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Die zerebrale Ischämie zählt weltweit zu den wichtigsten kardiovaskulären Erkrankungen und bedarf einer kontinuierlichen Optimierung der Prävention und der Therapie. Das Renin-Angiotensin-System (RAS) ist ein mögliches therapeutisches Target, da die Angiotensin-vermittelte Initiation fibrotischer und nekrotischer Prozesse sowie die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) die Genese diverser kardiovaskulärer und neurologischer Erkrankungen begünstigt. Die kürzlich entdeckten alternativen Renintranskripte, die ein Bestandteil lokaler RAS z.B. des zentralen Nervensystems (ZNS), des Herzens und der Lunge sind, könnten von Bedeutung sein. So werden dem alternativen zytosolischen Renintranskript (Ren[1a-9]) am Herzen unter ischämierelevanten Bedingungen anti-nekrotische und zytoprotektive Effekte attestiert. Daher ergab sich die übergeordnete Fragestellung, wie die Expression der Renintranskripte im ZNS in Abhängigkeit von ischämierelevanten Bedingungen reguliert wird und welche Bedeutung das lokale RAAS des Gehirns innehat. Die Grundvoraussetzung der angestrebten Untersuchungen bildete die Etablierung eines geeigneten neuronalen Zellmodells. Im Anschluss wurden die basale Reninexpression und deren Abhängigkeit vom Zellzyklus und dem Differenzierungsgrad der Zellen untersucht. Abschließend erfolgte die Analyse der Reninexpression und deren Regulation nach Kultivierung der Zellen unter Glukose- und Sauerstoffdepletion. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die adhärenten PC12 Zellen als zentrales Zellmodell etabliert werden, um die molekularen Mechanismen und die funktionellen Zusammenhänge der Reninexpression in neuronalen Zellen zu untersuchen. Die non adhärenten PC12 Zellen eignen sich für diese Zwecke nicht. Die mHippo18 Zellen sind für die funktionellen Analysen des sekretorischen Renintranskripts zu empfehlen. In Abhängigkeit von der Zellzyklusphase war eine Regulation der Renintranskripte zu beobachten. Der Übergang der stationären und der NGF-stimulierten Zellen in die G0/G1-Phase korrelierte mit einer Induktion der exprimierten Renintranskripte. Die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben durch weiterführende funktionelle Analysen zu klären. Abschließend war in den PC12 Zellen eine Stimulation der zytosolischen Reninexpression unter OGD nachzuweisen. Insgesamt legen die Ergebnisse dieser Arbeit eine mögliche Relevanz des intrazellulären RAS für das Verständnis und die Therapie der zerebralen Ischämie nahe.

Die chronische Nierenkrankheit (CKD) gehört neben Diabetes mellitus und Hypertonie zu den Weltgesundheitsproblemen. Aufgrund der Vielzahl von Ursachen, die zu einer CKD führen können, gibt es nur wenige gezielte Therapiemaßnahmen, die vor allem auf Veränderungen des Lebensstils der Patienten oder die Behandlung von Vor- oder Folgeerkrankungen abzielen. Um gezielter eine CKD behandeln zu können, ist es essentiell die genauen molekularen Mechanismen, die an der Entwicklung einer CKD beteiligt sind, zu identifizieren. Das intrarenale Renin-Angiotensin-System (RAS) ist eines der Systeme, die eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer CKD spielen. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des intrarenalen RAS für die Entwicklung der CKD in zwei, voneinander unabhängigen, Versuchsreihen untersucht. In der Versuchsreihe I wurden genetisch veränderte Mäuse (ACE-/--Mäuse) verwendet, die eine verminderte renale Angiotensin-I-Konversionsenzym (ACE)-Expression haben. Bei diesen Mäusen steht die Transkription des ACE-Gens unter der Kontrolle des Albumin-Promotors, so dass ACE bei ACE-/--Mäusen vor allem in der Leber exprimiert wird. Vor dem Hintergrund, dass das renale RAS bei einer CKD aktiviert ist und die genetische Veränderung der ACE-/--Mäuse einen Bestandteil des RAS betrifft, wurde in Versuchsreihe I untersucht, ob ACE-/--Mäuse vor einem experimentell-induzierten chronischen Nierenschaden geschützt sind. Weiterhin wurde untersucht, ob an einem möglichen Schutz die alternative renoprotektive ACE2/Angiotensin (1-7)/Mas-Rezeptor-Achse beteiligt ist. Die Daten einer klinischen Studie unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass sowohl die renale Angiotensinogen- als auch die renale Renin-Ausscheidung als potenzielle Biomarker einer CKD in Frage kommen. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde in Versuchsreihe II untersucht, ob die renale Angiotensinogen- bzw. die renale Renin-Ausscheidung auch als potenzielle Biomarker für den zeitlichen Verlauf eines experimentell induzierten, chronischen Nierenschadens geeignet sind. In dieser Versuchsreihe wurden nur Wildtyp-Mäuse verwendet, die über einen Zeitraum von 13 Wochen untersucht wurden. Der chronische Nierenschaden wurde bei den Mäusen beider Versuchsreihen mittels Aristolochiasäure I (AAI), 3 mg/kg Körpergewicht, i.p. an jedem 3. Tag für sechs Wochen und einer sich anschließenden behandlungsfreien Phase von weiteren sechs bis sieben Wochen induziert. Am Ende des Beobachtungszeitraums wurden die Nieren makroskopisch sowie mikroskopisch begutachtet, die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) mittels Inulin-Clearance als Maß für die Nierenfunktion bestimmt und weitere molekularbiologische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. In Versuchsreihe I führte AAI nur bei Wildtyp-Mäusen zu einer statistisch signifikanten Abnahme der GFR, jedoch nicht bei ACE-/--Mäusen. Die renalen ACE2- und Mas-Rezeptor-Protein-Gehalte nahmen zwar bei beiden Mausstämmen unter AAI ab, allerdings waren beide Parameter unter basalen Bedingungen bei ACE-/--Mäusen statistisch signifikant höher als bei Wildtyp-Mäusen. Gleichzeitig führte AAI bei ACE-/--Mäusen zu einem Anstieg der renalen Angiotensin-(1-7)-Konzentration, nicht jedoch bei Wildtyp-Mäusen. Die Ergebnisse der Versuchsreihe I zeigen zum ersten Mal, dass genetisch veränderte ACE-/--Mäuse vor einem AAI-induzierten, chronischen Nierenschaden geschützt sind. Dieser Schutz könnte auf eine basal höhere renale ACE2- und Mas-Rezeptor-Expression sowie auf die Zunahme der renalen Angiotensin-(1-7)-Konzentration unter AAI und somit eine Aktivierung der renoprotektiven ACE2/Angiotensin (1-7)/Mas-Rezeptor-Achse zurückzuführen sein. In Versuchsreihe II nahm die renale Angiotensinogen-Ausscheidung während der Behandlungsphase unter AAI zu und während der sich anschließenden behandlungsfreien Phase ab. Sie blieb jedoch während des gesamten Versuchszeitraums statistisch signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die renale Renin-Ausscheidung nahm ebenfalls unter AAI, allerdings auch in der Kontrollgruppe, während der Behandlungsphase zu und nahm während der behandlungsfreien Phase ab. Die Befunde der Versuchsreihe II lassen zwar keine abschließenden Aussagen zur Eignung der renalen Renin-Ausscheidung als Biomarker zu, allerdings sind die Ergebnisse zur renalen Angiotensinogen-Ausscheidung vielversprechend. Die Daten zeigen, dass die renale Angiotensinogen-Ausscheidung als Biomarker für den zeitlichen Verlauf eines AAI-induzierten, chronischen Nierenschadens bei Mäusen geeignet ist und dass das unter diesen Bedingungen mit dem Harn ausgeschiedene Angiotensinogen vermutlich überwiegend renalen Ursprungs ist.

Es wurden die Lokalisation des (P)RR/ATP6ap2 in PC12 Tumorzellen neuronalen Ursprungs, kardialen und renalen Zellen und Geweben sowie die funktionellen Folgen nach Downregulation oder Überexpression (paradoxe Downregulation) des Rezeptors untersucht. Er weist sowohl eine ER-spezifische, Membran-assoziierte als auch eine Lokalisation in der löslichen Fraktion auf. Als akzessorische Untereinheit der vakuolären H+ ATPase beeinflusst der Rezeptor ihre Integrität und Aktivität. Die Vielzahl differenter Daten zwischen den mit einem V ATPase-Inhibitor behandelten und den (P)RR/ATP6ap2-downregulierten PC12 Zellen verdeutlicht, dass die Funktion des (P)RR/ATP6ap2 insbesondere im Metabolismus über eine bloße Regulation der V ATPase-Aktivität hinausgeht und möglicherweise durch die Integration des (P)RR/ATP6ap2 im Wnt-Pathway bestimmt wird.

Das Ziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Rolle des Renin Binding Proteins (RenBP) bei der kardioprotektiven Wirkung des zytosolischen Renins in H9c2 Zellen, die einer Glucosedepletion ausgesetzt waren. Die Ergebnisse der Immunhistochemie ließen eine Kolokalisation beider Proteine nach Glucosedepletion erkennen. Mittels chemischen Detergenzien und Renin gelang im Nativen Western Blot die Unterscheidung zwischen RenBP Homodimer, Heterodimer und Monomer. Ein artifizieller ATP-Mangel durch Apyrase, ähnlich der Glucosedepletion, bewirkte eine Heterodimerbildung. Allerdings gelang mit dieser Methode kein Nachweis des endogenen zytosolischen Renins mit dem verwendeten Antikörper. Der Abfall der NAGE-Aktivität unter Überexpression des zytosolischen Renins und Glucosemangel in Zusammenhang mit den bisher erhobenen Ergebnissen konnte die initial vermutete Interaktion zwischen RenBP und zytosolischen Renin bestätigen. Im zweiten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob ein RenBP Knock down ähnliche Effekte ausübt, wie eine Interaktion zwischen RenBP und zytosolischem Renin. Der Knock down hatte keinen Einfluss auf die Nekroserate unter Kontrollbedingungen. Im Gegensatz zu den Kontrollzelllinien konnte bei Zellen mit einem milden RenBP Knock down ein weiterer Glucosedepletion-induzierter Anstieg der Nekroserate vermieden werden. Anhand dieser Daten schlussfolgern wir, dass unter Ischämie-relevanten Bedingungen, wie einer Glucosedepletion, die zytosolische Bildung von RenBP-Renin-Heterodimeren mit einer Zellprotektion assoziiert ist. Weitere Untersuchungen müssen nach kritischer Betrachtung dieser Erkenntnis zur Verifizierung folgen. Insgesamt weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf die Notwendigkeit des RenBP beim zytoprotektiven Effekt des zytoslischen Renins in H9c2 Zellen hin. Neben der Suche anderer Interaktionspartner für das zytosolische Renin ist zudem die Klärung des Stellenwertes des RenBP im Zellmetabolismus mit Auswirkung auf Prozesse wie Sialisierung und Glykosylierung zukünftig notwendig.

Die Nieren spielen in der Regulation des Blutdrucks eine sehr wichtige Rolle, da sie den Wasser- und Elektrolythaushalt kontrollieren und Schwankungen des Blutdrucks langfristig normalisieren können. Bei der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie wird häufig eine Funktionsstörung der Nieren beobachtet, insbesondere eine Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands. Die entsprechenden pathophysiologischen Prozesse sind noch nicht vollständig geklärt. Die Enzyme Rho-Kinase (ROCK) und NADPH-Oxidase (NOX) sind an vielen physiologischen Steuerungsprozessen des Organismus beteiligt, vor allem auch an der Regulation des Gefäßtonus. Sie wurden in mehreren experimentellen und klinischen Studien mit der Entstehung einer arteriellen Hypertonie in Verbindung gebracht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu klären, inwiefern ROCK und NOX in der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie auf die Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands Einfluss nehmen. Die Untersuchungen wurden am Tiermodell der Cyp1a1ren-2 transgenen Ratten durchgeführt, das es ermöglicht, durch Beigabe des Stoffes Indol-3-Carbinol zum Futter, eine AngII-abhängige Hypertonie zu induzieren. Die Tiere wurden in Gruppen mit unterschiedlich langer Induktionsphase und Induktionsdosis aufgeteilt, wodurch verschiedene Phasen der Hypertonieentwicklung beobachtet werden konnten. Anschließend wurden mit Nierengefäßen und Aortengewebe der Versuchstiere mehrere Experimente zur Aktivität der ROCK und NOX und deren Einfluss auf die Gefäßkontraktilität durchgeführt. In den Nierengefäßen der induzierten Tiere konnte mittels PCR eine erhöhte Gen-Expression der NOX-Isoformen Nox1 und Nox2 nachgewiesen werden. Die Lucigenin verstärkte Chemilumineszenz ergab zudem Hinweise auf eine vermehrte NOX abhängige Superoxidbildung in den Nierengefäßen der hypertonen Tiere. Die Gen-Expression der ROCK-Isoformen war nach Induktion eines Bluthochdrucks nicht signifikant unterschiedlich. Auch die Aktivität der ROCK, die durch Western-Blot Versuche ermittelt wurde, zeigte keine Unterschiede. Zusätzlich wurde in einem Drahtmyographen die Gefäßantwort auf Phenylephrin ohne und mit Zugabe des ROCK-Inhibitors Y-27632 sowie ohne und mit Zugabe des Superoxid Radikalfängers Tiron gemessen. Auch wurde in einem Experiment die Gefäßantwort auf H2O2 untersucht. Diese Experimente ließen den Schluss zu, dass die ROCK bei den induzierten Tieren eine zunehmende Bedeutung in der Phenylephrin-induzierten Gefäßkontraktion renaler Widerstandsgefäße hatte, wohingegen radikale Sauerstoffspezies keinen veränderten Einfluss nach Induktion der Hypertonie zeigten. Im Rahmen dieser Arbeit war es zudem möglich, diese Untersuchungen zur Gefäßkontraktilität auch an humanen renalen Gefäßen durchzuführen, die nach Tumor bedingter Explantation aus einer Niere gewonnen wurden. Hierbei zeigte sich durch die ROCK-Hemmung auch eine signifikante Verringerung der Agonist-induzierten Kontraktion menschlicher Nierengefäße. Dies mag auf eine Übertragbarkeit der tierexperimentellen Ergebnisse auf die Vorgänge in der menschlichen Niere hinweisen. Zusammenfassend haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROCK und NOX in unterschiedlicher Form einen Einfluss auf den renalen Gefäßwiderstand in der frühen Hypertonieentwicklung Cyp1a1ren-2 transgener Ratten haben. Dabei können auch Wechselwirkungen zwischen den Enzymen eine Rolle spielen, da mehrere andere Studien eine gegenseitige Aktivierung der ROCK und NOX beobachteten. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung der Untersuchung der ROCK und NOX und ihrer Hemmstoffe mit dem Ziel der Entwicklung potenzieller neuer Medikamente, um die Therapie der Hypertonie weiter verbessern zu können.