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Staphylococcus aureussuperantigens (SAgs) are among the most potent T cell mitogensknown.They stimulate large fractions of T cells by cross-linking their T cell receptor withmajor histocompatibility complex class-II molecules on antigen presenting cells, resulting in Tcell proliferation and massive cytokine release. To date, 26 different SAgs have been described in thespeciesS. aureus; they comprise the toxic shock syndrome toxin (TSST-1), as well as 25 staphylococcalenterotoxins (SEs) or enterotoxin-like proteins (SEls). SAgs can cause staphylococcal food poisoningand toxic shock syndrome and contribute to the clinical symptoms of staphylococcal infection. Inaddition, there is growing evidence that SAgs are involved in allergic diseases. This review providesan overview on recent epidemiological data on the involvement ofS. aureusSAgs and anti-SAg-IgEin allergy, demonstrating that being sensitized to SEs—in contrast to inhalant allergens—is associatedwith a severe disease course in patients with chronic airway inflammation. The mechanisms by whichSAgs trigger or amplify allergic immune responses, however, are not yet fully understood. Here, wediscuss known and hypothetical pathways by which SAgs can drive an atopic disease
In Deutschland gibt es ca. 3 Millionen Kontaktlinsenträger und pro Jahr ca. 12000 kontaktlinsen-assoziierte Keratitiden. Die Hauptursache dieser Keratitiden ist die mangelnde Compliance der Kontaktlinsenträger hinsichtlich einer adäquaten Kontaktlinsenhygiene. Leider sind jedoch die gängigen Reinigungsmethoden, besonders die am häufigsten angewandte chemische Reinigung mit den so genannten All-in-One-Lösungen besonders anfällig für Hygienefehler (Austauschrhythmen, Einwirkzeiten, mechanische Vorreinigung).
In dieser Arbeit wurde nun ein neues Desinfektionsverfahren getestet, das weitestgehend unabhängig von der Compliance der Anwender ist. Dazu setzten wir UVC-Strahlung ein und bestrahlten damit weiche Monatslinsen. Wir verwendeten zwei unterschiedlich dimensionierte Prototypen (UVC-Bestrahlungsgerät, LED-UVC-Bestrahlungsgerät). Wir testeten das Verfahren anhand der Vorschriften der Europäischen Norm EN ISO 14729. Diese Norm regelt die mikrobiellen Anforderungen und Prüfverfahren für Produkte und Systeme zum Hygienemanagement von Kontaktlinsen. Sie verlangt zwei verschiedene Test. Der Stand Alone Test ist die Pflegemitteldirektprüfung. Dabei wird das neue Desinfektionsverfahren an einer Keimaufschwemmung getestet. Der Regimen Test ist die Prüfung des Verfahrens anhand der eigenen Pflegeanleitung. Das Verfahren muss dazu an 5 Testkeimen (Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Fusarium solani) getestet werden.
Parallel zur UVC-Bestrahlung testeten wir noch vier handelsübliche All-in-One-Lösungen (Perfect Aqua Plus (MPG&E), Opti-Free Replenish (Alcon), All-in-One light (Sauflon Pharmaceuticals), Solo Care Aqua (Ciba Vision)) und verglichen dann die Ergebnisse.
Die Versuche bewiesen, dass die UVC-Bestrahlung sehr gut geeignet ist, um weiche Kontaktlinsen zu desinfizieren. Es reichten nur 30 s (UVC-Bestrahlungsgerät) bzw. 2 Stunden (LED-UVC-Bestrahlungsgerät) Bestrahlung aus um die geforderte Log-Reduktion von 3-5 Logstufen bei allen 5 Testorganismen zu erreichen.
Leider mussten wir feststellen, dass die All-in-One-Lösungen deutlich schlechter abschnitten und die Norm somit zum größten Teil nicht erfüllten, wenn man auf den Schritt der manuellen Vorreinigung verzichtete.
Zusammenfassend ist also zu sagen, dass die UVC-Bestrahlung eine sehr gute Alternative für die mikrobielle Reinigung von Kontaktlinsen, im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren, darstellt und dass ihre Wirksamkeit dabei weitestgehend unabhängig von der Compliance der Anwender ist.
Das Gram-positive Bakterium Staphylococcus aureus besiedelt die menschliche Haut und die oberen Atemwege, z.B. die Nase. Aus noch unbekannten Gründen können die Bakterien gelegentlich einen pathogenen Charakter entwickeln und Krankheiten wie Furunkulose, Pneumonien oder Sepsis verursachen. Dieses pathogene Potenzial in Verbindung mit dem Auftreten von zahlreichen Antibiotika-Resistenzen in vielen klinisch relevanten S. aureus-Stämmen stellt ein Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Deshalb ist es notwendig, potenzielle Effekte der bakteriellen Produkte, die die eukaryotischen Wirtszellen relevanter Organsysteme beeinflussen könnten, zu erforschen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, spezifische Elemente der frühen Signaltransduktion, der Genregulation und der physiologischen Antworten von humanen immortalisierten Atemwegsepithelzellen (S9) auf Kontakt mit Staphylococcus aureus-Zellkulturüberständen sowie rekombinant hergestellten individuellen Virulenzfaktoren (Hämolysin A (Hla, ein porenformendes Toxin) und Hämolysin B (Hlb, ein Enzym mit Sphingomyelinase-Aktivität)) zu untersuchen. Diese Ansätze dienen dazu, Hinweise auf die Identität sezernierter Stoffwechselprodukte von S. aureus zu erhalten, die in den eukaryotischen Wirtszellen zu direkten Abwehr- oder Vermeidungsreaktionen (angeborene Immunität) oder zu Bakterien-induziertem „Fehlverhalten“ führen, das möglicherweise (Mit-)Ursache der Pathogenität einiger Stämme des Bakteriums ist. Quantitative Western-Blot-Analysen mit löslichen Proteinextrakten von S9-Zellen offenbarten dabei eine Aktivierung der Erk-Typ-MAPK, der p38 MAPK und der Akt1/3, aber keine Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) oder Akt2 infolge der Behandlung mit steril-filtrierten S. aureus-Überständen aus der exponentiellen Wachstumsphase (OD540nm = 1), der stationären Wachstumsphase (OD540nm = 10) bzw. nach der Behandlung mit rekombinant hergestellten S. aureus Hämolysinen (rHla, rHlb). Analysen der Produkte sogenannter „früher Gene“ zeigten eine moderate Erhöhung der Expression von c-Jun und Egr-1, und eine stärkere Erhöhung der Expression von c-Fos nach der Behandlung der S9-Zellen mit den bakteriellen Überständen oder rekombinanten Toxinen (rHla, rHlb). Da Atemwegsepithelzellen bei Kontakt mit potenziell pathogenen Bakterien bzw. sekretorischen Faktoren dieser Bakterien Chemokine zur Rekrutierung von Neutrophilen sekretieren, (speziell IL-8), wurde ein Multiplex-Assay-System eingesetzt, mit dem es möglich war, 11 verschiedene Zytokine im Kulturüberstand der S9-Zellen nach Behandlung der Zellen mit den bakteriellen OD10-Überständen bzw. rekombinanten Hla oder Hlb zu analysieren. Die S9-Zellen reagierten dabei auf die Behandlung mit dem Überstand, Hla oder Hlb mit der Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-8, IFN-γ und IL-6, und diese Zytokin-Expression wurde teilweise vermittelt über die Signalwege der Erk-Typ-MAPK und der p38 MAPK. Weiter konnte gezeigt werden, dass Atemwegsepithelzellen infolge der Behandlung mit bakteriellem Überstand bzw. Hla Zellformveränderungen unterliegen und ihre Integrität verlieren. Dieses könnte parazelluläre Wege im Epithel öffnen, und so den Bakterien ermöglichen, ins Innere des Wirtskörpers vorzudringen.
Streptococcus pneumoniae (pneumococci) and Staphylococcus aureus (S. aureus) are human-specific commensals of the upper respiratory tract. Every individual is asymptomatically colonized with both bacteria at least once in their life-time. The opportunistic pathogens can affect further organs and invade into deeper tissue. The occupation of normally sterile niches of the human body with the bacteria can lead to local infections such as sinusitis, otitis media and abscesses, or to life-threatening diseases like pneumonia, meningitis or sepsis. A strong interaction between the bacterium and the respiratory epithelial cells is a prerequisite for a successful colonization. This interaction is ensured by bacterial surface proteins, so called adhesins. The binding of the adhesins to the epithelial lineage occurs predominantly indirectly via components of the extracellular matrix (ECM), but also directly to cellular receptors. Pneumococci and S. aureus bind to various ECM glycoproteins, amongst others: fibronectin, fibrinogen, vitronectin, and collagen. Also binding of both pathogens to human thrombospondin-1 has been described. Thrombospondin-1 is mainly stored in the α-granula of thrombocytes (platelets) and released into the circulation upon activation. However, thrombospondin-1 is also produced and secreted by other cell types like endothelial cells, macrophages, and fibroblasts, which gets subsequently incorporated as component into the ECM. So far, no thrombosponin-1-binding adhesins of pneumococci were identified. PspC, Hic, and PavB are important surface-localized virulence factors, which were shown to interact with human ECM and plasma proteins. PspC and Hic bind to vitronectin and factor H, which inhibits the complement cascade of the human immune system. PavB interacts with fibronectin and plasminogen, and a pavB-deficient mutant of S. pneumoniae showed diminished capacity in colonization in a mouse model. Among the surface proteins of S. aureus, only Eap was identified as thrombospondin-1-binding adhesin. Beyond colonization, pneumococci and S. aureus can enter the blood circulation, interact with platelets, and cause their activation. The aggregation of platelets, especially initiated by S. aureus, plays an important role in the clinic, because most of the septic patients develop thrombocytopenia. Surface localized factors of
S. pneumoniae triggering platelet activation are unknown to date. In contrast, few proteins of S. aureus with potential to activate platelets, including Eap, were identified previously.
This study identified the surface proteins PavB, PspC, and Hic of S. pneumoniae as specific ligands of the human thrombospondin-1. Flow cytometric, surface plasmon resonance spectroscopic and immunological analyses revealed interactions between the pneumococcal proteins and soluble as well as immobilized thrombospondin-1. The use of specific pneumococcal deletion mutants verified the importance of the three virulence factors as binding partners of soluble thrombospondin-1. The results suggest that pneumococci are capable of acquiring soluble thrombospondin-1 from blood as well as utilizing immobilized glycoprotein of the ECM as substrate for adhesion. Furthermore, the thrombospondin-1-binding domain within the pneumococcal proteins was analyzed by use of recombinant fragments of PavB, PspC, and Hic. The binding capacity of thrombospondin-1 increased proportionally with the amount of repetitive sequences in PavB and PspC, and the length of the α-helical region within the Hic molecule. The binding behavior of thrombospondin-1 towards PavB and PspC is comparable with that of the ECM proteins vitronectin and fibronectin, but is unique towards Hic.
The localization of the binding domain of the adhesins within the thrompospondin-1 molecule occurred via use of glycosaminoglycans as competitive inhibitors for the interaction. The results suggest that the pneumococcal proteins Hic and PspC target the identical binding region within thrombospondin-1, which differs from the binding domain for PavB. However, all three virulence factors seem to bind in the N-terminal part of thrombospondin-1.
Two-dimensional gel electrophoresis, thrombospondin-1 overlay assay and subsequent mass spectrometric analysis identified AtlA of S. aureus as a surface localized interaction partner of human thrombospondin-1. Moreover, a vitronectin binding activity for AtlA was determined. Immunological and surface plasmon resonance binding studies with recombinant AtlA fragments revealed that interactions with both matrix proteins is mediated via the C-terminal located repeats R1R2 of the AtlA amidase domain. Binding of thrombospondin-1 and vitronectin occurred not simultaneously, due to a competitive inhibition.
The second part of the study focused on the activation of human platelets by recombinant pneumococcal and staphylococcal proteins. In total, 28 proteins of S. pneumoniae and 52 proteins of S. aureus were incubated with human platelets. The activation of the cells was detected by flow cytometry using the activation markers P-selectin and the dimerization of the integrin αIIbβIII. The proteins CbpL, PsaA, PavA, and SP_0899 of S. pneumoniae induced platelet activation, however, the detailed mechanism has to be deciphered in further studies. Furthermore, the secreted proteins CHIPS, FLIPr, and AtlA of S. aureus were discovered as inductors for the activation of platelets. In addition, the domains of AtlA and Eap, crucial for platelet activation, were narrowed down. Interestingly, CHIPS, FLIPr, and Eap were described as inhibitors of neutrophil recruitment. Platelets are recently recognized as immune cells, due to the expression of immune receptors. The data obtained in this study highlight a comprehensive spectrum of effects of the S. aureus proteins towards different type of immune cells. Besides the activation of platelets in suspension buffer and plasma, the aggregation of platelets in whole blood was triggered by the proteins CHIPS, AtlA, and Eap. These results suggest a contribution of the proteins during the S. aureus-induced infectious endocarditis. Secretion of the platelet activating virulence factors, which were identified within this study, might represent a pathogenic strategy during S. aureus infection in which a direct contact between S. aureus and platelets is not required or even avoided.
In conclusion, PavB, PspC, and Hic of S. pneumoniae and AtlA of S. aureus were identified as interaction partners of human thrombospondin-1. Furthermore, CHIPS, FLIPr, AtlA, and Eap were characterized as platelet activators. This study provides candidates for the development of protein-based vaccines, to prevent bacterial colonization and to neutralize secreted pathogenic factors.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
This thesis contains results from transcriptome studies on different aspects of host-pathogen interactions. First, liver gene expression profiles from a murine chronic stress model served to elucidate aspects of the influence of stress on metabolism and immune response state. Chronic stress in female BALB/c mice was shown to lead to a hypermetabolic syndrome including induction of gluconeogenesis, hypercholesteremia, and loss of essential amino acids, to the induction of the acute phase response, but also of immune suppressive pathways and to the repression of hepatic antigen presentation. Increased leukocyte trafficking, increased oxidative stress together with counter-regulatory gene expression changes, and an induction of apoptosis were detected. The influence of intra-venous infection on the host kidney gene expression was analyzed in another murine model using the wild type strain Staphylococcus aureus RN1HG and its isogenic sigB mutant. Gene expression profiling indicated a highly reproducible host kidney response to infection. The comparison of infected with non-infected samples revealed a strong inflammatory reaction of kidney tissue, e. g. Toll-like receptor signaling, complement system, antigen presentation, interferon and IL-6 signaling. However, the results of this study did not provide any hints for differences in the pathomechanism of the S. aureus strains RN1HG and ΔsigB, since the host response did not differ between infections with the two strains analyzed. Effects of SigB might be transient, only apparent at earlier time points, or might also be compensated for in the in vivo infection by the interlaced pattern of other regulators. SigB might possess only to a lesser extent characteristics attributed to virulence factors and might act in vivo more like a virulence modulator and fine tune bacterial reactions. In addition to the analysis of tissue samples, different in vitro models were furthermore studied. The third part of this thesis focuses on bone-marrow derived macrophages (BMM) of the two mouse strains BALB/c and C57BL/6, which are described in literature to exhibit genetically determined differences in their reaction to infection. Expression profiling was performed on control and IFN-γ treated samples from a serum-free cultivation system and revealed mainly induction of gene expression after treatment of BMM with IFN-γ. Gene expression changes confirmed known IFN-γ effects like induction of immunoproteasome, antigen presentation, interferon signaling related genes, GTPase/GBPs, and inducible NO synthase. IFN-γ dependent gene expression changes were highly similar in BALB/c and C57BL/6 BMM. Considering gene expression differences between BMM of both strains, a similar expression trend was visible on the level of untreated controls as well as after IFN-γ treatment. Differentially expressed genes between BMM of both strains included immune-relevant genes as well as genes linked to cell death, but the coverage of functional groups was limited. The bronchial epithelial cell line S9 was used as an in vitro model system for the infection with S. aureus RN1HG. The fourth chapter in this thesis includes S9 cell gene expression signatures 2.5 h and 6.5 h after start of infection. At the early time point, only 40 genes were differentially expressed, which nevertheless indicated a beginning pro-inflammatory response, e. g. induction of cytokines (IL-6, IFN-β, LIF) or prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), but also counter-regulatory processes, e. g. induction of CD274. The host cell response was dramatically aggravated at the later 6.5 h time point. Differential expression was detected for 1196 genes. These included induced cytokines, pattern recognition receptor signaling, antigen presentation, and genes involved in immune defense (e. g. GBPs, MX, APOL). Negative effects on growth and proliferation were even more enhanced in comparison to the early time point, and signs for apoptotic processes were revealed. Finally, the last chapter addresses amongst others the pathogen’s expression profile in the S9 cell in vitro infection model at the two time points 2.5 h and 6.5 h after start of infection by tiling array gene expression analysis. The pathogen expression profiling revealed the activity of the SaeRS two-component system in internalized staphylococci. Partly dependent on SaeRS, the induction of adhesins (e. g. fnbAB, clfAB), toxins (hlgBC, lukDE, hla), and immune evasion genes (e. g. chp, eap) was observed. Furthermore, expression changes of metabolic genes were recorded (gene induction of amino acid biosynthesis, TCA cycle, gluconeogenesis; gene repression of glycolysis, purine biosynthesis, tRNA synthetases). Expression analysis recorded a distinct bacterial expression program, which supported literature results of a specific, bacterial strain and host cell line dependent transcriptional adaptation of the pathogen.
Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen, überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt. Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest (Sytox-Assay) und mittels Immunfluoreszenzfärbung analysiert. Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen: (1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft. Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose, Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden. (2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass der Zelltod durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern. Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden basierte.
The metabolomic approach is one part of the "-omics" cascade further comprising genomic, transcriptomic, and proteomic investigations. Since information about the metabolome of the important human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus is scarce, the aim of this thesis is the characterization of the exo- and endometabolome of this bacterium on a most global scale. For this, the metabolomic platform consisting of the analytical instruments used for 1H-NMR spectroscopy, HPLC-MS, and GC-MS analysis was applied. First, the requirements for an accurate sampling procedure for the analysis of intracellular metabolites are presented, explaining important pitfalls during the sampling and the subsequent metabolome analysis via HPLC-MS and GC-MS (book chapter I). The challenging task of the metabolite identification is demonstrated, as well as the requirements for absolute quantification of intracellular metabolites. In order to enhance the knowledge about the staphylococcal physiology and the biochemical network, the impact of different stresses and varying cultivation media on the bacterial metabolite pool was investigated in several studies. In article I, a first description of the primary metabolism of growing S. aureus COL cells cultivated aerobically in CDM is provided. This study also monitored the adaptation to glucose starvation on the level of metabolites and proteins. The uptake of all amino acids and the secretion and reuse of overflow metabolites were analyzed in a time-dependent manner. During the switch to a non-growing state, a drastic rearrangement of the amino acid pool in the bacterial cells was detected, and intracellular amounts of glycolytic intermediates were found to decrease in parallel to extracellular glucose exhaustion. During infection processes, S. aureus has to cope with varying levels of oxygen supply, including anaerobic conditions. A global metabolomic approach investigated the adaptation of S. aureus COL to strict anaerobic conditions using CDM as the culture medium. Thereby only linear growth was possible despite the higher uptake rate of glucose compared to aerobically, logarithmically growing cells. In an anoxic environment, S. aureus mainly switched on the less reliable lactic acid fermentation. Only serine and threonine but no alanine were significantly taken up. Subsequent glucose limitation led to energy starvation indicated by a drop in the adenylate energy charge. This was accompanied with an arrest of the fermentative metabolism and declining numbers of colony-forming units without taking advantage of the energy supplying arginine deiminase pathway. Compared to the established CDM, the eukaryotic cell culture medium RPMI 1640 provides more in vivo-like growth conditions. In article II, the growth behavior and the metabolic footprint of the S. aureus strains COL and HG001 were investigated during the aerobic cultivation in RPMI 1640 medium. Both strains are commonly used in laboratory research. The observed uptake and secretion pattern of extracellular metabolites provides important information for infection studies in which this medium is used for the precultivation of S. aureus. The extracellular accumulation of the noncanonical D-amino acid D-isoleucine was an interesting outcome. The strain specific metabolic footprint points to noteworthy differences in the biochemical system of both strains. Moreover, this study demonstrates the impact of the cultivation medium on the metabolic status of bacterial cells. Due to increasing resistance against a large number of antibiotics, community- and hospital- acquired infections with S. aureus are of major concern in medical therapy. Thus, greater knowledge about adaptive mechanisms after antibiotic treatment is required. In article III, the response of S. aureus HG001 to antibiotics with varying target sides, such as ciprofloxacin, erythromycin, fosfomycin, vancomycin, and ampicillin, was investigated on the metabolite level. Thereby, the abundances of 176 intracellular metabolites were observed in a time-dependent manner, thus providing the most comprehensive experimental metabolite dataset so far available for S. aureus. None of the antibiotic compounds led to alterations of single metabolite amounts, but mostly entire metabolic pathways were affected. The intermediates of the cell wall biosynthesis were affected by each antibiotic, confirming this pathway as the most potential target for new antibacterial compounds. The metabolite composition of human nasal secretions and human sweat was analyzed, since such secretions present natural habitats of S. aureus during the colonization of typical host sides. The results confirm that the bacteria has to cope with low concentrations of most of the amino acids but large amounts of urea and lactate during host colonization. Considering the supply of amino acids, the results support the usage of the RPMI 1640 medium as a step to more in vivo-like cultivation experiments. Moreover, essential information for future studies about the adaptation of S. aureus to more in vivo growth conditions is provided. Altogether, the metabolomic approach was proven to be an important tool for helping unravel the complex bacterial metabolism and the environmental factors that also play a role in the virulence of Staphylococcus aureus.
Staphylococcus aureus, einer der häufigsten Erreger von Pneumonien, Endokardien und Sepsen (Frank et al. 2010), gehört bei nahezu einem Drittel der Bevölkerung zur normalen Nasenschleimhautflora (van Belkum et al. 2009) und kann unter bestimmten Risikobedingungen, vor allem in nosokomialer Umgebung, weiter in die unteren Atemwege vordringen und sich dort vermehren (van Belkum et al. 2009, Ahmed et al. 2015). Da das respiratorische Epithel von einer dicken, viskösen Mukusschicht bedeckt ist (Knowles & Boucher 2002), die Bakterien aufgrund ihrer Größe kaum durchdringen können, liegt die Hypothese nahe, dass es die sehr viel kleineren, löslichen Virulenzfaktoren der Bakterien sind, die den Mukus überqueren und einen ersten Pathogen-Wirt-Kontakt herstellen können. Das lösliche, porenbildende α-Hämolysin (Hämolysin a, Hla) ist einer der Haupt-Virulenzfaktor von S. aureus (Spaulding 2012). Studien hatten gezeigt, dass Hla auch in sublytischer Konzentration zu einer Auflösung der Zell-Zell- (Inoshima et al 2012) und Zell-Matrix-Kontakte (Hermann et al. 2015) humaner Atemwegsepithelzellen führte und so eine Lückenbildung im Zellverband induzierte. In vivo könnten solche Hla-vermittelten Prozesse dazu beitragen, dass eine erste Schädigung des Epithels erfolgt und die Überwindung der epithelialen Barriere für S. aures erleichtert wird. Die vorliegende Arbeit konnte in einem ersten Teil zeigen, dass diese Unfähigkeit von humanen Atemwegsepithelzellen (16HBE14o- und S9), nach Inkubation mit rHla den epithelialen Zusammenhalt aufrecht zu erhalten und entstandene parazelluläre Lücken durch aktive Migration zu schließen, auf eine rHla-induzierte Hyperphosphorylierung des fokalen Kontaktproteins Paxillin an Tyrosin 118 (und damit erhöhten Turnover der fokalen Kontakte) und Hypophosphorylierung des Actin-depolymerisierenden Faktors Cofilin an Serin 3 (und damit verstärkten Abbau von Stressfasern) zurückzuführen war. Der Hla-Effekt konnte so in fünf Prüfgrößen quantifizierbar erfasst werden: (1) Verlust des epithelialen Zusammenhalts, (2) Reorganisation des Actinzytoskeletts, (3) Auflösung fokaler Kontakte, (4) Hyperphosphorylierung von Paxillin und (5) Hypophosphorylierung von Cofilin. Im zweiten Teil der Arbeit wurden diese Prüfgrößen herangezogen, um den Mechanismus der Hla-Wirkung genauer aufzuklären. Durch Einsatz einer nichtporenbildenden Mutante rHla-H35L und dem Porenblocker IB201 konnte zunächst gezeigt werden, dass für die schädigenden Effekte auf den epithelialen Zusammenhalt der Zellen Ausbildung einer funktionellen Hla-Pore notwendig war und nicht Bindungsereignisse der Monomere, der Vorpore oder der Pore allein den Hla-Effekt auslösen konnten. Um die porenabhängigen Ereignisse zu untersuchen, wurden Ionenströme durch die Hla-Pore identifiziert und mit Ionomycin (erzeugt einen Calciumeinstrom) und Gramicidin (erzeugt einen Natriumeinstrom und Membrandepolarisierung) nachgebildet. Beide Ionenströme zusammen konnten den Hla-Effekt nahezu vollständig erzeugen. Die Ergebnisse wiesen darüber hinaus darauf hin, dass die Hla-erzeugten ionalen Veränderungen an der Membran unterschiedliche Signalveränderungen in der Zelle vermittelten: Calciumaktivierte Signalwege schienen vor allem für die beobachtete Paxillin-Phosphorylierung verantwortlich zu sein, während ein Natriumeinstrom zu einer Cofilin-Dephosphorylierung führte. Die genaue Signaltransduktion zwischen Einstrom der Ionen und (De-)Phosphorylierungsereignissen erfordert jedoch noch eine genauere Aufklärung. Des Weiteren konnte die Modellierung der Ionenströme den Hla-Effekt nicht komplett nachbilden, sodass wahrscheinlich zusätzliche porenabhängige Signalwege nach Hla-Behandlung (z.B. Verlust von ATP, Baaske & Richter et al. 2016) aktiviert werden.
Functional characterization of a novel protease isolated from a mouse-adapted S. aureus strain
(2018)
Background: The high incidence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) strengthens the need for new effective antibiotics and a protective vaccine. Up till now, mainly human-adapted Staphylococcus aureus strains were used to study S. aureus pathogenicity in mouse models. However, it is known that S. aureus is highly host-specific. Recently, a mouse-adapted S. aureus strain, JSNZ, was identified. This strain could be a promising tool in developing more appropriate infection models. JSNZ produces high amounts of a putative extracellular protease, named JSNZ extracellular protease (Jep). Since the jep gene was only detected in S. aureus isolates from laboratory mice and wild small rodents and shrews, we hypothesize that Jep is important for colonization and infection in mice. The jep deletion mutant previously created by our collaborators from the University of Auckland, New Zealand, intriguingly showed a reduced survival and growth fitness in murine serum and whole blood as compared to the JSNZ wild type (WT) strain.
Objective: To elucidate the role of Jep in the interaction between S. aureus and its
host by comparing the impact of JSNZ WT with a mutant and a complement strain on the murine immune system. In addition, the elucidation of possible genetic factors behind host-adaptation of S. aureus strains isolated from wild rodents and shrews.
Methods: A jep complemented strain was generated by chromosomal replacement.
JSNZ WT, the jep mutant and the complement strain were subjected to functional
assays (whole blood survival assay, coagulation assay). In addition, the genetic
background that might confer host specificity was tested by staph array genotyping.
Results: The mutant strain JSNZDjep was successfully complemented with the jep
gene using a chromosomal integration approach. The WT strain and the
complemented strain produced the Jep protein in comparable amounts.
Unexpectedly, the complemented strains did not behave like the WT strain but rather like the mutant in a series of in vitro assays. Firstly, the growth of both the deletion mutant and the complemented strains was slightly reduced in TSB as compared to the WT strain. Secondly, the jep knockout strain showed a strongly reduced survival in murine whole blood compared to its wild type counterpart, but so did the complemented strain. Finally, the coagulation of murine plasma was less pronounced for the jep deletion mutant and the complemented strain as compared to the JSNZ WT. To exclude a defect in jep gene expression, we compared the amount of Jep expressed during growth in TSB medium for the three strains. The complemented strain produced Jep in a manner similar to the WT strain in a growth-phase dependent manner, suggesting that Jep expression was not affected during the creation of the complemented strain.
The array data showed some differences in the genetic makeup between animal
isolated strains and matched human strains. For example, while all animal isolates of the CC88 lacked the resistance mecA gene it was found in some human isolates of the same strain.
Conclusion: In conclusion, our unidentified mutation created during the generation
of the jep knock-out strain rather than the jep gene itself manipulated the murine
immune response. The responsible gene and the underlying mechanisms remain to
be clarified. Genetic profiling of S. aureus strains allowed us to obtain some valuable information including data about CC49, the most frequently isolated lineage in wild rodents and shrews where compared to the human isolates the murine strains showed clear signs of host adaptation. However, the analysis had several limitations including the small sample size.