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Carboxylester-Hydrolasen gehören zu den Enzymen, die durch hohe Lösungsmitteltolereanz, gute Lagerstabilität und ein breites Substratspektrum, am häufigsten in der Biokatalyse eingesetzt werden. Allerdings akzeptieren sie im Gegensatz zu Estern primärer und sekundärer Alkohole nur in Ausnahmefällen Ester tertiärer Alkohole als Substrate. In der Arbeit werden Wege untersucht mittels Gerichteter Evolution und rationalem Protein Design, Esterasevarianten zu generieren die in der Lage sind diese Substrate mit guten Enantioselektivitäten umzusetzen. Unter Verwendung von Methoden der Zufallsmutagenese werden große Enzymbibliotheken aufgebaut und mit einem mikrotiterplatten basierendem Assays-system auf neu generierte Aktivitäten untersucht. Mittels molecular modeling, werden Positionen vorhergesagt, an den gezielt Mutationen eingeführt werden können um eine erhöhte Enantioselektivität zu erreichen.
Ziel der Arbeiten war es, ein Hefe basiertes Testsystem zu entwickeln, mit dem in komplexen Proben (Urin, Milch, Ab-, Brack-, See-, Mineralwasser, Lebensmittel, Kosmetika und pharmazeutische Formulierungen) mit möglichst geringem Aufwand/Probevolumen/Kosten estrogene Aktivitäten be-stimmbar sind. Der entwickelte neue Arxula adeninivorans Estrogen-Screen (nAES-Assay) ermöglicht die Detektion estrogen-wirksamer Substanzen als Summenparameter. Der In vitro-Assay basiert auf transgenen A. adeninivorans-Zellen mit zwei Expressionsmodulen (Rezeptorgenmodul mit TEF1-Promotor – hERa-Gen – PHO5-Terminator, Reportergenmodul mit Arxula eigenen GAA-Promotor – phyK/ATAN1-Gen – PHO5-Terminator). Durch die Insertion zweier "Estrogen-Response-Elemente" (EREs) in die GAA-Promotorregion wurde diese zum Estrogen induzierbaren Promotor GAA2xERE–107 modifiziert. Als Reporter wurden zwei nicht-konventionelle Gene benutzt, die Klebsiella sp. ASR1 abgeleitete PhytaseK (phyK-Gen) und die Tannase (ATAN1-Gen) aus Arxula. Um die Genmodule in das Arxula Genom zu integrieren wurde die Transformations-/Expressionsplattform Xplor® 2 mit den Selektionsmarkermodulen ALEU2-/delALEU2-Promotor – ATRP1-Gen verwendet. Vorteil dieser Plattform ist, dass keine dominanten Resistenzmarker (HPH1(r)) in die Hefe übertragen werden und sich mitotisch stabile Hefetransformanten selektieren lassen. Xplor® 2 ermöglicht zudem die komplette Eliminierung aller E. coli-Plasmidbestandteile einschließlich Resistenzgene (Kan(r), Amp(r)). Die im Rahmen der Arbeit selektierten Transformanten wurden bezüglich ihrer Robustheit und Anwendbarkeit als biologische Komponente für den nAES-Assay geprüft. Anhand der auf PhytaseK und Tannase als Reporter basierenden zwei Varianten des nAES-Assays (nAES-P, nAES-T), wurde eine "Standard Operation Procedure – SOP" erstellt, was die Nutzbarkeit des Assays vereinfacht. Die Testplattform umfasst 96-well Arbeitsstandard, lyophilisierten Hefezellen und der validierten Testprozedur mit passender, von der quo data GmbH Dresden entwickelen Auswertesoftware Bioval®. Die Verwendung von A. adeninivorans G1212 [aleu2 atrp1::ALEU2] mit unikal integrierter Kassette in Verbindung mit dem Selektionsprotokoll ermöglichte eine ~2-fache Verbesserung der Messparameter des nAES im Vergleich zum konventionellen A-YES. Die zwei nAES Assay genutzten Reportervarianten wurden hinsichtlich Temperatur-, pH-Optimum und Anwendbarkeit in verschiedenen Proben charakterisiert. So eignet sich nAES-P besser für die Messung von Brack- und Seewasserproben, während der nAES-T die höhere Robustheit gegenüber NaCl aufweist. nAES-T und nAES-P erreichen bei der Bestimmung von estrogenwirksamen Substanzen in Urin und Abwasserproben mit 6–25 h Assaydauer, Nachweis-, Bestimmungsgrenze und EC50-Wert für 17b-Estradiol von 2,8; 5,9; 33,2 ng/l (nAES-P) bzw. 3,1; 6,7; 39,4 ng/l (nAES-T) ähnliche Charakteristika. Dem gegenüber sind die Substratspezifität und der dynamische Messbereich innerhalb der beiden Varianten annähernd gleich. Daraus ergibt sich, dass sich der nAES-Assay basierend auf der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans besonders für die Analyse von komplexen Umweltproben und im regulatorischen Sektor (Abwasserkontrolle, Steroidanalytik, REACh) eignet. In ersten Versuchen mit Realproben, wie Abwasser zeigten sich durchschnittliche estrogene Belastungen des Abwassers von < 6 ng/l. In Direkteinleitern ohne jegliche Behandlung konnten 17b-Estradiol estrogenequivalente-Aktivitäten (nAES-EEQ) von 8–70 ng/l detektiert werden. Die zusätzliche Messung von 47 Rinderurinen mit dem nAES-Assay auf estrogen-wirksame Substanzen ergab eine gute Korrelation zur parallel durchgeführten chemischen Analysen (ana-EEQ) mit GC/MS. Dies unterstreicht den praktischen Nutzen der nAES-EEQ Ergebnisse. In Kälberurin wurde ein durchschnittlicher nAES-EEQ von 800 ng/l und in Rinderurinen (älter als 24 Wochen) von 13000 ng/l bestimmt. Auch Testserien mit Mineralwasser und Eluaten aus dazugehörigen Verpackungsbestandteilen dokumentierten mit nAES-EEQs von < 6 ng/l die Praxistauglichkeit des nAES Assays. Damit hat sich dieser Assay als ein relativ schneller Assay zu Messung estrogener Aktivitäten in komplexen Probenmatrices (inklusive inhibitorischer Bestandteile), wie Urin und Abwasser, ohne aufwendige Aufkonzentrierungen und Vorbehandlungsschritte erwiesen. Die Vorteile zu vergleichbaren Assays und zelllinienbasierten Testsystemen sind seine leichte Handhabung und das Vorhandensein einer bereits erprobten/validierten Testprozedur.
Neue Konzepte für das Protein-Engineering am Beispiel von Enzymen mit alpha/beta-Hydrolasefaltung
(2010)
Trotz einer sehr großen funktionellen Diversität, zeichnen sich die Enzyme innerhalb der α/β-Hydrolasefaltung-Superfamilie durch eine sehr hohe strukturelle Homologie aus, weshalb man annimmt, dass sich deren Vertreter über divergente Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Unter Zuhilfenahme von Methoden des Protein-Engineerings sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob es möglich ist, Enzyme innerhalb dieser Superfamilie ineinander umzuwandeln. Als Modelenzyme dienten eine Esterase aus Pseudomonas fluorescens (PFE) und eine Epoxidhydrolase aus Agrobacterium radiobacter (EchA). Nach der Etablierung geeigneter Analysemethoden für Esteraseaktivität und Epoxidhydrolaseaktivität wurden mittels verschiedener Sequenz- und Strukturalignments Aminosäuren identifiziert, die essentiell für den jeweiligen Reaktionsmechanismus sind. Diese wurden nachfolgend mittels positionsgerichteter Mutagenese in die jeweiligen Enzyme eingefügt und die entsprechenden Mutanten auf die jeweilige Aktivität hin untersucht. Leider zeigte weder die PFE Epoxidhydrolaseaktivität, noch die EchA Esteraseaktivität. Anschließend wurden über weitere Strukturvergleiche ganze Bereiche in Epoxidhydrolasen identifiziert, die möglicherweise von Wichtigkeit für die Funktionalität des Enzyms sind. Es wurden also ganze Bereiche der PFE durch solche der EchA ersetzt und auf diese Weise drei Chimär-Enzyme hergestellt. Diese Chimären wurden mittels Coexpression von Chaperonen hergestellt und anschließend aufgereinigt. Eines dieser Chimärenzyme zeigte eindeutig Epoxidhydrolaseaktivität. Es wird angenommen, dass der Eingangsbereich ins aktive Zentrum der PFE im Wildtyp-Enzym versperrt war und dieser durch den Austausch eines Loops geöffnet wurde. Weiterhin wurde ein Ansatz entwickelt, Esteraseaktivität in der EchA zu generieren. Dieser basiert auf einem strukturbasierten Sequenzalignment, das es erlaubt Aminosäuren zu identifizieren, die sich in Epoxidhydrolasen und Esterasen unterscheiden. Leider führte dieser Ansatz bisher noch nicht zum Erfolg, weshalb weitere Untersuchungen nötig sind. Im zweiten Teil der Arbeit ging es darum, Mutantenbibliotheken für die fokussierte, gerichtete Evolution möglichst klein, aber qualitativ hochwertig herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ebenfalls ein strukturbasiertes multiples Sequenzalignment herangezogen, das es erlaubt die Aminosäureverteilung an verschiedenen Positionen des Enzyms in einer riesigen Anzahl strukturell verwandter Enzyme zu bestimmen. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Aminosäuren an definierten Positionen sehr häufig sind und welche eher selten. Von solchen Resten, die sehr selten sind, wird angenommen, dass sie negative Auswirkungen auf die strukturelle Integrität des Proteins haben und deshalb von der Natur nicht berücksichtigt wurden. Diese Annahme wurde zur Herstellung von Proteinbibliotheken ausgenutzt. In einer fokussierten, gerichteten Evolution wurden einmal 3 und einmal 4 Aminosäuren der PFE simultan und zufällig durch Aminosäuren ersetzt, die sehr häufig in 2800 verwandten Sequenzen an diesen Positionen vorkommen. Die auf diese Weise generierten Bibliotheken wurden einmal auf eine verbesserte Thermostabilität (für die 3 Positionen) und einmal auf eine verbesserte Enantioselektivität untersucht (4 Positionen). Hierbei wurde zusätzlich die Auswirkung der Mutationen auf die Substratspezifität untersucht. Als Vergleichsbibliotheken wurden ebenfalls einmal alle 20 proteinogenen Aminosäuren eingefügt und einmal nur solche, die sehr selten im Alignment auftauchen. Das Ergebnis war in beiden Fällen eine sehr viel bessere Bibliothek, wenn nur solche Reste vertreten waren, die auch in der Natur bevorzugt vorkommen. Dies galt sowohl in Bezug auf die Anzahl aktiver Klone in jeder Bibliothek, als auch auf die Chance eine verbesserte Variante zu finden (stabiler bzw. selektiver). Die besten Mutanten der Bibliotheken hatten im Vergleich zum Wildtyp einen 8°C höheren Schmelzpunkt bzw. einen bis 18fach höheren E-Wert (bei 50facher katalytischer Effizienz). Weiterhin konnten die Substratspezifität um den Faktor 4.300 verändert werden.
Tertiary alcohols have become interesting targets for organic synthesis themselves or as building blocks for valuable pharmaceutical compounds. However, the synthesis of optically pure tertiary alcohols is still a challenge both chemical and enzymatic means. Enzymes containing the GGG(A)X motif in the active site region have been known to show activity towards these sterically demanding substrates. Several tertiary alcohols have been resolved with high enantioselectivity by using this biocatalytic synthetic route. This thesis aims at providing a better understanding of enantiorecognition of GGG(A)X motif hydrolases in the enzymatic synthesis of enantiomerically enriched tertiary alcohols. Kinetic resolution of a wide range of tertiary alcohols using hydrolases provided insights on factors that can influence enantioselectivity of GGG(A)X motif enzymes. Additionally, a newly proposed chemoenzymatic method to synthesize protected alpha,alpha-dialkyl-alpha-hydroxycarboxylic acids has broadened the application of these enzymes to synthesize optically pure tertiary alcohols. Newly found biocatalysts through functional screening, database mining and rational protein design approaches provided a better enzyme platform for optically pure tertiary alcohol resolution.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit ergaben sich aus zwei Arbeitsschwerpunkten - dem Nachweis einer neuartigen prokaryotischen Phenoloxidase bei dem Bakterienisolat Azotobacter chroococcum SBUG 1484 und der Durchführung Phenoloxidase-katalysierter Biotransformationsreaktionen zur Derivatisierung von ortho- bzw. para-dihydroxylierten Verbindungen. Der zunächst unbekannte, eine neue Phenoloxidase bildende, Bakterienstamm sollte mittels morphologischer und physiologischer Tests sowie 16S-rDNA-Analysen einer Art zugeordnet werden. Da die Expression der Phenoloxidase nur unter bestimmten Bedingungen auftrat sollten die in Abhängigkeit von verschiedenen Kultivierungsparametern zahlreich auftretenden Zelldifferenzierungsprozesse des Stammes untersucht und eine standardisierte Kultivierungsmethode zur Erzielung hoher Phenoloxidase-Aktivitäten entwickelt werden. Die Untersuchung wesentlicher Eigenschaften der neubeschriebenen Phenoloxidase war für eine Zuordnung in die Gruppe der Multikupfer-Oxidasen und eine Prüfung der Eignung des Enzyms für biotechnologische Anwendungen eine unbedingte Voraussetzung. In Phenoloxidase-katalysierten Reaktionen sollte die Aminierung von einfach alkylsubstituierten Brenzkatechinen und Hydrochinonen sowie mehrfach-substituierten ein- bzw. zweikernigen dihydroxylierten Aromaten mit aliphatischen sowie alicyclischen Amindonoren untersucht werden. Im Mittelpunkt der Betrachtungen standen dabei die Aufklärung von Reaktionsmechanismen bei homo- und heteromolekularen Kopplungsreaktionen sowie die Prüfung des Einflusses verschiedener Reaktionsparameter (u.a. Hydroxylierungspositionen der Enzymsubstrate, Substituenten, Eduktkonzentrationen, Katalysatoren, pH-Werte der Reaktionssysteme, Lösungsmittel) auf die Nebenreaktionen und Ausbeuten der anvisierten Zielverbindungen (sekundäre Amine). Eine strukturchemische Analyse der Syntheseprodukte war dazu unerlässlich.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gefürchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist für eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an verändernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Veränderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivität führt. Außerdem stellt die Fähigkeit, Resistenzen gegen gegenwärtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. Für ein vollständiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivitäten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der Enzyme des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und stationären Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden für die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugeführt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazelluläre Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und stationären Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme für Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH über Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivität im Citrat-Zyklus hinweist. Möglicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einführung von Aminosäuren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten Säuregärung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivitäten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen befähigt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose über die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer höheren spezifischen Enzymaktivität der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier hauptsächlich über Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivität unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivitäten gemessen. Außerdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivitäten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel für metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden können. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die Möglichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. Für ein allumfassendes Verständnis ist es wichtig, Enzymaktivitäten zu untersuchen.
Gout was described by Hippocrates in the 5th century BC as a disease of rich people and linked with excess food and alcohol. It is caused by long-lasting hyperuricemia, which is a result of an imbalance between excretion and production of uric acid. The surplus of uric acid leads to deposition of monosodium urate crystals in the joints, which can initiate a painful inflammation called a gout attack. Despite various pharmacological treatments for this disease, a low purine diet remains the basis of all gout therapies. Since food is rich in purines, the aim of this project was to develop a novel enzyme system to decrease the purine content of food, what should result in reduced serum urate concentration in patients with hyperuricemia. The system consists of five degrading enzymes (adenine deaminase, guanine deaminase, xanthine oxidoreductase, urate oxidase and purine nucleoside phosphorylase) that combined in one product are able to hydrolyse all purines to a highly soluble allantoin, which can be easily removed from the body. This approach provides the patients a possibility to reduce the symptoms and frequency of gout attacks or even doses of prescribed drugs. In order to obtain necessary system components, yeast Arxula adeninivorans LS3 was screened for enzyme activities. A. adeninivorans is known to utilise various purines and this ability is a result of activity of desired enzymes, two of which, adenine deaminase and xanthine oxidoreductase, are in focus of this thesis. The analysis of growth of A. adeninivorans on various carbon and nitrogen sources gave the first insight into the cells’ nutrient preferences indicating the presence of purine degrading enzymes, such as adenine deaminase and xanthine oxidoreductase. Purines, such as adenine and hypoxanthine, could be utilised by this yeast as sole carbon and nitrogen sources and were shown to trigger the gene expression of the purine degradation pathway. Enzyme activity tests and quantitative real-time PCR method allowed for identification of the best inducers for adenine deaminase and xanthine oxidoreductase, as well as their concentration and time of induction. The adenine deaminase (AADA) and the xanthine oxidoreductase (AXOR) genes were isolated and subjected to homologous expression in A. adeninivorans cells using Xplor®2 transformation/expression platform. The selected transgenic strains accumulated the recombinant adenine deaminase in very high concentrations. The expression of AXOR gene posed difficulties and remained a challenge. Additional expression of both proteins in alternative E. coli system was undertaken but failed for AXOR gene. The recombinant adenine deaminase and wild-type xanthine oxidoreductase were purified and characterized biochemically. The characterization included determination of optimal pH and temperature, stability in different buffers and temperatures, molecular weight, substrate spectrum, enzyme activators and inhibitors, kinetics and intracellular localisation. The determination of these parameters was necessary to ensure optimal conditions for application of these enzymes in the industry. At the final stage, the enzymes were combined in one mix with provided guanine deaminase and urate oxidase and used to degrade purines in selected food constituents. The application was successful and demonstrated the potential of this approach for the production of food with lower purine concentration.
Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Senkung der Harnsäurekonzentration im Blutserum von Patienten mit Hyperurikämie und der damit verbundenen Verringerung der Anzahl von schmerzhaften Gichtanfällen. Dafür sollten Purine in Lebensmitteln mit einem Gemisch aus purinabbauenden Enzymen zu dem gut löslichen Allantoin abgebaut werden. Durch diesen neuen Ansatz ist eine abwechslungsreiche Ernährung von Hyperurikämiepatienten ohne oder mit reduzierter zusätzlicher medikamentöser Behandlung zur Senkung der Harnsäurebildung, Erhöhung der Harnsäureausscheidung bzw. enzymatischen Reduktion von Harnsäure möglich. Die Analyse des Wachstumsverhaltens von Arxula adeninivorans LS3 zeigte die Vermehrung des Zellmaterials in einer Kultivierung mit Adenin als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bzw. mit Hypoxanthin und Harnsäure als alleiniger Stickstoffquelle. Die Fähigkeit des Wachstums mit Adenin, Hypoxanthin oder Harnsäure als alleiniger Stickstoffquelle bestätigte das Vorhandensein des Purinabbauweges in der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans LS3. Das Guanin-Deaminase-Gen (AGDA) aus A. adeninivorans LS3 kodierte für ein Protein aus 475 Aminosäuren, das in der Zelle als Dimer vorlag (55 kDa je Untereinheit). Das Guanin-Deaminase-Protein (Agdap) zeigte eine Homologie auf Aminosäureebene zwischen 44 und 55 % zu anderen pilzlichen Guanin-Deaminasen. Beim Wachstum auf Medien mit Adenin, Hypoxanthin oder Guanin als alleiniger Stickstoffquelle erfolgten eine Induktion der Genexpression des AGDA-Gens sowie eine intrazelluläre Akkumulation des Guanin-Deaminase-Proteins in der Vakuole wie auch dem Zytoplasma der Hefezelle. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die biochemische Charakterisierung der Uratoxidase. Das Uratoxidase-Gen (AUOX) aus A. adeninivorans LS3 lag auf Chromosom 4 und kodierte für das Uratoxidase-Protein (Auoxp) mit 306 Aminosäuren. Bei dem Auoxp handelte es sich um ein 35 kDa großes Protein, das als Dimer in der Zelle vorlag. Ein Vergleich mit anderen pilzlichen Uratoxidasen ergab eine Homologie von 61 bis 65 % auf der Ebene der Aminosäuresequenz. Das Enzym zeigte konservierte Sequenzmotive, die in den Uratoxidasen einer Vielzahl von Organismen beschrieben wurden. Die AUOX-mRNA-Konzentration stieg bei Wachstum auf Medien mit Harnsäure, Adenin und Hypoxanthin als alleiniger Stickstoffquelle. Die Akkumulation von Auoxp zeigte einen Maximalwert nach achtstündiger Kultivierung im Medium mit Harnsäure und zeitlich verschoben mit den Stickstoffquellen Adenin bzw. Hypoxanthin (nach 12 Stunden). Der biotechnologische Einsatz der purinabbauenden Enzyme der Hefe A. adeninivorans erforderte eine Überexpression der Uratoxidase- bzw. der Guanin-Deaminase-Gene in transgenen A. adeninivorans-Stämmen aufgrund zu niedriger, natürlicher Expressionshöhe im Wildtypstamm LS3. Als Transformations-/Expressionssystem fand das etablierte Xplor®2-Vektorsystem Verwendung. Diese Plattform bietet den Vorteil, dass keine Resistenzgene in die Hefe übertragen werden. Die Hefen wurden mit unterschiedlichen Expressionsmodulen transformiert, um die optimalen Expressionsbedingungen für die Guanin-Deaminase bzw. die Uratoxidase zu ermitteln. Vergleichende Untersuchungen bezüglich der Integrationshäufigkeit, dem Wirtsorganismus (homolog/heterolog) und der optimalen Expression (konstitutiv/induziert) zeigten, dass A. adeninivorans ein geeigneter Organismus für die Expression des Guanin-Deaminase- bzw. Uratoxidase-Gens darstellte. Für weiterführende Analysen erfolgte die nähere Untersuchung der Hefetransformanden mit der höchsten Guanin-Deaminase-Aktivität bzw. der über einen längeren Zeitraum konstant hohen Uratoxidase-Aktivität. Das über den C-terminalen His-Tag gereinigte rekombinante Protein zeigte eine hohe Übereinstimmung der biochemischen Eigenschaften (Substratspektrum, intrazelluläre Lokalisation, usw.) im Vergleich zum endogenen Protein der Hefe A. adeninivorans LS3 (nach induzierter Genexpression). Die rekombinanten Enzyme des Purinabbauweges (Uratoxidase, Guanin-Deaminase, Adenin-Deaminase und Xanthin-Oxidoreduktase) bewirkten nach deren Zugabe zu einem reinen Puringemisch aus Adenin, Guanin, Xanthin, Hypoxanthin und Harnsäure eine Reduktion der Konzentration sämtlicher Purine. Das Gemisch aus purinabbauenden Enzymen der Hefe A. adeninivorans belegte bei ersten Anwendungen in einem Lebensmittel (Rinderbrühe) die abbauende Wirkung auf sämtliche, im Lebensmittel befindlichen, Purine. Es gelang in dieser Arbeit, den Puringehalt eines Lebensmittels mit in transgenen A. adeninivorans-Stämmen hergestellten Proteinen enzymatisch abzubauen.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Kristallstrukturanalysen der ersten bakteriellen Chalconisomerase (CHI) bilden die Grundlage für das strukturelle Verständnis der Flavonoiddegradation von Eubacterium ramulus. Das Enzym zeigt eine offene und eine geschlossene Lid-Konformation, die das aktive Zentrum vollständig vom Solvens abgrenzt. Durch SAXS-Messungen konnte gezeigt werden, dass sich diese beiden Konformationen im Solvens in einem dynamischen Gleichgewicht befinden und nur eine geringe Energiebarriere zur Schließung überwunden werden muss. Die Lokalisation des aktiven Zentrums konnte durch Cokristallisation mit dem Substrat (2S)-Naringenin bewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus konnte durch Mutagenese-Studien und spezifischen 1H/2H-Austausch durch NMR bewiesen werden. Trotz jeglicher fehlender funktionaler Verwandtschaft zeigt die Tertiärstruktur der bakteriellen CHI große Ähnlichkeiten zu der ferredoxin-like Faltung der Chloritdismutase aus Dechloromonas aromatica und dem mit Stress verbundenen Protein SP1 aus Populus tremula. Ein Vergleich der bakteriellen CHI mit der pflanzlichen CHI von Medicago sativa zeigt, dass deren 3D-Struktur in keinem verwandtschaftlichen Verhältnis steht. Dies suggeriert eine konvergente Evolution der beiden Chalconisomerasen ausgehend von unterschiedlichen Vorläuferproteinen. Anhand von Strukturaufklärungen der (R)-selektiven Amin-Transaminase aus Aspergillus fumigatus konnten erste Informationen über die strukturellen Voraussetzungen zur (R)-Selektivität dieser neuen Enzymklasse gewonnen werden. Die in silico Experimente zeigen, dass ähnlich zu den BCATs und D-ATAs das aktive Zentrum der (R)-ATA in eine große und eine kleine Bindetasche unterteilt ist. Dies konnte strukturell über den Inhibitorkomplex verifiziert werden. Die De-/Protonierung des Substrates durch das katalytische aktive Lys179 kann ausschließlich von der si-Seite erfolgen, sodass es zur Bildung des (R)-Enantiomers kommt. Der Mechanismus zur Bindung polarer Substrate (dual substrate recognition) wurde durch einen kovalenten Inhibitorkomplex und Mutagenese-Studien belegt und ist auf ein konserviertes Arginin im active site loop zurückzuführen.
Within this thesis the protein engineering, immobilization and application of enzymes in organic synthesis were studied in order to enhance the productivity of diverse biotransformations. Article I is a review about Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) and provides a detailed overview of the most recent advantages in the application of that enzyme class in biocatalysis. Protein engineering of a former uncharacterized polyol-dehydrogenase (PDH) identified in the mesothermophilic bacterium Deinococcus geothermalis 11300 is described in Article II. Article III covers the combination of one PDH mutant with a BVMO in a closed-loop cascade reaction, thus enabling direct oxidation of cyclohexanol to ε-caprolactone with an internal cofactor recycling of NADP(H). Article IV and Article V report a process optimization for transamination reactions due to a newly developed immobilization protocol for five (S)- and (R)-selective aminotransferases (ATA) on chitosan support. Furthermore, the immobilized ATAs were applied in asymmetric amine synthesis. In Article VI, an ATA immobilized on chitosan, an encapsulated BVMO whole cell catalyst and a commercially available immobilized lipase were applied in a traditional fixed-bed (FBR) or stirred-tank reactor (STR), and were compared to a novel reactor design (SpinChem, SCR) for heterogeneous biocatalysis.