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Thrombozyten haben neben ihrer Funktion in der Hämostase eine wichtige Rolle in der Immunabwehr. Sie interagieren hierbei mit Komponenten des angeborenen und des adaptiven Immunsystems und sind in der Lage, direkte anti-mikrobielle Einflüsse zu vermitteln. Die Interaktion von Thrombozyten mit Gram-positiven Bakterien unterscheidet sich von jener mit Gram-negativen Erregern. Bei beiden Gruppen von Bakterien scheint die Aktivierung von Thrombozyten und Freisetzung anti-mikrobieller Peptiden aus den Granula ein wichtiger Bestandteil der direkten Pathogenabwehr durch Thrombozyten zu sein. Hierbei führt die Interaktion mit S. aureus direkt zu einer starken pathogen-induzierten Thrombozytenaktivierung, während bei Gram-negativen Organismen wie E. coli eine Verstärkung durch die Opsonierung mit PF4 und anti-PF4/H IgG notwendig scheint. Vermutlich ist die Bindung von PF4 und anti-PF4/H IgG an Gram-positive Bakterien von größerer Bedeutung für die Opsonierung für andere Immunzellen als für den direkten bakteriziden Effekt der Thrombozyten.
Der Gram-positive S. pneumoniae führt durch Funktionsstörung und Exposition von Phosphatidylserin zu einer Schädigung der Thrombozyten. Dieser schädigende Effekt auf Thrombozyten durch S. pneumoniae wird unter anderem durch Pneumolysin, ein porenbildendes Toxin der Pneumokokken, vermittelt. Dieses induziert bereits in geringen Konzentrationen die Porenbildung in der Thrombozytenmembran und führt zur Induktion von Apoptose.
In der Arbeit konnten die initialen Fragestellungen folgendermaßen beantwortet werden:
1.Thrombozyten können einen direkten schädigenden Effekt auf Gram-positive Bakterien vermitteln.
2.PF4 und anti-PF4/Polyanion IgG spielen in der direkten Thrombozyten-vermittelten Pathogenabwehr bei Gram-positiven Erregern, trotz der Bindung an Gram-positive Bakterien, eine untergeordnete Rolle. Sie verstärken weder die Thrombozyten-aktivierung noch den anti-bakteriellen Effekt.
3.Die Auswirkung der Co-Inkubation mit Bakterien auf die Thrombozyten ist heterogen und abhängig vom untersuchten Bakterienstamm. Es kommt zur Aktivierung der Thrombozyten durch S. aureus und zur Schädigung der Thrombozyten durch S. pneumoniae.
Thrombozyten reagieren auf Infektionen, unter anderem auf die mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). Dabei zeigt sich eine erhöhte Rate an kardiovaskulären und thrombotischen Ereignissen. Die medikamentöse Therapie hemmt unter anderem die reverse Transkriptase der HI-Viren. Allerdings wirken diese Arzneimittel auch auf die humanen Thrombozyten. Diese besitzen eine endogene reverse Transkriptase. Eine solche ist in den Blutplättchen in Form von Long Interspersed Nuclear Element 1 (LINE-1) Ribonukleinsäure (RNA) als Grundlage für die Translation vorhanden. Auch die entsprechenden Proteine sind als Open Reading Frame 1 (ORF1) und Open Reading Frame 2 (ORF2) - Proteine nachweisbar. Diese kodieren unter anderem für eine Endonuklease, Chaperone und reverse Transkriptase. Letztgenannte ist in den Blutplättchen auch aktiv. Folglich sind humane Thrombozyten in der Lage RNA in Desoxyribonukleinsäure (DNA) umzuschreiben. Dem Dogma der Molekularbiologie folgend, besitzen Zellen ohne Nucleus keine DNA. Auf Grund des Vorhandenseins einer endogenen reversen Transkriptase in humanen Thrombozyten konnte erstmals DNA in Form von Gewebsthromboplastin und Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator Rezeptor (uPAR) nachgewiesen werden.
Aktivierung von humanen Thrombozyten durch Staphylococcus aureus und seine Sekretionsprodukte
(2008)
Die Ansichten über die Funktion der Thrombozyten unterliegen derzeit einem Wandel. Neben dem Verschluss von Endothelläsionen spielen sie eine Rolle in der Pathologie der Artherosklerose, der Endokarditis und weiterer Erkrankungen und es existieren Hinweise auf eine Beteiligung bei der Immunantwort über die Expression von CD40L (Elzey et al., 2003). Ihre übermäßige Aktivierung und damit ihr Verbrauch bei der DIC sind noch nicht endgültig aufgeklärt. Zu dieser schwerwiegenden Komplikation im Gerinnungssystem kann es unter anderem durch eine Bakteriämie bzw. Sepsis mit dem grampositiven Erreger Staphylococcus aureus kommen, der in jüngster Zeit durch eine weit reichende Resistenzentwicklung in den Mittelpunkt der Forschung gerückt ist. Die Sepsis ist mit einer Letalität von 30 – 50% trotz modernster Intensivmedizin weiter ein ernstes Problem und grampositive Erreger wie S. aureus verursachen einen großen Anteil der Fälle (Moerer et al., 2004). Die Interaktion von Thrombozyten und S. aureus wurde bisher immer unter dem Aspekt des direkten Kontakts dieser Zellen untersucht, jedoch scheint auch eine Betrachtung der Sekretionsprodukte und ihrer Auswirkungen auf Thrombozyten wegweisend, denn nicht immer ist bei Auftreten von septischen Gerinnungskomplikationen eine Bakteriämie nachweisbar. In dieser Arbeit sollte daher die thrombozytenaktivierende Wirkung von Sekretionsprodukten von S. aureus untersucht werden, es sollte eine Annäherung an die Identität dieser Substanzen erfolgen und es sollte geklärt werden, ob der menschliche Organismus Abwehrmechanismen gegen diesen spezifischen Angriffsweg besitzt. Dazu wurden 20 kommensale und 20 invasive (aus Blutkulturen gewonnene) Isolate von S. aureus sowie die Laborstämme RN6390, RN6911 (RN6390Δagr) und ALC136 (RN6390ΔsarA) bis zur stationären Wuchsphase kultiviert und ihr zellfreier Kulturüberstand untersucht. Das Sekretom von RN6390 und seiner regulatordefizienten Mutanten ist bekannt (Ziebandt et al., 2001). Die Thrombozytenaggregation wurde größtenteils in einem einfachen Funktionstest mit gewaschenen Thrombozyten gemessen. Weitere Tests wurden mit gewaschenen Erythrozyten durchgeführt. 60% der Isolate sezernieren thrombozytenaggregationsauslösende Substanzen, dabei ist die Herkunft des Isolats (kommensal oder invasiv) und die im Kulturüberstand enthaltene Gesamtproteinmenge nicht entscheidend. 35% der Isolate sezernieren ausreichend hämolysierende Substanzen, dies ist ebenfalls unabhängig von ihrer Herkunft. Die zellaktivierenden Substanzen waren hitzeempfindlich, daher konnten Zellwandbestandteile wie Lipoteichonsäure oder Peptidoglykane als Verursacher ausgeschlossen werden. Mittels PCR wurden die genetischen Anlagen der verschiedenen Hämolysine der Isolate untersucht. Die thrombozytenaggregierende und hämolysierende Wirkung von alpha-Toxin konnte in dieser Arbeit nachvollzogen werden (Bhakdi et al., 1991). Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass verschiedene Protease-Typen von S. aureus an der Thrombozytenaggregation beteiligt sind. Diese Ergebnisse konnten bei der Untersuchung von RN6390 und seiner Mutanten bestätigt werden. Die aggregationsauslösenden Substanzen sind positiv durch den globalen Genregulator agr reguliert. Eine Koinkubation mit Serum, aus Serum gewonnenen IgG und IgG-Präparationen führte zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung der Aggregation ausgelöst durch bakterielle Kulturüberstände. Insgesamt handelt es sich bei der durch Sekretionsprodukte von S. aureus ausgelösten Thrombozytenaggregation um ein multifaktorielles Geschehen, welches zur Pathogenese der Gerinnungsstörungen bei einer Sepsis oder Infektion beitragen kann. Die Aggregation kann durch im Serum enthaltene IgG in vitro gehemmt werden. In weiteren Untersuchungen muss die genaue Identität dieser Antikörper gefunden werden. Dies kann als neuer Ansatzpunkt in der Behandlung der Gerinnungskomplikationen während eine S. aureus- Sepsis dienen, zusätzlich zu bisherigen Strategien der Substitution und medikamentösen Intensivtherapie.
Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des demographischen Wandels auf die
Blutversorgung in Mecklenburg-Vorpommern (MV) zu analysieren. Dabei sollten
Grundlagen für die Entwicklung von gesundheitspolitischen Strategien geschaffen
werden, um einem Defizit in der Versorgung entgegenwirken zu können.
Durch eine prospektive Longitudinalstudie mit Daten zu allen Vollblutspendern und
Empfängern von Erythrozytenkonzentraten (EK) in MV in den Jahren 2005, 2010 und
2015 wird die Versorgungskette vollständig abgebildet. Derartige Informationen liegen
zum jetzigen Zeitpunkt für kein anderes Bundesland vor.
Es konnte gezeigt werden, dass die demographischen Veränderungen durch eine
Abnahme der Spenderzahlen zu einem ausgeprägten Rückgang der Vollblutspenden
geführt haben (-18,0%). Dies wird verstärkt durch einen Rückgang der Spendebereitschaft
um -10,6% insbesondere bei den <30-Jährigen. Gleichzeitig konnte trotz
alternder Bevölkerung auch der Blutbedarf dank des medizinischen Fortschritts um
13,5% reduziert werden. Dennoch deckten bereits im Jahr 2015 die gewonnenen
Blutspenden nur noch knapp den Blutbedarf der Patienten. Die durchgeführten Vorausberechnungen
für 2030 lassen erwarten, dass es mit einem Defizit von circa
18.000 EK zu erheblichen Versorgungsproblemen im Bundesland kommen wird,
wenn Spendebereitschaft und Transfusionsbedarf auf dem Niveau von 2015 verbleiben.
Die demographische Situation Mecklenburg-Vorpommerns ist denen der westlichen
Bundesländer Deutschlands circa 10 Jahre voraus. Damit nimmt Mecklenburg-
Vorpommern als Modellregion eine Vorreiterrolle bezüglich der Bewältigung der
damit einhergehenden Herausforderungen für die Blutversorgung ein. Um den Blutbedarf
der Patienten langfristig und überregional decken zu können, wird in Zukunft
eine noch engere interdisziplinäre Kooperation von Blutspendediensten, Krankenhäusern
und Gesundheitspolitik sowohl auf Landes- als auch Bundesebene notwendig
sein.
Zusammenfassung: Heparin ist ein häufig verwendetes Medikament, das zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen eingesetzt wird. Eine unerwünschte Nebenwirkung des Heparins ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT), die paradoxerweise mit potentiell lebensbedrohlichen arteriellen und venösen Gefäßverschlüssen assoziiert ist. Die Erkrankung wird durch die Bil-dung von Thrombozyten-aktivierenden Antikörpern der Klasse Immunglobulin G (IgG) aus-gelöst. Diese sind gegen Komplexe aus dem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin gerichtet. Die zugrunde liegende B-Zell-vermittelte Immunität entspricht nicht der klassischen Immunantwort und führt zu einer frühzeitigen und transienten Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern der Klassen IgM und IgG. In der vorliegenden Arbeit wurden die B-Zellen, die an der Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern beteiligt sind, identifiziert. Hierfür wurden die Mäuse systemisch mit PF4/Heparin-Komplexen immunisiert. Das Vorliegen einer Immunantwort wurde durch den Nachweis der Antikörperproduktion mittels eines neu entwickelten Fluid-Phase ELISA nach-gewiesen. Der Einsatz von rekombinanten Maus-PF4/Heparin-Komplexen zeigte, dass die beim Menschen für die HIT charakteristisch frühe und transiente Antikörperproduktion auch im Mausmodell auftritt. Diese Immunantwort war spezifisch für PF4/Heparin-Komplexe und konnte nicht durch andere unspezifische Reize wie ein Gewebetrauma oder dem Modellanti-gen Ovalbumin ausgelöst werden. Der Nachweis der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellpopulation(en) wurde durch die Etablierung des Zell-spezifischen Enzym-gekoppelten Immun-Spot Tests (ELISPOT) auf der Fluid-Phase Basis – Detektion der PF4/Heparin-Antikörper-Komplexe in der löslichen Phase – ermöglicht. Unterschiedliche Gewebe/Kompartimente (Milz, Knochen-mark, Peritonealhöhle) von naiven, nicht-immunisierten und PF4/Heparin-immunisierten Mäusen wurden mit diesem Assay auf das Vorliegen von PF4/Heparin-spezifischen B-Zellen untersucht. Während in nicht-immunisierten Mäusen ausschließlich B-Zellen nachgewiesen werden konnten, die anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM produzierten, wurden in immunisierten Mäusen sowohl kurzlebige PF4/Heparin-spezifische IgM (7%)- als auch IgG (25%)-sezernierende B-Zellen detektiert. Die spezifischen Zellen befanden sich in beiden Fällen in der Milz. Dieses Gewebe dient als Nische für follikuläre, Marginalzonen (Mz)- und B1-B-Zellen, wobei sie im Fall der Mz-B-Zellen die einzige Überlebensnische darstellt. Den Hauptanteil der Antikörper-produzierenden Milzzellen bilden die follikulären B-Zellen, deren Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist. Als Hauptquelle der anti-PF4/Heparin-Antikörper konnte diese Zellpopulation ausgeschlossen werden, da T-Zell-defiziente Mäuse nach der Behandlung mit PF4/Heparin weiterhin spezifische Antikörper produzierten. Normale Mäuse, denen vor der PF4/Heparin-Behandlung die Milz und somit die Mz-B-Zellen operativ entfernt wurden, konnten hingegen keine anti-PF4/Heparin-Antikörper mehr bilden. Dies zeigt, dass B1-Zellen allein nicht ausreichend sind, um die anti-PF4/Heparin-Antikörperproduktion zu induzieren, und dass Mz-B-Zellen für die Immunantwort notwendig sind. Der Mechanismus, der die Aktivierung der PF4/Heparin-spezifischen Mz-B-Zellen auslöst, ist bisher nicht im Detail bekannt. Jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die in vitro Stimulation von B-Zellen mit Mitogenen wie CpG und SAC antigenunabhängig zur Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern führt. Dies lässt vermuten, dass neben dem Kontakt mit dem Antigen auch andere immunstimulatorische Faktoren in die Induktion der Immunantwort gegen Maus-PF4/Heparin-Komplexe involviert sind.
Die transfusionsassoziierte akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist eine der schwerwiegendsten Komplikationen bei der Transfusion von Blutprodukten. Rund 80% der TRALI Fälle wird von Alloantikörpern gegen Humane Leukozyten Alloantigene (HLA) und Humane Neutrophilen Alloantigene (HNA) ausgelöst. TRALI zeigt starke Parallelen zur akuten Lungeninsuffizienz (ALI), einer häufigen und schwerwiegenden Komplikation in der Intensivmedizin. Die Aufklärung des Pathomechanismus der TRALI könnte daher sehr weitreichende Implikationen für das Verständnis des akuten Lungenversagens haben. Der Fokus dieser Arbeit war die Untersuchung der HNA-2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelten Aggregation von Granulozyten, welche eventuell ein bedeutender Bestandteil der TRALI-Pathogenese ist. Das wichtigste angewendete Messverfahren war der Granulozytenagglutinationstest (GAT), mit dessen Hilfe die Rolle der Zellmotilität, des Energiestoffwechsels und der Proteaseaktivität in der HNA 2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelten Granulozytenaggregation (GA) untersucht wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Aggregation der Granulozyten ein aktiver und energiearmer Prozess ist. Während die Hemmung der aeroben Atmungskette und der Aktin-Reorganisation nur einen geringen, nicht signifikanten Einfluss auf die Aggregation der Granulozyten hat, resultierte sowohl die Inhibition der NADPH-Oxidase als auch die Inhibition von Serinproteasen mit Trypsin-ähnlicher oder Chymotrypsin-ähnlicher Spezifität in einer signifikanten Abschwächung der GA. Es ist jedoch bisher unklar, ob die Wirksamkeit der verschiedenen Inhibitoren auf die Hemmung eines gemeinsamen Signalweges zurückzuführen ist, oder ob unterschiedliche, in derselben Zellantwort mündenden, Signalwege gehemmt werden. Eine Beteiligung von Cystein-, Aspartat- und Metalloproteasen wurde ebenso ausgeschlossen, wie die Beteiligung der Proteinase 3, der humanen Neutrophilen-elastase und Cathepsin G. Die Arbeit zeigt auch, dass sich die HNA-2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelte GA mechanistisch von der klassischen, entzündungsbedingten Aggregation unterscheidet. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Rolle von Serinproteasen in der HNA-2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelten GA stellt den ersten Schritt zur Entwicklung und Erprobung neuer therapeutischer Ansätze in einem Tiermodell dar und eröffnet möglicherweise Wege zur Behandlung von Antikörper-induzierter TRALI und der akuten Lungeninsuffizienz in der Intensivmedizin.
Thrombozytenkonzentrate (TKs) sind wichtige Blutprodukte für die Therapie von Blutungen unter Thrombozytopenie oder bei Thrombozytenfunktionsstörungen. Trotz moderner Sicherheitsmaßnahmen können Infektionsübertragungen und immunologische Nebenwirkungen durch die Transfusion von Thrombozyten nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Pathogeninaktivierungsverfahren (PIV) wurden entwickelt, um Bakterien und Viren in TKs zu inaktivieren und die Sicherheit von TKs weiter zu erhöhen. Zu diesen Verfahren zählen u.a. das Intercept-Verfahren (Amotosalen und UVA-Bestrahlung) und das Theraflex-Verfahren (ausschließlich UVC-Bestrahlung). In dieser Arbeit wurde der Einfluss der PIV durch Amotosalen/UVA und durch UVC auf das Thrombozytenproteom untersucht, welches mit Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS) untersucht wurde.
Im Falle einer neuen, sich rasch ausbreitenden viralen Erkrankung empfiehlt die WHO die Verwendung von Blutplasma von bereits Genesenen (Rekonvaleszenten-plasma) zur ersten Therapie bevor Impfstoffe entwickelt werden können, da dieses Plasma bereits Immunglobuline gegen den Erreger enthält. In dieser zeitkritischen Situation kann die von der deutschen Richtlinie für Hämotherapie geforderte Quarantänelagerung für Plasmen für mindestens vier Monate nicht immer ein-gehalten werden. Eine Alternative zur Quarantänelagerung stellen Verfahren zur Pathogeninaktivierung des Plasmas dar. Es muss jedoch sichergestellt werden, dass die enthaltenen Immunglobuline durch die Pathogeninaktivierung nicht beeinträchtigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Pathogeninaktivierung von Plasma mittels Methylenblau-Behandlung keinen signifikanten Einfluss auf Immun-globuline M und G hat. Die Ergebnisse können die Sicherheit der Verwendung von Rekonvaleszentenplasma zu Beginn einer Ausbreitung einer viralen Erkrankung deutlich erhöhen.
Blutplasma muss generell blutgruppenkompatibel transfundiert werden, um Blutgruppeninkompatibilitäten durch enthaltene gegen die Blutgruppenantigene A und B gerichetete Antikörper (Isoagglutinine) zu vermeiden. Plasma von Spendern der Blutgruppe AB enthält keine Isoagglutinine und kann somit Patienten aller Blutgruppen transfundiert werden. Der Anteil der Spender in der mitteleuropäischen Bevölkerung mit Blutgruppe AB ist mit 4 % jedoch sehr gering. Daher besteht der Bedarf Isoagglutinine aus Plasma der Blutguppe A, B und 0 zu entfernen, um dieses „universell“ transfundierbar zu machen. Das so hergestellte Isoagglutinin-depletierte Plasma kann auch für Notfalltransfusionen bei Patienten mit unbekannter Blutgruppe angewendet werden. Kleinere Krankenhäuser können ihre Logistik effizienter gestalten und lediglich diese Art von Plasma bevorraten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ein geschlossenes Beutelsystem und ein Prozess entwickelt, welcher die Depletion von Isoagglutininen aus Plasma mit Mitteln ermöglicht, die in jeder transfusionsmedizinischen Einrichtung vorhanden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die Qualität des Plasmas der des bereits zugelassenen humanen gefrorenen Frischplasmas entspricht. Durch Poolen im Herstellungs-prozess können mehrere Plasmen gleichzeitig bereitgestellt werden. Das Verfahren hat das Potenzial, die klinische Praxis der Plasmatherapie zu beeinflussen.
Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II ist eine antikörpervermittelte Immunreaktion. Nur ein Teil der HIT-Patienten entwickelt allerdings lebensbedrohliche Komplikationen wie Thrombosen. Faktor V Leiden, die Prothrombin G20210A-Mutation und der Methylentetrahydrofolatreduktase(MTHFR)-C677T-Polymorphismus gelten als genetische Risikofaktoren für die Entstehung von Thrombosen. In der vorliegenden Arbeit wird der Stellenwert der drei Mutationen als mögliche Risikofaktoren für die Entstehung HIT-assoziierter Thrombosen untersucht. In der Gruppe aller untersuchten HIT-Patienten ließ sich keine signifikant erhöhte Inzidenz der Faktor-V-Leiden-Mutation, des Prothrombin G20210A und des MTHFR-C677T-Polymorphismus im Vergleich zu Kontrollgruppen nachweisen. Auch bei den einzelnen Untergruppen der mit thrombembolischen Komplikationen symptomatischen HIT-Patienten zeigte sich kein Zusammenhang zwischen dem Vorliegen der Mutationen mit venösen oder arteriellen HIT-assoziierten Thrombosen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß keine der drei untersuchten Mutationen ein herausragender Risikofaktor für die Manifestation thrombembolischer Komplikationen bei HIT-Patienten darstellt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zur Beantwortung der Forschungsfrage 1 Lagerungsversuche durchgeführt. Diese zeigten, dass bei einem Lagerungszeitraum von bis zu sieben Tagen die Intensität aller gefärbten Strukturen mit der Zeit abnahm. Die Abnahme der Intensität war bei den meisten angefärbten Strukturen bereits ab dem ersten Lagerungstag zu beobachten. Zudem zeigte sich, dass Thrombospondin nur mit EDTA-antikoaguliertem Blut darstellbar war. Mit Hilfe dieser Arbeit konnte aber nicht nur die Abnahme der Intensität über den Lagerungszeitraum nachgewiesen werden, sondern auch, dass es innerhalb des Lagerungszeitraum zu Veränderungen der Strukturverteilung der angefärbten Strukturen kam. Filamin A und NMMIIA lagen an Tag 0 fixiert und gefärbt noch diffus verteilt im Thrombozyten vor und stellten sich im Anschluss ab dem ersten Lagerungstag vermehrt als eine Ringstruktur dar. Veränderungen der Struktur über den Lagerungszeitraum fand sich ebenso bei ß1-Tubulin. Alle weiteren Strukturen blieben über den gelagerten Zeitraum unverändert.
Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit Blutausstriche nach ihrer Intensität und Struktur beurteilt, die an Tag 0 fixiert wurden und im Anschluss fixiert bis Tag 7 gelagert wurden. Erst nach der fixierten Lagerung bis zu dem entsprechenden Lagerungstag wurden die Blutausstriche gefärbt. Bei dieser Methode, der an Tag 0 fixierten Blutausstriche, zeigte sich eine stärkere Intensität der angefärbten Strukturen, als wenn sie unfixiert gelagert wurden.
Zur Beantwortung der Forschungsfrage 2 wurde im zweiten Teil dieser Arbeit die Visualisierung der Signalkaskade mit Hilfe von phosphorylierten Kinasen und der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch die Anfärbung der phosphorylierten Kinasen in der Fluoreszenzmikroskopie konnte keine ausreichende Sensitivität und Spezifität erreicht werden und wurde aus diesem Grund nicht weiterverfolgt. Der parallele Ansatz mit der Durchflusszytometrie zeigte hingegen erfolgreiche Ergebnisse. Mit Hilfe von Zeitreihen konnte der optimale Zeitpunkt der Inkubation mit den Induktoren vor der duchflusszytometrischen Untersuchung bestimmt werden. Dieser lag bei drei Minuten. Durch die Verwendung verschiedener Induktoren konnte eine Phosphorylierung der SRC-, SYK- und AKT1/2/3-Kinasen gezeigt werden. Bei der SRC-Kinase eigneten sich besonders TRAP-6, U46619 und Kollagen als potente Induktoren. Bei der SYK-Kinase waren es U46619, TRAP-6, Convulxin und ADP. Zusätzlich zeigte die SYK-Kinase in der Negativkontrolle die geringste Hintergrund-Phosphorylierung. Zur niedrigsten nachweisbaren Phosphorylierung kam es bei der AKT1/2/3-Kinase. Eine Induktion mit TRAP-6 zeigte dabei die für AKT1/2/3 stärkste Phosphorylierung. Durchflusszytometrisch war somit eine gute Darstellung der Phosphorylierung der verwendeten drei Kinasen durch kleinsten Blutmengen möglich.
Für die gezielten Inhibitionsversuche dieser Arbeit wurde unter anderem die Medikamentenfamilie der Sartane zur GPVI-Rezeptorinhibition verwendet. Es zeigte sich, dass besonders bei der Induktion mit U46619 und Verwendung eines Vertreters der Familie der Sartane bei allen drei Kinasen die Phosphorylierung der Kinase deutlich gesenkt werden konnte. Die Phosphorylierung lag durch die Inkubation (1 min) mit einem Sartan auf dem Niveau der Negativkontrolle. Bei Induktion mit Convulxin und Verwendung von Losartan steigerte sich hingegen die Phosphorylierung bei allen drei Kinasen. Bei durchflusszytometrischer Untersuchung von Patientenblut, bei in vivo-Einnahme von Telmisartan, konnte im Vergleich mit drei gesunden Spendern gezeigt werden, dass die Phosphorylierung der SRC-Kinase bei Convulxin und Kollagen deutlich reduziert ist. In der Aggregometrie nach Born konnte bei allen verwendeten Sartanen eine Reduktion der Thrombozytenaggregation nachgewiesen werden.
Die weiteren Versuche mit dem PAR4-Rezeptorblocker Vorapaxar, zeigte im Durchflusszytometer bei der AKT1/2/3-Kinase keine Reduktion. Stattdessen konnte hier in der höchsten verwendeten Konzentration, sogar eine Zunahme der Phosphorylierung beobachtet werden. In der parallel durchgeführten Aggregometrie nach Born zeigte sich hingegen eine komplette Hemmung der Thrombozytenaggregation.
Um festzustellen, ob Proben für die Untersuchungen mit dem Durchflusszytometer versendet werden können, wurden in einem letzten Schritt erneut Lagerungsversuche durchgeführt. Durch die verwendeten Lagerungszeiträume sollte die Dauer, die durch den Transport bei einer Zentralisierung zustande kommt, imitiert werden. In dem durchgeführten Untersuchungsansatz war eine Lagerung über den Tag 0 nicht möglich. Zu einem späteren Zeitpunkt waren nur noch wenige bis keine Thrombozyten nachweisbar.