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In der vorliegenden Arbeit wurde das Proteom von Seminomen mit dem von nicht-neoplastischem Hodengewebe von 6 Patienten vergleichend analysiert. Ziel der Arbeit war die Ermittlung von Expressionsunterschieden zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe auf Protein-Ebene. Zur Auftrennung der Proteine und Darstellung des Proteoms wurde die zweidimensionale Gelelektrophorese angewandt. Diese erlaubt eine Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht und ihrem isoelektrischen Punkt. Mit den hier verwendeten Gelen wurden Proteine im Molekulargewichtsbereich von ca. 10-200 kDa und einem isoelektrischen Punkt zwischen 4 und 7 erfasst. Die Darstellung der Proteine erfolgte durch Silber- und FluoreszenzfÀrbung. Die Bearbeitung und Auswertung der Proteinmuster erfolgte mit der Software Delta 2D (Decodon). Bei 5 von 6 Patienten fand sich ein Protein, welches im Seminomgewebe geringer exprimiert war als im gesunden Hodengewebe. Das Protein wurde massenspektroskopisch mittels MALDI-MS analysiert und als GSTM3, Glutathion-S-Transferase der Mu-Klasse, identifiziert. Glutathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Enzyme des Phase-Il-Stoffwechsels und spielen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Karzinogenen und Xenobiotika. Eine verminderte Expression von GST-Isoformen der Mu-Klasse in Seminomen wurde in der Literatur bereits beschrieben, jedoch ohne Angabe der GST-Isoformen. Diese Arbeit berichtet erstmalig von einer verminderten Expression der GSTM3-Isoform in Seminomgeweben. Auch die Menge an GSTM3-mRNA korrelierte mit den Proteindaten. Durch semiquantitative RT- PCR konnte das Ergebnis somit auf Transkriptionsebene bestÀtigt werden.
Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende VerlĂ€ufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. FĂŒr die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunĂ€chst lokalen Infektionsherd zu etablieren. WachstumsphasenabhĂ€ngig werden z.B. AdhĂ€sine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunĂ€chst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulĂ€ren Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium fĂŒr die Kokultur der Wirts âwie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulĂ€ren Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschlieĂende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhĂ€ngigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG â Streifen 24cm fĂŒr pI 4-7; 11cm u. 18cm fĂŒr pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer GröĂe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen FĂ€rbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo FluoreszenzfĂ€rbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten fĂŒr den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden fĂŒr das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte VerĂ€nderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur fĂŒr Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgefĂŒhrt. Der Datenvergleich der extrazellulĂ€ren Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulĂ€ren Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten VerĂ€nderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationĂ€r und spĂ€t stationĂ€r) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. WĂ€hrend der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationĂ€ren Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
Teil 1: Pathogeninaktivierung: Es wurde ein neues Verfahren zur Pathogeninaktivierung mittels Proteomanalysen untersucht. Bei diesem wurden Proben von Kaninchenthrombozyten mit Riboflavin bzw. Psoralen inkubiert und mit UV-A Licht bestrahlt. Dadurch werden die in Pathogenen enthaltenen NukleinsĂ€uren unbrauchbar gemacht, wohingegen gezeigt werden konnte, dass die PlĂ€ttchen kaum in ihrem Proteom und damit vermutlich in ihrer FunktionalitĂ€t beeinflusst wurden. Teil 2: Thrombozytenalterung: Durch Apherese wurde an drei auf einander folgenden Tagen die in einem humanen Spender zirkulierenden PlĂ€ttchen auf 80000/”l depletiert und anschlieĂend PlĂ€ttchen aus dem Vollblut mittels differentieller Zentrifugation gewonnen. WĂ€hrend der einsetzenden Nachbildung von Thrombozyten wurde das Proteom der Zellen mit den Ausgangswerten verglichen und so versucht, Alterungsmarker im Thrombozytenproteom zu finden.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende Îł Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus fĂŒr kĂ€lteangepasste Bakterien und Enzyme. ZusĂ€tzlich ist es ein alternativer Expressionswirt fĂŒr die lösliche Ăberproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von KĂ€lteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kĂ€lteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der VerĂ€nderung zellulĂ€rer ZustĂ€nde und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschĂ€ftigt haben. DarĂŒber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulĂ€rer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgefĂŒhrt. ZusĂ€tzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 wĂ€hrend des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, AminosĂ€ure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhĂ€ngigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme fĂŒr PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten fĂŒr PhTAC125 Ă€hnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kĂ€lteangepassten Bakterien wĂ€hrend des Wachstums bei geringen Temperaturen (†20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstĂ€rkten ROS-Bildung essentiell. Die VerfĂŒgbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenĂŒber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulĂ€ren Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenĂŒbergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter NĂ€hrstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der spĂ€ten exponentiellen und stationĂ€ren Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der spĂ€ten exponentiellen und stationĂ€ren Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten AminosĂ€uren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stĂ€rker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Ăberleben unter NĂ€hrstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgefĂŒhrt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe AminosĂ€urequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und ĂŒber konstante oder exponentielle SubstratzufĂŒtterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein âdefinierteresâ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat fĂŒr die FĂŒtterungslösung eingesetzt. Mit einer anfĂ€nglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten FĂŒtterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenĂŒber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Staphylococcus aureus ist ein ubiquitĂ€r verbreitetes Bakterium. HĂ€ufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zĂ€hlt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von PathogenitĂ€ts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hĂ€molytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und OberflĂ€chenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurĂŒckzufĂŒhren. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulĂ€ren Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulĂ€ren Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-HĂ€molysin, gamma-HĂ€molysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulĂ€ren Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulĂ€ren Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulĂ€ren Proteoms nicht grundsĂ€tzlich Ă€ndert. Jedoch konnte durch eine âlabelfreieâ Quantifizierung eine verstĂ€rkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-HĂ€molysin, gamma-HĂ€molysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur fĂŒr die delta sigB Mutante identifiziert werden. AdhĂ€sine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich wĂ€hrend der exponentiellen Wachstumsphase fĂŒr die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte fĂŒr clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergĂ€nzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulĂ€ren Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestĂ€tigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulĂ€rer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulĂ€ren Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazellulĂ€re Enzyme die ErschlieĂung von NĂ€hrstoffquellen in extremen Habitaten begĂŒnstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die ĂberlebensfĂ€higkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion nĂ€her zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die DurchfĂŒhrung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch fĂŒr die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgefĂŒhrt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunĂ€chst zu einer Integrin-vermittelten AdhĂ€sion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus fĂŒhrte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen fĂŒhrt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
Macrophages are cells of immune system and distributed throughout the body. They provide the first line of defense against microbial pathogen infections. Using bone marrow macrophages (BMMs) which derived from mice of strain BALB/c and strain C57BL/6, this study aimed to identify the changes in proteome of the macrophages due to IFN gamma stimulation and S. aureus infection. Two quantitative proteomic techniques, two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were applied in this study. The analysis results indicated that many proteins which play important roles in immunological functions of macrophages were changed due to IFN gamma stimulation and S. aureus infection. This study also identified the differences in proteome of macrophages derived from mice of strain BALB/c in comparing to macrophages of strain C57BL/6.
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der MilchdrĂŒse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die WirtsspezifitĂ€t von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfĂŒgbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der StĂ€mme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst StĂ€mme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. fĂŒr HĂ€molysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen StĂ€mmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. ZusĂ€tzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulĂ€ren Proteommuster der einzelnen StĂ€mme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte âCore-Exoproteomâ. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der KulturĂŒberstĂ€nde auf humane und bovine PBMC (mononukleĂ€re Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen PathogenitĂ€tsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stĂ€rker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der AktivitĂ€t dieser Superantigene hindeutet. SchlieĂlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die hĂ€ufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die VariabilitĂ€t in der ExpressionshĂ€ufigkeit dieser Proteine könnte mit der WirtsspezifitĂ€t von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das VerstĂ€ndnis ĂŒber seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. FĂŒr jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschlieĂender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine fĂŒr einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstĂ€rkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von NukleinsĂ€uren oder DNA beteiligt sind, was bestĂ€tigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter SchĂ€digung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. AminosĂ€uresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress fĂŒhrte wie erwartet zur verstĂ€rkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative DisulfidbrĂŒcken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schlieĂen. Die Effekte von NO Ă€hnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere AktivitĂ€t fermentativer Stoffwechselwege bestĂ€tigt werden. Die FĂ€higkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell fĂŒr seine höhere Resistenz gegenĂŒber NO sein.
In the post genomic era, novel âOmicsâ technologies like genomics and proteomics can be used in powerful screening approaches to provide unbiased lists of candidate genes and proteins and thus facilitate a comprehensive analysis of complex diseases such as cancer, which would not have been possible applying traditional genetic and biochemical approaches alone. During my PhD tenure I applied functional genomics screening technologies including proteomics in combination with traditional biochemical and cell biology approaches in two disease oriented projects: 1. Characterization of the role of BCL11b in Human T cell lymphomas (and) 2. Elucidation of the mechanism of pathophysiology of Johanson Blizzard Syndrome using UBR1 knockout mice and JBS patientsâ lymphoblasts cell lines.
1.Characterization of the role of BCL11b in Human T cell lymphomas
: The Bcl11b protein belongs to the C2H2-family of Krueppel-like zinc finger proteins and thus is a member of the largest family of transcription factors in eukaryotes. It was shown to be important for a variety of functions such as T cell differentiation, normal development of central nervous system and DNA damage response. Malignant T cells undergo apoptotic cell death upon BCL11B down-regulation. However, the detailed mechanism of this cell death is not fully understood. Two dimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE), mass spectrometry and cell biological experiments were employed to investigate the functional impact of knock down of BCL11B in malignant T cell lines such as Jurkat and huT78. To further confirm the findings of these experiments, changes in protein patterns were also recorded after down-regulation of BCL11B expression in Jurkat cells over expressing BcL-xL and in Jurkat cells over expressing BCL11B. These experiments provide evidence for the involvement of the mitochondrial apoptotic pathway and increased levels of cleavage fragments of known caspase targets such as myosin, spectrin and vimentin were observed after BCL11B knockdown. The findings suggest an involvement of ERM proteins, which were up-regulated and phosphorylated upon BCL11B down-regulation. Besides ERM proteins, PDCD5, a key regulator of apoptosis, was also found at increased levels upon down regulation of BCL11B. Moreover, the levels of several proteins implicated in cell cycle entry, including DUT-N, UCK2, MAT1, CDK6, MCM4 and MCM6 were elevated, which might lead to uncontrolled cell cycle progression, uracil misincorporation and cell death. Interestingly, an inverse regulation pattern, i.e. decreased levels of ERM proteins, DUT-N, UCK2 and PDCD5 was seen upon over expression of BCL11B in Jurkat cells. In summary, proteome analyses revealed several previously unidentified mechanisms which could significantly contribute to the cell death following BCL11B knockdown.
2.Elucidation of the mechanism of pathophysiology of Johanson Blizzard Syndrome using UBR1 knockout mice and JBS patientsâ lymphoblasts cell lines
: Johanson-Blizzard syndrome (JBS; OMIM 243,800), which was first described in 1971, is a rare autosomal recessively inherited genetic disorder with a unique combination of congenital abnormalities. The most constant clinical feature of JBS is the loss of exocrine pancreatic function due to progressive destruction of pancreatic acini. Genome wide linkage analysis identified the disease associated locus in the 15q14-q21 chromosome region and high-throughput sequencing of this region revealed several truncated and some missense mutations in the UBR1 gene. UBR1 gene contains 47 exons and spans over 161 kilobases. The UBR1 protein belongs to the E3 ubiquitin ligase family and is an important component of the N-end rule pathway of ubiquitous protein degradation. It was hypothesized that stabilization of direct and unique substrates of UBR1 could be the main cause of the JBS pathophysiology. So far sequencing of the UBR1 gene is the only available diagnostic procedure. However, sequencing might not always allow precise prediction of residual UBR1 activity. Hence, this study was started to develop a protein based diagnostic assay for the detection of subclinical cases of JBS and to identify signalling pathways contributing to the pathophysiology of this complex disorder using a murine UBR1 knockout model. 2D-DIGE proteome analysis was carried out for a comparative evaluation of lymphoblast samples of 14 patients and 11 controls. Principal component Analysis (PCA) clearly discriminated JBS patients from controls. However, 4 JBS patients differed from the rest and resembled controls more closely. Western-blot analysis revealed residual UBR1 levels in these patients, which were linked to a milder phenotype. Hierarchical clustering of the three groups (controls, patients with residual UBR1 levels and patients without UBR1) showed group-specific characteristic differences in the abundance of differentially regulated proteins. Quantification of a panel of five selected protein spots encompassing Interferon-induced GTP binding protein, HLA class II histocompatibility antigen, Annexin A6, FK506-binding protein 4 and GRP78 permitted discrimination of controls and JBS patients with mild phenotypes. Of note, the molecular chaperones GRP78 (BiP) and FK506BP were consistently altered in level in JBS patients and probably constitute UBR1 dependent substrates. This suggested JBS as an ER-stress related disease also indicating a possible way of therapeutic intervention. Comparative proteome analysis of UBR1 knockout and wild type animals after caerulein treatment revealed a significant accumulation of pancreatic proteases such as chymotrypsin B, anionic trypsin and pancreatic elastase in animals lacking UBR1. Furthermore, an up-regulation of ER-stress proteins and inflammation related proteins was observed. Phenotypic characterisation revealed in UBR1 knockout animals significantly increased lipase levels, a significantly increased histological score and significantly increased elastase activity 8h after the onset of pancreatitis. In isolated pancreatic acini of UBR1 knockout animals we found a significant increase in intracellular elastase activation upon supramaximal CCK stimulation, which was associated with a significant rise in the rate of necrosis explaining the more severe phenotype in the UBR1 knock-out animals. A TUNEL assay showed that there was more apoptosis in wild type compared to UBR1 knockout mice. Another set of experiments was designed to identify physiologically important substrates of UBR1. Inhibition of such substrates might then in turn allow reversion or prevention of the severe form of pancreatitis in UBR1 knockout mice. However, using the trypsin specific and reversible inhibitor S-124 it was shown that impaired trypsin degradation and thereby prolonged activation of this protease did not critically influence the phenotype. Calcium analysis after physiological stimulation revealed an increase of pathological Ca2+ signalling events, i.e. significant decrease of spike number and significant increase of spike duration. Of the candidates potentially influencing Ca2+ signalling RGS4 turned out to be of particular importance. Pre-incubation of pancreatic acini of UBR1 knockout animals with a specific RGS4 inhibitor (CCG-4986, 10 ”M) normalized Ca2+ patterns, did not affect trypsin activity itself but prevented Ca2+-triggered premature trypsin activation and thus acinar disintegration. In summary, using lymphoblasts samples of JBS patients we were able to deduce a protein panel which could be developed as a possible diagnostic tool for confirmation of JBS syndrome. Furthermore, using UBR1 knockout mice in an experimental model we were able to elucidate the vital function of UBR1 and its direct substrate RGS4 in the defense against pathologic pancreatic damage thereby manifesting JBS as an inflammatory disorder due to an inadequate UBR1 mediated defense.
Zur AufklĂ€rung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszkyâschen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgefĂŒhrt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum gröĂten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die KomplexitĂ€t des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine AffinitĂ€tsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren lieĂ. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe TrennschĂ€rfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der AffinitĂ€ten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erhöhung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bezĂŒglich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellulĂ€ren mRNA fĂŒhrt, als ĂŒberraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellulĂ€ren-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes NukleĂ€res Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den stĂ€rker negativ geladenen Varianten beobachtet, die möglicherweise auf Phosphorylierungen zurĂŒckzufĂŒhren sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgefĂŒhrt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten VerĂ€nderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen VorgĂ€ngen sein dĂŒrften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang verĂ€ndert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ÎUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anfĂ€lligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der ProbenkomplexitĂ€t. Ein Vergleich zur AffinitĂ€tsfestphasenextraktion zeigte, dass ein GroĂteil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie SpleiĂfaktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten VerĂ€nderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besaĂen pUL29 und pUL39 eine erhöhte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zusĂ€tzlich eine GröĂenvariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gestĂŒtztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. Itâs multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the hostâs immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor ÏB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor ÏB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and ÏB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on ÏB. A potential ÏB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, TĂŒbingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, TĂŒbingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
