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Background
Vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT) is a prothrombotic, heparin-induced thrombocytopenia (HIT)-mimicking, adverse reaction caused by platelet-activating anti-platelet factor 4 (PF4) antibodies that occurs rarely after adenovirus vector-based COVID-19 vaccination. Strength of PF4-dependent enzyme immunoassay (EIA) reactivity—judged by optical density (OD) measurements—strongly predicts platelet-activating properties of HIT antibodies in a functional test. Whether a similar relationship holds for VITT antibodies is unknown.
Objectives
To evaluate probability for positive platelet activation testing for VITT antibodies based upon EIA OD reactivity; and to investigate simple approaches to minimize false-negative platelet activation testing for VITT.
Methods
All samples referred for VITT testing were systematically evaluated by semiquantitative in-house PF4/heparin-EIA (OD readings) and PF4-induced platelet activation (PIPA) testing within a cohort study. EIA-positive sera testing PIPA-negative were retested following 1/4 to 1/10 dilution. Logistic regression was performed to predict the probability of a positive PIPA per magnitude of EIA reactivity.
Results
Greater EIA ODs in sera from patients with suspected VITT correlated strongly with greater likelihood of PIPA reactivity. Of 61 sera (with OD values >1.0) testing negative in the PIPA, a high proportion (27/61, 44.3%) became PIPA positive when tested at 1/4 to 1/10 dilution.
Conclusions
VITT serology resembles HIT in that greater EIA OD reactivity predicts higher probability of positive testing for platelet-activating antibodies. Unlike the situation with HIT antibodies, however, diluting putative VITT serum increases probability of a positive platelet activation assay, suggesting that optimal complex formation depends on the stoichiometric ratio of PF4 and anti-PF4 VITT antibodies.
Platelet factor 4 (PF4, synonym: CXCL4) is an evolutionary old chemokine with proposed roles in hemostasis and antimicrobial defense. In addition, PF4 has attracted considerable attention as a crucial mediator of one of the most prothrombotic adverse drug effects affecting blood cells, heparin-induced thrombocytopenia (HIT). Interest in PF4 substantially increased in 2021 when it was identified as the target antigen in the life-threatening adverse effect, vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT). We address the concept that a major biological function of PF4—a strongly cationic chemokine—is to bind to negatively-charged prokaryotic microorganisms, resulting in structural changes in PF4 that trigger a danger signal recognized by the adaptive immune system. Application of biophysical tools has provided substantial insights into the molecular mechanisms by which PF4 becomes immunogenic, providing insights into a new mechanism of autoimmunity. Binding of autoantibodies with high affinity induces conformational change(s) in the endogenous protein, which are then recognized as foreign antigen, as exemplified by the prothrombotic disorders, autoimmune HIT and VITT. The final part of our review summarizes current assays for HIT and VITT, explaining how structural aspects of anti-PF4 pathobiology relate to assay design and performance characteristics. Currently, functional (platelet activation) assays using washed platelets detect HIT antibodies when heparin is added, and VITT antibodies when PF4 is added. Solid-phase PF4-dependent immunoassays using microtiter plates are sensitive for both HIT and VITT antibodies, while rapid immunoassays, in which the PF4/heparin antigen is coated on beads, are sensitive and specific for HIT, but not for VITT antibodies.
Platelet adhesion and spreading at the sites of vascular injury is vital to hemostasis. As an integral part of the innate immune system, platelets interact with opsonized bacterial pathogens through FcγRIIA and contribute to host defense. As mechanoscavangers, platelets actively migrate and capture bacteria via cytoskeleton-rich, dynamic structures, such as filopodia and lamellipodia. However, the role of human platelet FcγRIIA in cytoskeleton-dependent interaction with opsonized bacteria is not well understood. To decipher this, we used a reductionist approach with well-defined micropatterns functionalized with immunoglobulins mimicking immune complexes at planar interfaces and bacteriamimetic microbeads. By specifically blocking of FcγRIIA and selective disruption of the platelet cytoskeleton, we show that both functional FcγRIIA and cytoskeleton are necessary for human platelet adhesion and haptotaxis. The direct link between FcγRIIA and the cytoskeleton is further explored by single-particle tracking. We then demonstrate the relevance of cytoskeleton-dependent differential mobilities of FcγRIIA on bacteria opsonized with the chemokine platelet factor 4 (PF4) and patient-derived anti-PF4/polyanion IgG. Our data suggest that efficient capture of opsonized bacteria during host-defense is governed by mobility dynamics of FcγRIIA on filopodia and lamellipodia, and the cytoskeleton plays an essential role in platelet morphodynamics at biological interfaces that display immune complexes.
Zusammenfassung: Heparin ist ein häufig verwendetes Medikament, das zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen eingesetzt wird. Eine unerwünschte Nebenwirkung des Heparins ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT), die paradoxerweise mit potentiell lebensbedrohlichen arteriellen und venösen Gefäßverschlüssen assoziiert ist. Die Erkrankung wird durch die Bil-dung von Thrombozyten-aktivierenden Antikörpern der Klasse Immunglobulin G (IgG) aus-gelöst. Diese sind gegen Komplexe aus dem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin gerichtet. Die zugrunde liegende B-Zell-vermittelte Immunität entspricht nicht der klassischen Immunantwort und führt zu einer frühzeitigen und transienten Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern der Klassen IgM und IgG. In der vorliegenden Arbeit wurden die B-Zellen, die an der Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern beteiligt sind, identifiziert. Hierfür wurden die Mäuse systemisch mit PF4/Heparin-Komplexen immunisiert. Das Vorliegen einer Immunantwort wurde durch den Nachweis der Antikörperproduktion mittels eines neu entwickelten Fluid-Phase ELISA nach-gewiesen. Der Einsatz von rekombinanten Maus-PF4/Heparin-Komplexen zeigte, dass die beim Menschen für die HIT charakteristisch frühe und transiente Antikörperproduktion auch im Mausmodell auftritt. Diese Immunantwort war spezifisch für PF4/Heparin-Komplexe und konnte nicht durch andere unspezifische Reize wie ein Gewebetrauma oder dem Modellanti-gen Ovalbumin ausgelöst werden. Der Nachweis der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellpopulation(en) wurde durch die Etablierung des Zell-spezifischen Enzym-gekoppelten Immun-Spot Tests (ELISPOT) auf der Fluid-Phase Basis – Detektion der PF4/Heparin-Antikörper-Komplexe in der löslichen Phase – ermöglicht. Unterschiedliche Gewebe/Kompartimente (Milz, Knochen-mark, Peritonealhöhle) von naiven, nicht-immunisierten und PF4/Heparin-immunisierten Mäusen wurden mit diesem Assay auf das Vorliegen von PF4/Heparin-spezifischen B-Zellen untersucht. Während in nicht-immunisierten Mäusen ausschließlich B-Zellen nachgewiesen werden konnten, die anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM produzierten, wurden in immunisierten Mäusen sowohl kurzlebige PF4/Heparin-spezifische IgM (7%)- als auch IgG (25%)-sezernierende B-Zellen detektiert. Die spezifischen Zellen befanden sich in beiden Fällen in der Milz. Dieses Gewebe dient als Nische für follikuläre, Marginalzonen (Mz)- und B1-B-Zellen, wobei sie im Fall der Mz-B-Zellen die einzige Überlebensnische darstellt. Den Hauptanteil der Antikörper-produzierenden Milzzellen bilden die follikulären B-Zellen, deren Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist. Als Hauptquelle der anti-PF4/Heparin-Antikörper konnte diese Zellpopulation ausgeschlossen werden, da T-Zell-defiziente Mäuse nach der Behandlung mit PF4/Heparin weiterhin spezifische Antikörper produzierten. Normale Mäuse, denen vor der PF4/Heparin-Behandlung die Milz und somit die Mz-B-Zellen operativ entfernt wurden, konnten hingegen keine anti-PF4/Heparin-Antikörper mehr bilden. Dies zeigt, dass B1-Zellen allein nicht ausreichend sind, um die anti-PF4/Heparin-Antikörperproduktion zu induzieren, und dass Mz-B-Zellen für die Immunantwort notwendig sind. Der Mechanismus, der die Aktivierung der PF4/Heparin-spezifischen Mz-B-Zellen auslöst, ist bisher nicht im Detail bekannt. Jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die in vitro Stimulation von B-Zellen mit Mitogenen wie CpG und SAC antigenunabhängig zur Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern führt. Dies lässt vermuten, dass neben dem Kontakt mit dem Antigen auch andere immunstimulatorische Faktoren in die Induktion der Immunantwort gegen Maus-PF4/Heparin-Komplexe involviert sind.