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- Plasmamembran (1) (remove)
Anorganische Stickstoffformen, wie Nitrat oder Nitrit, dienen in Pflanzen als Quelle fĂŒr die enzymatische Bildung des SignalmolekĂŒls Stickstoffmonoxid (NO). In Wurzeln wird NO an der apoplastischen Seite der Plasmamembran (PM) durch die Nitrit:NO-Reduktase (NI-NOR) gebildet, die fĂŒr Nitrit eine hohe AffinitĂ€t aufweist. Die dafĂŒr benötigten Elektronen stammen aus der Oxidation von Succinat, wobei in vitro auch Elektronen aus reduziertem Cytochrom c akzeptiert werden. Zur fluoreszenzmikroskopischen Lokalisierung der NI-NOR (in planta) innerhalb der Tabakwurzeln (Nicotiana tabacum cv. Samsun) wurden DAF-Farbstoffe (Diaminofluoresceine) eingesetzt, die sich jedoch aufgrund zahlreicher NO-unspezifische Reaktionen zum Nachweis der NI-NOR unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht eigneten. Die Bestimmung und Quantifizierung der NI-NOR-AktivitĂ€t in vitro, an isolierten PM-Vesikeln, solubilisierten PM-Proteinen und partiell gereinigten PM-Proteinen, erfolgte mittels Chemilumineszenzanalyse. Neben NO wurde unter Anwendung der Membran-Inlet-Massenspektrometrie an PM-Vesikeln auĂerdem die Bildung von N2O und NO2 nachgewiesen. In AbhĂ€ngigkeit von der externen NitraternĂ€hrung der Tabakpflanzen bestand ein Zusammenhang zwischen der NI-NOR-AktivitĂ€t und der Kolonisierungsrate der Wurzeln mit dem vesikulĂ€r-arbuskulĂ€ren Mykorrhizapilz Glomus mosseae, wobei geringe NI-NOR-AktivitĂ€ten unter Stickstoffmangelbedingungen mit hohen Kolonisierungsraten und umgekehrt hohe NI-NOR-AktivitĂ€ten bei optimaler NitraternĂ€hrung mit geringen Kolonisierungsraten korrelierten. Die NI-NOR-AktivitĂ€t wurde konzentrationsabhĂ€ngig und reversibel durch die Anwesenheit von Sauerstoff gehemmt und erreichte bei einer Luftsauerstoffkonzentration von 21 % noch etwa 22 % ihrer ursprĂŒnglichen, unter anoxischen Bedingungen gemessenen AktivitĂ€t. Um die IdentitĂ€t dieses Enzyms ĂŒber massenspektrometrische Analysen zu klĂ€ren, wurde die NI-NOR ausgehend von isolierten PM-Vesikeln aus Tabakwurzeln durch Solubilisierung sowie ĂŒber chromatographische und gelelektrophoretische Trennungsmethoden aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie wurden vor allem verschiedene Aquaporine und KanĂ€le sowie einige noch unbekannte Proteine identifiziert, bei denen es sich möglicherweise um die NI-NOR handeln könnte. Eine Oxidoreduktase, als möglicher Kandidat fĂŒr die NI-NOR, wurde jedoch nicht gefunden.