosisabhängig den apoptotischen Zelltod oder die Induktion einer protektiven Stressantwort auslösen. In der therapeutischen Anwendung der Proteasominhibition sind neben der Wirksamkeit auch exakte Kenntnisse der Wirkungsweise essentiell, um die primären Effekte durch die Proteasominhibition besser zu erfassen und die initialen Effekte der Vermittlung dieser zellulären Reaktion besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurden Methoden der Proteom- und Transkriptomebene kombiniert, um komplexe zelluläre Veränderungen von Endothelzellen nach Proteasomhemmung zu charakterisieren. Weiterhin wurde mittels Immunpräzipitation Ubiquitin-bindender Proteine untersucht, welche Substrate des Proteasoms nach Proteasomhemmung in Endothelzellen stabilisiert werden. Primäre humane Endothelzellen (Huvec) wurden als Modell gewählt und mit niedrigen bzw. hohen Dosierungen des Proteasominhibitors MG132 behandelt. Das Expressionsprofil wurde in einer Zeitkinetik innerhalb der ersten 6h mittels Affymetrix Chipanalysen bestimmt. Die differentielle Proteinexpression nach zwei Stunden Proteasomhemmung wurde im Gesamtzelllysat durch 2D Gelelektrophorese und anschließende Silberfärbung visualisiert. Dabei konnten mehr als 20 regulierte Proteine identifiziert werden, welche zuvor nicht direkt im Zusammenhang mit der Vermittlung einer protektiven Stressantwort nach niedrig dosierter Proteasomhemmung bekannt waren. Durch Korrelation mit den parallel durchgeführten Expressionsarrays konnte die Regulation dieser Proteine als unabhängig von der Transkription erfasst werden. Die funktionelle Annotation der Daten zeigte dabei eine Anreicherung von Proteinen der zellulären Stressantwort, der intrazellulären Signaltransduktion und des oxidativen Stresses. Diese waren differentiell reguliert nach niedrig bzw. hoch dosierter Proteasominhibition. Während die niedrig dosierte Proteasominhibition ein protektives Genmuster zeigte, induzierten hohe Dosen den apoptotischen Zelltod. Auch konnte, in Abhängigkeit vom Grad der Proteasominhibition, ein deutlicher Anstieg der freien Radikale innerhalb der Zellen nachgewiesen werden, was auf die Vermittlung der Apoptose durch freie Radikale hinweist. Mit DJ-1, Peroxiredoxin-1 und -6 wurden mehrere Sensorproteine für oxidativen Stress identifiziert. Um, neben der Proteom- und Transkriptomanalyse, auch gezielt Substrate der Proteasominhibition zu identifizieren und als mögliche Mediatoren der protektiven Stressantwort zu identifizieren, wurden Gesamtzelllysate mittels Ubiquitin-Immunpräzipitation getrennt und Ubiquitin-bindende Proteine per Massenspektrometrie identifiziert. Dabei konnte ein Set von 22 Proteinen identifiziert werden, welche spezifisch nach 2h an der Ubiquitin-spezifischen Matrix gebunden wurden. In diesem Set finden sich vor allem RNA bindende Proteine, Bestandteile des UPS und ribosomale Proteine. Um gezielt transkriptionelle Mediatoren der protektiven Stressantwort nach partieller Proteasominhibition zu identifizieren, wurde eine Subproteom-Analyse mit nukleären Extrakten von Huvec durchgeführt. Nach Visualisierung mittels DIGE-Labeling und quantitativer Auswertung konnten 361 regulierte Spots nach 2 stündiger Proteasominhibition erfasst werden. Von diesen Spots konnten 319 per MALDI-MS identifiziert werden und 152 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden. Die funktionelle Auswertung ergab eine deutliche Überrepräsentation von RNA-bindenden und Splicing-relevanten Proteinen. Auch konnte für HnRNP A1, einem RNA-bindenden Protein, eine funktionelle Methylierung sowie eine Veränderung der subzellulären Lokalisierung nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Regulation des zellulären Splicings hin. In parallel dazu angefertigten Exon-sensitiven Affymetrix Arrays wurden über 600 Gene mit differentiell regulierten Exons identifiziert, welche vor allem Gene mit Rezeptor- und Transportproteinen kodieren. Auch eine erhöhte Anzahl von Genen mit Methyltransferase-/Kinaseaktivität wurde identifiziert. Insbesondere die Methyltransferasen, welche auch bei der posttranslationalen Modifikation von HnRNP A1 eine Rolle spielen, zeigten dabei eine signifikante Regulation unter niedrig dosierter Proteasominhibition. Zusammengefasst tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse dazu bei, einen detaillierten Überblick über die initialen Prozesse niedrig dosierter Proteasominhibition in Endothelzellen zu geben. Die Daten deuten dabei auf eine schnelle Adaptation der Zellen nach partieller Proteasomhemmung mittels Aktivierung einer anti-oxidativen Stressantwort sowie durch Regulation von Splicingvorgängen hin, die letztendlich in einem veränderten Expressionsprofil der Endothelzellen münden. Mit diesem systematischen Ansatz und der Kombination von Proteom- und Transkriptomanalyse konnten dabei einzelne Targets für die Mediation einer protektiven zellulären Stressantwort nach partieller Proteasomhemmung identifiziert werden.
In the post genomic era, novel “Omics” technologies like genomics and proteomics can be used in powerful screening approaches to provide unbiased lists of candidate genes and proteins and thus facilitate a comprehensive analysis of complex diseases such as cancer, which would not have been possible applying traditional genetic and biochemical approaches alone. During my PhD tenure I applied functional genomics screening technologies including proteomics in combination with traditional biochemical and cell biology approaches in two disease oriented projects: 1. Characterization of the role of BCL11b in Human T cell lymphomas (and) 2. Elucidation of the mechanism of pathophysiology of Johanson Blizzard Syndrome using UBR1 knockout mice and JBS patients’ lymphoblasts cell lines.
1.Characterization of the role of BCL11b in Human T cell lymphomas
: The Bcl11b protein belongs to the C2H2-family of Krueppel-like zinc finger proteins and thus is a member of the largest family of transcription factors in eukaryotes. It was shown to be important for a variety of functions such as T cell differentiation, normal development of central nervous system and DNA damage response. Malignant T cells undergo apoptotic cell death upon BCL11B down-regulation. However, the detailed mechanism of this cell death is not fully understood. Two dimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE), mass spectrometry and cell biological experiments were employed to investigate the functional impact of knock down of BCL11B in malignant T cell lines such as Jurkat and huT78. To further confirm the findings of these experiments, changes in protein patterns were also recorded after down-regulation of BCL11B expression in Jurkat cells over expressing BcL-xL and in Jurkat cells over expressing BCL11B. These experiments provide evidence for the involvement of the mitochondrial apoptotic pathway and increased levels of cleavage fragments of known caspase targets such as myosin, spectrin and vimentin were observed after BCL11B knockdown. The findings suggest an involvement of ERM proteins, which were up-regulated and phosphorylated upon BCL11B down-regulation. Besides ERM proteins, PDCD5, a key regulator of apoptosis, was also found at increased levels upon down regulation of BCL11B. Moreover, the levels of several proteins implicated in cell cycle entry, including DUT-N, UCK2, MAT1, CDK6, MCM4 and MCM6 were elevated, which might lead to uncontrolled cell cycle progression, uracil misincorporation and cell death. Interestingly, an inverse regulation pattern, i.e. decreased levels of ERM proteins, DUT-N, UCK2 and PDCD5 was seen upon over expression of BCL11B in Jurkat cells. In summary, proteome analyses revealed several previously unidentified mechanisms which could significantly contribute to the cell death following BCL11B knockdown.
2.Elucidation of the mechanism of pathophysiology of Johanson Blizzard Syndrome using UBR1 knockout mice and JBS patients’ lymphoblasts cell lines
: Johanson-Blizzard syndrome (JBS; OMIM 243,800), which was first described in 1971, is a rare autosomal recessively inherited genetic disorder with a unique combination of congenital abnormalities. The most constant clinical feature of JBS is the loss of exocrine pancreatic function due to progressive destruction of pancreatic acini. Genome wide linkage analysis identified the disease associated locus in the 15q14-q21 chromosome region and high-throughput sequencing of this region revealed several truncated and some missense mutations in the UBR1 gene. UBR1 gene contains 47 exons and spans over 161 kilobases. The UBR1 protein belongs to the E3 ubiquitin ligase family and is an important component of the N-end rule pathway of ubiquitous protein degradation. It was hypothesized that stabilization of direct and unique substrates of UBR1 could be the main cause of the JBS pathophysiology. So far sequencing of the UBR1 gene is the only available diagnostic procedure. However, sequencing might not always allow precise prediction of residual UBR1 activity. Hence, this study was started to develop a protein based diagnostic assay for the detection of subclinical cases of JBS and to identify signalling pathways contributing to the pathophysiology of this complex disorder using a murine UBR1 knockout model. 2D-DIGE proteome analysis was carried out for a comparative evaluation of lymphoblast samples of 14 patients and 11 controls. Principal component Analysis (PCA) clearly discriminated JBS patients from controls. However, 4 JBS patients differed from the rest and resembled controls more closely. Western-blot analysis revealed residual UBR1 levels in these patients, which were linked to a milder phenotype. Hierarchical clustering of the three groups (controls, patients with residual UBR1 levels and patients without UBR1) showed group-specific characteristic differences in the abundance of differentially regulated proteins. Quantification of a panel of five selected protein spots encompassing Interferon-induced GTP binding protein, HLA class II histocompatibility antigen, Annexin A6, FK506-binding protein 4 and GRP78 permitted discrimination of controls and JBS patients with mild phenotypes. Of note, the molecular chaperones GRP78 (BiP) and FK506BP were consistently altered in level in JBS patients and probably constitute UBR1 dependent substrates. This suggested JBS as an ER-stress related disease also indicating a possible way of therapeutic intervention. Comparative proteome analysis of UBR1 knockout and wild type animals after caerulein treatment revealed a significant accumulation of pancreatic proteases such as chymotrypsin B, anionic trypsin and pancreatic elastase in animals lacking UBR1. Furthermore, an up-regulation of ER-stress proteins and inflammation related proteins was observed. Phenotypic characterisation revealed in UBR1 knockout animals significantly increased lipase levels, a significantly increased histological score and significantly increased elastase activity 8h after the onset of pancreatitis. In isolated pancreatic acini of UBR1 knockout animals we found a significant increase in intracellular elastase activation upon supramaximal CCK stimulation, which was associated with a significant rise in the rate of necrosis explaining the more severe phenotype in the UBR1 knock-out animals. A TUNEL assay showed that there was more apoptosis in wild type compared to UBR1 knockout mice. Another set of experiments was designed to identify physiologically important substrates of UBR1. Inhibition of such substrates might then in turn allow reversion or prevention of the severe form of pancreatitis in UBR1 knockout mice. However, using the trypsin specific and reversible inhibitor S-124 it was shown that impaired trypsin degradation and thereby prolonged activation of this protease did not critically influence the phenotype. Calcium analysis after physiological stimulation revealed an increase of pathological Ca2+ signalling events, i.e. significant decrease of spike number and significant increase of spike duration. Of the candidates potentially influencing Ca2+ signalling RGS4 turned out to be of particular importance. Pre-incubation of pancreatic acini of UBR1 knockout animals with a specific RGS4 inhibitor (CCG-4986, 10 µM) normalized Ca2+ patterns, did not affect trypsin activity itself but prevented Ca2+-triggered premature trypsin activation and thus acinar disintegration. In summary, using lymphoblasts samples of JBS patients we were able to deduce a protein panel which could be developed as a possible diagnostic tool for confirmation of JBS syndrome. Furthermore, using UBR1 knockout mice in an experimental model we were able to elucidate the vital function of UBR1 and its direct substrate RGS4 in the defense against pathologic pancreatic damage thereby manifesting JBS as an inflammatory disorder due to an inadequate UBR1 mediated defense.
Massenspektrometrie hat sich zur Methode der Wahl für die globale relative und absolute Proteinquantifizierung entwickelt. Da das vorhandene Methodenspektrum in der Anzahl der zu analysierenden Proben limitiert ist und bei der Vermeidung von Vorfraktionierungstechniken keine globale Analyse erlaubt, war es das Ziel dieser Dissertation das Methodenspektrum anhand von anschaulichen Beispielen zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien zu erweitern. Dazu erstreckt sich diese Arbeit von der Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten der Isotopen markierten relativen Quantifizierungsmethode, über die Entwicklung eines globalen markierungsfreien relativen Quantifizierungsansatzes bis zur globalen absoluten Quantifizierung und weiter im speziellen der Stöchiometrie-Aufklärung eines Proteinkomplexes. Die Kombination aus 14N/15N metabolischer Markierung mit der GeLC-MS Technik erlaubt eine robuste relative Quantifizierung auf globaler Ebene. Durch die Verwendung eines internen 15N-markierten Referenzextraktes wurde eine bisher nicht erreichte zeitliche Auflösung von zehn Zeitpunkten bei der Untersuchung eines Nährstoffwechsels zwischen den bevorzugten Kohlenstoffquellen, Glukose und Malat, des Gram positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erreicht. Dieses Experiment zeigte klar, dass die Anpassung an Malat als zweite Kohlenstoffquelle sehr schnell passiert. Im Gegensatz dazu findet die Anpassung an Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle mit einer zeitlichen Verschiebung von ca. 45 Min. statt. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Anpassung an Malat hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene geschieht und die Anpassung an Glukose auf transkriptioneller Ebene stattfindet. Die geringe Reproduzierbarkeit von Vorfraktionierungstechniken beschränkt ihre Anwendung während einer markierungsfreien Quantifizierung. Die eingeschränkte Kombinationsmöglichkeit mit Vorfraktionierungstechniken führt zu einer geringeren Anzahl an identifizierten und quantifizierten Proteinen, was durch den Einsatz von Ausschlusslisten mit optimierten Messparametern in wiederholten Messungen mit einer eindimensionalen Chromatographie ausgeglichen wurde. Im Vergleich zu einer einfachen Wiederholung der Messung konnte die Anzahl an identifizierten Peptiden um 32 % gesteigert werden. Der Ausschlusslistenansatz konnte anschließend erfolgreich für eine markierungsfreie globale Proteinquantifizierung der Stickstoffmonoxid (NO) Stressantwort des humanpathogenen Stapylococcus aureus eingesetzt werden. Die Ergebnisse wurden mittels paralleler Quantifizierung mit 14N/15N metabolischen Markierung verifiziert. Mit dem Ansatz wurden fast 50 % des gesamten Proteoms identifiziert und 70 % davon konnten mit einem zu dem Markierungsexperiment vergleichbaren Ergebnis quantifiziert werden. Die Proteomsignatur der NO-Stressantwort zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu der von Antibiotika, die wie NO zu DNA-Strangbrüchen führen. Auch bei der absoluten Proteinquantifizierung kann nicht ohne Weiteres eine Vorfraktionierung eingesetzt werden. Durch die Verwendung einer „multiplexed LC-MS“ (LC-MSE) Methode wurde fast die Hälfte aller zytosolischen Proteine von B. subtilis mit einer hohen durchschnittlichen Sequenzabdeckung von 40 % identifiziert. Die Hi3-Methode ermögliche zusätzlich die absolute Quantifizierung fast aller identifizierten Proteine, die über fast vier Größenordnungen nachgewiesen werden konnten. Die Zuverlässigkeit des Ansatzes wurde für sechs Proteine mit der gut etablierten AQUA-Technik bestätigt. Mit der Hi3-Methode wurden zum einen absolute Proteomsignaturen für unterschiedliche Nährstoffsituationen erstellt, was auch Einblicke in die Regulation der Expression von Aminosäure-Biosynthese und –abbau-Enzyme ermöglichte. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Konzentration von ribosomalen und weiteren Wachstumsraten-abhängig benötigten Proteinen sich bei niedrigen Wachstumsraten nicht unterscheidet und erst ab einer Wachstumsrate von 0,8 Std.-1 linear ansteigt. Die vergleichsweise hohe Standardabweichung der Hi3-Methode (~30 %) erschwert ihre Anwendung bei der Bestimmung von nicht gradzahligen Protein-Komplex-Stöchiometrien. Deswegen wurde zur Analyse des RNA-Polymerase-Komplexes von B. subtilis der AQUA-Ansatz gewählt, der sich durch eine sehr geringe Standardabweichung auszeichnet (< 10 %). Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, welches auf einer mTRAQ-Markierung der Referenzpeptide und des verdauten Komplexes beruhte. Es war so möglich die bekannte Stöchiometrie des Kernkomplexes RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 zu bestätigen und zusätzlich die zwei ω-Unterheiten und die σ-Faktoren σA und σB absolut zu bestimmen. Die Menge an σB im Komplex nahm nach Glukose-Hunger und Ethanol-Stress auf bis zu 5 % zu und es konnte gezeigt werden, dass sich die Menge einer ω-Unterheit (YloH) sich im gleichen Maße im Komplex ändert, wie die Menge an σA.
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.
Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium. Häufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zählt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hämolytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und Oberflächenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulären Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms nicht grundsätzlich ändert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verstärkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur für die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adhäsine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich während der exponentiellen Wachstumsphase für die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte für clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergänzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestätigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulärer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazelluläre Enzyme die Erschließung von Nährstoffquellen in extremen Habitaten begünstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die Überlebensfähigkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion näher zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchführung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch für die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgeführt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunächst zu einer Integrin-vermittelten Adhäsion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus führte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen führt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
Beeinflussung der Wundheilung von respiratorischen Epithelzellen in vitro durch Roxithromycin
(2023)
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des Makrolid-Antibiotikums Roxithromycin auf die frühe Phase der postoperativen Wundheilung am Zellkulturmodell untersucht werden. Gründe für den Einsatz des Medikamentes sind abseits der bekannten bakterios-tatischen Wirkung insbesondere die in der Langzeitanwendung beschriebenen immunmodulatorischen Effekte. Es sollte untersucht werden, ob diese bereits in der Akutsituation zu einem Benefit in der Wundheilung im HNO-Bereich führen, da Wundhei-lung hier sekundär verläuft und Wundheilungsstörungen durch Fibrosierungen und Re- Stenosen nicht selten zu einer operativen Korrektur zwingen.
Gewählt wurden S9-Zellen als Modell für respiratorisches Epithel, welche einer standardi-sierten Wundsetzung durch Stanzung unterzogen wurden. Mittels AlamarBlue-Assay wurden zytotoxische Medikamentenkonzentrationen herausgearbeitet und im Folgenden durch Konzentrationsfindungsversuche über 120 Stunden mit kombinierter Wundsetzung bestätigt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe beschleunigt Roxithromycin in Konzentrationen von 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml eher die Wundheilung, während Konzentrationen von 80 µg/ml und 160 µg/ml zu einer signifikanten (p ≤ 0.01 bzw. p ≤ 0.05) Hemmung der Wundheilung führen. Die Effekte waren jeweils über die ganze Beobachtungsdauer und im Ausmaß zunehmend nachweisbar. Roxithromycin in einer Konzentration von 160 μg/ml konnte die Zellproliferation 96 und 120 h nach Wundsetzung so stark hemmen, dass die residuale Wundfläche sogar anstieg.
In einem Validierungsansatz konnte zudem herausgearbeitet werden, dass die Wundsetzung konsequenterweise von nur einer/m Experimentierenden erfolgen sollte, um ein re-produzierbares Ergebnis zu erhalten, während sich kein Unterschied in der Auswertung der Wundflächen durch verschiedene Personen zeigte.
Zum Verständnis der molekularbiologischen Effekte des Medikamentes auf Epithelzellen wurden unter Berücksichtigung der in der Literatur beschriebenen maximalen Serumkonzentration bei systemischer Anwendung von Roxithromycin (7,28 ± 1,85 mg/l), fehlenden Hinweisen auf einen zytotoxischen Effekt sowie tendenziell beschleunigter Wundheilung nachfolgend 2D–DIGE-Experimente gekoppelt mit massenspektrometrischen Proteinidentifikationen für die Roxithromycinkonzentration von 10 µg/ml durchgeführt. Es ergaben sich Hinweise auf eine Förderung des Zellwachstums durch Beeinflussung des Polyaminmetabolismus über Induktion der Spermidinsynthase und darüber hinaus Spermidin-abhängige Modifikation des Translationsfaktors EIF5A. Des Weiteren wurde eine Nrf2-assoziierte Antwort auf oxidativen Streß bereits bei niedriger Roxithromycin- Konzentration von 10 µg/ml als protektiver Faktor ermittelt. Durch quantitative LC-MS/MS-Analysen wurde dieser Effekt ebenso für Konzentrationen von 20 und 40 µg/ml Roxithromycin bestätigt. Der weitläufig dokumentierte konzentrationsabhängige zytotoxische Effekt des Medikamentes bei höheren Konzentrationen konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Während apoptoseauslösende Proteine in der Konzentration von 10 µg/ml nicht nachgewiesen werden konnten, gelang in höheren Roxithromycin-Konzentrationen eine Darstellung von regulierten Proteinen des intrinsischen und extrinsischen Apoptoseweges, bis hin zur bereits mikroskopisch erfassbaren Zelldepletion bei Konzentrationen von 80 und 160 µg/ml. Insbesondere bei der Konzentration von 20 µg/ml fanden sich Hinweie, dass eine Regulation über den ERK1/2-Pathway stattfindet, welcher umfangreiche Funktionen wie Zytokinfreisetzung, Zellmigration, Zellproliferation und auch Zelltod moderiert.
Die Behandlung mit Roxithromycin führt in niedriger Konzentration (10 µg/ml) tendenziell zu einer beschleunigten Wundheilung ohne Auftreten zytotoxischer Effekte. Grundlage könnte die Aktivierung von Translationsfaktoren (EIF5A) und Protektion vor den Schäden durch oxidativen Streß sein. Damit stellt diese Therapie eine Option in der frühen postoperativen Situation im HNO-Bereich dar, welche allerdings weiterer Untersuchung z. B. durch Testung an Fibroblasten bedarf. Attraktiver erscheint das Outcome bei einer Medikamentenkonzentration von 20 µg/ml, da die epitheliale Wundheilung signifikant schneller abläuft und somit zu einem schnelleren Wundverschluß führt. Die molekularbiologischen Hinweise auf Induktion der Apoptose werden bei dieser Konzentration offenbar noch durch protektive Mechanismen über Beeinflussung der Zellmigration, Neutralisierung von Schäden durch oxidativen Streß und Eingriff in den ERK-Pathway aufgefangen, was bei höheren Roxithromycinkonzentrationen nicht mehr gelingt und in einer Zelldepletion mündet. Daher bietet sich für die Konzentration von 20 µg/ml insbesondere die topische Applikation als Salbenstrang oder Nasenspray an, um die positiven Effekte zu nutzen und die Limitation durch vorheriges Erreichen der maximalen Serumkonzentration zu umgehen. Empfehlenswert ist die Untersuchung des Medikamentes in weiteren Zell-reihen und in vivo da Wundheilung ein multimodaler Prozeß ist. Eine topische Applikation von ggf. höheren lokalen Konzentrationen scheint hier keinen zusätzlichen Nutzen darzustellen.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden die antimikrobiellen Effekte der Phytopharmaka
BNO 101 und Myrtol stand. auf Staphylococcus aureus direkt miteinander verglichen. Für
BNO 101 umfassten die Untersuchungen Wachstumsexperimente mit Messungen der
Optischen Dichte und Experimente zur CFU-Bestimmung. In keinem dieser Experimente
konnten antimikrobielle Effekte auf S. aureus unter Behandlung gezeigt werden. Für Myrtol
stand. wurden Wachstumsexperimente analog durchgeführt. Hierbei konnte ein deutlicher
bakteriostatischer Effekt auf S. aureus und verglichen mit BNO 101 eine höhere Wirksamkeit
nachgewiesen werden.
Unter der Gesamtkonzentration von 0,25% Myrtol stand. liegen die Überlebensraten der
Bakterien 4 h bis 24 h nach Behandlung bei unter 40% im Vergleich zu der Kontrolle. Um
Ursachen für die antibakteriellen Effekte zu finden, wurden die Zellen mittels
Rasterelektronenmikroskopie morphologisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung
untersucht und eine Myrtol stand.-spezifische Volumenzunahme von bis zu 69% ermittelt.
Zusätzlich wurden Proteinproben der Zellen mittels 2D-DIGE aufgetrennt. Hierbei wurden
separat intrazellulär 1223 sowie extrazellulär 610 Proteinspots detektiert und miteinander
verglichen. Durch Behandlung mit 0,25% Myrtol stand. wurde das S. aureus Proteom über den
gesamten Messzeitraum von 24 h nach Behandlung massiv verändert. Mittels
anschließendem tryptischen Verdau und Massenspektrometrie (LC-MS) signifikant
veränderter Spots, konnte eine Vielzahl von Proteinen identifiziert und davon 54 verschiedene
Proteine einzelnen Stoffwechselwegen durch Datenbankabgleich und Literaturrecherche
zugeordnet werden. Bemerkenswert ist die deutliche Reduktion der Virulenzfaktoren des
Bakteriums durch Myrtol stand. Behandlung. Unter anderem konnten für Superantigen Enterotoxine, Leukotoxine, Hämolysine und Serine-Proteasen und den Genregulator Agr
deutlich verminderte Proteinmengen nach Behandlung gemessen werden. Die veränderten
Proteinmengen sind hierbei sowohl auf eine Umverteilung der Proteine zwischen den
Zellkompartimenten, als auch auf deutliche Regulation in der Proteinbiosynthese
zurückzuführen. Neben den Virulenzfaktoren ließen sich bspw. auch zahlreiche Enzyme der
Zellwand- und Zellmembransynthese sowie des Energiemetabolismus mit deutlich
veränderten Proteinmengen nachweisen, die für das Überleben der Bakterienzellen kritisch
sind. Mittels Direktverdau und nachfolgender LC-MS der Proteinproben wurden die
Ergebnisse bestätigt und weitere regulierte Proteine identifiziert.
Im Rahmen dieser Dissertation konnten antimikrobielle Effekte von Myrtol stand. auf
Staphylococcus aureus nachgewiesen und deren Ursachen aufgezeigt werden. Die
ausführlichen Proteinanalysen nach Behandlung mit Myrtol stand. lassen auf eine starke
verminderte Virulenz des Bakteriums schließen. Angesichts des Bedarfs an zielgerichteten
Therapieverfahren entsprechend der Phänotypen von CRS und ABRS, bietet die systemische
Gabe von Myrtol stand. hier eine kausale Therapieoption. Die zusätzliche Möglichkeit einer
topischen Anwendungsform kann angesichts der hier gezeigten Wirkungen eine
vielversprechende Behandlungsmaßnahme sein und sollte Ziel klinischer Untersuchungen
werden