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Der Sepsis sowie einer Reihe von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose und Diabetes mellitus Typ 1 ist, ebenso wie zahlreichen weiteren Krankheitsbildern, gemein, dass für diese eine Beteiligung der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) an deren Pathogenese durch exzessive Freisetzung von Stickstoffmonoxid bewiesen ist bzw. diskutiert wird. Die Auffindung von effektiven und selektiven Inhibitoren der iNOS stellt einen möglichen, erfolgversprechenden Ansatz dar, zumindest die Symptomatik dieser Erkrankungen positiv zu beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue Wirkstoffe als potentielle Inhibitoren der iNOS zugänglich gemacht und auf ihre Aktivität getestet werden. Ein wesentlicher Ansatzpunkt für das Wirkstoff-Design ist die strukturelle Modifikation des natürlichen Substrats der iNOS, der Aminosäure Arginin. Ein bekannter Arginin analoge Hemmstoff der iNOS ist Aminoguanidin. Das Konzept der vorliegenden Arbeit zur strukturellen Abwandlung dieses Moleküls beinhaltete dessen Integration in ein heterobicyclisches System, mit dem Ziel, die Flexibilität der Aminoguanidin-Struktur herabzusetzen, um somit die Hemmwirkung und die iNOS-Spezifität zu verbessern. Die bisher wenig erschlossene Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine erschien sehr gut geeignet, dieses Konzept zu realisieren. So wurden verschieden substituierte Vertreter dieses Grundkörpers als Analoga zu Aminoguanidin dargestellt. Als Hauptsyntheseroute wurde die Darstellung von Hexahydro[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen über Ringschluss von Hexadyro-1-carbothioamid mit Aldehyden / Ketonen verfolgt. Anschließend wurden diese durch S-Methylierung mit Iodmethan zu 1-Methylsulfanyl-5,6,7,8-tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen umgesetzt und schließlich mittels S-N-Austausch Tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazin-1-amine dargestellt. Die erhaltenen Vertreter der Zielverbindungen aller Synthesestufen wurden auf ihre Aktivität gegenüber der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase und mögliche zytotoxische Effekte mittels eines Zellkultur-Modells getestet. Im Ergebnis der chemisch-synthetischen und strukturanalytischen Arbeiten wurde eine Vielzahl von Verbindungen mit [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-Struktur einschließlich entsprechender Vorstufen neu- bzw. resynthetisiert. Alle Verbindungen wurden umfassend strukturanalytisch charakterisiert. So war es möglich eine umfangreiche Substanzbibliothek mit diversen Substitutionsmustern zu generieren, welche für die Überprüfung der generellen Eignung von Abkömmlingen des [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazins als Inhibitoren der induzierbaren NO-Synthase genutzt werden konnte. Für diese biologischen Untersuchungen zur Inhibition der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) durch die synthetisierten Titelverbindungen wurde ein optimiertes Zellkultur-Testverfahren unter Verwendung der Ratten-Insulinom Zelllinie RINm5F für den Arbeitskreis etabliert. Diese wurden mit den proinflammatorischen Zytokinen Interleukin-1β und Interferon-γ zur Expression von induzierbarer NO-Synthase stimuliert. Nach der Inkubation mit den potentiellen Hemmstoffen wurde die verbleibende NO-Produktion der Zellen durch Ermittlung der Nitritkonzentration im Überstand bestimmt. Anschließend wurde an den bereits behandelten Zellen auf mögliche Zytotoxizität der Substanzen durch einen MTT-Assay getestet. Mit diesem Verfahren wurden eine Reihe der Titelverbindungen bezüglich ihrer iNOS-hemmenden und zytotoxischen Eigenschaften untersucht. Davon inhibierten etliche in Position 3 unterschiedlich substituierte [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-1-thione dem Aminoguanidin vergleichbar oder stärker die NO-Produktion der iNOS bei nur geringem, zytotoxischem Effekt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine mit einer breiter Palette von Derivaten synthetisch zu erschließen und eine iNOS-inhibierende Wirkung für eine Anzahl von Vertretern zu belegen.
Neu isolierte und synthetisierte Wirkstoffe müssen neben ihrer biologischen Wirksamkeit auch auf ihre Unbedenklichkeit für den Menschen hin untersucht werden. Ein Bestandteil der Untersuchungen zur Unbedenklichkeit ist die Prüfung auf mögliche Immuntoxizität. Die Risikobewertung und -klassifizierung von (immun-)toxischen Substanzen erfolgt derzeit in Tierversuchen, die, abgesehen von ethischen Bedenken, zeit- und kostenintensiv sind und deren Übertragbarkeit auf den Menschen nicht vollständig gewährleistet ist.
Im Fokus dieser Arbeit stand die Etablierung und Anwendung eines Methodensets basierend auf funktionalen in vitro Methoden zur Charakterisierung immunologischer Wirkungen ausgewählter Naturstoffe. Dieses sollte der Beurteilung der immuntoxischen Wirkungen der getesteten Naturstoffe und der Entwicklung eines Entscheidungsbaums, der die Vorhersage des immuntoxischen Potentials mithilfe von in vitro Versuchen gestattet, dienen. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien (Jurkat-Zellen als Beispiel für T-Zellen, THP-1-Zellen als Beispiel für Monozyten) und für einige Versuche vergleichsweise primäre Blutzellen eingesetzt. Es wurden Methoden zur Untersuchung folgender Parameter etabliert und angewendet: Vitalität, Zellzyklusverteilung, Induktion von Apoptose, iROS, DNA-Schäden (Genotoxizität), Zytokinfreisetzung und mitochondriale Funktion. Folgende Naturstoffe wurden für die Untersuchungen ausgewählt: Mannitol und Urethan als Negativkontrollen, Cyclosporin A, Deoxynivalenol und Mycophenolsäure als Positivkontrollen, ausgehend von Hinweisen auf Wirkungen im Immunsystem Tulipalin A, Helenalin, Vincristin, Cannabidiol, Agaritin und p-Tolylhydrazin als Testsubstanzen.
Es zeigten sich nur geringfügige Unterschiede der Substanzwirkungen zwischen den Immunzelllinien, welche v.a. auf Zytokinebene nachweisbar waren. Die Substanzen besaßen zeit- und konzentrationsabhängige Effekte. Die Negativkontrolle Mannitol hatte eine geringe Wirkung auf die Immunzelllinien, während Urethan die Zytokinfreisetzung supprimierte/¬stimulierte. Die untersuchten Positivkontrollen zeigten einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung und führten weiterhin zu immuntoxischen Effekten durch eine konzentrationsabhängige Apoptoseinduktion. Die Testsubstanzen Vincristin, Agaritin und p-Tolylhydrazin besaßen nur eine geringe toxische Wirkung auf die Immunzellen. Weitere Substanzen wie Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A wiesen immunspezifisch und - unspezifisch vermittelte Immuntoxizität durch einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung, Apoptose und iROS auf.
Funktionale in vitro Untersuchungen zur Vitalität, Zellzyklusverteilung, Apoptose und Zytokinfreisetzung waren zum Nachweis bzw. Ausschluss von Immuntoxizität geeignet und neben Proteom- und Metabolomanalysen wesentlicher Bestandteil eines Entscheidungsbaums zur Klassifizierung von direkt immuntoxischen Substanzen. Es zeigte sich, dass die Zytokinmessung der wichtigste Parameter zur Klassifizierung von immuntoxischen Substanzen im subtoxischen Bereich ist. Es konnte sowohl Cyclosporin A als Positivkontrolle als auch Mannitol als Negativkontrolle in beiden Zelllinien bestätigt werden. Von den hinreichend untersuchten Testsubstanzen wurde Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A in Jurkat-Zellen sowie Cannabidiol und Tulipalin A in THP-1-Zellen unter Verwendung des Entscheidungsbaums als immuntoxisch klassifiziert.
Darüber hinaus konnte die hautsensibilisierende Wirkung von Farnesol und Tulipalin A durch Anwendung von weiteren in vitro Methoden bestätigt werden.
Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Vorscreening Testung neuer Substanzen ermöglichen und nicht nur zu einer Reduktion von Tierversuchen führen, sondern auch eine Zeit- und Kostenersparnis bedeuten.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
In Anbetracht der zunehmenden UV-Intensität und des Wissens um die Spätfolgen jedes einzelnen Sonnenbrandes besteht ein großes Interesse an UV-protektiven Wirkstoffen. Daher war es Ziel dieser Arbeit, neue Wirkstofflieferanten aus der Natur für diese Anwendung zu identifizieren. Ein breites Spektrum von verschiedenen Organismen wurde auf ihre protektiven oder regenerativen Effekte auf UVB-behandelte Keratinozyten hin gescreent und anschließend vielversprechende Naturstoffe ausgewählt und genauer untersucht. Zusätzlich war die Auffindung von vitalitätssteigernden sowie zytotoxisch wirkenden Extrakten und Reinstoffen von Interesse. Dazu wurden zunächst in vitro Testmodelle auf Basis der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT etabliert und die Wirkung von UVB-Strahlung auf diese Zellen charakterisiert. Genutzt wurden der MTT-Assay zur Bestimmung der Vitalität und Proliferation, der Neutralrot-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran und Proliferation und der Lactatdehydrogenase-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran. Mittels Durchflusszytometer wurden Zellzyklusanalysen durchgeführt, sowie zur Erfassung von DNA-Schäden die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay), außerdem wurde mit Hilfe des Interleukin-6-Assays die zelluläre Zytokinproduktion gemessen. Nach Bestrahlung der HaCaT-Zellen mit UVB ergaben sich zeit- und dosisabhängig folgende wesentliche Effekte: Ein leichter G2/M-Arrest bei geringeren UVB-Dosen (10mJ/cm2-30mJ/cm2), ein G0/G1-Arrest bei höheren UVB-Dosen (50mJ/cm2 und 100mJ/cm2), die dosisabhängige Zunahme des subG1-Peaks (Apoptoseinduktion), die Zunahme der LDH-Freisetzung mit steigender UVB-Dosis, die Stimulation der IL-6-Produktion mit steigender UVB-Dosis, sowie eine dosisabhängige Schädigung der DNA sowohl sofort nach UVB-Bestrahlung als auch nach 24 stündiger Inkubation. Nach Testung verschiedener UVB-Dosen und unterschiedlicher Inkubationszeiten wurde zur Untersuchung der Naturstoffe mit einer Dosis von 20mJ/cm2 UVB und einer Inkubationszeit von 24 Stunden gearbeitet. Die Testung auf UV-protektive Wirkungen der Extrakte gegenüber DNA-Schäden anhand des Comet Assays erfolgte direkt nach UVB-Bestrahlung. In dieser Arbeit wurden insgesamt 100 verschiedene Extrakte und 12 Reinsubstanzen allein oder in Kombination mit UVB-Strahlung untersucht. Die getesteten Naturstoffe stammten von Algen, Cyanobakterien, terrestrischen und marinen Pilzen, sowie von Pflanzen. Im Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse aufgelistet: Eine vitalitätssteigernde Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 33 Extrakte und Reinsubstanzen. Durch die Inkubation mit 12 Naturstoffen konnte ein Serummangel-induzierter G0/G1-Zellzyklusphasenarrest bei den HaCaT-Zellen verhindert oder überwunden werden. Ein durch UVB-Strahlung induzierter G2/M-Zellzyklusarrest konnte durch Inkubation der Zellen mit 9 Naturstoffen verhindert oder überwunden werden. 11 Naturstoffe führten zu einer verminderten Lactatdehydrogenase-Freisetzung UVB-bestrahlter Zellen. 5 Naturstoffe hemmten die UVB-induzierte IL-6-Produktion der Zellen. 15 Naturstoffe führten auf unterschiedlichen Wegen zu einer Verminderung UVB-bedingter DNA-Schäden an HaCaT-Zellen. Eine zytotoxische Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 58 Extrakte und Reinsubstanzen Anhand der Ergebnisse sind die drei terrestrischen Pilze Inonotus nodulosus, Piptoporus betulinus und Tricholoma equestre, sowie die beiden Pflanzen Annona muricata und Harpephyllum caffrum aussichtsreiche Kandidaten für eine zukünftige Anwendung als Hautschutz- oder Hautpflegemittel. Des Weiteren haben auch die Extrakte von Nannochloropsis spec., Ganoderma lucidum, Ganoderma pfeifferi, Hydnotrya michaelis, Tricholoma populinum und Tamarix aphylla auffällige Ergebnisse geliefert und verdienen weiteres Interesse. Die Ergebnisse zeigen die Eignung der etablierten Testmodelle zur Auffindung von Wirkstoffen mit UV-protektiven und weiteren Effekten auf Hautzellen. Gleichzeitig wird auch das große Potential von Organismen verschiedener Gruppen zur Bildung von Naturstoffen mit derartigen Eigenschaften deutlich.