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In unserem Alltag sind Polymere weit verbreitet. In Form von funktionellen Polymeren werden sie u.a. als Wirk- oder Effektstoff eingesetzt. Sie bestehen aus einem Träger, an welchen über einen Spacer eine funktionelle Gruppe gebunden ist. Die Spacergruppen beeinflussen die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Polymere bzw. ermöglichen diese erst. Dadurch stellen sie in der pharmazeutischen Industrie und der medizinischen Chemie Schlüsselbausteine dar.
Auch Monoester von symmetrischen Dicarbonsäuren oder symmetrischen Diolen werden für die Einführung von Spacergruppen verwendet. Sie können durch die Hydrolyse von Diestern oder Dioldiestern chemisch synthetisiert werden. Da diese Reaktion nicht selektiv erfolgt, entstehen Nebenprodukte wie Disäuren oder Diole, die die Ausbeuten schmälern und eine aufwändige Aufarbeitung notwendig machen. Selektive enzymatische Verfahren stellen eine echte Alternative dar, denn eine Trennung des Produkts vom Nebenprodukt ist nicht notwendig. Bisher sind nur wenige Enzyme bekannt und verfügbar, die zur Synthese von Monoestern verwendet werden können.
Ziel dieser Arbeit ist die Entdeckung neuer Lipasen und Carboxylesterasen als Biokatalysatoren zur Synthese von Monoestern, die zudem in ausreichender Verfügbarkeit generiert werden sollen. Als Gendonor und Expressionssystem diente hierfür die Hefe Blastobotrys raffinosifermentans. Die nicht-konventionelle, nicht-pathogene und thermotolerante Hefe B. raffinosifermentans weist ein breites Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen Spektrum auf, was sie für industrielle Anwendungen interessant macht. Aufgrund einer bereits vielfach eingesetzten, effizienten Transformationsmethode wurde die Hefe bereits zur Produktion verschiedener Proteine wie humanem Serumalbumin, Interleukin-6, Phosphatasen mit Phytase-Aktivität, Tannasen und einer Lipase eingesetzt. Die exzellenten Wachstumsparameter garantieren hohe Enzymausbeuten.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit 30 putative Lipase- und Carboxylesterase-Gene in ihrem Genom durch Annotationsanalysen identifiziert. Diese Gene wurden isoliert, amplifiziert und in der Hefe selbst überexprimiert. Die Proteinextrakte der erzeugten Stämme wurden anschließend auf Esteraseaktivität getestet, wovon sieben Kandidaten das Substrat p-Nitrophenylbutyrat (pNP-Butyrat) hydrolysierten. Anschließend wurde mittels eines Assays untersucht, ob die Enzyme die Hydrolyse der Substrate Adipinsäurediethylester (DEA), Dimethyl trans-1,4-cyclohexandicarboxylat (DMCH), Terephthalsäurediethylester (DETS) und Decandiol-dimethacrylsäureester (DDMAE) katalysieren. Vier Kandidaten hydrolysierten DEA und DMCH und ein Extrakt eignete sich zur Hydrolyse von DETS. Es folgten eine Testung auf Selektivität mittels Gaschromatographie mit gekoppeltem Flammenionisationsdetektor und eine affinitätschromatographische Reinigung der fünf Proteine. Dabei stellten sich die drei Kandidaten Alip2-6hp, 6h-Best1p und 6h-Best2p, eine putative Lipase und zwei putative Carboxylesterasen, als potenziell geeignete Kandidaten heraus.
Anschließend erfolgte die biochemische Charakterisierung der drei Proteine. Das Temperatur-Optimum der Enzyme lag zwischen 31 °C und 41 °C und das pH-Optimum zwischen 6,6 und 7,0. Die Metallionen Fe2+, Fe3+ und Cu2+ inhibierten alle drei Biokatalysatoren und auch die Zugabe verschiedener Lösungsmittel verringerte ihre Aktivität. Die Untersuchung des Substratspektrums mit p-Nitrophenylestern mit Kettenlängen von C2 bis C18 zeigte eine Präferenz von Alip2-6hp für mittelkettige pNP-Ester mit einem Maximum bei pNP-Caproat und von 6h-Best1p und 6h-Best2p für kurzkettige pNP-Ester mit einem Maximum bei pNP-Acetat. 6h-Best1p und 6h-Best2p zeigen damit das für Carboxylhydrolasen typische Substratspektrum. Da Lipasen üblicherweise langkettige Substrate bevorzugen, wurde die Klassifizierung für Alip2-6hp mittels Tween 20- und Olivenöl-Agarplattentest weiter untersucht. Das positive Ergebnis dieser Untersuchung lässt auf eine Lipase schließen.
Zur Bestimmung der Selektivität der Enzyme wurde die Hydrolyse von DEA und DMCH zeitlich per GC-FID verfolgt. Nach Derivatisierung der Carboxylgruppen war die quantitative Auswertung zum Gehalt an Monoester, Diester und Disäure möglich. Es ließ sich damit die Hydrolyse von DEA mit 6h-Best1p bestätigen. Bessere Ergebnisse wurden mit Alip2-6hp für das Substrat DMCH erzielt und mit Abstand die schnellste Hydrolyse wurde mit DEA als Substrat erreicht. In gereinigter Form hydrolysierte Alip2-6hp das Substrat DEA selektiv zu MEA, sodass bis zu 96 % Monoester synthetisiert werden konnten. Im Vergleich dazu wird MEA deutlich langsamer hydrolysiert.
Zusätzlich wurden fünf unterschiedliche Formulierungen des Enzyms Alip2-6hp mit dem Substrat DEA getestet: (1) Rohextrakt, (2) freies, gereinigtes Enzym, (3) immobilisiertes, gereinigtes Enzym (Beads) und als Ganzzellkatalysatoren (4) permeabilisierte (Triton-) Zellen und (5) permeabilisierte, immobilisierte (Triton-) Zellen. Die vielversprechendsten Ergebnisse wurden mit isoliertem gereinigtem Enzym erzielt. DEA wurde vollständig und spezifisch zu MEA umgesetzt.
Zur Gewährleistung einer ausreichenden Verfügbarkeit der Enzyme erfolgte die Kultivierung der Überexpressionsstämme im Fermenter im Fed-batch. Der Alip2-6hp produzierende Hefestamm erbrachte Aktivitäten von 674 U L-1, während der 6h-Best2p Überexpressionsstamm 2239 U L-1 produzierte.
Die Maul- und Klauenseuche (MKS) stellt eine Tierseuche dar, die bei Ausbruch zu dramatischen wirtschaftlichen Verlusten durch Beeinträchtigung der anfälligen Tiere führt. Das verursachende Agens der Krankheit ist das Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV), welches der Familie der Picornaviren und der Gattung der Aphthoviren angehört. Ausbrüche der MKS weltweit sind selten, jedoch sollte der Erreger weiterhin erforscht werden, um ablaufende Prozesse besser verstehen, sichere und effiziente Impfstoffe entwickeln und im Falle eines Ausbruches angemessene Gegenmaßnahmen ausüben zu können. Das aus in etwa 8500 Basenpaaren bestehende Genom des Virus codiert unter anderem für die Leader Protease, ein wichtiger Virulenzfaktor, welcher unter anderem die Expression der Wirtsproteine durch die Spaltung des eukaryotischen Initiationsfaktors 4G (eIF4G) beeinträchtigt und ebenfalls die Immunantwort des Wirtes beeinflusst. In dieser Arbeit sollten verschiedene Systeme zur Untersuchung und Differenzierung der Funktionen der Leader Protease analysiert werden. Unter Zuhilfenahme unterschiedlich komplexer Systeme (Infektionssystem, Replikonsystem und Einzelexpressionssystem) erfolgte die Untersuchung der Translationsinhibierung, vermittelt über die eIF4G-Spaltung und der damit einhergehende Einfluss auf die Analyse auf andere Funktionen der Leader Protease. Sowohl im Infektionssystem als auch im hier etablierten Replikonsystem konnte die MKSV-induzierte Spaltung des eukaryotischen Initiationsfaktors 4G verifiziert werden. Hingegen konnte im Einzelexpressionssystem die Spaltung erst nach Lyse der Zellen nachgewiesen werden. Diese bisher noch nicht beschriebene Problematik lässt die bisher veröffentlichten Resultate und Schlussfolgerungen aus Einzelexpressionssystemen in Frage stellen. Die mit Hilfe des Einzelexpressionssystems durchgeführten Studien dieser Arbeit weisen darauf hin, dass ein zusätzlicher translationsinhibierender Mechanismus der Leader Protease, unabhängig von der proteolytischen eIF4G-Spaltung, ausgeübt wird. Dementsprechend sind die Möglichkeiten der Untersuchung zur Leader Protease mittels Einzelexpressionssystem sehr eingeschränkt, da eine Analyse spezifischer Leader Protease-Effekte unabhängig von einer Translationsinhibierung, dem „host-shut-off“, experimentell kaum möglich ist. Dies betrifft insbesondere die durchgeführten InterferonReportergenversuche. Somit konnten unter Verwendung verschiedener Untersuchungssysteme experimentelle Möglichkeiten, aber auch entscheidende experimentelle Limitierungen für die proteinbiochemische Analyse der Leader Protease-vermittelten eIF4G-Spaltung aufgezeigt werden.
Natürliche Hormone und Substanzen mit einer hormonellen Wirkung werden als organischen Spurenstoffen oder Mikroschadstoffe bezeichnet und werden über verschiedene Quellen in die Umwelt eingetragen. Dies führt insbesondere bei aquatischen Lebewesen zu Veränderungen im endokrinen System. Um die Belastung der Gewässer mit hormonell aktiven Substanzen zu verringern und einen guten chemischen und ökologischen Status nach europäischer Wasserrahmenrichtlinie zu erreichen, wird eine Reduktion des Eintrags hormonell aktiver Substanzen angestrebt. Die meisten Abwässer werden in Kläranlagen gesammelt, die somit Punktquellen für den Eintrag von hormonell aktiven Substanzen in die Umwelt darstellen. Zur Untersuchung neuer Methoden zur Abwasserreinigung sind zuverlässige und sensitive analytische Messtechniken notwendig. Da aktuelle instrumentelle Messmethoden nicht in der Lage sind hormonell aktive Substanzen im wirkungsrelevanten Konzentrationsbereich zu messen, wurden Hefezellenassays zur Detektion der östrogenen (A-YES) und androgenen (A-YAS) Aktivitäten für eine Anwendung in Oberflächengewässern und Abwässern evaluiert. Im Anschluss wurden diese Assays zur Beurteilung und Optimierung der Eliminationsleistung einer großtechnischen Ozonung auf einer kommunalen und einer Krankenhaus Kläranlage eingesetzt. Die untersuchten Abwassermatrices zeigten keine Effekte auf die Enzym Substrat Reaktion und die optische Dichte der A-YES Hefezellensuspension. Proben eines Oberflächengewässers sowie von Kläranlagen Zuläufen verursachten im A-YAS eine erhöhte optische Dichte der Zellsuspension im Vergleich zur Referenz. Eine verringerte optische Dichte der A-YAS Hefezellsuspension konnte in Extrakten von Zulaufproben bestimmt werden. Durch die Dotierung unterschiedlicher Konzentrationen der Referenzsubstanzen zu Oberflächengewässer- und Abwasserproben konnten Dosis Wirkungskurven mittels A-YES und A-YAS Assays abgebildet werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass insbesondere in Kläranlagen-Zulaufproben sowohl eine östrogene als auch eine androgene Aktivität bereits in der undotierten Ausgangsprobe vorhanden war. Des Weiteren konnten inhibierende Effekte in den Proben detektiert werden, die auf antagonistische Substanzen hindeuten. Die Analyse von Kläranlagen Abläufen zeigte östrogene Aktivitäten zwischen 0,035 und 5,5 ng EEQ/L sowie androgene Aktivitäten zwischen < 0,31 und 6,1 ng DHTEQ/L. Während der großtechnischen Ozonung konnte die östrogene Aktivität in einer kommunalen sowie einer Krankenhaus Kläranlage um bis zu 97% bzw. 83% reduziert werden. Die Reduktion der androgenen Aktivität lag bei 80% und 66%. Für zwei Verfahren zur bedarfsabhängigen Steuerung der Ozonung basierend auf der östrogenen Aktivität und auf dem DOC Gehalt konnte die Machbarkeit gezeigt werden. Allerdings stellten sich beide Methoden zum jetzigen Zeitpunkt als nicht wirtschaftlich heraus. Antagonistische Aktivitäten konnten in einem Konzentrationsbereich von 330 - 2.700 µg OHTEQ/L (anti-östrogene Aktivität) und 550 - 730 µg FEQ/L (anti-androgene Aktivität) mittels anti A-YES und anti A-YAS detektiert werden. Während der einzelnen Reinigungsstufen konnte keine Reduktion der antagonistischen Aktivitäten nachgewiesen werden. Sowohl A-YES als auch A-YAS sind für die Analyse von Abwasserproben geeignet und ermöglichen so erstmals die Beurteilung von Verfahren zur Abwasserreinigung im wirkungsrelevanten Konzentrationsbereich.
Das Genus Pestivirus gehört zur Familie der Flaviviridae und enthält eine Reihe von tierpathogenen Erregern, welche (fast) ausschließlich Paarhufer befallen. Das bei Pestiviren vorkommende Strukturprotein ERNS ist einzigartig in der Familie Flaviviridae, es finden sich keine homologen Proteine in den anderen Genera dieser Familie. ERNS ist ein sehr ungewöhnliches Protein, da es für ein virales Strukturprotein verschiedene untypische Eigenschaften aufweist. Neben einer intrinsischen RNase-Aktivität findet sich am C Terminus eine sehr ungewöhnliche Signalpeptidase-Spaltstelle. Während die RNase Aktivität einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt, sorgt die ungewöhnliche Spaltstelle mutmaßlich für die verlangsamte Prozessierung des ERNS-E1-Vorläuferproteins. Inwieweit die verlangsamte Spaltung des Vorläuferproteins für das Virus wichtig sein könnte, ist bis dato noch ungeklärt. Auch ist die Ausbildung von Dimeren wichtig für die Virulenz von ERNS. Darüber hinaus erfolgt eine partielle Sekretion von ERNS in den extrazellulären Raum, während ein Großteil in der Zelle verbleibt. Zusätzlich verfügt ERNS über eine untypische Membranverankerung, die durch eine lange, C-terminale amphipathische Helix vermittelt wird. Innerhalb dieser amphipathischen Helix findet sich eine Reihe geladener Aminosäuren, deren Lokalisation und Anordnung zu zwei spiegelsymmetrisch komplementären Gruppen bei Pestiviren konserviert ist. Es stellte sich die Frage, welche biologische Relevanz dieses Muster an geladenen Aminosäuren haben könnte. Ausgehend von der vorgeschlagenen Ausbildung eines „Charge Zippers“ – durch Rückfaltung und Ausbildung von Salzbrücken zwischen den komplementären Ladungen –, wurden mittels transienten Expressionsexperimenten die sechs hoch konservierten Ladungen im „Inneren“ des möglichen „Reißverschlusses“ untersucht, und es zeigte sich, dass der postulierte Charge-Zipper-Mechanismus bei ERNS vermutlich keine Rolle spielt. Für einige der betrachteten Aminosäuren konnten Hinweise erhalten werden, dass sie eine Rolle bei der Prozessierung, der Retention und bei der Dimerisierung von ERNS spielen. Vor allem ein Austausch der Ladung an der Position 194 im ERNS zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Prozessierung und Retention von ERNS. Auch bei der Dimerisierung stach diese Position hervor, da entgegen anderer Mutationen ein Austausch hier zu einer vermehrten Dimerbildung führte. Weiterführend wurden diese Mutationen in rekombinante Viren eingeführt, und es zeigte sich, dass vor allem die spezifischen Ladungen an den Positionen 184 und 191 im ERNS wichtig für die effiziente Virusvermehrung sind. Ladungsaustausche an diesen Positionen sorgten für nicht lebensfähige Virusmutanten, während Alaninsubstitutionen im Lauf von Passagen zur ursprünglichen Ladung revertierten. Diese Ergebnisse zeigen die elementare Bedeutung der Ladungen für die Generierung von infektiösen Viren. Die molekularen Mechanismen, in denen diese Reste von Bedeutung sind, müssen in weiteren Arbeiten noch aufgeklärt werden.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae reagiert auf die sich ständig ändernden Umweltbedingungen durch eine präzise Regulation der Genexpression. Möglich wird dies durch ein komplexes Netzwerk aus spezifischen Regulatoren und pleiotropen Faktoren. Aktivatorproteine binden an Aktivierungssequenzen (UAS-Elemente) in ihren Zielpromotoren und rekrutieren basale Transkriptionsfaktoren sowie Coaktiva¬toren. Dadurch erhöhen sich Wahrscheinlichkeit und Häufigkeit der Transkriptions¬initiation und die DNA im Promotorbereich wird durch die Aktivität von Komplexen der Chromatinremodellierung und -modifizierung für die Transkriptionsmaschinerie zugänglich gemacht. Dagegen binden spezifische Repressor¬proteine an ihre Regula¬tionssequenzen (URS-Elemente) oder an Aktivatorproteine, inhibieren deren Wirkung oder rekrutieren Histondeacetylase-Komplexe wie den Sin3-Corepressor, die eine Verdichtung des Chromatins bewirken. Der Sin3-Corepressorkomplex ist an einer Vielzahl von Regulationsprozessen beteiligt. In Hefe existieren zwei Sin3-Varianten, die als Rpd3L bzw. Rpd3S bezeichnet werden und sich in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Neben Sin3 als zentralem Gerüst¬protein in beiden Komplexen sind im Rpd3L strukturelle Untereinheiten wie Sds3, Sap30 und Pho23 sowie die Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 als enzymatische Komponenten enthal¬ten. Durch Funktionsanalysen von Mutanten einzelner Unterein¬heiten wurde festge¬stellt, dass zusätzlich zu Rpd3 weitere HDACs an der Repression ICRE-abhängiger Gene der Phospholipid-biosynthese Gene beteiligt sind. Interaktionsstudien zeigten, dass auch die HDACs Hda1 und Hos1 an Sin3 binden. Die Bindung erfolgt über drei sogenannte HDAC-Interaktionsdomänen (HID1-3), wobei Hda1 und Hos1 an HID2 und HID3 binden, Rpd3 dagegen an HID1 und HID3. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die HDACs direkt an ihre jeweiligen HIDs binden. Außerdem inter¬agieren Hda1 und Hos1 auch in vivo mit Sin3. Die HID1 wurde auf die Aminosäuren 801-950 verkürzt und es wurde nachge¬wiesen, dass eine funktionsfähige katalyti¬sche Domäne von Rpd3 nicht für die Wechselwirkung mit Sin3 notwendig ist. Außerdem wurden die Interaktionsdomänen von Sds3 und Sin3 kartiert. Die erhaltenen Befunde ergänzen die Daten zu Protein-Protein-Inter¬aktionen im Sin3-Corepressorkomplex und komplettieren funktionelle Aspekte der HDAC-Rekrutierung. Eine weitere Zielstellung dieser Arbeit war die Erstellung eines Interaktionsnetzwerks zwischen spezifischen Aktivatoren und allgemeinen Faktoren der Transkription. Eukaryotische Aktivatorproteine sind modular aufgebaut und besitzen voneinander separierbare Funktionsdomänen. Die Erkennung und Bindung von UAS-Elementen in den Zielpromotoren erfolgt über die DNA-Bindedomäne (DBD), während Tran¬skriptions¬¬aktivierungs¬domänen (TADs) basale Transkriptionsfaktoren und Co¬aktiva¬toren rekrutieren und somit die aktivierende Wirkung vermitteln. Im Gegensatz zu den DBDs folgen TADs meist keinen durch Sequenzanalysen vorhersagbaren Strukturmotiven und müssen manuell eingegrenzt werden. Für die Kartierung funktioneller TADs wurden Längenvarianten von über 30 Aktiva-toren aus verschiedenen Familien DNA-bindender Proteine an die Gal4DBD fusioniert und auf ihre Fähigkeit überprüft, ein UASGAL-abhängiges Reportergen zu aktivieren. Dabei konnten 15 neue TADs eingegrenzt werden. Weiterhin wurden die bisher nicht charakterisierten Zinkcluster¬proteine Yjl206c, Yer184c, Yll054c und Ylr278c als Aktivatoren bestätigt. Dadurch stand eine Samm¬lung aus 20 bekannten und neukartierten TADs zur Verfügung, die nach Konstruktion von GST-Fusionen für in vitro-Interaktionsexperimente mit Unter¬einheiten des Mediators, des TFIID- und des SWI/SNF-Komplexes eingesetzt wurden. Es konnten direkte Wechselwirkungen von Aktivatoren (u. a. Aft2, Aro80, Mac1 und Zap1) mit den TFIID-Komponenten TBP, Taf1, Taf4 und Taf5 detektiert werden. Die Bindung an Taf1 erfolgte im Bereich von aa 1-250, der zwei Aktivator¬interaktions-domänen (AID) enthält und in vorangegangenen Experimenten auch mit Ino2 und Adr1 interagierte. Die Rap1-Bindedomäne (RBD) von Taf4 (aa 253-344) interagierte auch mit Mac1, Aft2 und Ino2. Daher wurde dieser Bereich als allgemeine AID klassifiziert. Für die Aktivatorinteraktion essentielle Aminosäuren konnten allerdings nicht identi¬fiziert werden. 17 von 20 TADs interagierten direkt mit der Mediator-Untereinheit Med15, während für Med17 10 Kontakte zu Aktivatoren detektiert wurden, was die Relevanz des Mediators für die Aktivatorfunktion unterstreicht. Die katalytische Untereinheit des SWI/SNF-Komplexes Swi2 zeigte ähnlich viele TAD-Interaktionen wie Med15. Der N-terminale Bereich von Swi2 (aa 1-450) stellte sich als ausreichend für die Bindung der Aktivatoren heraus und enthält demnach eine oder mehrere AIDs. Damit konnte das Interaktionsnetzwerk zwischen Aktivatoren und allgemeinen transkriptionalen Cofaktoren substantiell erweitert werden.
In der Hefe S. cerevisiae erfolgt die Transkriptionsregulation der Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese in Abhängigkeit der intrazellulären Konzentration der beiden Phospholipid¬vorstufen Inositol und Cholin (IC). Bei IC-Mangel kommt es zu einer Akkumulation des Signalmoleküls Phosphatidsäure, wodurch der Repressor Opi1 extranukleär am endoplasmatischen Retikulum (ER) verankert wird. Dadurch kann der heterodimere Aktivator Ino2/Ino4 an eine spezifische „upstream activation site” (UAS) in der Promotorregion, die als ICRE-Motiv („inositol/choline-responsive element“) bezeichnet wird, binden und die Initiation der Transkription vermitteln. Die aktivierende Wirkung geht dabei von zwei Transkriptions¬aktivierungsdomänen (TAD) im N-Terminus von Ino2 aus. Da bisher unbekannt war, wie die Ino2-vermittelte Genaktivierung erfolgt, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Identifizierung der Coaktivatoren, die direkt an die TADs von Ino2 binden. Ferner sollten die für die Transkriptionsaktivierung wichtigen Wechselwirkungen innerhalb der Coaktivatoren präzise kartiert werden. Es konnte hier mit Hilfe der affinitätschromatographischen Methode des GST-„Pulldown“ gezeigt werden, dass TAD1 und TAD2 von Ino2 mit den generellen Transkriptionsfaktoren TFIID und TFIIA interagieren. Innerhalb des TFIID wurden die Untereinheiten Taf1, Taf4, Taf6, Taf10 und Taf12 in vitro als direkte Ino2-Interaktionspartner identifiziert. Dabei binden alle identifizierten Taf-Proteine an die starke TAD1, Taf10 zusätzlich an die TAD2. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass Mutationen innerhalb der TAD1 von Ino2 (D20K, F21R) zu einem vollständigen Verlust der Aktivierungsleistung führen. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass die gerichtete Mutation dieser Aminosäuren zu einem vollständigen Interaktionsverlust mit den Taf-Proteinen führt. Mit Hilfe von Interaktionsexperimenten wurden innerhalb von Taf1 zwei distinkte Aktivatorinteraktionsdomänen (AID1: AS 1-100; AID2: AS 182-250) kartiert, die die Bindung an Ino2 vermitteln. Mutationen hydrophober und basischer Aminosäure-Reste innerhalb der Taf1-AID2 hatten einen vollständigen Verlust der Interaktion mit Ino2 zur Folge. Möglicherweise sind also ionische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Interaktion von Ino2 und Taf1 beteiligt. Mit Hilfe der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) erfolgte der Nachweis, dass Taf1 in Abhängigkeit von Ino2 auch in vivo an den ICRE-haltigen Promotoren INO1 und CHO2 vorhanden ist. Im Folgenden wurden auch die Ino2-Interaktionsbereiche innerhalb der Proteine Taf6, Taf10 und Taf12 durch die Generierung sukzessiver GST-Verkürzungen eingegrenzt. Taf10 und Taf12 besitzen wie Taf1 zwei separate AIDs (Taf10: AID1 AS 1-100; AID2 AS 131-176; Taf12: AID1 AS 50-100; AID2 AS 100-178). Untersuchungen mit mutagenisierten Varianten, bei denen wie zuvor im Fall von Taf1 hydrophobe und basische Aminosäuren innerhalb der Taf12 AID2 ausgetauscht wurden, führten lediglich zu einer Verringerung der Bindungsintensität. Dies lässt vermuten, dass mehrere kleine Domänen innerhalb der AID2 existieren, die funktionell redundant sind. Mit Hilfe weiterer ChIP-Experimente konnte auch nachgewiesen werden, dass Taf6 und Taf12 abhängig von Ino2 an den untersuchten Promotoren INO1 und CHO2 vorhanden sind. Die Proteine Taf1 und Taf6 wurden exemplarisch für Genexpressionsstudien ausgewählt, um ihren Einfluss auf die Transkription des Gens INO1 unter in vivo Bedingungen nachzuweisen. Durch vergleichende Northernblot-Hybridisierungen mit temperatursensitiven (ts) taf-Mutanten wurde gezeigt, dass die INO1-Expression unter nichtpermissiven Bedingungen (37°C) auf 7% (taf1ts) bzw. 4% (taf6ts) abfällt. Diese Befunde belegen, dass INO1 zu den Taf-abhängigen Genen zählt. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIA wurde ebenfalls auf eine Interaktion mit Ino2 untersucht. Bekannt war bereits, dass der Aktivator Rap1, der ähnlich wie Ino2 mit mehreren TFIID-Untereinheiten interagiert, auch TFIIA kontaktiert. Durch GST-„Pulldown“-Studien konnte die Untereinheit Toa1 als direkter Ino2-Interaktionspartner identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass Toa1 sowohl mit der TAD1 als auch der TAD2 von Ino2 interagiert und die TAD1 Aminosäuresubstitutionen D20K und F21R zu einem vollständigen Interaktionsverlust führen. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass die generellen Transkriptionsfaktoren TFIID und TFIIA als Coaktivatoren des für die Transkription der Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese essentiellen Aktivators Ino2 fungieren.
Die ADHs aus Rhodococcus ruber (RrADH) und Lactobacillus brevis (LbADH) wurden erstmals in der Hefe Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans) hergestellt und zur Synthese von enantiomerenreinen 1-Phenylethanol eingesetzt. Die entsprechenden Gene wurden hierfür mit dem starken konstitutiven TEF1-Promotor und dem PHO5-Terminator flankiert und unter Nutzung der etablierten Xplor2®-Transformations-/Expressionsplattform in der Hefe exprimiert. Die erhaltenen selektierten Transformanden wiesen dabei ADH-Aktivitäten von 21 bzw. 320 U g-1 dcw für die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol in Schüttelkultur auf. RrADH und LbADH sind für die Reduktion von Acetophenon und Acetophenon-Derivaten, alpha-Ketoestern und aliphatischen Ketonen geeignet. Die RrADH synthetisiert (S)-konfigurierte Alkohole und ist NAD+/NADH-abhängig, während die LbADH die Reduktion von Acetophenon zu 1-(R)-Phenylethanol mithilfe des Cofaktors NADPH katalysiert. Rohextrakt des RrADH produzierenden Hefestamms konnte erfolgreich für die Synthese von enantiomerenreinem 1-(S)-Phenylethanol mit einer Ausbeute von 90 % und einem Enantiomerenüberschuss (ee) von >99 % über Substrat-gekoppelte Regeneration mit Isopropanol eingesetzt werden. Die Erhöhung der Ausbeute auf 100 % gelang durch Enzym-gekoppelte Regenerierung des Cofaktors NADH mit der GDH aus Bacillus megaterium (Bm) für RrADH bzw. NADPH mit der BmGDH und G6PDH aus Bacillus pumilus (Bp) für LbADH katalysierte Reaktionen. ADHs und Cofaktor-regenerierende Enzyme wurden simultan durch die konstitutive Coexpression der entsprechenden Gene in A. adeninivorans für die Synthese von enantiomerenreinem 1-Phenylethanol hergestellt. Die Enzymrohextrakte der RrADH-BmGDH, LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH produzierenden Hefestämme katalysieren ohne Ausnahme die Synthese des jeweiligen Enantiomers von 1-Phenylethanol mit ee >99 % und Ausbeuten von 100 % für Substratkonzentrationen bis 40 mM. Nach der Extraktion des 1-Phenylethanols liegt dieses chemisch rein vor, sodass aufwendige Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte erspart bleiben. GDH bzw. G6PDH sind hervorragend für die Regeneration von NADH und NADPH bzw. ausschließlich letzterem geeignet. Dabei wurden standardmäßig 40 mol 1-Phenylethanol pro Mol NAD+ oder NADP+ erreicht. Auch intakte Hefezellen der rekombinanten ADH und BmGDH bzw. BpG6PDH synthetisierenden Stämme wurden für die Synthese von 1-(S)- bzw. 1-(R)-Phenylethanol verwendet. Nach Permeabilisierung mit Triton X-100 wiesen sie vergleichbare Aktivitäten zu den entsprechenden Rohextrakten auf. Der RrADH-BmGDH produzierende Stamm synthetisiert 1-(S)-Phenylethanol mit einer Aktivität von 20 U g-1 dcw, während die LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH Hefestämme sogar 45,6 und 87,9 U g-1 dcw lieferten. Die Ausbeuten und ee waren im Vergleich zu den Rohextrakten ähnlich. Die Erhöhung der Konzentration des Ausgangsstoffs Acetophenon reduzierte unabhängig von den verwendeten Enzymen die erhaltene Ausbeute. Die katalytische Produktivität der Biokatalysatoren wurde durch ihre Wiederverwendung erhöht. Hierfür wurden permeabilisierte Zellen, die einfach aus der Syntheselösung abzentrifugiert werden können, genutzt. Außerdem konnten der Rohextrakt und die Zellen nach ihrem Einschluss in unlösliches Calciumalginat in Form von kleinen Kügelchen aus der Synthese abfiltriert und wiederverwendet werden. Permeabilisierte Zellen und Immobilisate wurden wiederholt für die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol eingesetzt, wobei immobilisierter Rohextrakt und Zellen für drei bis maximal sechs Synthesezyklen verwendet werden konnten. Immobilisierte und permeabilisierte Zellen sind wesentlich stabiler. Sie können ohne erhebliche Aktivitätsverluste 14 (LbADH-BpG6PDH), 29 (RrADH-BmGDH) bzw. mehr als 50 Mal (LbADH-BmGDH) wiederholt zur Acetophenon-Reduktion eingesetzt werden. Auf ihrer Grundlage wurde ein erster Reaktor für die semi-kontinuierliche Synthese von 1-(R)-Phenylethanol im Labormaßstab konstruiert und in Betrieb genommen. Es konnten 206 mol 1-(R)-Phenylethanol pro Mol NADP+ und 12,78 g 1-(R)-Phenylethanol mit einem ee von 100 % und einer Raum-Zeit-Ausbeute von 9,74 g L-1 d-1 oder 406 g kg-1 dcw d-1 erhalten werden. Weitere Optimierungen der Hefestämme, Reaktionsbedingungen und Reaktionsführung sind zur Erhöhung der Ausbeute und zum Erreichen vergleichbarer Produktivität mit derzeitigen Syntheseprozessen für 1-Phenylethanol nötig. Der ee ist bereits optimal. Zusammenfassend ist A. adeninivorans ein hervorragender Wirt zur Herstellung von ADHs für die Synthese enantiomerenreiner Alkohole wie 1-(S)- und 1-(R)-Phenylethanol. Nach Extraktion liegt das Produkt rein und mit optimalen ee vor. Durch die in dieser Arbeit gezeigten Untersuchungen können bisher chemische Synthesen durch enzymatische Reaktionen unter Einsatz von ADHs, deren Produktion in A. adeninivorans erfolgte, ersetzt werden, was Kosten und natürlichen Ressourcen spart.
Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
In der Hefe Saccharomyces cerevisiae werden die Strukturgene der Phospholipid-Biosynthese auf Transkriptionsebene in Abhängigkeit der Verfügbarkeit der Phospholipidvorstufen Inositol und Cholin (IC) über ein in der Promotorregion befindliches UAS-Element, genannt ICRE („inositol/choline-responsive element“), reguliert. Bei Mangel an IC kommt es zu einer Anhäufung des Intermediats Phosphatidsäure, wodurch der Repressor Opi1 außerhalb des Zellkerns am endoplasmatischen Reticulum verankert wird. Dadurch kann ein Heterodimer, bestehend aus den bHLH-Proteinen Ino2 und Ino4, an das ICRE-Motiv binden und die transkriptionelle Aktivierung vermitteln. Ist ausreichend IC vorhanden, gelangt der Repressor Opi1 in den Zellkern und bindet an Ino2. Dadurch ist eine Aktivierung nicht mehr möglich. Ferner kontaktiert Opi1 über seine Opi1-Sin3-Interaktionsdomäne (OSID) die Corepressor-Komplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die durch Rekrutierung von Histondeacetylasen (HDACs) zur Chromatinverdichtung und damit zur Genrepression führen. In einer früheren Arbeit wurde beobachtet, dass die regulierte Expression von Genen der Phospholipid-Biosynthese auch durch die Phosphatkonzentration beeinflusst wird. Es konnte festgestellt werden, dass bei Phosphatmangelbedingungen die Expression ICRE-abhängiger Gene auf 10 % reduziert ist. Eine Δopi1-Mutante zeigte dieses Expressionsmuster jedoch nicht mehr. Dieser Befund wies darauf hin, dass Opi1 seine Repressorfunktion sowohl bei IC-Überschuss als auch bei Phosphatmangel ausführt. Ein Protein, welches die Phosphatverfügbarkeit an Opi1 möglicherweise über eine Phosphorylierung vermitteln könnte, ist die cyclinabhängige Proteinkinase Pho85, für die eine in vitro Interaktion mit Opi1 gezeigt wurde. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden mittels gerichteter Mutagenese Aminosäurereste mutmaßlicher Pho85-Phosphorylierungsstellen im Opi1-Protein (S321, T51) gegen das nicht mehr phosphorylierbare Alanin ausgetauscht. Hefestämme, die solche Opi1-Protein-varianten (S321A, T51A) synthetisierten, zeigten jedoch weiterhin einen klaren Einfluss des Phosphatmangels auf die Expression eines ICRE-regulierten Reportergens. Dies lässt darauf schließen, dass die Repression unter Phosphatmangelbedingungen nicht über eine Phosphorylierung von Opi1 durch Pho85 zu Stande kommt. Parallel durchgeführte in vitro-Interaktionsstudien zeigten, dass die Bindung von Pho85 an Opi1 über zwei unabhängig voneinander funktionierende Interaktionsdomänen im Opi1-Protein (aa 30-70 und aa 321-350) erfolgt. Mit Hilfe des „Two-Hybrid“-Systems wurde festgestellt, dass die Opi1-Pho85 Wechselwirkung in vivo phosphatabhängig stattfindet. Die Befunde erlauben die Hypothese, dass Pho85 bei Phosphatüberschuss u. a. die OSID im Opi1 abdeckt, dadurch die Wechsel-wirkung mit Sin3/Cyc8 verhindert und eine gesteigerte Genexpression zulässt. Mittels Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) konnte gezeigt werden, dass Opi1, Co-Repressoren wie Sin3 und Cyc8 als auch die HDACs Hda1 und Hos1 an Promotoren ICRE-regulierter Gene Ino2-abhängig anwesend sind. Des Weiteren wurde festgestellt, dass sich Sin3 unabhängig von Opi1 an ICRE-haltigen Promotoren befindet. Dieses Ergebnis wider-sprach einer früheren Arbeitshypothese, konnte aber durch weitere Versuche, die eine direkte in vitro Interaktion von Sin3 mit dem Ino2-Aktivator zeigten, plausibel in ein neues Rekrutierungsmodell eingefügt werden. Abschließend wurden die am Beispiel von Opi1 gewonnenen Erkenntnisse durch in vitro Interaktionsanalysen diverser spezifischer Repressoren mit den pleiotropen Co-Repressoren Sin3 und Cyc8/Tup1 erweitert. Für zahlreiche Repressoren wurde gefunden, dass sie parallel mit Sin3 und Cyc8 interagieren (u. a. Rox1, Yox1, Dal80 und Mot3). Durch Kartierungsexperimente konnten minimale Repressordomänen charakterisiert werden, die die Interaktion zu Sin3 bzw. Cyc8 vermitteln, und sequenzhomologe Domänenstrukturen analysiert werden. Des Weiteren zeigte sich, dass alle Repressoren, die mit Sin3 wechselwirken, dessen Domänen PAH1 oder PAH2 („paired amphipathic helix“) kontaktieren.
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive und Katalase-negative humanspezifische Kommensalen der oberen und unteren Atemwege. Diese Bakterien sind andererseits auch als schwere Krankheitserreger bekannt und verursachen bei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, wie beispielsweise Kindern, Älteren und immungeschwächten Personen sowohl Atemwegs- als auch lebensbedrohliche invasive Erkrankungen wie eine ambulant erworbene Pneumonie, Meningitis und Sepsis. Pneumokokken haben aufgrund ihrer Besiedelung des Respirationstraktes effiziente Mechanismen entwickelt, um in einer sauerstoffreichen Nische überleben zu können. Dabei richten sich die Mechanismen vor allem gegen reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Spezies, ROS), die einerseits als Abwehrfunktion des Wirts (oxidative burst) vom angeborenen Immunsystem und andererseits von den Pneumokokken selbst produziert werden, um als chemische Waffe zur Bekämpfung bakterieller Konkurrenten in ihrem Habitat eingesetzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein hochkonserviertes Zwei-Operon-System, das für die extrazelluläre oxidative Stress-Resistenz in S. pneumoniae verantwortlich ist, identifiziert und auf pathophysiologischer sowie struktureller Ebene charakterisiert. Dieses komplexe System besteht aus zwei integralen Cytochrom C-ähnlichen Membranproteinen (CcdA1 und CcdA2), zwei Thioredoxin-ähnlichen Lipoproteinen (Etrx1 und Etrx2) und einer Methioninsulfoxid-Reduktase AB2 (MsrAB2). Die Etrx-Proteine werden zwar in zwei räumlich voneinander getrennten Operonen kodiert, sind aber funktionell miteinander verbunden. Der Einfluss des Systems auf die Pathogenese der Pneumokokken wurde in Maus-Virulenz-Studien und Untersuchungen der Phagozytose unter Verwendung von isogenen Mutanten gezeigt. Sowohl in den in vivo als auch den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Funktion beider Etrx-Proteine beziehungsweise der Methioninsulfoxid-Reduktase MsrAB2 die Virulenz der Pneumokokken stark reduziert. Hieraus resultierte eine erheblich verringerte Letalität des Wirts, eine beschleunigte bakterielle Aufnahme durch die Makrophagen sowie ein schnelleres Abtöten der Pneumokokken durch eine oxidative Schädigung von Oberflächen-lokalisierten Proteinen mittels Wasserstoffperoxid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Etrx2 die Abwesenheit von Etrx1 und umgekehrt Etrx1 das Defizit von Etrx2 kompensieren kann. Durch Strukturaufklärung der beiden Thioredoxin-ähnlichen Proteine Etrx1 und Etrx2 sowie der Modellierung der beteiligten Komponenten CcdA und MsrAB2 konnte die Rolle jedes einzelnen Proteins dieses Systems (CcdA-Etrx-MsrAB2-System) bei der Reparatur beschädigter Oberflächen-lokalisierter Proteine in einem Modell dargestellt werden. Das postulierte Modell konnte über in vivo und in vitro Untersuchungen des Elektronentransfers innerhalb dieses Systems bestätigt werden. Mit der Bestimmung der Standardredoxpotentiale der rekombinanten Proteine Etrx1, Etrx2 und der Einzeldomänen MsrA2 und MsrB2 konnte in vitro gezeigt werden, dass der Elektronenfluss in Richtung von Etrx1 und Etrx2 zu MsrAB2 erfolgen muss. Die direkte Elektronenübertragung zwischen diesen Proteinen konnte in kinetischen Experimenten gezeigt werden. Die Messungen ergaben, dass Etrx1 bevorzugt mit der MsrA2-Untereinheit interagiert beziehungsweise Etrx2 sowohl mit der MsrA2-Untereinheit als auch mit der MsrB2-Untereinheit in Wechselwirkung treten kann. Der in vivo Redoxzustand von MsrAB2 wurde unter Verwendung der nicht-reduzierenden/reduzierenden „2D-Diagonal“-SDS-PAGE in den isogenen ccdA- und etrx-Mutanten bestimmt. Hierbei konnte ein Unterschied im Redoxzustand von MsrAB2 in den isogenen Einzelmutanten und Doppelmutanten von ccdA und etrx beobachtet werden. Während in den Einzelmutanten der Elektronenfluss innerhalb des CcdA-Etrx-MsrAB2-Systems unverändert war, zeigte sich in den Doppelmutanten ccdA1/ccdA2 und etrx1/etrx2 eine deutliche Beeinträchtigung der Elektronenübertragung auf MsrAB2, welche sich in der Zunahme der oxidierten Form von MsrAB2 deutlich machte. Somit konnte der Elektronenfluss von sowohl von CcdA1 über Etrx1 zu MsrAB2 als auch von CcdA2 über Etrx2 zu MsrAB2 in vivo betätigt werden. In Anbetracht der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das hochkonservierte CcdA-Etrx-MsrAB2-System der extrazellulären oxidativen Stress-Resistenz von S. pneumoniae zur Entwicklung proteinbasierter Pneumokokken-Impfstoffe und zum Angriffspunkt für Behandlungen gegen diese wichtigen humanpathogenen Erreger beitragen.