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The role of uptake and efflux transporters in the pharmacokinetics of ß1-receptor blocker talinolol
(2016)
Introduction: The β1-adrenergic receptor antagonist talinolol is a probe drug for P-glycoprotein (P-gp). It is absorbed erratically and incompletely from the gastrointestinal tract. However, its pharmacokinetics might also be influenced by further uptake and efflux transporters as concluded from interaction studies with naringin and verapamil in human. Additionally, the transcellular transport through the different tissues, including enterocytes, hepatocytes and kidney tubular cells, is not completely understood so far. Therefore, we aimed to measure the affinity of talinolol to drug transporting proteins (OCT1-3, PEPT1, OCTN2, ASBT, NTCP, MRP 1-3 and P-gp as well as OATP 1B1, 1B3, 2B1 and 1A2) and some of their genetic variants known to be of pharmacokinetic relevance (OATP1A2 *2 and*3 as well as OATP2B1 V201M, R312Q and S486F). In a further step, we retrospectively evaluated the impact of clinically relevant genetic polymorphisms of transporters on the pharmacokinetics of talinolol in healthy subjects. Materials and Methods: Time and concentration-dependent uptake assays with [3H]-talinolol were performed either in stable transfected HEK293 or MDCKII cells expressing OATP1A2 *1, *2 and *3, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 (and its genetic variants p.V201M, p.R312Q and p.S486F), NTCP, ASBT, PEPT1, OCTN2, OCT 1-3 and the respective vector control or in inside-out lipovesicles expressing the efflux transporters MRP1-3 and P-gp. Talinolol was quantified by liquid scintillation counting. The transport rates were then corrected by the transporter proteomics measured in the cellular membrane. Regarding the pharmacogenomic evaluation, it was carried out retrospectively in 39 healthy subjects who had participated in former pharmacokinetic studies with talinolol. This evaluation included a variety of transporter related genetic variants, known to be of a clinical meaning for their substrates. Results: Among the uptake transporters, talinolol was shown to be a substrate of OATP1B3 (Km= 153 ± 137 μmol/l; Vmax= 168 ± 30.3 μmol/mgxmin), OATP1B1 (Km= 301 ± 133 μmol/l; Vmax= 1135 ± 348 μmol/mgxmin), OATP2B1 (Km= 459 ± 260 μmol/l; Vmax= 4.32 ± 1.33 μmol/mgxmin), OATP1A2 (Km= 477 ± 158 μmol/l; Vmax= 0.61 ± 0.1 μmol/mgxmin) and NTCP (Km= 2560 ± 781 μmol/l; Vmax= 15944 ± 3741 μmol/mgxmin) but not a substrate of OCT1-3, OCTN2, PEPT1 or ASBT. When it comes to the efflux transporters, talinolol was transported by both P-gp (Km = 175 ± 206 mol/l; Vmax = 14 ± 10.8 nmol/mgxmin) and MRP3 (Km= 86.8 ± 62.8 μmol/l; Vmax= 133 ± 51.5 μmol/mgxmin) but not by MRP2. The pharmacogenomic analysis supported the in-vitro results, as it showed a significant decrease in talinolol absorption (AUC and Cmax) in subjects with the loss of function variant MRP3 211C>T and in those with a decreased P-gp function due to having less than 5 T-allels in the haplotype P-gp 1236-2677-3435-TTT. No significant changes were found associated with other transporters’ genetic variants. Conclusion: Our in-vitro results suggested the vectorial transport of talinolol through the enterocytes to consist mainly of apical OATP2B1 and P-gp and basolateral MRP3. Additionally in the hepatocytes, apical OATP1B1, OATP1B3 and NTCP seem to be involved as well. This vectorial transport was demonstrated in-vivo for the first time by our pharmacogenomic analysis, where talinolol absorption was significantly influenced by both P-gp and MRP3 genetic variants.
Azathioprin und 6-Mercaptopurin sind wichtige Arzneimittel in der Therapie onkologischer und inflammatorischer Erkrankungen. Die Wirksamkeit dieser Medikamente ist im Wesentlichen von der Bildung aktiver Metabolite, sog. Thioguaninnukleotide (TGN), abhängig. Diese sind die Summe von Thioguanosinmonophosphat (TGMP), Thioguanosindiphosphat (TGDP) und Thioguanosintriphosphat (TGTP). Im Jahr 2005 wurde erstmals berichtet, dass das Ansprechen der Thiopurintherapie bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen vom Verhältnis der Metabolite Thioguanosindiphosphat (TGDP) zu Thioguanosintriphosphat (TGTP) abhängt (Neurath et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):1007-14). Es wird angenommen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch das ubiquitär exprimierte Enzym Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) katalysiert wird. Die interindividuelle Variabilität der humanen NDPK-Expression bzw. -Funktion und deren Bedeutung für den Thiopurinmetabolismus sind bisher nicht systematisch untersucht worden. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, zuerst den Nachweis zu führen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch die NDPK katalysiert wird. Im Anschluss daran erfolgte eine systematische Analyse der interindividuellen Variabilität der relevanten NDPK-Isoformen, NDPK A und NDPK B, in verschiedenen humanen Geweben (Leber und Blutzellen). Dabei sollte auch der Einfluss von genetischen, nicht genetischen sowie epigenetischen Faktoren auf die Variabilität der NDPK-Expression untersucht werden. Dafür wurden zunächst die NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B rekombinant exprimiert und ein high performance liquid chromatographie (HPLC)-Assay zur Bestimmung der NDPK-Aktivität etabliert. Die Quantifizierung der NDPK-Expression auf mRNA- und Proteinebene wurde mit Hilfe von quantitativer real-time PCR bzw. durch indirekte Immunodetektion der Isoformen mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Um den Einfluss von genetischen und epigenetischen Faktoren auf die NDPK A bzw. B Expression zu untersuchen, wurden die Genbereiche von NDPK A (NME1) und NDPK B (NME2) sequenziert bzw. mittels Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B in E.coli rekombinant zu exprimieren. Mithilfe des validierten HPLC-Assays zur Bestimmung der NDPK-Aktivität konnte gezeigt werden, dass beide Isoformen die Konversion von TGDP zu TGTP katalysieren können. Durch Quantifizierung der mRNA- und Proteinexpression von NDPK A und NDPK B sowie der Bestimmung der NDPK-Aktivität wurde eine systematische Analyse zur Phänotyp- (Expression bzw. Funktion) Genotyp Korrelation dieser Enzyme in humaner Leber bzw. Blutzellen durchgeführt. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität für die NDPK A- und NDPK B-Expression auf RNA und Proteinebene für beide Gewebetypen. Bei der Sequenzierung der relevanten Genbereiche für die NDPK A (NME1) wurden zahlreiche genetische Varianten identifiziert, darunter zwei bisher noch nicht beschriebene Varianten im Promotorbereich. Für die NDPK B (NME2) konnte nur eine einzige genetische Variante detektiert werden. Mit Hilfe eines neu etablierten 16-plex MALDI-TOF MS Assays wurden genomische DNA-Proben der humanen Leberbank bzw. DNA aus Blutzellen auf diese gefundenen Varianten genotypisiert. Für zwei Promotorvarianten von NME1 konnte ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A-Expression gezeigt werden, diese wurden mittels electromobility shift assays (EMSA) auf Verlust der DNA-Bindungskapazität von Kernproteinen untersucht. Darüber hinaus wurde bei der Analyse verschiedener nicht genetischer Faktoren (z. B. Alter, Geschlecht, Raucherstatus, Alkoholkonsum, Medikation und Diagnose), ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A- bzw. NDPK B Expression in humanen Leberproben von Patienten mit cholestatischen Leberparametern beobachtet. Untersuchungen zur Methylierung der NME1-Promotorbereiche mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden, den sog. CpG-Inseln, konnten keinen signifikanten Einfluss des Methylierungsstatus auf die NME1/NDPK A-Expression zeigen. Ergänzende Untersuchungen mit Centre dÉtude du Polymorphisme Humain (CEPH)-Zelllinien bestätigten eine ausgeprägte Variabilität der NDPK A- und NDPK B Expression, die durch genetische Varianten nicht erklärt werden konnte.