Refine
Year of publication
- 2021 (5) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (5)
Has Fulltext
- yes (5)
Is part of the Bibliography
- no (5)
Keywords
- Aditus orbitae (1)
- Ausrichtung (1)
- DVT (1)
- Differenzierung (1)
- Digitale Volumentomographie (1)
- Glomerulus (1)
- Homo sapiens (1)
- Leda-1 (1)
- Menschen (1)
- Neuroanatomie (1)
- Niere (1)
- Pianp (1)
- Pianp-1 (1)
- Podozyt (1)
- Symmetrie (1)
- Tiermodell (1)
- Tupaia belangeri (1)
- Zebrabärbling (1)
- disease model (1)
- focal segmental glomerulosclerosis (1)
- podocytes (1)
- zebrafish (1)
Institute
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (5) (remove)
80% of chronic kidney diseases are caused by the loss and the damage of a differentiated and postmitotic cell type, the podocytes. The size-selectivity of the blood filtration barrier is highly dependent on the complex interdigitation of the podocyte foot processes as well as of the slit membrane which is spanned in between. Changes of this specific morphology as well as a detachment of podocytes lead to the clinical hallmark of a nephrotic syndrome e.g. proteinuria and oedema formation.
Since specific drugs or therapies are usually not available, patients are often dependent on dialysis and transplantation. Therefore, intensive studies are necessary to understand the pathogenesis of glomerulopathies as well as to identify specific drugs. In the past, it was already demonstrated that the zebrafish is an ideal model to study kidney function and to screen for drugs, since the larvae quickly develop a simple glomerulus that is comparable to the glomeruli of mice, rat and human.
In the present work, a zebrafish model was established to study a specific glomerulopathy named focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). FSGS is mainly characterized by histology of the glomeruli which shows segmental scar formation and matrix deposition due to an activation of parietal epithelial cells (PEC) lining the Bowman’s capsule. For this purpose, we used the nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ) system, in which a cytotoxic agent is exclusively generated in podocytes by the enzyme NTR resulting in apoptosis of cells. Firstly, the parameters for development of an FSGS-like disease were evaluated and the glomerular response to podocyte depletion was examined during three days after the induction of podocyte damage. Using classic histological techniques, immunofluorescence staining and transmission electron microscopy, it was possible to demonstrate that zebrafish larvae phenocopy human FSGS in important characteristics after partial podocyte depletion. Secondly, by intravascular injection of fluorescence-labeled high molecular weight dextran, we found that the filtration barrier became leaky. Moreover, we identified a severe podocyte foot process effacement, formation of subpodocyte space pseudocysts and loss of the slit membrane protein podocin. Morphometrical, histological and ultrastructural analysis revealed an enlargement of the glomerulus, proliferation of cuboidal PECs and intraglomerular deposition of extracellular matrix components, all typical hallmarks of FSGS. Further, we observed adhesions between the parietal and the visceral glomerular cell layer forming sclerotic lesions. However, it remains still unclear whether an inflammatory response is involved in the development of sclerotic lesions. Our microscopic analysis provided some evidence for immigration of immunocompetent cells like neutrophils, presumably due to induction of apoptosis in our model.
Taken together, in the present work a zebrafish model was established with characteristics of mammals FSGS which will be useful for pathomechanism studies as well as for drug screening.
Zusammenfassung
In der vorliegenden Studie wurde die Morphologie des N. opticus von Tupaia belangeri untersucht. Grundlage dieser Untersuchung waren die MRT-Datensätze von 20 adulten Köpfen von Tupaia belangeri beiderlei Geschlechts. Die MRT Schichtaufnahmen erfolgten mit einem 7 Tesla ClinScan Kernspintomographen der Firma Bruker. Ausgehend von diesen MRT-Datensätzen wurden Volumenmessungen des N. opticus, lineare Streckenmessungen des N. opticus und der A. centralis retinae sowie Flächenmessungen der Retina vorgenommen.
Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen, dass mit Hilfe der magnetresonanztomographischer Bilddiagnostik Messungen des N. opticus, der A. centralis retinae und der Fläche der Retina bei Tupaia belangeri vorgenommen werden können. Der Vorteil bei der Magnetresonanztomographie besteht in der detailreichen Qualität der Schichtaufnahmen mit exzellentem Weichteilkontrast.
Zwischen den beiden Geschlechtern von Tupaia belangeri besteht bezüglich des Volumens des N. opticus kein signifikanter Geschlechtsdimorphismus. Mit steigendem Alter wird bei beiden Geschlechtern eine Zunahme des Volumens des N. opticus deutlich. Die Länge des N. opticus vergrößert sich mit steigendem Alter der Tiere bei beiden Geschlechtern ohne erkennbaren Geschlechtsdimorphismus. Beim Durchmesser des N. opticus zeigten sich ebenfalls keine signifikaten Unterschiede bezogen auf das Geschlecht und auf das Alter der Tiere.
Die Längenmessungen des Durchmessers der A. centralis retinae von Tupaia belangeri zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Geschlecht und dem Alter der Tiere. Bei den Flächenmessungen der Retina wurden keine signifikaten Zusammenhänge zwischen dem Geschlecht der Tiere deutlich. Eine Flächenabnahme der Retina wurde hingegen mit steigendem Alter der Tiere erkennbar.
Um mögliche Merkmalszusammenhänge zwischen dem Volumen, der Länge und dem Durchmesser des N. opticus sowie dem Durchmesser der A. centralis retinae und der Fläche der Retina darzustellen, wurde eine Korrelations- und Regressionsanalyse durchgeführt. Die Korrelationsanalysen zeigten signifikante Zusammenhänge zwischen dem Volumen des N. opticus und der Fläche der Retina und dem Volumen des N. opticus und dem Alter der Tiere. Außerdem konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Volumen des N. opticus und seiner Länge festgestellt werden. Signifikante Korrelationen zwischen der A. centralis retinae und dem Volumen des N. opticus, zwischen der A centralis retinae und dem Durchmesser des N. opticus und zwischen der A. centralis retinae und der Fläche der Retina konnten nicht festgestellt werden.
Die MRT-Schichtaufnahmen von Tupaia belangeri mit dem 7-Tesla-Kleintier-MRT erlauben eine ausgezeichnete bilddiagnostische Befundung von anatomischen Strukturen innerhalb der Orbita und deren Topographie zueinander. Durch die hohe Auflösung der Bilder können die zu untersuchenden Regionen exakt analysiert und mit klinischen Daten in Bezug gesetzt werden. Mit Hilfe der Magnetresonanztomographie kann der zu vermessende anatomische Bereich abgegrenzt und in ein 3D-Rekonstruktionsmodell umgewandelt werden. Die vorliegende Studie liefert erstmalig detaillierte Größenangaben zum Volumen, der Länge und dem Durchmesser des N. opticus bei Tupaia belangeri. Die hier durchgeführten anatomischen Untersuchungen des N. opticus der Ordnung Scandentia können einen wesentlichen Beitrag zum besseren Verständnis der Morphologie der Kopfregion von Primaten darstellen.
Etwa jeder zehnte Deutsche leidet an einer chronischen Nierenerkrankung (CKD), deren Entstehung zu etwa zwei Drittel auf eine Schädigung der Podozyten zurückgeführt werden kann. Die Funktion der Podozyten für die Aufrechterhaltung der selektiven glomerulären Filtration ist eng an ihre einzigartigen Morphologie interdigitierender Fußfortsätze gebunden. Deren Zwischenräume werden von einer Schlitzmembran überbrückt, die aus spezifischen Proteinen wie Nephrin besteht. Im Falle einer CKD kommt es jedoch zu einer Dedifferenzierung der Podozyten, welche einen Verlust ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur und damit eine Proteinurie nach sich zieht. Da dieser Prozess durch die derzeit zur Verfügung stehenden Pharmaka wie Glukokortikoide oder Calcineurin Inhibitoren nur unzureichend therapiert werden kann, ist eine Dialysepflichtigkeit und/oder Nierentransplantation für die meisten Patienten unausweichlich.
Deswegen wurde im Rahmen dieser Arbeit der GlomAssay entwickelt und für das Screening podozytenspezifischer Wirkstoffe genutzt. Dazu wurden die Glomeruli eines transgenen Nephrin::CFP Mausstammes isoliert, welcher unter der Kontrolle des Nephrin Promoters den Fluoreszenzreporter CFP exprimiert. Anschließend wurden die Glomeruli kultiviert und der durch die zeitabhängige Dedifferenzierung der Podozyten bedingte Nephrin Abfall anhand der CFP Fluoreszenzintensität in situ quantifiziert.
Beim Vergleich verschiedener Isolationsmethoden erwies sich die Glomeruli Isolation mit magnetischen Dynabeads als geeignetstes Verfahren. Die Unversehrtheit der Podozyten wurde mittels Laser Scanning , Raster und Transmissionselektronenmikroskopie sowie durch Immunfluoreszenzfärbungen der Podozytenmarker Nephrin, Podocin und WT-1 verifiziert. Die spontane Dedifferenzierung der Podozyten in Zellkultur führte zu einem graduellen Abfall der CFP Fluoreszenz über 9 Tage. Dass die sinkende CFP Fluoreszenzintensität dabei unmittelbare Rückschlüsse auf eine verringerte Nephrin Expression zulässt, wurde mittels RT PCR, Western Blot , Transkriptom und Proteomanalyse belegt. Ein Effacement der Podozyten-Fußfortsätze und ein Verlust der Schlitzmembranen wurde anhand transmissions- und rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen nachgewiesen.
Um die Mechanismen der Podozytendedifferenzierung genauer zu verstehen, wurde das glomeruläre Transkriptom und Proteom nach 3 , 6 und 9 tägiger Kultivierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass außer den Schlitzmembranproteinen auch bspw. die Komponenten des Zytoskeletts, der Zell Matrix Kontakte oder der glomerulären Basalmembran von Bedeutung sind für die Podozytendedifferenzierung.
Die Validierung des GlomAssays erfolgte mit Hilfe verschiedener podozytenprotektiver und schädigender Substanzen. Die Podozyten Noxen Daunorubicin und Vinblastin bedingten dabei erwartungsgemäß einen Abfall der CFP Fluoreszenzintensität mit einer IC50 Konzentration von 1,55 µM bzw. 87,82 nM. Von den untersuchten podozytenprotektiven Pharmaka Dexamethason, all trans Retinsäure, Pioglitazon und 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 führte nur die Behandlung mit Letzterem zu einer Reduktion der Podozytendedifferenzierung. Die damit einhergehende, erhöhte Nephrin und CFP Expression wurde mittels RT PCR und Western Blot Analyse nachgewiesen.
Anschließend wurde der GlomAssay für das Screening neuer Substanzen verwendet. Dabei wurde zum einen das Glykoprotein Hämopexin untersucht, welches mit der Entstehung der Minimal Change-Glomerulonephritis in Zusammenhang gebracht wird. Es zeigte jedoch keinen Effekt auf die Podozytendedifferenzierung. Zum anderen wurde der Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) getestet, welcher als prognostischer Marker im Urin von CKD Patienten dient und für die Entwicklung und Integrität der glomerulären Filtrationsbarriere essentiell ist. Jedoch beeinflusste weder die Inkubation der Glomeruli mit BDNF noch mit dem BDNF bindenden TrkB-Fc Fusionsproteins die Differenzierung der Podozyten. Die Blockade des Tropomyosin Rezeptor Kinase B (TrkB) Rezeptors, welcher durch Interaktion mit BDNF aktiviert wird, durch den nichtkompetitiven Inhibitor ANA 12 bewirkte hingegen einen vorzeitigen Abfall der CFP Fluoreszenz mit einer IC50 Konzentration von 19,74 µM. Mit dem allosterischen TrkB Inhibitor Cyclotraxin B ließen sich diese Ergebnisse allerdings nicht bestätigen. Nichtsdestotrotz belegen die mit ANA 12 erzielten Resultate die Relevanz des BDNF für Podozytendifferenzierung.
Insgesamt gelang es mit dem GlomAssay ein neue in vitro Methode zu etablieren, um den Effekt pharmakologischer Substanzen auf die Podozytendifferenzierung schnell, nicht destruktiv und wiederholbar zu untersuchen. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, das Screening podozytenprotektiver Wirkstoffe bereits in der präklinischen Phase stärker zu forcieren und so zukünftig die Entwicklung neuer Therapieoptionen zur Behandlung von CKDs voranzutreiben.
Die äußere Öffnung der Orbita, der Aditus orbitae, stellt eine aus verschiedenen Knochenelementen zusammengesetzte Komponente des kraniofazialen Skelettes im Grenzbereich zwischen Mittel- und Obergesicht dar. Der Aditus orbitae ist dabei von großer Bedeutung für die Gesichtswahrnehmung, Gesichtserkennung und persönliche Identifikation. Trotz seiner bekannten morphologischen Variabiltät haben sich bisherige Studien überwiegend mit der Morphologie des Aditus orbitae als flache zweidimensionale Kurve befasst. Da der Aditus orbitae vielmehr eine dreidimensionale Struktur aufweist, bestand das Ziel dieser Studie darin, die dreidimensionalen Ausrichtung des menschlichen Aditus orbitae und dessen intra- und interindividuelle Symmetrie unter Berücksichtigung des Geschlechtsdimorphismus und der Schädelgröße zu analysieren.
Die Studie basiert auf der Untersuchung von insgesamt 60 DVT-Datensätzen erwachsener Probanden beiderlei Geschlechts, die im Rahmen des klinischen Alltags in der Klinik für Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie / Plastische Operationen der Universitätsmedizin Greifswald erstellt worden sind. Basierend auf Rohdatensätzen wurden mit Hilfe der NewTom 3G-Software (QR NNT Version 2.11 Professional ©) axiale Schnitte der DVT-Aufnahmen mit einer Schichtstärke von 0,5 mm erstellt. Zur Bestimmung der Größe und der Ausrichtung des Aditus orbitae wurden lineare Strecken- und Winkelmaße in mehreren definierten Sagittalebenen von temporal nach nasal sowie Horizontalebenen von kaudal nach kranial erhoben. Die statistische Auswertung der Daten hinsichtlich der Seiten- und Geschlechtsunterschiede erfolgte mittels t-Test. Darüber hinaus wurde eine Korrelations- und Regressionsanalyse unter Berücksichtigung verschiedener Schädelmaße durchgeführt und zur Beurteilung der Symmetrieverhältnisse der Asymmetrie-Index bestimmt.
Weder bei weiblichen noch bei männlichen Probanden zeigten sich signifikante Seitenunterschiede in Bezug auf die verschiedenen Breiten- und Höhenparameter. Für einen Großteil der in dieser Studie erhobenen Breiten- und Höhenparameter konnte jedoch ein signifikanter Geschlechtsdimorphismus zugunsten männlicher Probanden nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte herausgearbeitet werden, dass sowohl die größte Breite als auch Höhe des Aditus orbitae bei Männern und Frauen im mittleren Drittel des Aditus orbitae liegt. Allerdings lag die größte Breite bei weiblichen Probanden sowohl links als auch rechts in einer Ebene 5 mm weiter kaudal als bei männlichen Probanden. Grundsätzlich zeigte sich, dass der Aditus orbitae sowohl der Männer als auch der Frauen breiter als hoch ist.
Um die Ausrichtung der verschiedenen Orbitabreiten und -höhen besser verstehen zu können, wurden Winkelmessungen in Bezug auf die Frontalebene durchgeführt. Während die Winkelmessung der Orbitabreiten in den verschiedenen Horizontalebenen von kaudal nach kranial durchgeführt wurde, erfolgte die Winkelmessung in Bezug auf die Orbitahöhen in den verschiedenen Sagittalebenen von temporal nach nasal. Bei den Winkelmessungen ließen sich weder bei Männern noch bei Frauen signifikante Seitenunterschiede nachweisen. Die Messergebnisse in den verschiedenen Horizontalebenen zeigten, dass der nasale Orbitarand bei beiden Geschlechtern weiter ventral liegt als der temporale Orbitarand. Der temporale Orbitarand lag im unteren Bereich des Aditus orbitae weiter dorsal als der im oberen Bereich. Dort lag er stets weiter ventral. Im mittleren Drittel der Horizontalebenen zeigten sich deutliche Geschlechtsunterschiede. Hier befand sich der temporale Orbitarand bei Frauen stets weiter dorsal als bei Männern. In sagittaler Ausrichtung lag, mit Ausnahme der nasal gelegenen Ebene, der Orbitaoberrand bei beiden Geschlechtern in allen Ebenen weiter ventral als der Orbitaunterrand.
Die Korrelationsanalyse wies auf zahlreiche Zusammenhänge zwischen den in dieser Studie ermittelten Abstandsmessungen des Aditus orbitae und verschiedenen Schädelmaßen hin. Dabei konnten signifikante Korrelationen zwischen verschiedenen Orbitabreiten mit der Biorbitalbreite sowie der Schädelbasislänge aufgezeigt werden. Weitere Zusammenhänge bestanden zwischen einigen Orbitahöhen mit der Schädelbasislänge und der Obergesichtshöhe. Die Obergesichtshöhe korrelierte mit dem horizontalen medialen Orbitawinkel in zwei verschiedenen sagittalen Messebenen.
Die vorliegende Studie erlaubt eine Aussage über die dreidimensionale Ausrichtung und Symmetrie des Aditus orbitae des Menschen in Bezug auf die Raumebenen. Damit liefert sie Grundlagen für weitere vergleichende Studien an verschiedenen menschlichen Populationen, um den Einfluss epigenetischer Faktoren auf den Aditus orbitae besser zu verstehen. Dieser Untersuchungsansatz kann auch für das Studium des Aditus orbitae nicht-menschlichen Primaten von Interesse sein.
Leda-1 ist ein 2010 entdecktes Transmembranprotein, das im neuronalen Gewebe exprimiert
wird. Bis zum jetzigen Zeitpunkt identifizierte Interaktionspartner sind PILRα und GABABRezeptor-
Komplexe. 2016 wurde bei einem Kleinkind eine homozygote Defizienz des
entsprechenden Gens festgestellt. Der Junge wies Dysmorphien und eine allgemeine
Entwicklungsstörung auf. Ziel dieser Arbeit ist es, Auswirkungen der Defizienz von Leda-1
im Mäusegehirn unter neuroanatomischen Gesichtspunkten zu erfassen und zu bewerten.
Die Mäusegehirne wurden makroskopisch auf Gewicht und Volumen und mikroskopisch
anhand immunhistochemisch gefärbter Hirnschnitte untersucht. Die Färbung erfolgte mit
CNPase- und GFAP-Antikörpern sowie DAPI als Gegenfärbung. Die Schichtdicken
ausgewählter Bereiche des Neocortex’, des Hippocampus und verschiedener Fasertrakte
wurden vermessen und die Astrozytendichte der CA1-Region des Hippocampus wurde
bestimmt. Zur Untersuchung der adulten Neurogenese wurden als Marker Progenitorzellen
in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus gezählt. Anhand von In-situ-
Hybridisierungsbildern wurde das Vorkommen von Leda-1 im Mäusegehirn beschrieben.
Das Gewicht der KO-Gehirne wies keinen Unterschied zur Kontrollgruppe auf. Das
Volumen war leicht erhöht. Im Stratum moleculare und im Stratum granulare des Gyrus
dentatus wurden signifikant geringere Schichtdicken bei den KO-Tieren gemessen. Die
Astrozytendichte war im untersuchten Bereich bei KO-Tieren vermindert. Die adulte
Neurogenese wies keinen messbaren Unterschied auf. Die Auswertung der In-situ-
Hybridisierungsbilder zeigte eine weit verbreitete Expression von Leda-1 in Neuronen des
gesamten Gehirns. Besonders stark stellte sich die Expression in den Purkinjezellen des
Kleinhirns dar.
Die Defizienz von Leda-1 bewirkt verschiedene neuroanatomische Veränderungen. Die
verringerten Schichtdicken könnten auf eine alterierte Zellzusammensetzung
zurückzuführen sein. Der Einfluss von Leda-1 auf die Astrozyten kann als Wirkung auf das
Immunsystem interpretiert werden. Wahrscheinlich beeinflusst Leda-1 auch die adulte
Neurogenese. Die makro- und mikrostrukturellen Veränderungen des Mäusegehirns, die
Wirkung auf das Immunsystem und die adulte Neurogenese sowie eine mögliche
Verbindung zur Autismus-Spektrum-Störung bleiben Thema zukünftiger Forschung.