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In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.
Durch in vitro-Studien konnte gezeigt werden, dass Polihexanid im Vergleich zu anderen bekannten antimikrobiellen Wirkstoffen sowie in Anwesenheit anwendungsnah simulierter organischer Belastungen ein für die Wundantisepsis geeigneter Wirkstoff ist. Im Kontext mit den bekannten Daten zur Verträglichkeit zumindest im Bereich der medizinischen Anwendungskonzentrationen (0,02 % und 0,04 % Polihexanid) und zum Einfluss auf die Wundheilung stützen die hier erhobenen Daten die bestehende Konsensusempfehlung zur Wundantiseptik, nach der Polihexanid zwar auch zur akuten Wundantiseptik, insbesondere aber zur Behandlung chronischer Wunden als geeignet angesehen wird. Auf Basis der biochemischen und biopysikalischen Grundlagen der Wirksamkeit von Polihexanid wurde die Möglichkeit der weiteren Verminderung der Zytotoxizität des Polihexanids bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der bakteriziden Wirksamkeit durch die Bindung an Phosphatidylcholin-haltige o/w-Emulsionen gezeigt; im Testsystem bei gleichzeitiger Anwesenheit von Bakterien und eukaryotischen Zellen unter simulierten Wundbedingungen war bereits die Kombination 0,05 % PHMB / 0,4 % EPC vollständig bakterizid und dabei ohne zytotoxischen Effekt wirksam. Diese Darreichungsform fungiert weiterhin als PHMB-Depot, das auch nach wiederholter Passage durch eine Bakteriensuspension noch die gleiche wundantiseptische Wirksamkeit aufweist wie in der ersten Passage. Erste in vitro- und in vivo-Erfahrungen mit den hier beschriebenen PHMB-haltigen o/w-Emulsionen wurden bereits durch andere Arbeitsgruppen publiziert. Demnach führt diese neue Darreichungsform zu einer größeren Eindringtiefe des Wirkstoffs in die Haarfollikel, die in Bezug auf die Hautfläche das mit Abstand größte Reservoir für die mikrobielle Hautflora und nicht zuletzt auch für eine Repopulation oberflächlich desinfizierter Haut darstellen. Die in vivo–Daten deuten darauf hin, dass mit partikel-gebundenem PHMB eine bessere und nachhaltigere Antisepsis erreicht werden kann als mit freiem PHMB. Zusätzlich zum Beitrag an der Konsensusempfehlung des Polihexanids zur Behandlung chronischer Wunden wird damit als wesentliches Ergebnis der Dissertation die Erschließung von bisher für wässrige PHMB-Lösungen nicht möglicher medizinischer Einsatzorte wie in sensiblen Geweben oder Anwendung bei Neugeborenen, am Auge, in Gegenwart von Knorpel, am Peritoneum und in anderen Körperhöhlen (Blase, Harnröhre, vereiterte Gelenkhöhlen), zur Mukositis-Prophylaxe, bei der Krebschemotherapie, bei Verbrennungen 3. Grades, aber auch in der antimikrobiellen Behandlung von Zellkulturen vorstellbar. Bis zu einer solchen therapeutischen Nutzung sind jedoch noch weitere Studien notwendig. Als günstig dürfte sich erweisen, dass es sich sowohl beim Polihexanid, als auch bei dem hier verwendeten Lipofundin ® um bereits etablierte und gut verstandene Medizinprodukte handelt. Im Kontext der weltweit zunehmenden Antibiotikaresistenzen und Verbreitungswege nosokomialer Erreger bei entsprechend geringer werdenden chemotherapeutischen Interventionsmöglichkeiten durch Antibiotika gewinnt die Möglichkeit des Einsatzes von Antiseptika mit breitem Wirkungsspektrum und guter Verträglichkeit immer mehr an Bedeutung, und dabei auch umso mehr die Erweiterung bestehender Einsatz-Indikationen. Neben der auf den ersten Blick vordringlich erscheinenden Identifikation neuer Wirkstoffe kann nicht zuletzt auf Basis der hier vorgelegten Ergebnisse die auf das gewünschte Wirkumfeld zugeschnittene Modifikation der Darreichungsform bekannter antiseptischer Wirkstoffe als möglicher Weg zur verbesserten antimikrobiellen Therapie herausgestellt werden. Diesem Gedanken folgen beispielsweise bereits Versuche, die die besonderen Eigenschaften von Nanopartikeln oder Peptid-basierten Nanostrukturen für die Bekämpfung von Infektionen und Kolonisationen zu nutzen, wobei deren Einsatz wegen der zum Teil hohen ökologischen Fremdartigkeit für biologische Systeme kritisch evaluiert werden muss. Im Gegensatz dazu ähnelt die Wirkung des Polihexanids auf die zwangsläufig und physiologisch kaum modifizierbar negativ geladenen bakteriellen Zellwandstrukturen dem Wirkmechanismen natürlich vorkommender antibakterieller Peptide wie dem β-Defensin, die einen wesentlichen Bestandteil des evolutionär sehr alten, angeborenen Immunsystems der Vertebraten darstellen – mikrobielle Zellumhüllungen sind anfällig gegenüber polykationischen Verbindungen mit hydrophoben Domänen. Auch das stellt einen Vorteil des Polihexanids gegenüber anderen Antiseptika dar.
Untersuchungen zur Phytochemie und zur biologischen Aktivität von Pittosporum angustifolium Lodd.
(2014)
Pittosporum angustifolium Lodd. (Pittosporaceae) ist ein kleiner Baum, welcher ursprünglich in Australien beheimatet ist, wo er in den meisten inländischen Gebieten zwar zerstreut, aber lokal nie gehäuft vorkommt. Von dieser Spezies, welche oft auch mit der Trivialbezeichnung „Gumby Gumby” betitelt wird, werden im Bereich der Ethnomedizin Zubereitungen für verschiedenste Indikationsbereiche wie Schmerzen, Krämpfe, Erkältungen oder Hauterkrankungen verwendet. Auch in der Komplementärmedizin werden Präparationen dieser Pflanze als Additivum bei malignen Erkrankungen eingesetzt. Zielstellung der vorliegenden Dissertation war eine exakte Charakterisierung der Phytochemie von Pittosporum angustifolium sowie eine Untersuchung von Extrakten, Fraktionen und Isolaten auf deren biologische Aktivitäten. Neben zwei grundlegenden Diplomarbeiten [35,36] lagen zu Beginn dieser Arbeit (Januar 2010) keinerlei wissenschaftliche Publikationen diesbezüglich vor. Im Rahmen der Untersuchungen zur Phytochemie wurden aus australischem Drogenmaterial (Blätter und Samen) sowie aus selbstgezogenen Pflanzen (Blätter) insgesamt 55 Triterpensaponine isoliert. Von diesen konnten 33 vollständig und fünf teilweise strukturell aufgeklärt werden, wobei 29 Verbindungen, welche als Pittangretoside A-Z und A1-C1 bezeichnet wurden, erstmalig als Naturstoffe beschrieben werden konnten. Hierbei handelt es sich um Aglyka vom Oleanan-, 17,22 seco Oleanolsäure- und Taraxasterol-Typ, welche mono- oder bisdesmosidisch vorliegen. Zwischen den verwendeten Drogen-Chargen konnten sowohl quali- als auch quantitative Unterschiede hinsichtlich der Phytochemie festgestellt werden. In allen untersuchten Pflanzenteilen (Blatt, Samen, Spross, Wurzel) wurden Triterpensaponine nachgewiesen. Von weiteren 13 isolierten Polyphenolen konnten drei als glykosylierte Flavonole und weitere drei als Derivate von mit Kaffeesäure substituierter Chinasäure identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um bekannte Verbindungen. Über weitere Bestimmungen konnten Fettsäuren sowie als Bestandteile des ätherischen Öls Mono- und Sesquiterpene sowie C13 Isoprenoide bestimmt werden. Über verschiedene Testsysteme und Assays wurden Überprüfungen hinsichtlich biologischer Aktivitäten der Polyphenole und insbesondere der Triterpensaponine durchgeführt. Für letztere konnten über Agardiffusionstests antimikrobielle Wirkungen gegen mehrere Candida Arten, hämolytische und gegen mehrere tumorigene Zelllinien zytotoxische Effekte nachgewiesen werden. Weiterhin wurde eine Hemmung der humanen Topoisomerase I belegt. Alle beobachteten Aktivitäten sind an strukturelle Voraussetzungen der Triterpensaponine wie das Acylierungsmuster und die Zuckerverknüpfung gebunden. Hierzu konnten interessante Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet werden. So scheint für viele der gezeigten biologischen Effekte eine Acylierung mit hauptsächlich C5-Resten an Position C-22 bzw. C-21 und C-22 des Aglykons essentiell zu sein, während sich Verbindungen mit fehlender oder an C-28 vorhandener Acylierung in den durchgeführten Untersuchungen als vergleichsweise schwächer oder nicht aktiv erwiesen. Unterschiedliche Zuckerkompositionen zeigten hierbei einen abschwächenden oder verstärkenden Einfluss. Für die isolierten Polyphenole wurde eine antioxidative Aktivität nachgewiesen. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche Induktion von IL8 durch den Rohextrakt der australischen Blattdroge. Eine Überprüfung von Saponinen und Polyphenolen via NMDA-Rezeptor- und Cholinesterase-Inhibitionsassay erbrachte keinen Anhaltspunkt für eine antidementive Wirkung. Ebenso konnte kein Nachweis für eine antiphlogistische Wirkung (Bestimmung von TNFalpha) und für die Beeinflussung weiterer Zytokine (IL1beta und IL10) erbracht werden. Über einige dieser Ergebnisse lassen sich Anwendungsbebiete im Bereich der Komplementärmedizin wie z. B. bei malignen Erkrankungen erklären. Für andere ethnomedizinische Indikationen konnten aufgrund nicht zur Verfügung stehender oder nicht adequater Testsysteme keine abschließenden, beurteilenden Aussagen getroffen werden.