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In dieser Arbeit sollte die Möglichkeit der Anwendung von kaltem atmosphärischen Plasma (CAP) bei der Therapie von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (HNSCC) evaluiert werden. Dazu wurden in vitro HNO97- und HNO41-Karzinomzellen mit Argon-CAP bzw. Helium-CAP durch den kINPen 09 bzw. einen Prototyp behandelt und einer Epithelzelllinie gegenübergestellt, um quellgasbedingte Unterschiede herauszuarbeiten. Durch die Verwendung von fetalem Kälberserum (FCS) und Panexin NTA (NTA) konnten zwei unterschiedliche Mediumzusätze verglichen werden.
In Wachstumskinetiken wurde eine Reduktion der Zellzahl von Karzinom- und Epithelzellen nach CAP-Behandlung erzielt. Daran schloss sich eine Proteomanalyse durch 2D-DIGE mit mas- senspektrometrischer Identifikation von in ihrer Menge veränderten Proteinen im Vergleich zu korrespondierenden Gaskontrollen an. Durch eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) regu- lierter Proteine konnten die behandelten Proben in Cluster aufgeteilt werden. Die Auftrennung war in absteigender Effektgröße abhängig vom verwendeten Serum, Quellgas und der CAP-Behandlung. Mit Hilfe von Ingenuity Pathway Analysen (IPA) wurden Regulatorproteine und molekulare Funktionen identifiziert. So ließ sich die Regulation von p53, HSF1 und TGF-b und eine damit verbundene Beeinflussung der Stressantwort auf ungefaltete Proteine, der mitochondrialen Membranpermeabilität und der Apoptose nachweisen. Durch Darstellung der regulierten Proteine in Netzwerken konnte der Einfluss von CAP auf den MAPK-ERK-Pathway als zentraler Bestandteil der Wirkung identifiziert werden.
Nach Analyse der Proteinveränderungen wurde explizit eine mögliche Beeinflussung von Hit- zeschockprotein 27 (HSP27) und Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) mittels Immunoblotassay untersucht. HSP27 dient u.a. der Reduktion von oxidativem Stress. GAPDH ist in Abhängigkeit vom Oxidationsstatus Bestandteil der Glykolyse oder an der Apoptose beteiligt. Es zeigte sich eine Reduktion der Proteinmenge von HSP27 durch CAP in Karzinomzellen, die unter Verwendung von NTA größer ausfiel als unter FCS. Die Proteinmenge von GAPDH änderte sich nicht, es ließ sich lediglich eine Modifikation des Proteins vermuten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Karzinomzellen an oxidativen Stress nur bedingt anpassungsfähig sind und CAP somit eine geeignete Therapieoption darstellt. Die Effektivität des CAP wird dabei durch das Quellgas, die Behandlungsdauer sowie extra- und intrazelluläre Scavengersysteme beeinflusst.
Histondeacetylase-Inhibitoren (HDIs) bilden eine Gruppe relativ neuer vielversprechender anti-neoplastischer Wirkstoffe. Sie hemmen die Funktion der Histondeacetylasen und greifen somit in die Regulation der genomweiten Transkription ein. HDIs besitzen direkte tumortoxische Wirkung, lassen nicht transformierte Zellen jedoch weitgehend unbeeinflußt. Darüber hinaus verstärken sie die zytotoxischen Aktivitäten einer Vielzahl anderer Tumortherapeutika und sensibilisieren Tumorzellen für die zytolytischen Effekte aktivierter NK-Zellen. Die Einbindung des Immunsystems in die Tumortherapie wirft jedoch die Frage nach einer direkten, möglicherweise hemmenden Wirkung der HDIs auf Immunzellen auf. In dieser Arbeit wurde untersucht, welcher Mechanismus dem Synergismus von HDIs und aktivierten NK-Zellen zugrunde liegt, ob HDIs Tumorzellen auch für die zytolytischen Effekte tumorspezifischer T-Zellen sensibilisieren und welche direkte Wirkung HDIs auf Immunzellen ausüben. Alle Arbeiten wurden in vitro mit humanen Zellen/Zellinien durchgeführt. Als HDIs kamen Suberoylanilid-Hydroxamsäure (SAHA) und Natriumbutyrat (NaB) zum Einsatz. Aufbauend auf ein bereits etabliertes in-vitro-Testsystem, wurde gezeigt, daß nach IL-2-Aktivierung von PBMCs im wesentlichen NK-Zellen Tumorzelltod induzierten. Dabei war die Funktionsfähigkeit der aktivierenden NK-Rezeptoren NKG2D, DNAM-1 und der NCRs kritisch für Erkennung und Lyse der Tumorzellen, wie der Einsatz blockierender Antikörper deutlich machte. Sowohl bei unbehandelten als auch bei HDI-behandelten Tumorzellen führte die Maskierung all dieser Rezeptoren zu einer vollständigen Inhibition der Tumorzellyse, d.h. die Induktion alternativer aktivierender NK-Liganden durch HDIs wurde ausgeschlossen. Wurden nur ein oder zwei aktivierende Rezeptoren maskiert, ergab sich hingegen ein Unterschied zwischen unbehandelten und HDI-behandelten Tumorzellen: Der protektive Effekt der Maskierung fiel bei HDI-behandelten Tumorzellen deutlich geringer aus. HDIs erhöhen also die Redundanz der schon zuvor involvierten aktivierenden NK-Rezeptoren. Oberflächenfärbungen legten nahe, daß diese Redundanzerhöhung – und somit die Sensibilisierung der Tumorzellen – auf die HDI-induzierte Heraufregulation aktivierender NK-Liganden auf Tumorzellen zurückzuführen ist. Ein Einfluß der HDIs auf die Expression der Todesrezeptoren Fas, DR4 und DR5 wurde ausgeschlossen. Um die Untersuchungen auf das Zusammenwirken von HDIs und zytotoxischen T-Zellen auszuweiten, wurde ein Primingsystem zur Generation tumorspezifischer T-Effektorzellen etabliert. Allogene Spender-T-Zellen wurden mit Hilfe CD86-transfizierter Zellen der Melanomzellinie SkMel63 geprimt, d.h. in diesem System dienten Alloantigene als Ersatz für Tumorantigene. Starke T-Zellproliferation und die Sekretion T-Zell-spezifischer Zytokine zeigten ein erfolgreiches Primen der T-Zellen an. Geprimte tumorspezifische T Zellen lysierten Wildtyp-SkMel63-Zellen effektiv ohne die Notwendigkeit eines Ko-Stimulus. Die Vorbehandlung mit SAHA sensibilisierte die SkMel63-Zellen für die Zelltodinduktion durch T-Zellen. Eine mögliche Ursache für den Synergismus könnte auch hier die verstärkte Expression der NKG2D-Liganden sein, da NKG2D auf T-Zellen als ko-stimulierender Rezeptor fungiert. Da funktionsfähige Immunzellen eine Voraussetzung für die beschriebenen sensibilisierenden HDI-Effekte sind, wurde auch die direkte Wirkung der HDIs auf NK- und T-Zellen untersucht. Tumortoxische Konzentrationen von SAHA verhinderten ihre aktivierungsinduzierte Proliferation und Zytokinsekretion, beeinträchtigten die CD107a-Mobilisierung und hemmten die zytolytische Aktivität der Immunzellen. Diese Beobachtungen spiegeln zwei Phänomene wider: Erstens übt SAHA eine zytotoxische Wirkung auf die Immunzellen aus, und zweitens inhibiert SAHA die IL-2-Aktivierung von NK-Zellen sowie das Primen tumorspezifischer T-Zellen. In starkem Gegensatz dazu wurden NK- und T-Zellen, die in Abwesenheit von HDIs aktiviert wurden, resistent gegen deren zytotoxische und immunsuppressive Wirkung und zeigten später – auch in Anwesenheit hoher HDI-Konzentrationen – normale zytolytische Aktivität. Die Sensibilität von NK- und T-Zellen für suppressive HDI-Effekte hängt also von ihrem Aktivierungszustand ab, und nur vollständig aktivierte Immunzellen sind resistent gegen HDIs. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ein großes therapeutisches Potential der Kombination von HDIs und immunstimulierender Behandlung auf. Als eine vielversprechende therapeutische Strategie erscheint daher ein sequentieller Ansatz, bestehend aus der Immunstimulation der Tumorpatienten gefolgt von der HDI-vermittelten Sensibilisierung der Tumorzellen für die Angriffe des patienteneigenen Immunsystems.
Das Pankreaskarzinom ist die zehnthäufigste (Männer) bzw. neunthäufigste (Frauen) Tumorerkrankung in Deutschland. Aufgrund der häufig fatalen Prognose ist es gleichzeitig die vierthäufigste Krebstodesursache in Deutschland. 5 Jahre nach Diagnosestellung sind im Mittel nur noch weniger als 8 % der Betroffenen am Leben. Bei regelhaft fehlenden Frühsymptomen erfolgt die Diagnosestellung häufig in bereits fortgeschrittenen Tumorstadien mit stark begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Da vielfältige Wechselwirkungen von chronischem Stress und beschleunigter Tumorprogression bekannt sind, könnte Stress die äußerst limitierte Prognose des Pankreaskarzinoms noch zusätzlich verschlechtern. Hierzu untersuchte die vorliegende Arbeit den Einfluss von Katecholaminen auf progressionsfördernde Veränderungen der Tumorzellbiologie von Pankreaskarzinomzelllinien in vitro. Untersucht wurden die Expression von MMP-2/-9, das Migrations- und Invasionsverhalten der Tumorzellen sowie die Auswirkungen von Katecholaminen auf das Proliferationsverhalten. Um eine mögliche Relevanz dieser Befunde in vivo zu überprüfen wurde die Tumorprogression unter chronischer Stressexposition in einem syngenen, orthotopen und immunkompetenten Tumormodell an C57BL/6N Mäusen mittels Überlebensanalysen und magnetresonanztomografischer Bildgebung untersucht. Schließlich wurde mit Propranolol in vitro und in vivo eine mögliche therapeutische Option evaluiert. Es ergaben sich vielfältige Hinweise für eine durch Stress erleichterte Tumorprogression des Pankreaskarzinoms in vivo und in vitro. Katecholamine stimulieren die Gelatinase-Aktivität, Migration, Invasion und Proliferation humaner Pankreaskarzinomzellen. Chronischer Stress führt in einem immunkompetenten Mausmodell zu erhöhter Tumorlast und verschlechterter Überlebensprognose. Diese Effekte sind zumindest partiell durch eine β-Rezeptorblockade mit Propranolol reversibel. Die vorliegende Untersuchung beschreibt fatale Auswirkungen von chronischem Stress auf die Tumorprogression. Auf Hinweise zu primär- und tertiärpräventiven Effekten von Betablockern bei malignen Grunderkrankungen des Menschen könnten bald adjuvante perioperative Studien mit einer Propranololgabe nach Tumorresektion folgen.