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Thrombozyten reagieren auf Infektionen, unter anderem auf die mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). Dabei zeigt sich eine erhöhte Rate an kardiovaskulären und thrombotischen Ereignissen. Die medikamentöse Therapie hemmt unter anderem die reverse Transkriptase der HI-Viren. Allerdings wirken diese Arzneimittel auch auf die humanen Thrombozyten. Diese besitzen eine endogene reverse Transkriptase. Eine solche ist in den Blutplättchen in Form von Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE-1) Ribonukleinsäure (RNA) als Grundlage für die Translation vorhanden. Auch die entsprechenden Proteine sind als Open Reading Frame 1 (ORF1) und Open Reading Frame 2 (ORF2) - Proteine nachweisbar. Diese kodieren unter anderem für eine Endonuklease, Chaperone und reverse Transkriptase. Letztgenannte ist in den Blutplättchen auch aktiv. Folglich sind humane Thrombozyten in der Lage RNA in Desoxyribonukleinsäure (DNA) umzuschreiben. Dem Dogma der Molekularbiologie folgend, besitzen Zellen ohne Nucleus keine DNA. Auf Grund des Vorhandenseins einer endogenen reversen Transkriptase in humanen Thrombozyten konnte erstmals DNA in Form von Gewebsthromboplastin und Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator Rezeptor (uPAR) nachgewiesen werden.

Protamine (PRT) is a positively charged protein, which is widely used in medicine as an adjunct to certain preparations of insulin and as a rapidly-acting antidote for heparin, particularly to neutralize the effects of high heparin concentrations needed for anticoagulation during cardiac surgical procedures using cardiopulmonary bypass. It has been demonstrated that PRT and heparin form multimolecular complexes and that these complexes have high immunogenicity in a mouse model. Studies in this thesis provide new insights into the pathophysiology of anti-PRT/heparin antibodies. The results of study I showed that the administration of PRT combined with heparin is responsible for high immunoglobulin G (IgG) immunization after cardiac surgery. A subset of these antibodies was able to induce platelet activation in a way similar to that observed by heparin-induced thrombocytopenia (HIT). Using an animal model, we demonstrated that anti-PRT/heparin antibodies are capable of platelet destruction in the presence of PRT and heparin. Moreover, our data suggests that platelet-activating anti-PRT/heparin antibodies at surgery are potentially associated with postoperative thrombocytopenia and an increased risk for thromboembolic events. In study II, the immune response against PRT/heparin complexes was investigated. This study showed a relatively fast development of IgG with no general preceding IgM formation. In addition, patients undergoing liver transplantation developed anti-PRT/heparin antibodies without previous exposure to PRT. These results suggest that a previous contact with the antigen(s) itself or other antigens with molecular mimicry induced this immune response. In fact, we were able to identify Neutral Protamine Hagedorn (NPH) insulin and core histones (DNA-binding proteins) as potentially antigenic candidates for a previous immunization. Furthermore, the findings of study III demonstrate the ability of anti-PRT/heparin antibodies to activate platelets in the presence of NPH insulin in a heparin-dependent way suggesting that diabetic patients may have an enhanced risk for thromboembolic complications if treated with NPH insulin and possibly while receiving prophylactic heparin. These observations justify further clinical investigations to assess the impact of the interaction between anti-PRT/heparin antibodies and PRT-mimicking antigens, such as NPH insulin or histones.

Die chronische arterielle Hypertonie erhöht das Risiko für kardiovaskuläre Komplikationen wie Schlaganfall und Myokardinfarkt. In der Pathophysiologie dieser Komplikationen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle. Hierbei gehen die meisten Experten derzeit davon aus, dass Thrombozyten mit den durch die Hypertonie geschädigten Gefäßwänden reagieren. Ziel unserer Untersuchungen war es, zu untersuchen, ob durch die Hypertonie auch Veränderungen in Thrombozyten entstehen. Thrombozyten zirkulieren im Kreislauf in engem Kontakt mit der Gefäßwand und reagieren sensibel auf hohe Scherkräfte und aktivierte Endothelzellen. Jede Aktivierung, auch in reversiblen Frühstadien führt dabei zu Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der Thrombozyten, dem Proteom. Da sie keinen Kern haben, ist die Proteinneosynthese in Thrombozyten stark limitiert. So „speichern“ Thrombozyten Informationen über ihre Aktivierungshistorie während ihrer zehntägigen Überlebenszeit, da die veränderten Proteine nicht, oder nur sehr eingeschränkt durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden. Proteomics bietet einen Ansatz, über tausend Proteine gleichzeitig zu untersuchen. Mittels zweidimensionaler, differentieller in Gel Elektrophorese (2D-DIGE) kann dabei ein sensibler quantitativer Vergleich zweier Proben erfolgen. Die komplexe Methodik erfordert jedoch eine hochgradige Standardisierung der Versuchsgruppen. In diesem Projekt wurde daher ein Tiermodell verwendet, um die ca. 1000, mittels 2D-PAGE dargestellten Proteinspots des Thrombozytenzytosols auf hypertoniebedingte Veränderungen zu untersuchen. Dabei wurden zwei unterschiedliche Rattenmodelle der Hypertonie eingesetzt um die Aussagekraft zu erhöhen. Nach 14tägiger Hypertoniephase wurden 45 Proteinspots detektiert, deren Intensität in beiden Rattenmodellen signifikant verändert war. Die Identifikation dieser Spots mittels Massenspektrometrie zeigte neben spezifischen Thrombozytenproteinen v.a. Zytoskelett- und Zytoskelett -assoziierte Proteine. Wurde an die 14tägige Hypertoniephase eine 10tägige Erholungsphase angeschlossen, waren diese Veränderungen nicht mehr nachweisbar. Überraschenderweise waren die beobachteten Veränderungen unterdrückbar durch mehrmalige Blutentnahme vor- und während der Hypertoniephase. Dabei wurden 8 Tage vor-, sowie zweimal während der Hypertoniephase (Tage 3 und 10) 3 ml Blut entnommen. Die daraufhin durchgeführte Untersuchung auf Veränderungen des Thrombozytenproteoms durch Blutentnahmen an normotensiven Tieren zeigte ein Muster an Veränderungen, dass dem unter Hypertonie beobachteten entgegengesetzt war. Eine denkbare Ursache für diese Beobachtung ist, dass die Thrombozytopoese durch die mehrmaligen Blutverluste gesteigert wurde. Die so vermehrt ausgeschütteten „jungen“ Thrombozyten zeigen ein inverses Proteommuster, gegenüber den durch Hypertonie gestressten Thrombozyten. Um dieser Hypothese nachzugehen wurden Ratten mit dem Thrombopoetinrezeptoragonisten Romiplostim behandelt. Das Thrombozytenproteom von Ratten nach Stimulation der Thrombozytopoese ähnelt dem von Ratten nach mehrmaligen Blutentnahmen. Dies unterstützt unsere Hypothese, dass die durch Blutentnahmen bedingten Proteomveränderungen auf eine gesteigerte Thormobzytopoese zurückzuführen sind und damit auf das gesteigerte Vorkommen junger Thrombozyten im Blutkreislauf. Veränderungen des Thrombozytenproteoms, die in beiden Tiermodellen unter Hypertonie auftraten, können mit großer Sicherheit auf die Hypertonie zurückgeführt werden. Zu beachten ist allerdings, dass beide Modelle auf einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems (RAAS) basieren. Es kann also nicht differenziert werden, ob die Veränderungen durch die Hypertonie selbst oder durch das aktivierte RAAS verursacht wurden. Die Tiermodelle spiegeln somit nur eine Subgruppe der Hypertoniepatienten wider. Wir haben mit diesen Experimenten Thrombozyten-Proteine identifiziert, die sich durch einen erhöhten Blutdruck verändern. Diese Proteine sind daher potentielle Kandidaten für Biomarker, die eine Aussage über den Blutdruckverlauf der zurückliegenden Tage ermöglichen. Solch ein Marker, ähnlich dem HbA1c beim Diabetes mellitus, könnte die Hypertoniediagnostik erheblich erleichtern. Für die in dieser tierexperimentellen Studie identifizierten Proteine finden sich analoge Proteine in menschlichen Thrombozyten. Deren Veränderung durch Bluthochdruck sollte in Fall/Kontroll-Studien am Menschen untersucht werden. In Ergänzung zum im Journal of Hypertension veröffentlichten Artikel wird in der vorliegenden deutschen Zusammenfassung detaillierter auf die Methoden eingegangen. Darüber hinaus werden zusätzliche Aspekte in der Diskussion angesprochen.

Die Ansichten über die Funktion der Thrombozyten unterliegen derzeit einem Wandel. Neben dem Verschluss von Endothelläsionen spielen sie eine Rolle in der Pathologie der Artherosklerose, der Endokarditis und weiterer Erkrankungen und es existieren Hinweise auf eine Beteiligung bei der Immunantwort über die Expression von CD40L (Elzey et al., 2003). Ihre übermäßige Aktivierung und damit ihr Verbrauch bei der DIC sind noch nicht endgültig aufgeklärt. Zu dieser schwerwiegenden Komplikation im Gerinnungssystem kann es unter anderem durch eine Bakteriämie bzw. Sepsis mit dem grampositiven Erreger Staphylococcus aureus kommen, der in jüngster Zeit durch eine weit reichende Resistenzentwicklung in den Mittelpunkt der Forschung gerückt ist. Die Sepsis ist mit einer Letalität von 30 – 50% trotz modernster Intensivmedizin weiter ein ernstes Problem und grampositive Erreger wie S. aureus verursachen einen großen Anteil der Fälle (Moerer et al., 2004). Die Interaktion von Thrombozyten und S. aureus wurde bisher immer unter dem Aspekt des direkten Kontakts dieser Zellen untersucht, jedoch scheint auch eine Betrachtung der Sekretionsprodukte und ihrer Auswirkungen auf Thrombozyten wegweisend, denn nicht immer ist bei Auftreten von septischen Gerinnungskomplikationen eine Bakteriämie nachweisbar. In dieser Arbeit sollte daher die thrombozytenaktivierende Wirkung von Sekretionsprodukten von S. aureus untersucht werden, es sollte eine Annäherung an die Identität dieser Substanzen erfolgen und es sollte geklärt werden, ob der menschliche Organismus Abwehrmechanismen gegen diesen spezifischen Angriffsweg besitzt. Dazu wurden 20 kommensale und 20 invasive (aus Blutkulturen gewonnene) Isolate von S. aureus sowie die Laborstämme RN6390, RN6911 (RN6390Δagr) und ALC136 (RN6390ΔsarA) bis zur stationären Wuchsphase kultiviert und ihr zellfreier Kulturüberstand untersucht. Das Sekretom von RN6390 und seiner regulatordefizienten Mutanten ist bekannt (Ziebandt et al., 2001). Die Thrombozytenaggregation wurde größtenteils in einem einfachen Funktionstest mit gewaschenen Thrombozyten gemessen. Weitere Tests wurden mit gewaschenen Erythrozyten durchgeführt. 60% der Isolate sezernieren thrombozytenaggregationsauslösende Substanzen, dabei ist die Herkunft des Isolats (kommensal oder invasiv) und die im Kulturüberstand enthaltene Gesamtproteinmenge nicht entscheidend. 35% der Isolate sezernieren ausreichend hämolysierende Substanzen, dies ist ebenfalls unabhängig von ihrer Herkunft. Die zellaktivierenden Substanzen waren hitzeempfindlich, daher konnten Zellwandbestandteile wie Lipoteichonsäure oder Peptidoglykane als Verursacher ausgeschlossen werden. Mittels PCR wurden die genetischen Anlagen der verschiedenen Hämolysine der Isolate untersucht. Die thrombozytenaggregierende und hämolysierende Wirkung von alpha-Toxin konnte in dieser Arbeit nachvollzogen werden (Bhakdi et al., 1991). Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass verschiedene Protease-Typen von S. aureus an der Thrombozytenaggregation beteiligt sind. Diese Ergebnisse konnten bei der Untersuchung von RN6390 und seiner Mutanten bestätigt werden. Die aggregationsauslösenden Substanzen sind positiv durch den globalen Genregulator agr reguliert. Eine Koinkubation mit Serum, aus Serum gewonnenen IgG und IgG-Präparationen führte zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung der Aggregation ausgelöst durch bakterielle Kulturüberstände. Insgesamt handelt es sich bei der durch Sekretionsprodukte von S. aureus ausgelösten Thrombozytenaggregation um ein multifaktorielles Geschehen, welches zur Pathogenese der Gerinnungsstörungen bei einer Sepsis oder Infektion beitragen kann. Die Aggregation kann durch im Serum enthaltene IgG in vitro gehemmt werden. In weiteren Untersuchungen muss die genaue Identität dieser Antikörper gefunden werden. Dies kann als neuer Ansatzpunkt in der Behandlung der Gerinnungskomplikationen während eine S. aureus- Sepsis dienen, zusätzlich zu bisherigen Strategien der Substitution und medikamentösen Intensivtherapie.