Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (6)
Language
- German (6) (remove)
Has Fulltext
- yes (6)
Is part of the Bibliography
- no (6)
Keywords
- Herpesvirus suis (6) (remove)
Herpesviren nutzen einen Vesikel-vermittelten Transportweg für die Translokation von Nukleokapsiden aus dem Zellkern, um für die weitere Virusmorphogenese in das Zytoplasma zu gelangen. Den dafür notwendigen Kernfreisetzungskomplex (nuclear egress complex; NEC) bilden zwei konservierte herpesvirale Proteine, die als pUL34 und pUL31 bezeichnet werden. Die Kristallstrukturen der NECs aus verschiedenen Herpesviren zeigten eine stabile Interaktion zwischen der N-terminalen Domäne von pUL31 und dem Kern von pUL34. Darüber hinaus gehören die am stärksten konservierten Reste von pUL31 zu einem Zinkfinger-Motiv (ZNF). Zur Klärung der funktionellen Bedeutung des ZNF-Motivs in PrV pUL31, das aus drei Cysteinen (C73, C89 und C92) der CR1 und einem Histidin (H188) der CR3 besteht, wurden die Cysteine einzeln zu Serinresten und das Histidin H188 zu Alanin substituiert. Funktionelle Analysen der mutierten Proteine, die in vitro mit artifiziellen Membranen und in situ in eukaryotischen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass das ZNF-Motiv eine wesentliche Voraussetzung für die NEC-Bildung und die notwendige Membranveränderung darstellt. Der N-terminale Bereich von pUL31 und der anderen Homologen ist sehr variabel und wurde daher in den Konstrukten für die Kristallisierung weggelassen. Wie auch einige andere pUL31-Homologe enthält PrV pUL31 ein Kernlokalisationssignal (NLS) im N-Terminus für einen effizienten Kernimport. Neben der Funktionalität des Kernimports scheint dieser spezifische Bereich ebenfalls eine Rolle bei der Freisetzung von Nukleokapsiden aus dem Kernspalt, der Vorbeugung von einer vorzeitigen Komplexbildung im Zytoplasma, der Translokation der reifen Kapside an die INM und bei der Regulierung des envelopment/deenvelopment Prozesses über Phosphorylierung zu spielen. Um zu untersuchen welche zusätzlichen Funktionen der N-terminale Bereich einnimmt, wurde der N-Terminus von PrV pUL31 schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 2-13 (pUL31-N14), einschließlich des Hauptteils des vorhergesagten NLS, für die NEC-Bildung und -Funktion entbehrlich sind. Die Deletion von vier zusätzlichen Aminosäuren (pUL31-N18), die alle grundlegenden Patches eliminierte, führte jedoch zu einem defekten Protein. Die vollständige Deletion der 25 N-terminalen Aminosäuren zeigte in Gegenwart von Wildtyp pUL31 eine Inhibierung des Kernaustritts. pUL31-N18, was überwiegend im Zytoplasma gefunden wurde, zeigte keinen dominant-negativen Effekt. Die Phosphorylierung der beiden vorhergesagten Stellen im N-Terminus von PrV pUL31 (S12/S13) spielt offensichtlich keine Rolle beim Kernaustritt. Die Titer von PrV-Mutanten denen pUL34 oder pUL31 fehlt, werden drastisch reduziert, jedoch die Freisetzung infektiöser Nachkommen nicht komplett inhibiert, was auf einen alternativen Austrittsweg hinweist. Wiederholtes Passagieren dieser Mutanten führte zu Revertanten, die eine Wildtyp-ähnliche Replikation wiedererlangten. PrV-ΔUL34Pass und PrV-ΔUL31Pass umgingen dabei den vesikulären Transportweg durch das Induzieren einer Fragmentierung der Zellkernmembran (NEBD). Um zu testen, ob CDKs eine Rolle im viral induzierten NEBD spielen, wurden Wildtyp- (wt) oder dominant-negative (DN) Versionen der zellulären CDKs 1-6 getestet. In Gegenwart von CDK2DN wurden die Titer für beide Viren signifikant reduziert. Ultrastrukturelle Analysen zeigten, dass die Freisetzung von PrV-Ka primären Virionen aus dem perinukleären Raum beeinträchtigt oder verzögert war und NEBD nur selten in PrV-ΔUL34Pass-ΔgG-CDK2DN-infizierten Zellen beobachtet wurde. Die genaue Zusammensetzung der primären Virionen sowie der Maschinerie für die Verschmelzung der primären Hülle mit der äußeren Kernmembran sind nicht bekannt. Um virale und/oder zelluläre Proteine und andere primäre Virion-Komponenten zu identifizieren, sollen primär umhüllte Virionen aus dem perinukleären Raum isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert werden. Da die Reinigung der primären Virionen aus dem perinukleären Raum nicht ganz einfach ist, wurde das membranverankerte pUL34 mit verschiedenen Affinitätsmarken markiert. Vier markierte pUL34-Konstrukte wurden nach Transfektion und Infektion generiert und getestet. Drei von ihnen erwiesen sich als funktionell während des herpesviralen Kernaustritts und es konnten stabil exprimierende Zelllinien hergestellt werden. Diese Zelllinien bilden nun eine solide Grundlage für weitere Experimente, um zuverlässige Protokolle für die Reinigung von primären Virionen aus dem perinukleären Raum zu etablieren.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene grundlegende Ansätze zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest entwickelt und teilweise evaluiert. Die ersten beiden befassten sich mit der Impfstoffentwicklung, wobei einerseits eine vektorbasierte Strategie verfolgt und zum anderen auf eine attenuierte ASPV Lebendvakzine hingearbeitet wurde. Die dritte Herangehensweise war auf die Inhibierung der viralen Replikation in Schweinezellen mittels CRISPR/Cas9 fokussiert, um Hinweise auf die generelle Anwendbarkeit des Systems in transgenen Schweinen zu gewinnen.
Der Pseudorabies-Virus Impfstamm Bartha (PrV-Ba) wurde als potenzieller Vektor für die Expression von ASPV-Antigenen im Schwein gewählt. Dazu wurde zunächst eine Methode etabliert, mit der PrV-Rekombinanten effizient generiert werden konnten. Dabei erwies sich die Verwendung eines artifiziellen bakteriellen Chromosoms (BAC), welches das infektiöse PrV-Genom enthielt, als hilfreich. In diesem wurde ein essentielles PrV-Gen inaktiviert, dass dann durch homologe Rekombination mit einem Transferplasmid in co-transfizierten Säugerzellen rekonstituiert werden konnte. Durch gleichzeitiges CRISPR/Cas9-vermitteltes Schneiden der BAC-DNA am gewünschten Insertionsort konnte die Rekombinationsrate weiter gesteigert werden. Diese Strategie wurde anschließend für die Insertion verschiedener ASPV Gene in das PrV-Genom genutzt, wobei unterschiedliche Promotoren und Kodonoptimierungen getestet wurden. In den meisten Fällen konnten durch Verwendung des CAG-Promotors und eine Kodonadaptation an porcine Gene die höchsten Expressionsraten erreicht werden. Somit wurde eine Methode entwickelt, mit der prinzipiell alle ASPV Gene im PrV Vektorsystem exprimiert und in Impfstudien getestet werden könnten.
In der zweiten Untersuchung wurden zwei Proteine des ASPV mittels monospezifischer Antiseren näher charakterisiert und ASPV-Deletionsmutanten generiert, um Hinweise auf die Funktionen der Proteine zu erhalten. Bei diesen Proteinen handelte es sich um p285L und pK145R. Sie wurden anhand von Daten aus einer vorhergehenden Proteomanalyse von Keßler et al. (2018) ausgewählt, da sie in großen Mengen in ASPV infizierten Zellen nachgewiesen wurden und deshalb wichtige Funktionen (beispielweise auch Virulenz-determinierende Funktionen) haben könnten. Bei p285L handelt es sich um ein früh exprimiertes Virionprotein, das zunächst in den sogenannten Virusfabriken infizierter Wildschweinlungenzellen (WSL) akkumuliert. pK145R ist ein spätes ASPV Protein, das in Virionen nicht nachweisbar ist und eine diffuse Verteilung im Zytoplasma infizierter Zellen zeigt. Beide Proteine sind für die Virusreplikation nicht essentiell, und ihre Deletion führte zu keiner (285L) oder einer nur mäßigen (K145R) Titerreduktion in infizierten WSL Zellen oder primären Blutzellkulturen (PBMC). Durch in vivo Analysen der Deletionsmutanten muss nun geklärt werden, ob p285L und pK145R für die Virulenz bzw. die Wechselwirkung von ASPV mit dem Wirtsimmunsystem wichtig sind und ob sich die Mutanten deshalb als lebend attenuierte Impfstoffe eignen könnten.
In der dritten Studie wurde untersucht, ob das CRISPR/Cas9 System zur Inhibition der ASPV Infektion in vitro geeignet ist. Dazu wurden WSL-Zelllinien generiert, die Cas9 und verschiedene sgRNAs konstitutiv exprimierten. Durch die Expression einer sgRNA gegen das Gen des ASPV Phosphoproteins p30 (CP204L) wurde die Virusreplikation nahezu komplett inhibiert. Die Spezifität des Effektes konnte durch parallele Versuche mit einem Virusisolat, dessen Zielsequenz nicht mit der genutzten sgRNA Sequenz übereinstimmte, gezeigt werden. Dieses ASPV Isolat konnte im Gegensatz zum Virus mit der passenden Zielsequenz in den rekombinanten Zellen genauso gut replizieren, wie in nicht modifizierten Zellen. Zudem wurde die Spezifität durch die Analyse von sporadisch auftretenden Escape-Mutanten bestätigt, die verschiedene Basenaustausche in der Zielsequenz aufwiesen. Somit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9 System eine effiziente Inhibition der ASPV Replikation in Zellkultur bewirken kann und deshalb möglicherweise auch in entsprechenden transgenen Schweinen eine Resistenz gegen letale ASPV-Infektionen vermitteln könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen drei Studien grundlegende Experimente erfolgreich durchgeführt wurden, die zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest beitragen können.
Qualitative und quantitative massenspektrometrische Analyse von Virionen des Pseudorabies Virus
(2006)
Das Ziel dieser Arbeit war die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Partikeln des Pseudorabies Virus (PrV), des Erregers der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein. In Partikeln des PrV-Virusstammes Kaplan wurden nach ein- oder zweidimensionaler Elektrophorese und Identifizierung durch peptide mass fingerprint 27 Strukturproteine viraler und vier Strukturproteine zellulärer Herkunft (Annexin I und -II, HSP70 und Aktin) identifiziert. Die viralen Strukturproteine pUL37, pUL48, pUL18, pUL19, pUL29 (gB) und alle Strukturproteine zellulärer Herkunft wurden nach zweidimensionaler Elektrophorese in mehreren Isoformen nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Zusammensetzung von Deletionsmutanten des PrV mit derjenigen von Wildtyp-Virionen verglichen. Ziel war hier die Analyse von Veränderungen in der Partikelzusammensetzung über den Verlust des deletierten Proteins hinaus, z.B. als Folge einer dadurch nicht mehr möglichen Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer abweichenden Morphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Untersuchung der Tegumentproteine, da diese in eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionen einbezogen sind und ihnen eine entscheidende Rolle während der Virusmorphogenese zukommt. Die quantitative Analyse von Mutanten mit Deletionen der Tegumentproteine pUS3, pUL11, pUL13, pUL16, pUL21, pUL35, pUL41, pUL43, pUL47, pUL49, pUL51, sowie der Deletion eines C-terminalen Fragments des UL36-Gens und des Glykoproteins E erfolgte massenspektrometrisch mit der SILAC Strategie. Nach Untersuchung der Strukturproteinprofile von allen oben genannten Deletionsmutanten lässt sich über die genannten Details hinaus generell folgendes feststellen: (1) Kapsid- beziehungsweise kapsid-assoziierte Proteine (pUL18, pUL25, pUL35 und pUL38) werden in stöchiometrischen Mengen zum Hauptkapsidprotein MCP142 (pUL19) in die Viruspartikel eingebaut. Diese Stöchiometrie war robust gegen alle untersuchten Deletionen. (2) Größere Flexibilität beim Einbau in das reife Virion zeigten Komponenten des Teguments. Kapsidnahe Tegumentproteine wie das pUL36 wurden meist stöchiometisch eingebaut. Größere Schwankungen beim Einbau in die verschiedenen untersuchten Deletionsmutanten zeigten die Tegumentproteine pUL11, pUL16, pUL21, pUL46, pUL48, pUL49 und pUS3. Deletionen in einzelnen Tegumentproteinen führten zu vermindertem Einbau anderer Proteine, was z.B. durch den Ausfall von Protein-Protein Wechselwirkungen erklärt werden kann, oder auf einen vermehrten Einbau anderer Tegumentproteine hindeutet. (3) Virale Hüllglykoproteine zeigten die größten quantitativen Schwankungen im Einbau, was die Bewertung des Einbaus der Glykoproteine in die verschiedenen Deletionsmutanten erschwerte. Ausnahme war hier das essentielle Glykoprotein gH, dessen Einbau in die untersuchten Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp durchgängig unverändert war.
Das 3084 Aminosäuren umfassende innere Tegumentprotein pUL36 des zu den Herpesviren zählenden Pseudorabies Virus (PrV) stellt ein multifunktionelles Protein dar, das für die sekundäre Umhüllung der Nukleokapside im Zytoplasma essentiell ist. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei der frühen Phase der Replikation, d.h. dem Transport der Nukleokapside zum Zellkern und der Andockung an die Kernpore als Voraussetzung für die Freisetzung der viralen DNA in den Zellkern. Um die Rolle von PrV pUL36 während des viralen Replikationszyklus weiter aufzuklären, wurden funktionelle Regionen identifiziert und bekannte Motive und Regionen mittels gezielter Deletion bzw. Mutagenese untersucht. Zunächst wurden eine konservierte Deubiquitinylierungs (DUB)-Domäne und potentielle Leucin-Zipper-Motive im N-Terminus des Proteins, sowie eine Alanin- und Prolin-reiche Region im C-Terminus mittels gezielter Deletionen untersucht. Zusätzlich wurden durch ungerichtete Transposon-vermittelte Mutagenese Insertionsmutanten hergestellt. Die Funktionalität dieser Mutanten wurde durch Komplementierung einer UL36-negativen PrV Mutante untersucht. Mutierte Proteine, in denen essentielle Regionen betroffen waren, konnten den Replikationsdefekt der Virusmutante nicht kompensieren, während für Mutanten, die den Defekt komplementieren konnten, stabile Virusrekombinanten isoliert wurden. Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten erfolgte mittels Plaquegrößenvergleich, Ein-Schritt-Wachstumskinetik und Ultrastrukturanalyse. Zusätzlich wurden einige Mutanten hinsichtlich des Replikationsverhaltens in vivo in einem Mausmodell untersucht. Um die Funktion von PrV pUL36 aufzuklären, ist es notwendig die intrazelluläre Lokalisierung von pUL36 zu kennen. Dazu wurden Immunfluoreszenz- und Ultrastrukturanalysen mit vier gegen unterschiedliche Bereiche des pUL36 gerichteten Antiseren durchgeführt. Auch die potentiellen Kernlokalisierungssignale (NLS) wurden hinsichtlich ihrer Funktion untersucht und die N-terminalen NLS-Motive 1/2 deletiert. Trotz der Funktionalität der essentiellen N-terminalen NLS-Motive 1/2 (Abb. 11) wurde pUL36 während der Virusreplikation niemals im Zellkern nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Tegumentierung ausschließlich im Zytoplasma abläuft. Die NLS vermitteln also bei der Infektion keinen Kerntransport des pUL36. Die Bedeutung der NLS könnte aber mit dem Transport der Kapside entlang der Mikrotubuli zum Zellkern und dem Andocken an die Kernporen zusammenhängen. Im Gegensatz dazu spielen die Leucin-Zipper (Abb. 11) offenbar bei der sekundären Umhüllung eine Rolle. Sie sind möglicherweise an der Verbindung des inneren und äußeren Teguments beteiligt. Im N-Terminus von pUL36 konnte zwischen der Interaktionsdomäne mit dem Komplexpartner pUL37 und den Leucin-Zippern eine weitere wichtige Region (Abb. 11) identifiziert werden. Diese Region ist auch in die sekundäre Umhüllung im Zytoplasma involviert und könnte für den Transport der teilweise tegumentierten Nukleokapside zum Trans-Golgi-Netzwerk verantwortlich sein, wobei pUL36, nicht aber die pUL36-pUL37-Interaktion hierbei eine Rolle spielt. Die gleichzeitige Deletion der DUB-Domäne und der Alanin- und Prolin-reichen Region (Abb. 11) führte zu einem Defekt bei der sekundären Umhüllung, wohingegen die Alanin- und Prolin-reiche Region allein für die Replikation von PrV kaum eine Rolle spielt. Allerdings konnte die Deletion nicht ohne Funktionsverlust weiter vergrößert werden, so dass die angrenzenden Bereiche für die Funktion von pUL36 essentiell sein könnten. Die zentrale Region von Aminosäure 1540 bis 1987 (Abb. 11) grenzt an diese Alanin- und Prolin-reiche Region an und ist für die Funktion von pUL36 essentiell, was durch den Funktionsverlust nach Insertionsmutagenese (mit einer Ausnahme) in diesem Bereich demonstriert wurde. Demnach könnte diese Region eine Rolle während der frühen Phase der Infektion, wie z.B. beim Transport der Kapside zum Zellkern und/oder beim Andocken der Kapside an die Kernpore und der Freilassung der DNA in den Zellkern spielen. Der essentielle C-Terminus von pUL36 (Abb. 11) kann wahrscheinlich auf die Aminosäuren 3022 bis 3066 eingegrenzt werden, so dass nicht nur die letzten 6, sondern womöglich die endständigen 18 Aminosäuren für die Funktion von pUL36 nicht gebraucht werden.
Die Glykoproteine gB und gH-gL sind bei allen Herpesviren konserviert und wichtig für den Viruseintritt und die direkte Zell-Zell-Ausbreitung. Allerdings kann sich PrV in Abwesenheit von gL noch in einem sehr geringen Ausmaß von Zelle zu Zelle ausbreiten, was Reversionsanalysen durch serielle Zellkultur-Passagen einer gL-negativen PrV-Mutante erlaubt. So konnte in einem Passageexperiment die Revertante PrV-ΔgLPassB4.1 isoliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen der gL-unabhängigen Infektiosität von PrV-ΔgLPassB4.1 untersucht. Dabei wurden Mutationen in den Glykoproteinen gB, gH und gD nachgewiesen und deren Auswirkung auf die Proteinfunktion mit Hilfe von transienten Transfektions-Fusionsassays untersucht. Die Aufklärung der Kristallstrukturen eröffnete die Möglichkeit, über zielgerichtete Mutagenese die Funktion von gH-gL besser zu analysieren. Erstaunlich war, dass im gH des Impfstammes PrV-Bartha ein ansonsten hochkonserviertes Prolin durch Serin ersetzt ist. Für dieses Prolin wurde postuliert, dass es für die Ausbildung einer ebenfalls bei allen Herpesviren konservierten Disulfidbrücke notwendig ist. Um den Effekt der Substitution und die Funktion der Disulfidbrücke zu testen, wurden gH Mutanten hergestellt, die entweder Prolin oder Serin an Position 438 oder Serin statt Cystein an Position 404 exprimierten. Diese wurden in transienten Transfektions-Fusionsassays sowie während einer Virusinfektion getestet. Obwohl die Aminosäuresequenzen der gH-Proteine der Herpesviren nur eine geringe Homologie aufweisen, sind die Kristallstrukturen erstaunlich ähnlich. Daher sind konservierte Strukturmotive wie die Disulfidbrücke in der Domäne III, für die eine Bedeutung für die Faltung und Stabilität der Domäne III postuliert wurde, von besonderem Interesse. Um weitere funktionsrelevante konservierte Regionen in Domäne III aufzudecken, welche für die Lokalisierung und Funktion des gH wichtig sein könnten, wurden zunächst Sequenzvergleiche zwischen EBV und PrV gH unter Berücksichtigung der vorhandenen gH-Kristallstrukturen durchgeführt. Hierbei wurden komplexe Interaktionsnetzwerke über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen konservierten und benachbarten nicht-konservierten Aminosäuren vorhergesagt. Diese wurden im EBV und PrV gH mutiert und die gH-Proteine anschließend auf ihre Oberflächenexpression und Fusionsfunktion untersucht. Zusätzlich wurden PrV Rekombinanten mit entsprechenden gH-Mutationen hergestellt und charakterisiert.
Zur Aufklärung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgeführt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum größten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die Komplexität des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine Affinitätsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren ließ. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe Trennschärfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der Affinitäten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erhöhung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bezüglich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellulären mRNA führt, als überraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellulären-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes Nukleäres Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den stärker negativ geladenen Varianten beobachtet, die möglicherweise auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgeführt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten Veränderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen Vorgängen sein dürften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang verändert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ΔUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anfälligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der Probenkomplexität. Ein Vergleich zur Affinitätsfestphasenextraktion zeigte, dass ein Großteil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie Spleißfaktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten Veränderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besaßen pUL29 und pUL39 eine erhöhte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zusätzlich eine Größenvariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gestütztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.