In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die zytotoxischen Effekte von TRAIL und Docetaxel auf endometriale Adenokarzinomzellen unter kombinierter Stimulation stĂ€rker waren, als unter Einzelstimulation. TRAIL ist fĂŒr seine selektive Induktion von Apoptose in Tumorzellen bekannt, ohne dem normalen Gewebe zu schaden. Doch obwohl fĂŒr alle fĂŒnf untersuchten Zelllinien eine Expression der Todesrezeptoren DR4 und 5 nachgewiesen werden konnte, induzierte TRAIL allein kaum Apoptose. In Kombination mit Docetaxel, dem halbsynthetischen Analogon von Paclitaxel, zeigte sich eine gröĂere ZytotoxizitĂ€t als unter Docetaxel und TRAIL allein. Es kam zu einer signifikanten Reduktion der Zellzahl sowie zu einem Anstieg der Apoptose- und Nekroserate. Hierbei deuteten sich synergistische Wirkweisen an. Eine ursĂ€chliche VerĂ€nderung des Rezeptorprofils durch Docetaxel war nicht zu erkennen. Die Schnittstelle liegt möglicherweise auf einer anderen Ebene. Die Freisetzung der Chemokine IL-8, MCP-1 und RANTES wurde durch Docetaxel, TRAIL und besonders stark durch die Kombination von beiden stimuliert. Dies könnte sich sowohl positiv als auch negativ auf die Tumorprogression auswirken, insbesondere im inflammatorischen Kontext und in vivo. Hier wĂ€ren weitere Untersuchungen indiziert. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse, dass eine Kombination von TRAIL bzw. agonistischen TRAIL-Rezeptorantikörpern mit Taxanen das Potential hat, in der Therapie von Endometriumkarzinomen eine Rolle zu spielen.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von endogenem TNF-related apoptosis inducing ligand (Trail) auf die murine polymikrobielle Sepsis untersucht, weil Vorversuche ergeben hatten, dass die Applikation von exogenem Trail bei Sepsis zu einem Ăberlebensvorteil fĂŒhrt. FĂŒr die Untersuchungen wurden transgene Trail defiziente Tiere mit C57BL/6 Wildtyp Tieren verglichen. Die Colon ascendens stent peritonitis (CASP) diente als Modell fĂŒr die polymikrobielle peritoneale Sepsis. Anders als nach den Ergebnissen der Vorversuche zu erwarten, konnte in der Ăberlebenskinetik kein Nachteil durch die endogene Trail-Defizienz festgestellt werden. Die bakterielle Clearance war durch den genetisch bedingten Mangel an Trail nicht eingeschrĂ€nkt. Im Blut war die Elimination der BakteriĂ€mie sogar effizienter. Durchflusszytometrisch wurden unterschiedliche Zellpopulationen identifiziert und verglichen, um die Auswirkungen der Trail-Defizienz auf Einzelzellebene zu beleuchten. GITR eignete sich im CASP-Modell nicht als Marker fĂŒr regulatorische T-Zellen. Seine Expression stieg durch die Aktivierung der T-Zellen unabhĂ€ngig von der Zugehörigkeit zu den Effektor T-Zellen oder den regulatorischen T-Zellen. Deshalb wurden die regulatorischen T-Zellen in dieser Arbeit durch den Transkriptionsfaktor Foxp3 und den Aktivierungsmarker CTLA-4 charakterisiert. Der Anteil der regulatorischen T-Zellen war in der transgenen Trail-/- Versuchsgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe erhöht. Diese Beobachtung konnte durch die immunhistochemische FĂ€rbung von regulatorischen T-Zellen bestĂ€tigt werden. Die Expression des Trail-Rezeptors DR5 stieg bei CASP in der transgenen Trail-defizienten Versuchsgruppe an, wohingegen in der Wildtyp Gruppe keine VerĂ€nderungen beobachtet wurden. Allerdings besitzen die Trail-defizienten Tiere nach aktuellem Wissen keinen Liganden fĂŒr diesen Todesrezeptor. Dennoch zeigten sie bei CASP einen höheren Anteil apoptotischer Zellen als Wildtyp-Tiere. Dies wurde sowohl mit Zellzyklusanalysen und TUNEL-FĂ€rbungen gezeigt. Da der Zelltod nicht durch Trail hervorgerufen sein konnte, wurde nach weiteren Apoptose-induzierenden Substanzen in diesem Sepsismodell gesucht. Weder die durchflusszytometrische Bestimmung von TNF-Rezeptoren noch die Bestimmung von Glukokortikoiden im Serum mittels ELISA zeigten bei CASP Anstiege in der Trail-/- Versuchsgruppe oder in Wildtyp-Tieren. SchlieĂlich wurde die ReaktivitĂ€t der Immunzellen bei CASP ex vivo untersucht. Dazu wurden die Zellen in vitro stimuliert und die Zytokinspiegel im Ăberstand bestimmt. In einigen Experimenten wurde Apoptose in vitro durch Applikation eines universellen Caspaseinhibitors unterbunden. Die ĂŒberraschenden Ergebnisse zeigten eine Zunahme der proinflammatorischen Zytokine, vor allem TNF-α und INF Îł und des antiinflammatorischen Zytokins Il-10. Insgesamt stĂŒtzen die Ergebnisse die Arbeitshypothese, dass Trail-Defizienz bei Sepsis negative Auswirkungen hat, nicht. Die ĂŒberraschende Beobachtung, dass der sepsisinduzierte Zelltod in Abwesenheit des âTodessignalsâ Trail zunimmt, eröffnet interessante Perspektiven fĂŒr die zukĂŒnftige Forschung.
Das Ewing-Sarkom ist der zweithĂ€ufigste primĂ€re Knochentumor im Kindes- und Jugendalter nach dem Osteosarkom. Vor der Ăra der Chemotherapie ĂŒberlebten weniger als 10% der Patienten. Heutige Therapieprotokolle favorisieren die primĂ€re Induktionschemotherapie gefolgt von Lokaltherapie (chirurgische und radiotherapeutische Alternativen) und adjuvanter Chemotherapie. Mit diesen neuen TherapieansĂ€tzen ist es gelungen, die FĂŒnfjahres-Ăberlebenswahrscheinlichkeit fĂŒr Patienten mit lokoregionaler Erkrankung auf 55-70% zu erhöhen. Doch nach wie vor haben Patienten mit Fernmetastasen bei Diagnosestellung sowie mit einem Rezidiv der Erkrankung eine mit ca. 15-20 % wesentlich schlechtere FĂŒnfjahresprognose, insbesondere bei disseminiertem Befall von Knochen und/oder Knochenmark. Es besteht also die Notwendigkeit, neue Therapieoptionen zu entwickeln, die sowohl die Ăberlebensrate der Patienten erhöhen als auch mit einer niedrigen systemischen ToxizitĂ€t verbunden sind. Diese Arbeit untersuchte das antineoplastische Potential von Histondeacetylase-Inhibitoren (HDIs), einer relativ neuen Klasse von Chemotherapeutika, fĂŒr die Behandlung von Ewing-Sarkomen. Dazu wurden die Effekte der HDIs Suberoyl anilide hydroxamic acid (SAHA), Natriumbutyrat (NaB) und MS-275 auf die Ewing-Sarkom-Zelllinien SK-ES-1 und WE-68 analysiert. Alle drei Substanzen induzierten effektiv den Zelltod in beiden Zelllinien, wie die Propidiumjod-Aufnahme-Analyse bewies. Jedoch variierten die drei HDIs in ihrer Wirkweise. SAHA und NaB fĂŒhrten zur mitochondrialen Depolarisation und Caspase-3- und -9-Aktivierung. Die zytotoxischen Effekte dieser beider Substanzen, wie Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, DNA-Fragmentation und Zelltod, konnten durch den Einsatz des Pancaspase-Inhibitors z-VAD-fmk signifikant reduziert werden. Im Gegensatz dazu war MS-275 ein wesentlich schwĂ€cherer Induktor der Caspase-9- und-3-AktivitĂ€t. Ebenso war die durch diese Substanz ausgelöste mitochondriale Membrandepolaristion deutlich geringer. Entsprechend besaĂ auch der Pancaspase-Inhibitor z-VAD-fmk nur schwache protektive Wirkungen auf den MS-275-induzierten Zelltod. Die zytotoxische Wirkung der HDIs zeigte sich als abhĂ€ngig von Transkription und de novo Proteinsynthese, gemessen durch Vorbehandlung mit dem Transkriptions-Inhibitor Actinomycin D und dem Proteinsynthese-Inhibitor Cycloheximid. Nach Hemmung der Caspasen durch den Pancaspase-Hemmstoff z-VAD-fmk stellte sich in der Zellzyklus-Analyse ein HDI-vermittelter G2/M-Arrest dar. Der Mechanismus ĂŒber den HDIs die Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus arretieren ist bisher nicht endgĂŒltig geklĂ€rt. Es wird aber eine erhöhte Expression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 damit in Zusammenhang gebracht. In der WE-68-Zelllinie konnte mittels Western-Blot-Analyse eine verstĂ€rkte Expression von p21 nach HDI-Behandlung nachgewiesen werden. DarĂŒber hinaus beschĂ€ftigte sich diese Arbeit mit der Frage, ob HDIs die zytotoxische Wirkung von konventionellen Zytostatika wie Etoposid und Vincristin oder des Zelltod-induzierenden Zytokins TRAIL zu steigern vermögen. Die Kombination von HDIs mit Zytostatika resultierte in additiver ZytotoxizitĂ€t. Die kombinierte Gabe von SAHA, NaB oder MS-275 mit TRAIL fĂŒhrte zu additiven Effekten in den als TRAIL-resistent beschriebenen SK-ES-1-Zellen, wĂ€hrend in den WE-68-Zellen supraadditive Effekte zu verzeichnen waren. Weiterhin wurde deutlich, dass HDIs die Expression des proapoptotischen TRAIL-Rezeptors-2 nicht erhöhten, sondern vielmehr diese reduzierten. Mit Hilfe der spezifischen Caspase-8-Hemmung und dem Einsatz einer Caspase-8-defizienten Ewing-Sarkom-Zelllinie (CADO-ES-1) konnte gezeigt werden, dass die aktivierte Caspase-8 zwar fĂŒr die TRAIL-induzierte Apoptose essentiell, aber fĂŒr den HDI-induzierten apoptotischen Zelltod in Ewing-Sarkom-Zellen nicht notwendig ist. Diese Ergebnisse deuten zusammenfassend darauf hin, dass die HDIs durchaus als eine neue Behandlungsstrategie sowohl als Monotherapie als auch in der Kombination mit TRAIL oder Etoposid und Vincristin in Frage kommen könnten.
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen LĂ€ndern der hĂ€ufigste Krebs des Mannes und verantwortlich fĂŒr einen betrĂ€chtlichen Teil der von Krebs verursachten TodesfĂ€lle. Es ist in fortgeschrittenen Stadien einer Zytostatikatherapie nur schwer zugĂ€nglich, neue TherapieansĂ€tze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist âtumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandâ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine ausreichende Wirkung. Die Beeinflussung intrazellulĂ€rer Resistenzfaktoren zur Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der Proteinkinase C(eta); in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimĂ€re Zweitgenerations-Antisense-Oligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstĂ€rkt. Nach âKnock-downâ der PKC(eta); zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptose-typischen VerĂ€nderungen, wie Caspase 3-Aktivierung und nukleosomale DNA-Fragmentierung. AuĂerdem kommt es zur VerstĂ€rkung der TRAIL-induzierten Störung des mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafĂŒr spricht, dass die PKC(eta); innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien wirksam ist. Die PKC(eta); kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender Angriffspunkt zur VerstĂ€rkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL. Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAIL-induzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen. Gegen die Erwartungen hat der âKnock-downâ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation fĂŒhrt zu einer signifikanten VerstĂ€rkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3-AktivitĂ€ten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes ZielmolekĂŒl zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKC(eta); und Bcl-xL erfolgversprechende ZielmolekĂŒle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
