Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (88)
Language
- German (88) (remove)
Has Fulltext
- yes (88)
Is part of the Bibliography
- no (88)
Keywords
- Biopharmazie (15)
- Wirkstofffreisetzung (13)
- Pharmazeutische Technologie (8)
- Gastrointestinaltrakt (7)
- Cytotoxizität (6)
- In vitro (6)
- Feste Arzneiform (5)
- Magen (5)
- Organische Synthese (5)
- biorelevant dissolution (5)
Institute
- Institut für Pharmazie (88) (remove)
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
Die Kv7-Kaliumkanalöffner Flupirtin und Retigabin waren wertvolle Alternativen bei der Pharmakotherapie von Schmerzen und Epilepsie. Beide Wirkstoffe werden aufgrund von unerwünschten Arzneimittelwirkungen derzeit jedoch nicht mehr eingesetzt. Die Flupirtin-induzierte Hepatotoxizität und die durch Retigabin hervorgerufenen Gewebeverfärbungen scheinen dabei auf den ersten Blick nicht zusammenzuhängen. Gleichwohl lassen sich wahrscheinlich beide Nebenwirkungen auf das gemeinsame oxidationsempfindliche Triaminoaryl-Grundgerüst zurückführen, welches zur Bildung von reaktiven Chinondiimin-Metaboliten neigt. Da hingegen der Wirkungsmechanismus, d. h. die Öffnung der Kv7-Kanäle, nicht an der Toxizität beteiligt zu sein scheint, hatte diese Arbeit zum Ziel, sicherere Alternativen für Flupirtin und Retigabin zu entwickeln. In einem Liganden-basierten Ansatz wurde eine Umgestaltung des Triaminoaryl-Kerns, den beide Wirkstoffe gemeinsam haben, vorgenommen, was zu Carba-Analoga führte, die durch eine erhöhte Oxidationsbeständigkeit sowie ein vernachlässigbares Risiko für die Bildung von chinoiden Metaboliten charakterisiert sind. Zusätzlich zu diesen verbesserten Sicherheitsmerkmalen offenbarten einige der neuartigen Derivate eine überlegene Kv7.2/3-Kanalöffnungsaktivität. Im Vergleich zu Flupirtin konnte die Potenz der Verbindungen um den Faktor 150 gesteigert werden, während die intrinsische Aktivität auf bis zu 176 % verbessert werden konnte, was die betreffenden Carba-Analoga zu vielversprechenden Kandidaten für eine weitergehende Entwicklung macht. Andererseits ermöglichten einige inaktive Verbindungen sowie die insgesamt deutlich abgestuften Kv7.2/3-Aktivitätsdaten die Etablierung von validen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Hypothesen zum Bindungsmodus, die mit Dockingergebnissen und Molekulardynamik-Simulationen korrelierten.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmodelle werden u. a. für das Screening neuartiger Formulierungen, zur Etablierung von In-vitro-/In-vivo-Korrelationen und zur Vorhersage des In-vivo-Verhaltens einer applizierten Darreichungsform angewendet. Die Entwicklung von In-vitro-Freisetzungsmodellen für peroral verabreichte Arzneiformen fokussierte bisher vorwiegend auf die Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden, „durchschnittlichen“ Erwachsenen. Patientenspezifische Faktoren, wie z. B. das Alter, Erkrankungen oder Geschlecht sowie individuelle Unterschiede, die die gastrointestinalen Verhältnisse und folglich auch das Freisetzungsverhalten einer peroral applizierten Arzneiform beeinflussen können, wurden bisher kaum berücksichtigt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Etablierung von patientenspezifischen, bioprädiktiven In-vitro-Freisetzungsmodellen für perorale Darreichungs-formen unter Berücksichtigung der gastrointestinalen Gegebenheiten zweier unterschiedlicher Patientenpopulationen: pädiatrische Patienten und Parkinson-Patienten.
Eine wichtige Voraussetzung für eine sichere und wirksame perorale Arzneimitteltherapie bei pädiatrischen Patienten sind altersgerechte Darreichungsformen sowie eine geeignete Einnahmepraxis. Peroral applizierte Arzneimittel werden pädiatrischen Patienten häufig zusammen mit Applikationsvehikeln verabreicht, um die Einnahme der Arzneimittel zu erleichtern. Es muss jedoch bei einer solchen Anwendungspraxis sichergestellt werden, dass die eingenommene Arzneiform mit dem jeweiligen Applikationsvehikel kompatibel ist. Die Beurteilung der Kompatibilität ist anhand klinischer In-vivo-Studien an gesunden Kindern jedoch aufgrund ethischer Bedenken kaum möglich. Zur Evaluierung der Kompatibilität könnten In-vitro-Freisetzungsmethoden als eine mögliche Alternative eingesetzt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pädiatrische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt, um zu evaluieren, ob die Stabilität und das In-vivo-Freisetzungsverhalten der neuartigen Alkindi®-Formulierung durch Co-Verabreichung mit alterstypischen Applikationsvehikeln beeinträchtigt werden. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden im Anschluss an eine intensive Literaturrecherche Physiologie-basierte In-vitro-Modelle auf Basis der Mini-Paddle-Apparatur entwickelt. In der ersten Studie wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung nach simulierter Applikation der Alkindi®-Formulierung mit typischen Applikationsvehikeln für Kinder unter 6 Jahren, d. h. Muttermilch, Formulamilch und Vollmilch, untersucht. In der zweiten In-vitro-Studie wurde der Altersbereich der adressierten Patientenpopulation auf 2 - 16 Jahre verändert und eine Reihe weiterer flüssiger sowie halbfester Applikationsvehikel, wie z. B. Orangensaft und Joghurt, verwendet. In beiden Studien konnte deutlich gezeigt werden, dass die Alkindi®-Formulierung ein robustes Freisetzungsverhalten aufwies und kompatibel mit den untersuchten Matrices war. Auf Grundlage der Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen wurde geschlussfolgert, dass die In-vivo-Freisetzung und die Bioverfügbarkeit der untersuchten Arzneiform nicht durch die untersuchten Applikationsvehikel beeinflusst werden und folglich diese Vehikel zur gemeinsamen Einnahme mit der Alkindi®-Formulierung geeignet sind. Diese Beobachtungen wurden darüber hinaus durch publizierte Ergebnisse einer korrespondierenden In-vivo-Studie in Erwachsenen bestätigt.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines neuartigen, Parkinson-spezifischen und Physiologie-basierten In-vitro-Freisetzungsmodells. Für die Entwicklung von biorelevanten In-vitro-Modellen zur Simulation der luminalen Bedingungen im Gastrointestinal-trakt einer spezifischen Patientenpopulation sind umfangreiche Kenntnisse über die jeweiligen gastrointestinalen In-vivo-Bedingungen und deren Variabilität unerlässlich. Im Rahmen einer Literaturrecherche wurde der aktuelle Wissensstand zu den gastrointestinalen Gegebenheiten in Parkinson-Patienten recherchiert, ausgewertet und zusammengefasst. Die Ergebnisse der Literaturstudie machen deutlich, dass sich die gastrointestinalen Bedingungen von Parkinson-Patienten teilweise erheblich von gesunden Erwachsenen unterscheiden. Das bedeutendste gastrointestinale Merkmal von Parkinson-Patienten ist die beeinträchtigte Motilität des Gastrointestinaltrakts, was sich u. a. in einer Verlangsamung der Magenentleerung sowie der intestinalen Passage äußert. Demgegenüber steht jedoch ein großer Mangel an Daten für eine Reihe von gastrointestinalen Parametern. Dies betrifft z. B. die Zusammensetzung und physiko-chemischen Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten des Gastrointestinaltrakts.
Als geeignete In-vitro-Testplattform wurde die USP-3-Apparatur – auch als Eintauchender Zylinder (Europäisches Arzneibuch, Ph. Eur.) und Reciprocating cylinder (Ph. Eur. und US-amerikanisches Arzneibuch, USP) bezeichnet – ausgewählt, da sich diese Testplattform insbesondere zur Untersuchung von Darreichungsformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung eignet und bereits in einer Vielzahl von analytischen Laboren etabliert ist. Die Nutzung der kompendialen USP-3-Apparatur ließ aufgrund der geringen Variationsmöglichkeiten keine Simulation typischer Motilitätsmuster im humanen Gastrointestinaltrakt zu und eignete sich noch weniger für die Entwicklung und Etablierung von individuellen, patientenspezifischen Motilitätsprofilen. Um diese technischen Limitationen zu überwinden, wurde für die Weiterentwicklung des arzneibuchkonformen Modells ein Lastenheft erstellt, welches detaillierte Anforderungen für die Entwicklung der neuen Testapparatur enthielt. Auf Grundlage des beschriebenen Übersichtsartikels und unter Anwendung einer auf Basis des Lastenheftes modifizierten USP-3-Apparatur wurden unter besonderer Berücksichtigung von Motilität, Passagezeiten und Flüssigkeitsvolumina Parkinson-spezifische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt. Für ausgewählte modifiziert freisetzende Levodopa-Fertigarzneimittel wurde anschließend eine vergleichende Serie von In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen unter Anwendung von Parkinson-spezifischen- oder „standardmäßigen“ Testmodellen durchgeführt, wobei letztere die gastrointestinalen Gegebenheiten eines „durchschnittlichen“, gesunden Erwachsenen simulierten. Für eine Beurteilung der Aussagekraft der entwickelten Parkinson-spezifischen Testmodelle wurden die generierten In-vitro-Freisetzungsdaten aus den Parkinson-spezifischen- und den „standardmäßigen“ Freisetzungsuntersuchungen in ein In-silico-PBPK-Modell implementiert und die jeweiligen simulierten Plasmakonzentrations-Zeit-Profile von Levodopa anschließend mit klinischen, durchschnittlichen In-vivo-Daten korreliert. Für PBPK-Modelle mit integrierten Parkinson-spezifischen In-vitro-Freisetzungsdaten wurde eine höhere Prädiktivität des In-vivo-Verhaltens der untersuchten Levodopa-Darreichungsformen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Parkinson-spezifischen In-vitro-Modelle ein vielversprechendes und prädiktives Instrument zur Vorhersage der In-vivo-Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Levodopa-Darreichungsformen darstellen. Der diskutierte methodische Ansatz der vorliegenden Studie könnte zukünftig das Screening neuartiger Formulierungen deutlich optimieren und somit zu einer verbesserten Arzneimitteltherapie für Parkinson-Patienten, aber auch für andere spezifische Patientengruppen beitragen
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Die zielgerichtete Steuerung einer Arzneiform zu einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltraktes ist ein wesentlicher Punkt, wenn es um die Erhöhung der Bioverfügbarkeit und um die Verringerung von möglichen Nebenwirkungen geht. Im Zuge dessen macht man sich die physiologischen Unterschiede entlang des Verdauungstraktes zu Nutze, die unter anderem den pH-Wert, die Transitzeiten oder die Enzymausstattung betreffen. Verschiedene Faktoren wie Nahrungsaufnahme oder pathophysiologische Veränderungen können allerdings dazu führen, dass pH-, Zeit- oder Enzym-getriggerte Darreichungsformen versagen und ihren Wirkstoff entweder zu früh, zu spät oder gar nicht freisetzen. Durch die Entwicklung neuer Arzneiformen, die ihren Wirkstoff aufgrund eines definierten Drucks freigeben, könnten diese Probleme unter Umständen vermieden werden. Weiterhin kann die Bioverfügbarkeit besonders von schwer löslichen Wirkstoffen negativ beeinflusst werden durch den Zeitpunkt und die Dauer der Desintegration einer Arzneiform und das Fehlen der dafür erforderlichen Wassermengen im Gastrointestinaltrakt. Besonders bei Wirkstoffen mit einem engen Absorptionsfenster im oberen Dünndarm ist ein schneller Lösungsprozess des Wirkstoffs einer Arzneiform wichtig, um eine optimale Absorption zu gewährleisten. Aus diesem Grund bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Entwicklung neuer drucksensitiver Darreichungsformen, die ihren Inhalt bei einem definierten Druck von 300 mbar, wie er am Pylorus vorherrscht, schlagartig und komplett freisetzen. Dabei sollten die Arzneiformen vor ihrer Entleerung weder durch eine verlängerte Magenverweilzeit noch durch den sauren pH-Wert des Magens angegriffen werden, um eine verfrühte Wirkstofffreisetzung zu vermeiden. Die entwickelten Darreichungsformen sollten den Wirkstoff entweder in bereits gelöster Form oder dispergiert in einer flüssigen Grundlage enthalten, die sich nach Zerplatzen über die Dünndarm-Schleimhaut verteilen und durch eine verlängerte Kontaktzeit die Absorptionsrate erhöhen kann. Für die entwickelten Arzneiformen wurden Methoden zur Gehaltsbestimmung entwickelt, um die Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit einschätzen zu können. Weiterhin wurde ein dreistündiger Freisetzungsversuch in der Paddle-Apparatur zur Simulation einer verlängerten Magenverweilzeit durchgeführt. Bruchfestigkeitsuntersuchungen am Texture Analyser sollten die Beeinflussung der aufzuwendenden Kraft in Bezug zu individuellen Parametern, wie Polymerbeladung oder Konzentration beurteilen. Mit Hilfe der Stresstest-Apparatur wurde die direkte Einwirkung von Druck im Bereich zwischen 100 und 500 mbar untersucht, und unter Verwendung eines Magenentleerungsprogramms das Verhalten der Darreichungsformen im nüchternen Magen und bei der Pyloruspassage simuliert. Es wurden sechs unterschiedliche Darreichungsformen entwickelt, deren Eignung als drucksensitive Arzneiform anhand der genannten Prüfungen untersucht wurde. Die Entwicklung der Agar-Kugeln beruhte auf der Eigenschaft des Gelbildners spröde Matrizes zu bilden, deren Bruchverhalten durch Veränderung der Konzentration oder durch eine definierte Trocknungszeit beeinflusst werden konnte. Das Prinzip der Hartfett- und PEG-Kugeln beruhte darauf, dass Hilfsstoffe, die bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur schmelzen, mit einem wasserunlöslichen Polymer überzogen wurden, der aus der Arzneiform bei Eintritt in den Körper einen flüssigkeitsgefüllten Ballon bildete. Die mit Ethylcellulose überzogenen Paraffin-Kapseln sollten durch das Einfügen einer Sollbruchstelle in Form von acht radial angeordneten Löchern zerplatzen und ihren Inhalt freigeben. Das wässrige Medium sollte durch die Löcher eindringen, die innere Gelatinekapsel anlösen und somit zu einer dünnen Polymer-Schicht führen, die auf Druck nachgeben und den Inhalt komplett freisetzen sollte. Die entwickelten Tristearin-Kapseln bestanden aus einer festen, spröden, wasserabweisenden Hülle aus einem hochschmelzenden Hartfett, mit welchem in flüssiger Form handelsübliche Gelatine-Kapseln innenbeschichtet werden konnten und wurden mit einem wirkstoffhaltigen Hydrogel gefüllt. Bei den Kaugummi-Tabletten sollte ein dünner Mantel aus lipophiler Kaugummi-Grundmasse die Arzneiform vor dem Einfluss wässriger Medien schützen. Ein enthaltener Kern aus Hartfett, welcher bei Körpertemperatur schmilzt, sollte zusätzlich dafür sorgen, dass das Gerüst der Tablette instabil wird und sie durch definierte Druckeinwirkung zum Platzen gebracht wird. Eingefügte Sollbruchstellen sollten das Platzen steuern und ein anschließendes Dippen in eine heptanhaltige Kaugummilösung sollte die Arzneiformen soweit stabilisieren, dass sie nicht bereits bei zu niedrigen Drücken zerbrachen. Unter den entwickelten Darreichungsformen erwiesen sich vor allem die Tristearin-Kapseln und die Hartfett-Kugeln als sehr geeignet für eine drucksensitive Freisetzung, während für die anderen Arzneiformen weitere Modifikationen notwendig wären.
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
In der Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung von trans-Platin(IV)-Diaziden beschrieben. Es wird gezeigt, dass sie durch die Verwendung von UV- und Weißlicht photoaktiviert werden können, wobei Photoreduktionen, Photosubstitutionen oder Photoisomerisierungen auftreten können. Ähnlich wie der bekannte Antitumorwirkstoff Cisplatin, sind die Verbindungen in der Lage irreversiblel an DNA zu binden. In Zellversuchen konnte zusätzlich eine antiproliferierende Aktivität festgestellt werden, wenn mit Licht bestrahlt wurde. Im Dunkeln zeigten die Verbindungen keine Wirkung. Durch Zellzyklusanalysen und der Beobachtung von morphologischen Veränderung nach der Behandlung mit Platin(IV)-Diaziden kann jedoch auf einen zu Cisplatin unterschiedlichen Wirkmechanismus geschlossen werden.
Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Koronare Drug-eluting Stents sind röhrenförmige, netzartig aufgebaute, medizinische Implantate aus meist metallischen Grundkörpern, die zur Vermeidung eines erneuten Gefäßverschlusses mit Wirkstoff beschichtet sind. Derzeit finden die Beschichtungen der Stents typischerweise über speziell entwickelte Einzelbeschichtungsverfahren statt, die es ermöglichen, die feingliedrige und fragile Struktur der Implantate zu beschichten. Wesentliche Nachteile dieser Verfahren liegen allerdings in hohen Materialverlusten und geringer Fertigungs¬menge, die zu hohen Produktionskosten führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung von Stents eingesetzt werden kann. Die Wirbelschichttechnologie stellt ein etabliertes Verfahren zur Beschichtung von Partikeln im Großmaßstab mit geringen Verlusten dar. Obwohl in der Literatur das Verhalten verschiedener Partikel (Größe, Form, Dichte) in der Wirbelschicht beschrieben ist, wurde das Verhalten von netzartig aufgebauten Hohlkörpern noch nicht untersucht. Inwiefern sich die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung der fragilen Stents eignet, ist daher nicht vorhersagbar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine Beurteilung hinsichtlich der Anwendbarkeit des Wirbelschichtverfahrens zur Beschichtung von Stents erfolgen. Dazu wurde das Fluidisierungs-verhalten der Körper unter Verwendung verschiedener Anströmböden untersucht. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Prozessparameter, verschiedener Beschichtungsrezepturen und Stenttypen auf die Qualität der Beschichtung untersucht. Dazu wurden die beschichteten Körper hinsichtlich Homogenität und Defekte der Oberfläche, ihrer Robustheit gegenüber mechanischen Einflüssen, der Schichtverteilung und Gehaltsgleichförmigkeit und des Wirkstofffreisetzungsverhaltens untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Stents den Partikel der Geldart- Klasse D zugeordnet werden und die Beschichtungen der Stents erfolgte unter Verwendung eines speziell angefertigten konisch ausgeformten Anströmbodens. In Versuchen mit verschiedenen Beschichtungsmaterialien war es möglich typischer Weise auftretende Beschichtungsdefekte und präventive Gegenmaßnahmen zu identifizieren. So zeigte sich, dass es unter Verwendung von wässrig dispergierten Beschichtungsmaterialien die Bildung von Brücken oder Schwimmhäuten ausblieb, während diese typischer Weise unter Verwendung von organisch gelösten Beschichtungsrezepturen auftraten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es durch Anpassung der Prozessparameter möglich war Beschichtungen mit hoher Qualität zu erzeugen. Dabei wurden unabhängig von der Lackrezeptur leichter Abrieb, Risse oder Deformationen der Stentgrundkörper vor allem an den Stentenden beobachtet, da die Stents während des Beschichtungsprozesses einer starken mechanischen Belastung ausgesetzt waren. In Versuchen mit unterschiedlichen Auftragsmengen beziehungsweise Prozesszeiten und unterschiedlich langen Stents konnte gezeigt werden, dass die Defekte unter gleichbleibenden Bedingungen mit zunehmender Prozesszeit und abnehmender Stentlänge zunehmen. Zudem zeigte sich, dass auch die Prozessparameter und Flexibilität der Beschichtung Einfluss auf den Anteil defekter Stents nimmt. Durch Adaptierung des Beschichtungsprozesses ist es entsprechend möglich die Defekte zu reduzieren. In der Regel wurde ein etwas höherer abluminaler Schichtauftrag erzielt, wobei die Schicht homogen über die gesamte Stentlänge verteilt war. Es resultierten üblicherweise Abscheideraten des Beschichtungslackes von 40 - 50 % und darüber hinaus konnten durch die gleichzeitige Beschichtung einer hohen Stückzahl von Grundkörpern Fertigungsmengen von umgerechnet bis zu 25 Stents pro Minute erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Wirbelschichttechnologie ein vielversprechendes Verfahren zur Beschichtung von Stents im Großmaßstab darstellt, das in Bezug auf Ausbeute und Fertigungsmenge den derzeit herkömmlich verwendeten Beschichtungstechnologien überlegen ist, wobei die Qualität der erzeugten Beschichtungen vergleichbar mit der Beschichtungsqualität herkömmlich beschichteter Stents ist.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein auf dem Promotor Pdes basierendes Kälte-induzierbares Expressionssystem für B. subtilis konstruiert und sukzessive optimiert. Dazu wurden verschiedene Kälte-regulatorische DNA-Sequenzen aus B. subtilis an das entsprechende Zielgen fusioniert, was neben der Kälte-Induzierbarkeit in einem positiven Einfluss auf die Expressionsstärke durch eine effizientere Translation bzw. Stabilisierung der mRNA resultierte. Vorausgehend wurde in vergleichenden Versuchen die Eignung unterschiedlicher Galaktosidasen zur Verwendung als Reporterenzyme für B. subtilis untersucht. Hierbei wurde erstmals die heterologe Expression einer Kälte-angepassten β-Galaktosidase aus P. haloplanktis TAE79 in B. subtilis durchgeführt und diese durch die Integration der DB-Sequenz sowie einer stem-loop-Struktur aus der 5‘-UTR des B. subtilis cspB-Gens gesteigert. Somit konnte nachgewiesen werden dass sowohl die additiven Sequenzen der cspB-DB und der cspB-sl-UTR als auch des bkdB-Terminators zu einer deutlich erhöhten Synthese der entsprechenden Zielproteine führt. Anhand der Überexpression einer Xylanase aus B. subtilis sowie einer α-Glucosidase aus S. cerevisiae wurde abschließend die Eignung des konstruierten Systems für die sekretorische und intrazelluläre Proteinsynthese in B. subtilis demonstriert. Diese Ergebnisse bestätigen die Eignung von B. subtilis als Wirtsorganismus auch für die Überproduktion kritischer, schwer zu faltender Proteine.