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(1) The serine protease inhibitor Kazal type 1 (SPINK1) inhibits trypsin activity in zymogen granules of pancreatic acinar cells. Several mutations in the SPINK1 gene are associated with acute recurrent pancreatitis (ARP) and chronic pancreatitis (CP). The most common variant is SPINK1 p.N34S. Although this mutation was identified two decades ago, the mechanism of action has remained elusive. (2) SPINK1 and human cationic trypsin (TRY1) were expressed in E. coli, and inhibitory activities were determined. Crystals of SPINK1–TRY1 complexes were grown by using the hanging-drop method, and phases were solved by molecular replacement. (3) Both SPINK1 variants show similar inhibitory behavior toward TRY1. The crystal structures are almost identical, with minor differences in the mutated loop. Both complexes show an unexpected rotamer conformation of the His63 residue in TRY1, which is a member of the catalytic triad. (4) The SPINK1 p.N34S mutation does not affect the inhibitory behavior or the overall structure of the protein. Therefore, the pathophysiological mechanism of action of the p.N34S variant cannot be explained mechanistically or structurally at the protein level. The observed histidine conformation is part of a mechanism for SPINK1 that can explain the exceptional proteolytic stability of this inhibitor.
Die Rolle von Sequenzvarianten im Cathepsin L als Risikofaktoren der chronischen Pankreatitis
(2016)
Die chronische Pankreatitis ist meist eine wiederkehrende Entzündung der Bauchspeicheldrüse mit intrapankreatischer Aktivierung der Verdauungsenzyme. Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (PSTI = SPINK1) finden sich häufig bei Patienten mit chronischer Pankreatitis. Die häufigste SPINK1 Mutation p.N34S ist aber auch bei 1-2 % der gesunden Normalbevölkerung nachweisbar. Experimentelle Daten belegen, dass das p.N34S mutierte Protein durch CTSL schneller degradiert wird. In dieser Arbeit wird untersucht, ob Mutationen im CTSL Gen das Risiko von p.N34S+ Individuen erhöhen, an einer Entzündung der Bauchspeicheldrüse zu erkranken. Hierfür werden mittels TaqMan-Analyse die Probanden der SHIP-Studie (SHIP-0 n=4308, im Weiteren Kontrollen) und Individuen mit chronischer ideopathischer Pankreatitis (n=2299, im Weiteren Patienten) für N34S-Mutation in SPINK1 genotypisiert. Hiernach wird bei den p.N34S+ Individuen das CTSL mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung untersucht. Wir finden eine nichtsynonyme Mutation (c.5A>C, p.N2T), eine Mutation mit Verschiebung des Leserasters (c.98delA, p.K33fs) und einen SNP c.-461C>A (rs3118869), für den eine Modifikation der Expression in anderem Zusammenhang publiziert ist. Die p.N2T Mutation wird bei einem Patienten und zwei Kontrollen nachgewiesen, die Verschiebung des Leserasters nur bei einem Patienten. Der SNP kann bei 42 Patienten und 46 Kontrollen nachgewiesen werden. Für keine der gefundenen Varianten zeigt sich ein signifikanter Unterschied in der Verteilung. Auch in der Haplotypenanalyse kann kein signifikanter Verteilungsunterschied gezeigt werden. Ein Einfluss von CTSL Mutationen auf das Risiko an einer Pankreatitis zu erkranken, erscheint für Träger der p.N34S Mutation im SPINK1 Gen möglich, kann an dem untersuchten Kollektiv aber nicht bewiesen werden.