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AGnES in der Regelversorgung - Umsetzung des § 87 Abs. 2b S. 5 SGB V im Bundesmantelvertrag AGnES (AGnES: Arztentlastende, Gemeinde-nahe, E-Healthgestützte, Systemische Intervention) ist ein vom Institut für Community Medicine der Univeritätsmedizin Greifswald entwickeltes Modell zur Entlastung von Hausärzten, bei dem Hausbesuche auf speziell fortgebildete nicht-akademische Fachkräfte delegiert werden. Die Hausbesuche werden ohne Anwesenheit des Arztes durchgeführt und sollen gerade im ländlichen Raum Ärzte entlasten und dem Ärztemangel entgegenwirken. AgnES wurde von 2005 bis 2008 in mehreren Bundesländern erprobt. Im Jahr 2008 wurde im Rahmen einer Pflegereform (Pflege-Weiterentwicklungsgesetz) auch § 87 Abs. 2b S. 5 SGB V ergänzt. In dieser Norm werden die Behörden der Selbstverwaltung im Gesundheitswesen (in diesem Fall die Kassenärztliche Bundesvereinigung, der Spitzenverband Bund der Krankenkassen und der Bewertungsausschuss) verpflichtet, Regelungen zur Vergütung von Hausbesuchen nicht ärztlicher Fachkräfte zu erlassen. Der Bundesgesetzgeber verfolgte mit der Schaffung dieser Norm gerade das Ziel, das AGnES-Projekt oder ein inhaltlich gleichwertiges, wissenschaftlich evaluiertes und breit erprobtes Delegationsmodell in der Regelversorgung der Gesetzlichen Krankenversicherung zu verankern. Die Selbstverwaltung im Gesundheitswesen hat hierfür 2009 einerseits den Bundesmantelvertrag durch eine Anlage ergänzt, die sog. Delegationsvereinbarung. Außerdem wurde der Einheitliche Bewertungsmaßstab als Leistungs- und Vergütungskatalog der Gesetzlichen Krankenversicherung um Abrechnungspositionen für nicht-ärztlich durchgeführte Hausbesuche erweitert. Delegationsvereinbarung und EBM bleiben weit hinter dem vom Gesetzgeber gemeinten AgnESProjekt zurück. Die Delegationsvereinbarung verstößt deshalb in vielfältiger Hinsicht gegen den Vorrang des Gesetzes. Sie lässt sich unter anderem hinsichtlich der bis Ende 2014 vorgenommenen Beschränkung auf unterversorgte Gebiete (§ 2 Abs. 2), der Einschränkung der infrage kommenden Patientengruppen (§ 3 lit. a) und b)), des Anstellungszwanges der Praxisassistentinnen bei den Praxen (§ 4 Abs. 2), der Notwendigkeit der ärztlichen Einzelfallanordnung (§ 5 Abs. 1 S. 1, Abs. 2 S. 2), den zugelassenen Ausgangsqualifikationen der Fachkräfte (§ 6 S. 2 lit.a)) und vor allem hinsichtlich der Dauer der Fortbildung und ihrer Inhalte u.a. (§ 7 Abs. 2) nicht mit dem von § 87 Abs. 2b S. 5 SGB V vorgegeben Anforderungen vereinbaren. Die Regelungen der Delegationsvereinbarung verfehlen nicht nur die vom parlamentarischen Gesetzgeber gestellten Anforderungen, sondern werden auch den anderen Beteiligten nicht gerecht: Durch die zu niedrig festgelegten Qualifikationsanforderungen wird die Sicherheit der Patienten möglicherweise gefährdet. Zudem werden durch die zu restriktiven Voraussetzungen, welche Patientengruppen überhaupt von Praxisassistentinnen versorgt werden dürfen, unnötig viele Patienten ausgeschlossen. Hinsichtlich der Praxisassistentinnen wird die Chance vertan, einen großen Schritt hin zur Steigerung der Attraktivität der Heilhilfsberufe zu unternehmen und diesen den Stellenwert im Gesundheitssystem einzuräumen, den sie in den anderen europäischen Ländern bereits haben und wo sowohl finanzielle als auch personelle Probleme mit Hilfe der Praxisassistentinnen abgefedert werden können. Schließlich werden die Regelungen der Delegationsvereinbarung und des EBM auch den Vertragsärzten nicht gerecht. Ihnen steht die dringend notwendige Entlastung bis Ende 2014 nur in unterversorgten Gebieten zur Verfügung, die notwendige Attraktivitätssteigerung des Hausarztberufes bleibt auf der Strecke. Schließlich sind Zahl und Schwierigkeitsgrad der delegierbaren Leistungen aufgrund der potentiell ungenügenden Qualifikation der Praxisassistentinnen nach der Delegationsvereinbarung und damit ihre Entlastungswirkung deutlich in Frage gestellt, wollen nicht Hausärzte und Praxisassistentinnen Gefahr laufen, deshalb haftungsträchtige Behandlungsfehler zu begehen.
Transportproteine spielen für viele Arzneistoffe eine bedeutende Rolle bei der Absorption, Verteilung und Elimination und können folglich auch maßgeblich über die Anflutung eines Wirkstoffs am Ort der Wirkung und / oder Nebenwirkung(en) entscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, die Affinität von Tigecyclin zu hepatischen Aufnahme- und Effluxtransportern zu bestimmen. Aus pharmakokinetischen Studien war bekannt, dass das Glycylcyclin hauptsächlich hepatisch ausgeschieden wird, wobei die zugrundeliegenden molekularen Transportmechanismen unbekannt waren, d.h. wie Tigecyclin von den Hepatozyten aufgenommen wird und wieder in die Galle bzw. in das Blut abgegeben wird. Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz (logP-Wert: 0,8; pKs-Wert: 0,25/ 8,76) sprechen gegen eine rein passive Diffusion über biologische Membranen.
Um den hepatozellulären Aufnahmetransport aufzuklären, wurden Kompetitionsversuche und direkte Aufnahmeversuch mit Hilfe von stabil transfizierten HEK293-Zellmodellen, die Transportproteine der SLC- und SLCO-Familie stabil überexprimieren, durchgeführt. Unter Verwendung von inside-out-Vesikeln wurde der Effluxtransport von Tigecyclin über MRP2- und MRP3-Transporter untersucht. Um sicher zu gehen, dass die Zellmodelle funktionstüchtig sind, wurde deren Funktionalität vor jedem Versuch mittels bekannter Standardsubstrate und Standardinhibitoren bestätigt. Die direkten Aufnahmeversuche wurden mittels LC-MS/MS analysiert.
Tigecyclin zeigte im verwendeten Konzentrationsbereich und den angewendeten Inkubationszeiten keine zytotoxische Wirkung auf die Versuchszellen. Mit den Kompetitionsassays konnte nachgewiesen werden, dass Tigecyclin einen hemmenden Einfluss auf den Transport von bekannten OATP1B3- und OATP2B1-Referenzsubstraten hat, jedoch keine Beeinflussung von OATP1B1 und NTCP zeigte. Des Weiteren konnte in direkten Aufnahmeversuchen gezeigt werden, dass Tigecyclin ein Substrat des ubiquitär exprimierten Transporters OATP2B1 ist. Ein signifikanter Nachweis, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP1B1-, OATP1B3- und NTCP-Transportern ist, gelang jedoch nicht.
Im Bezug auf Effluxtransporter konnte eine Kompetition von Tigecyclin mit dem MRP2- und MRP3-vermittelten Transport in inside-out-Vesikeln nachgewiesen werden. Ein direkter Transport von Tigecyclin über die Vesikel ließ sich jedoch nicht beweisen. Aufgrund methodischer Schwierigkeiten und der sehr begrenzten Bearbeitungszeit, konnten die Versuche nicht oft genug durchgeführt und keine entsprechend belastbaren Daten generiert werden.
Zusammenfassend kann aus den durchgeführten Untersuchungen abgeleitet werden, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP2B1 ist und OATP2B1 somit möglicherweise für die hepatische Aufnahme des Arzneistoffes verantwortlich ist. Ob noch andere Transporter eine Rolle spielen, bleibt weiterhin unbekannt. Auch die konkrete Transportkinetik mit der Affinität (Km) und der Transportkapazität (vmax), bleibt nach diesen Versuchen noch unklar. Des Weiteren legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass bei gleichzeitiger Tigecyclin-Gabe ein gewisses Risiko für unerwünschte pharmakokinetische Interaktionen mit Substraten der Transporter OATP1B3, OATP2B1, MRP2 und MRP3 besteht.
Als Fazit kann gesagt werden, dass mit dieser Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Arzneimitteltransports und der Transporteigenschaften von Tigecyclin in den Hepatozyten geleistet werden konnte. Zusätzlich konnten weitere Erkenntnisse zur Kompetition gewonnen werden. In wie weit die in vitro Resultate auf in vivo Mechanismen übertragbar sind, ist unklar und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen.
Die therapeutische Anwendung kalter Atmosphärendruckplasmen (CAP) ist der zentrale Schwerpunkt des in einer hoch interdisziplinären Schnittstelle zwischen Natur- und Lebenswissenschaften angesiedelten Forschungsgebiets der Plasmamedizin. Trotz eines auf Basis grundlagentechnologischer und anwendungsorientierter Forschung zunehmenden Erkenntnisgewinns, wirft die Plasmamedizin sowohl bezüglich spezifischer Wirkeffekte als auch Risikopotentiale nach wie vor verschiedene Fragestellungen auf und zeigt, vor dem Hintergrund einer nicht ausschließlich auf Grundlage von in vitro Daten zu prognostizierenden unbedenklichen in vivo Anwendbarkeit, vor allem ein Defizit an klinischen Daten.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte erstmals eine systematische Langzeituntersuchung eines unter standardisierten Bedingungen mittels kaltem atmosphärischen Plasma behandelten Probandenkollektivs. Die 5 Probanden waren 5 Jahre zuvor Teil einer Untersuchung zum CAP-Einfluss auf die Wundheilung CO2-Laser-induzierter Hautläsionen, im Zuge derer jeweils 3 der 4 Läsionen mit unterschiedlichen Applikationsschemata (1 x 10 s; 1 x 30 s; 3 x 10 s) mittels des kINPen® MED behandelt wurden.
Neben einer klinischen Evaluation wurde die Nachuntersuchung durch aufwendige, bildgebende Diagnostika wie Dermatoskopie, konfokale Laserscanmikroskopie (KLSM) und Hyperspectral Imaging (HSI) assistiert sowie fragebogengestützt hinsichtlich plasmavermittelter Hautveränderungen (POSAS) und einer möglichen therapieassoziierten Beeinträchtigung der Lebensqualität (DLQI) ergänzt.
Im Ergebnis konnten weder klinisch-makroskopisch, dermatoskopisch, noch mittels KLSM oder HSI malignitätssuspekte Veränderungen, Anzeichen chronischer Entzündungsreaktionen, pathologische Modifikationen der Zellarchitektur und Zellmorphologie oder mikrozirkulatorische Pathologien in den plasmabehandelten Arealen, gegenüber dem umliegenden, nicht mittels Kaltplasma therapierten Gewebe, belegt werden.
Die in dieser Komplexität im Rahmen einer Langzeituntersuchung am Menschen bisher einzigarten Daten tragen, insbesondere auf dem hochaktuellen Diskussionsfeld plasmaassoziierter Risikopotentiale, zu einem weiteren Erkenntnisgewinn bei. Zur Sicherung indikationsspezifischer Dosisempfehlungen und Behandlungsfenster bedarf es, aufgrund verschiedener allgemeiner und spezieller Limitationen, jedoch weiterer klinischer Studien.
Die Atemwege sind mögliche Eintrittspforten für Staphylococcus aureus in den menschlichen Organismus. Inhalierte Bakterien oder Bakteriencluster kommen initial vermutlich nicht direkt mit den Epithelzellen der Atemwege in Kontakt, sondern nur mit der aufgelagerten Mukusschicht. Die Mikroorganismen nehmen in dieser Situation möglicherweise über sekretorische lösliche Virulenzfaktoren auf die Funktion der Epithelzellen Einfluss und können dadurch das Infektionsgeschehen für sich günstig beeinflussen. Die Behandlung einer Infektion ist oft schwierig, da viele S. aureus-Stämme resistent gegenüber Antibiotika sind. Es ist daher von großem Interesse, mehr über die vielfältigen Interaktionen dieser Bakterien mit ihren eukaryotischen Wirtszellen in Erfahrung zu bringen. Bisher ist nur wenig über die Reaktionen humaner Atemwegsepithelzellen auf Kontakt mit S. aureus-Sekretionsprodukten bekannt, deswegen wurden in dieser Arbeit die Effekte der löslichen Virulenzfaktoren, Hämolysin A und B, auf die Zellmorphologie, Zytokinsezernierung und Ca2+-Signaltransduktion in verschiedenen humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o-, S9, A549) genauer charakterisiert. Unter rHla-Einwirkung konnte in konfluenten Zellrasen die Bildung parazellulärer Lücken beobachtet werden, wobei die Stärke der Reaktion zelltypspezifisch war. Für die in vivo-Situation könnte der Verlust des stabilen Zellverbands bedeuten, dass das Bakterium dadurch die Möglichkeit erhielte, in den Wirtsorganismus einzudringen. Die Untersuchungen an primären Nasenepithelzellen unterstützen diese Schlussfolgerung. Hingegen zeigten Hämolysin B und die bakteriellen Zellwandbestandteile Lipoteichonsäure und Peptidoglykan kaum Effekte auf die Morphologie der Zellen. Durch fluorometrische Messung mit Indo1-beladenen Zellen wurde deutlich, dass die rHla-Behandlung und der daraus resultierende Einbau von Hla-Poren in die Membran der Atemwegsepithelzellen zu einem Ca2+-Einstrom in die Zellen führen. Wurden die A549-Zellen mit höheren Hla-Konzentrationen behandelt, war der Ca2+-Einstrom sehr stark und konnte nicht durch den zelleigenen Ca2+-Auswärtstransport kompensiert werden, so dass die intrazelluläre Ca2+-Konzentration [Ca2+]i stetig anstieg. Diese Ca2+-Überladung könnte zur Schädigung der Zellen oder gar zum Absterben einiger Zellen beigetragen haben, was in den Experimenten mit dem Time lapse-Mikroskop beobachtet wurde. Auch die Behandlung der A549-Zellen mit rHlb, durch dessen Sphingomyelinase-Aktivität Spaltprodukte entstehen können, die selbst als Signalmoleküle fungieren, führte zu einer leicht veränderten [Ca2+]i in den A549-Zellen. Ob dieses durch Sphingosin-1-Phosphat erfolgt, das in A549-Zellen tatsächlich ein deutliches Ca2+-Signal erzeugt, oder durch andere Hlb-bedingte Effekte auf die Zellen, wurde nicht abschließend geklärt. Auch der direkte Einfluss der beiden Hämolysine auf die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zyto- und Chemokinen aus den Atemwegsepithelzellen unter rHla und rHlb wurde quantitativ bestimmt. Mit Hilfe von FlowCytomix-Kits konnte ebenfalls gezeigt werden, dass beide Hämolysine die Sekretion von IL-6 und IL-8 aus den Zellen bewirken. Um die physiologischen Vorgänge im respiratorischen Gewebe nach Kontakt mit S. aureus bzw. dessen Virulenzfaktoren zu ergründen, wurden in dieser Arbeit verschiedene endogene Proteinkinasen und Signalmoleküle der Atemwegsepithelzellen pharmakologisch inhibiert und untersucht, wie sich die selektive Hemmung der Signaltransduktion auf die Lückenbildung im Zellrasen unter der Stimulation mit rHla auswirkt. Da die intrazelluläre Konzentration von Ca2+-Ionen für die Steuerung der Salz- und Wassersekretion im respiratorischen Gewebe und somit für die Abwehr potentieller Pathogene wichtig ist, wurden für diese Arbeit einige Schlüsselelemente dieses Systems analysiert. Die Resultate weisen auf eine komplexe Verbindung der Signalwege hin, wobei die Zellantworten häufig Zelltyp-spezifisch waren. Es konnte durch Time lapse-Beobachtungen gezeigt werden, dass Calmodulin, c-Src, Calpaine, die Proteinkinasen A, G, B und C sowie NF-κB den Zellen tendenziell helfen, ihre Zellform unter rHla-Einwirkung zu bewahren. Für Calmodulin, die Ca2+/CaM abhängige Kinase II, ERK1/2, p38 und NF-κB wurde eine Beteiligung an der Erhöhung der Sekretionsraten von IL-8 und IL-6 durch rHla sowie rHlb festgestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die untersuchten Signalwege, je nach Intensität der Einwirkung der bakteriellen Faktoren auf die Atemwegsepithelzellen, sowohl zellprotektive als auch Epithel-beeinträchtigende Prozesse beeinflussen, jedenfalls aber in die Produktion von Signalen (Freisetzung von Zyto- und Chemokinen) eingebunden sind, die solcherart Epithelzellen in vivo an das Immunsystem eines Wirts senden.
In einer retrospektiven Längsschnittstudie wurden insgesamt 1172 Intoxikationsnotfälle einer internistischen Intensivstation (Bürgerhospital Stuttgart) aus den Jahren 1980, 1990, 2000 und 2010 erfasst und im Hinblick auf Trends untersucht. Nach einem drastischen Anstieg der Heroinintoxikationen zwischen 1980 und 1990, festgestellt in einer früheren Studie, zeigt sich in den Jahren 2000 und 2010 wiederum ein Rückgang der Heroinintoxikationen auf das Ausgangsniveau von 1980. Stattdessen ist ein signifikanter Anstieg polyvalenter Intoxikationen (unter Einschluss neuer synthetischer Drogen) in den Jahren 2000 und 2010 zu beobachten, außerdem relativ mehr Frauen und eine Zunahme des Durchschnittsalter der Intoxizierten. Ein Vergleich der Ergebnisse mit Resultaten anderer Studien der letzten Jahrzehnte, aber auch mit Statistiken von Suchthilfe und Bund, ermöglichen Rückschlüsse auf Veränderungen des sozio-kulturellen Kontexts. Eine Anpassung bestehender Behandlungsstrukturen an die festgestellten Veränderungen des Patientenkollektivs wird gefordert.
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob es einen Zusammenhang zwischen kraniomandibulären Dysfunktionen (CMD) und einer abgeschlossenen kieferorthopädischen Behandlung einer Klasse l- und Klasse II- Malokklusion gibt und ob Abhängigkeiten zum Ausgangsbefund objektivierbar sind. Nach der kieferorthopädischen Behandlung wurden die 100 Probanden in drei Gruppen geteilt: erste Gruppe - 22 Probanden zeigten zu Beginn und am Ende der kieferorthopädischen Therapie eine neutrale Kieferbasenrelation; zweite Gruppe - 52 Probanden zeigten zu Beginn eine distale und am Ende eine neutrale Kieferbasenrelation; dritte Gruppe - 26 Probanden zeigten zu Beginn und am Ende eine distale Kieferbasenrelation. Es konnten in allen drei Gruppen Zeichen und Symptome von CMD festgestellt werden. Die geringen Unterschiede zwischen den Gruppen waren nur selten signifikant. Die zweite Gruppe zeigte häufiger muskuläre Symptome und kraniomandibuläre Dysfunktionen. Aber wir dürfen nicht vergessen, dass das kraniomandibuläre System in dieser Gruppe durch die funktionelle Therapie eine längere Adaptationszeit benötigt. Aus der Literaturrecherche war ersichtlich; dass Dysfunktionen in der untersuchten Altersgruppe häufiger auftreten und im zunehmendem Alter wieder abnehmen, Demzufolge ist zu vermuten, dass die CMD in der durchgeführten Untersuchung nur temporär zunehmen. Mädchen zeigten häufiger Zeichen und Symptomen von CMD als Jungen. Aufgrund der ähnlichen Altersstruktur konnte ein Zusammenhang zum Alter zu Beginn der Therapie und CMD nicht ermittelt werden. -------------------------------------------------------------------------------- Zusammenfassung in Englisch (Abstract) The aim of this investigation was to study signs and symptoms of craniomandibular disorders (CMD) in girls and boys from Class I- and Class II- malocclusions after orthodontic treatment. 100 patients were divided into three groups after treatment: first group - 22 subjects before and after treatment with normal occlusion, second - 52 subjects with Class II- malocclusion before and normal occlusion after treatment, third - 26 subjects with Class II before and after treatment. In all three groups were found signs and symptoms of CMD. The incidence of signs and symptoms of CMD were only small differences between the three groups and there were rarely significantly different. The second group showed a major increase of muscular symptoms and temporomandibular disorders. However we may not forget that the craniomandibular system needs a longer adaptation time after functional therapy. From the literature search it was evident that in this examined age group dysfunctions arise more frequently and with increasing age disappear. Therefore it is to be assumed that CMD in this investigation increases only temporarly. The prevalence of signs and symptoms of CMD was higher in girls than in boys. In conclusion, a connection between signs and symptoms of CMD and orthodontic treatment could not be proven clearly. We found more patients without CMD than with CMD after treatment. Due to the similar age structure a connection between the age could not be determined at the beginning of treatment and CMD after treatment.
Ziel der Arbeit war eine Analyse des Auftretens von Risikoclustern unter der Berücksichtigung der Risikoausprägung der Risikoverhaltensweisen Tabakrauchen, Alkoholkonsum, Übergewicht und geringe körperliche Aktivität in einer bevölkerungsrelevanten Stichprobe. Dafür wurde ausgehend von Literaturrecherchen ein Risikoscore entwickelt, anhand dessen Prävalenzdarstellungen sowie multinomiale logistische Regressionsanalysen für als besonders relevant erachtete Risikoscoreausprägungen erfolgten. Die Ergebnisse zeigten ein Dominieren von nicht und wenig riskanten Verhaltenskombinationen in der Gesamtbevölkerung sowie eine Häufung von Risikoverhaltensweisen bei Jüngeren und kürzer Ausgebildeten. Zudem bestand bei den Befragten mit geringerem Bildungsgrad eine hohe Varianz der Risikoverhaltenskombinationen. Als wichtigste Risikoverhaltenskombination mit erhöhter Risikoausprägung wurde das Vorliegen eines Bewegungsmangels kombiniert mit dem Konsum von Tabak festgestellt.
Hintergrund: Psychiatrische Institutsambulanzen (PIA) sind in Deutschland inzwischen weit verbreitet, deren Nutzen für gerontopsychiatrische Patienten jedoch wenig untersucht. Methoden: In einem Prä-Post-Studiendesign werden Effekte durch die PIA-Behandlung hinsichtlich Hospitalisierung, Polypharmazie und Effizienz analysiert. Datengrundlage sind retrospektiv erhobene Routinedaten der Jahre 2003 bis 2006 von 114 im Jahr 2006 durch die PIA Stralsund behandelten Altenheimbewohnern. Ergebnisse: Für Patienten ohne stationäre Voraufenthalte während der dreijährigen Präphase vor Behandlung durch die PIA und Heimbewohner mit geringem stationärem Behandlungsbedarf finden sich keine signifikanten Ergebnisse. Bei Patienten mit hohem Behandlungsbedarf (heavy-user) ist hinsichtlich der Hospitalisierungsdauer- und Häufigkeit eine Reduktion um durchschnittlich 50 Tage (83%) bzw. 2 Aufenthalte (69%) festzustellen. Auch ist für diese Patientengruppe eine Effizienzsteigerung in Höhe von mehr als 10.000€ pro Patient und Jahr nachweisbar. Es wird für keine der drei Patientengruppen eine Abschwächung des zuvor beobachteten Trends zunehmender Verschreibung somatischer und psychiatrischer Arzneimittel gefunden. Diskussion und Schlussfolgerung: Heavy user profitieren von der aufsuchenden und multiprofessionellen Behandlung der PIA, für weitere Heimbewohner deutet sich die Behebung einer bisherigen Unterversorgung an. Insbesondere für jüngere Patienten und langjährige Heimbewohner scheint eine Reduktion der Polypharmazie möglich. Für beide Aspekte sind weiterführende Untersuchungen notwendig.
Bisher sind Teildarstellungen der Mundgesundheit bei Kindern im Alter von 5 – 6 Jahren entstanden. Daher wird im Rahmen des Forschungsverbundes Community Medicine der Ernst- Moritz- Arndt Universität Greifswald eine komplexe repräsentative Erhebung, die sich mit dem Gesundheitszustand in der 1. Dentition befasst, durchgeführt. Die gesetzlich vorgeschriebene medizinische Eingangsuntersuchung wird für den Schuljahrgang 1995 der Stadt Greifswald mit einer zahnmedizinischen Querschnittsstudie an 521 Kindern im Durchschnittsalter von 5,9 Jahren kombiniert. Als wesentliche Mundgesundheitsparameter in der Milchgebissphase werden angesehen: - Kariesprävalenz - Kariessanierungsgrad - Zahnverlustrate - Plaquebefall und Gingivazustand - Dysgnathien einschließlich definierter Dysgnathiesymptome - Orofaziale Dysfunktionen und Parafunktionen Es bestehen Beziehungen zwischen der Gebissmorphologie einerseits und der Weichteilfunktion und Sprachlautbildung andererseits. Eine erhöhte Kariesintensität läst sich im engstehenden, lückenlosen und dysgnathen Milchgebiss nachweisen. Das engstehende Milchgebiss stellt sich als Hochrisikogruppe hinsichtlich der Dysgnathieprävalenz und der kieferorthopädischen Behandlungsbedürftigkeit dar. Die Diskrepanz zwischen notwendigen und tatsächlich durchgeführten kieferorthopädischen Frühbehandlungen ist groß und der Sanierungsgrad der Milchgebisskaries ist schlecht.
Der Kernexport neusynthetisierter Kapside stellt einen Schlüsselprozess in der Herpesvirus-Replikation dar. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Vesikel-vermittelten Translokation sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Der nuclear egress wird dabei maßgeblich von zwei viralen Proteinen dirigiert, die in PrV und HSV-1/-2 als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden und in allen Herpesviren konserviert sind. Beide Proteine interagieren an der inneren Kernmembran, wo sie den sogenannten nuclear egress complex (NEC) bilden. Während pUL34 ein membranständiges Protein in der Kernmembran ist, gelangt das lösliche pUL31 über einen aktiven Transport in den Kern. Obwohl der erste Schritt der Freisetzung aus dem Kern, die Vesikelbildung und Abschnürung an der inneren Kernmembran, schon gut untersucht ist und auch die Kristallstrukturen des NEC für verschiedene Herpesviren ermittelt werden konnte, sind noch viele Fragen offen. So war zu Beginn dieser Arbeit noch unklar wie die Kapside in diese Hüllen rekrutiert werden und welche Rolle die nicht konservierte und offensichtlich flexible N-terminale Domäne von pUL31, die nicht in den Kristallstrukturen dargestellt werden konnte, für die Regulierung dieses Prozesses spielt. So konzentrierte sich diese Arbeit auf die Fragen, wie die Kapside mit dem NEC interagieren (Paper I und II) und wie der pUL31-N-Terminus diesen ungewöhnlichen Transportweg beeinflusst (Paper III).
Paper I und II: Untersuchungen zur Nukleokapsid/NEC Interaktion
Unklar ist, wie der NEC mit seiner Fracht, den Nukleokapsiden, interagiert. Auf Grundlage der vorhandenen Kristallstrukturen des Komplexes unterschiedlicher Herpesviren wurde eine Interaktionsdomäne in pUL31 postuliert und angenommen, dass dies mittels elektrostatischer Wechselwirkungen erfolgt. Um dies näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit geladene Aminosäuren, die als mögliche Interaktionspartner in Frage kommen, zu Alanin mutiert. Die so generierten pUL31 Mutanten wurden, nach Transfektion entsprechender Expressionsplasmide in Kaninchennierenzellen (RK13), auf ihre Lokalisation und nach Koexpression mit pUL34 auf Interaktion getestet. Die Funktionalität der mutierten Proteine während der Virusreplikation wurde mit Hilfe stabiler Zelllinien nach Infektion mit PrV-∆UL31 untersucht. Über elektronenmikroskopische Analysen wurde der Einfluss auf den Kernexport im Detail betrachtet. Hierbei konnte einem konservierten Lysin an Position 242 in PrV pUL31 im Prozess der Kapsidumhüllung eine Schlüsselrolle zugeordnet werden. Dieses Lysin befindet sich im membrandistalen Bereich des NECs, in der Alphahelix H10 von PrV pUL31. Die Substitution des K242 zu Alanin führte zu einem Abschnüren und einer Akkumulation leerer, Virushüllen-ähnlicher Vesikel im PNS, obwohl reife Kapside im Kern und in unmittelbarer Nähe zu den Akkumulationen vorhanden waren. Dies führte zu der Hypothese, dass die Ladung des Lysins direkt an der Interaktion mit dem Kapsid beteiligt ist (Paper I).
Obwohl das Lysin 242 in der Struktur des Dimers oberflächenexponiert erschien, zeigten Modellierungen im NEC Oligomer, dass diese Aminosäure vermutlich zu tief in der Struktur verborgen ist um als direkter Interaktionspartner in Frage zu kommen. Um die im vorherigen Paper aufgestellte Hypothese zu verifizieren oder auch zu widerlegen, wurde das Lysin nicht nur durch Alanin, sondern auch durch andere nicht geladene, sowohl positiv als auch negativ geladene oder in ihrer Größe variierende Aminosäuren substituiert (Paper II).
Die neu generierten Substitutionsmutanten wurden nach Transfektion der Expressionsplasmide auf ihre Lokalisation und nach Kotransfektion mit pUL34, auf ihre Interaktion untersucht. Die Funktionalität der mutierten Proteine wurde ebenfalls mit Hilfe stabil exprimierender Zelllinien analysiert. Die vorliegenden Phänotypen wurden weiter mittels elektronenmikroskopischer Analysen bestimmt. Es stellte sich heraus, dass unabhängig von der vorhandenen Ladung der Aminosäure an Position 242 der Kernexport signifikant beeinträchtigt wurde. In Strukturanalysen der einzelnen Mutanten zeigte sich, dass vielmehr die Ausrichtung und Größe der Seitenkette der ersetzten Aminosäure entscheidend war. So störte beispielsweise die Substitution zu Serin und Tyrosin, die die Lage der Seitenketten des ursprünglich vorliegenden Lysins imitierten, die Funktion des pUL31 am wenigsten und die Titer erreichten fast Wildtypwerte. Dagegen führten Substitutionen zu deutlich längeren Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Arginin, zu massiven Beeinträchtigungen des nuclear egress. Allerdings führte keine der Substitutionen zu einem unkontrollierten Abschnüren von Vesikeln ohne Aufnahme eines Kapsids an der inneren Kernmembran.
Die hier gezeigten Ergebnisse entkräfteten die Annahme einer elektrostatischen Interaktion über pUL31 K242 mit den Nukleokapsiden in PrV. Vielmehr deuteten sie auf eine strukturell basierte Störung der Kapsidaufnahme in die Vesikel hin (Paper II).
Mittels serieller Passagen von Virusmutanten die das UL31 mit der K242A Substitution exprimierten, wurde nach möglichen kompensatorischen (second-site) Mutationen gesucht, die den Defekt ausgleichen und darüber hinaus Aufschluss auf die molekularen Ursachen ziehen lassen.
Die generierten Virusrekombinanten erreichten bereits nach ca. 10 Passagen Wildtpy-ähnliche Titer. Aus den Passagen wurden verschiedene Isolate charakterisiert. Es zeigte sich zwar keine Reversion zum Lysin 242, vielmehr waren jedoch entweder weitere Mutationen in pUL31 oder in pUL34 zu finden. Während die detektierten pUL34 Mutationen zu einem späteren Zeitpunkt charakterisiert werden müssen, wurden die second-site mutierten pUL31 Proteine auf Lokalisation, Kolokalisation und Kompensation des K242A Defektes getestet. Die Ergebnisse bestärkten die Annahme eines Strukturdefektes durch K242A. Darüber hinaus konnten durch Rückmutation des K242A Defektes in den second-site mutierten pUL31 zwei Helices bestätigt werden (H5 und H11), die ähnlich der H10 einen starken Einfluss auf den Kernexport besitzen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäure an Position 242 nicht direkt mit den Nukleokapsiden interagiert, dass eingeführte Mutationen jedoch die Umorganisation des NEC-Oligomers, welche offensichtlich notwendig für die effiziente Kapsidumhüllung an der inneren Kernmembran ist, stört und so den nuclear egress inhibiert (Paper II).
Es zeigte sich, dass sich die Struktur-Funktions-Beziehungen in den NECs komplexer darstellen als vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit können zwar nicht den Mechanismus des Kapsidexports bzw. der Kapsidbindung und -inkorporation aufklären doch zeigen sie, dass die Interaktionen der NECs miteinander sehr viel komplexer aber auch wesentlich flexibler sind als zunächst angenommen.
Paper III: Untersuchung der N-terminalen Domäne von PrV pUL31
Neben einem Kernlokalisationssignal (NLS) beherbergt der N-terminus verschiedener pUL31 Homologer auch zahlreiche vorhergesagte Phosphorylierungsstellen, die an der Regulation des Kernexportes beteiligt sind bzw. sein könnten. Dieser flexible N-terminale Bereich hat in PrV pUL31 eine Länge von 25 Aminosäuren, wobei auffallend viele basische Aminosäuren in Clustern und verschiedene mögliche Phosphorylierungsstellen enthalten sind. Computer-unterstütze Analysen (NLStradamus) erkennen in der Aminosäuresequenz ein bipartites NLS (AS 5-20). Um die Rolle des N-terminalen Bereiches in PrV pUL31 näher zu untersuchen, wurde dieser schrittweise verkürzt und die basischen Aminosäuren, sowie die möglichen Phosphorylierungsstellen, durch gerichtete Mutagenese durch Alanin ersetzt. Getestet wurden diese Mutanten nach Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in RK13 Zellen auf ihre Lokalisation und, nach Koexpression von pUL34, auf Interaktion und der Umorganisation der Kernmembran. Über stabil-exprimierende Zelllinien und nach Infektion mit der UL31 negativen Virusmutante (PrV-∆UL31) wurde die Funktionalität in eplikationsassays und auch ultrastrukturell charakterisiert. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass weder das bipartite NLS noch die vorhergesagten Phosphorylierungsstellen eine entscheidende Rolle spielen. Vielmehr konnte der größte Teil des N-Terminus ohne sichtbaren Funktionsverlust deletiert werden, sofern mindestens ein Cluster basischer Aminosäuren in dieser Region erhalten blieb. Die Ergebnisse zeigten, dass der basische Charakter dieser Region entscheidend für die korrekte Lokalisation, sowie für die Bildung und Funktionalität des NEC ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung im N-Terminus von PrV pUL31, wie auch die roteinkinase pUS3, zwar nicht essenziell für die Freisetzung der Nukleokapside aus dem perinukleären Spalt sind, jedoch diesen Prozess unterstützen (Paper III).