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The biodiversity of marine microorganisms opens a promising potential for the discovery of new technical enzymes. During this study a characterization of marine microorganisms, isolated from Arctic or Antarctic ice, sea water or sediment from the ocean was performed based on a comprehensive strain collection at the Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung. These marine psychrophilic bacteria indicated a wide spectrum of extracellular cold-active enzymes. 16S rRNA sequencing revealed that many of these psychrophilic bacteria represent new species. Characterization of selected isolates by means of transmission electron or raster electron microscopy showed remarkably pleomorphic cellular structures throughout their growth. The major part of this thesis focuses on a marine Antarctic, psychrophilic bacterium (strain ANT/505) isolated from sea ice covered surface water from the Southern Ocean, which was identified to express a very uncommon enzymatic activity for the marine environment, namely a pectinolytic activity. The sequencing of the 16S rRNA of isolate ANT/505 and biochemical tests indicated a taxonomical affiliation to the specie Pseudoalteromonas haloplanktis. The supernatant of this bacterial isolate showed after growth on citrus pectin three different pectinolytic activities. By activity screening of a genomic DNA library of isolate ANT/505 in Escherichia coli, two different pectinolytic clones could be isolated. Subcloning and sequencing revealed two open reading frames of 1671 and 1968 nt corresponding to proteins of 68 and 75 kDa. The deduced amino acid sequence of the two orfs showed homology to pectate lyases from Erwinia chrysanthemi and Aspergillus nidulans. The pectate lyases contain signal peptides of 17 and 26 amino acids length that were correctly processed after overexpression in E. coli BL21. Both enzymes were purified by anionic exchange chromatography. Maximal enzymatic activities for both pectate lyases were observed at a temperature of 30°C and a pH range of 9-10. The Km values of both lyases for pectate and citrus pectin were 1 g⋅l-1 and 5 g⋅l-1, respectively. Calcium was required for activity on pectic substrates, while the addition of 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) resulted in complete inhibition of the enzymes. These two cold-adapted enzymes represent the first pectate lyases isolated and characterized from a marine bacterium. Further cloning and sequence analyses revealed that PelA from P. haloplanktis is an exceptionally big bifunctional enzyme featuring pectate lyase and pectin methylesterase activity. The deduced amino acid sequence of the pectin methylesterase domain showed homology to group I pectin methylesterases from Erwinia chrysanthemi and Erwinia carotovora. The pectin methylesterase domain of PelA was found to show highest homology to a potential pectin methylesterase from Saccharophagus degradans strain MD2-40. Maximum pectin methylesterase activity of PelA was detected at a pH of 7.5 and a maximum temperature of 30°C. This cold-adapted enzyme revealed high remaining pectin methylesterase activity at low temperatures around 5°C and was quickly unstabilized at temperatures above 45°C. The analysis of the localization of the two pectinolytic genes on the genome of P. haloplanktis ANT/505 revelaed that these pectinase genes are expressed from independent cistrons, which are not clustered but located at distant positions on chromosome I of the P. haloplanktis genome. It was found that the transcription of both pectinase genes is induced by the presence of pectin. By means of primer extension the promoter regions of both cistrons were detected.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu zellulären Abwehrmechanismen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) während einer Infektion mit dem wirtschaftlich bedeutsamen Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHSV) durchgeführt. Unter Verwendung eines in vitro-Testsystems zur Erfassung der zellvermittelten Zytotoxizität wurde festgestellt, dass Forellen ab dem 10. Tag nach Infektion antivirale zytotoxische Abwehrzellen generieren. Anfangs lysierten diese zytotoxischen Leukozyten ausschließlich virusinfizierte Targetzellen mit identischem MHC-Klasse-I und erst später nach Zweitinfektion MHC-Klasse-I-inkompatible Zellen. Ein mit dem Anstieg des Zytotoxizitätsvermögens einhergehender Anstieg der CD8α-mRNA-Expression im Verlauf der Infektion deutet auf die Beteiligung spezifischer zytotoxischer Zellen bei der antiviralen Abwehr hin. Eine erneute Infektion bereits infizierter Forellen mit homologem Virus führte bei erhöhter CD8α-mRNA-Expression zu einer gesteigerten zellvermittelten Zytotoxizität. Das deutet darauf hin, dass Forellen, ähnlich wie höhere Vertebraten, über spezifische zytotoxische T-Zellen sowie über ein immunologisches Gedächtnis verfügen. Im Unterschied zu Säugern konnte eine zytotoxische Aktivität gegen MHC-Klasse-I-inkompatible Targetzellen und damit eine Beteiligung von NK-ähnlichen Zellen zeitlich erst nach der T-Zell-ähnlichen Zytotoxizität gemessen werden, wobei ein Anstieg der mRNA-Expression des indirekten NK-Zellmarkers NKEF durch die Effektorzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt erfolgte. NKEF wird bei Säugern von hämatopoetischen Zellen gebildet. Deshalb ist die erhöhte Expression von NKEF als Folge einer kompensatorischen Reaktion bei der hämorrhagischen Erkrankung VHS zu werten. Zum Zeitpunkt der NK-ähnlichen Aktivität hatte das Niveau VHSV-spezifischer Antikörper ein Maximum erreicht, weshalb die Bewaffnung von NK-ähnlichen Zellen mit Antikörpern denkbar ist, die ihrerseits natives VHSV-Protein auf infizierten Targetzellen erkannt und letztere lysiert haben könnten. Gegenstand dieser Arbeit war es ferner, den Einfluss des Glyko(G)- beziehungsweise Nukleo(N)-proteins des VHSV auf das zelluläre Abwehrsystem der Forelle zu untersuchen. Dazu wurde die DNA-Immunisierungstechnologie eingesetzt. Nach Applikation von VHSV-Protein-kodierenden Plasmid-DNAs konnte als Voraussetzung für eine erfolgreiche Antigenpräsentation am Applikationsort die Expression viraler Proteine in den Forellenmuskelzellen gezeigt werden. Ebenso generierten Forellen nach Immunisierung antivirale zytotoxische Zellen gegen beide Proteine. Das Glykoprotein, welches nach der Virusreplikation auf der Virushülle und auch auf der Membran infizierter Wirtszellen exprimiert wird, regte die Bildung von virusspezifischen CTL-ähnlichen, aber auch NK-ähnlichen zytotoxischen Effektorzellen an, da zytotoxische Zellen aus DNA-immunisierten Forellen sowohl infizierte MHC-Klasse-I-identische als auch Zellen mit einem anderen MHC-Klasse-I lysierten. Das Nukleoprotein dagegen bewirkte lediglich die Bildung CTL-ähnlicher Zellen, da ausschließlich MHC-Klasse-I-kompatible Zellen lysiert wurden. Diese Aktivität erreichte nur in den Sommermonaten ein signifikantes Niveau. Solche, bei poikilothermen Vertebraten zu erwartenden saisonbedingten Schwankungen im Niveau und in der Qualität antiviraler zellvermittelter Zytotoxizität, sind bei Fischen bisher nicht beschrieben worden. Diese Unterschiede sind umso bemerkenswerter, als dass die Forellen ganzjährig einem konstanten Temperatur- und Lichtregime ausgesetzt waren. Die Kombination eines Testsystems für zellvermittelte Zytotoxizität mit Untersuchungen zur mRNA-Expression, zum Antikörperstatus und zur Expression von Leukozyten-Oberflächenmarkern lassen bei paralleler Analyse bereits veröffentlichter Daten wichtige Schlussfolgerungen zum allgemeinen Verständnis der Immunreaktionen bei Fischen zu. Es sind Parallelen aber auch Unterschiede (verspätete NK-zellähnliche Aktivität, Saisonabhängigkeit) zum Immunsystem höherer Vertebraten feststellbar. Ferner leisten diese Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der VHS und geben Anhaltspunkte für Vakzinationsstrategien insbesondere von DNA-Vakzinen.
Synthesis and evaluation of pseudosaccharin amine derivatives as potential elastase inhibitions
(2006)
Elastase is a serine protease which by definition is able to solubilize elastin by hydrolytic cleavage.Human Leukocyte Elastase, HLE (EC 3.4.21.37), is involved in deseases such as adult respiatory distress syndrome, pulmonary emphysema, smoking related chronic bronchitits, ischemic-reperfusion injury and rheumatoid arthritis. Hence, the elastase inhibitors have clinical utility in these diseases. Heterocyclic compounds are one of the most important classes of the elastase inhibitiors. In the present work different pseudosaccharin amine derivatives were synthesized and tested against the elastase. The synthesis of pseudosaccharin amine dervatives was carried out from the amines and(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylsulfanyl)acetonitrile in different solvents. Futhermore, the pseudosaccharin amines were obtained by refluxing the thiosaccarinates in absolute acetic acid. The reaction of 3-ethoxybenzo[d]isothiazole 1,1-dioxide with different amines in dioxane under reflux resulted into the desired pseudosaccharin amine derivatives in higher yields. Pseudosaccharin chloride was also used in the synthesis of these derivatives.A detail study of the synthesis of pseudosaccharin amine dervatives from the above differnt routes is described. Peptides were also synthesized by using the mixed anhydride method. The ester, acid, amide and peptide derivatives were tested against the Porcine Pancreatic Elastase (PPE) and Human Leukocyte Elastase (HLE). The esters were found to be the reversible inhibitors of HLE. The process of the PPE inhibion by cyanomethyl(2S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylbutanoate was studied. Michaelis-Menten curve and Lineweaver-Burk double reciprocal plot were constructed in order to study the kinetic of this reaction. The compounds showing high inhibition of HLE were further stuied for determination of their inhibitory constant(Ki). The esters were found to be the higly active compounds against HLE. The cyanomethyl(2S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylbutanoate and cyanomethyl(2S,3S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylpentanoate showed the competitive reversible inhibition of HLE.The cyanomethyl(2S,3S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylpentanoate is highly potent inhibitor of HLE. The possible mechanism of inhibition of elastase by these compounds is discussed. Molecular modelling of some of the ester derivatives is also discussed.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden in der 1. eigenen Beurteilung der Bedeutung der Hepatitis B-Infektion bei Hämodialysepatienten mittels einer retrospektiven Krankenblattanalyse im etablierten Dialysezentrum Stralsund, 2. Ermittlung der Serokonversionsraten von Hämodialysepatienten sowie präterminal niereninsuffizienten Patienten nach einer Immunisierung gegen Hepatitis B, 3. Untersuchung der SCN‾-Spiegel bei Hämodialysepatienten, Einfluß der Hämodialyse auf diese Spiegel und Eruierung der Möglichkeiten zur Erlangung physiologischer Verhältnisse, 4. Untersuchung des Einflusses einer oralen SCN‾-Supplementierung auf die Immunantwort bei Hämodialysepatienten im Rahmen einer Immunisierung gegen Hepatitis B, 5. Spiegelbestimmungen von Neopterin und Procalcitonin bei Hämodialysepatienten und mögliche Einflüsse einer Immunisierung gegen Hepatitis B auf deren Höhe. Mittels der eigenen retrospektiven Krankenblattanalyse konnte die deutlich höhere Prävalenz hinsichtlich des Auftretens der Virushepatitis B bei Hämodialysepatienten herausgearbeitet werden. Zudem waren nicht nur hohe Infektionszahlen sondern auch häufiger chronische Verläufe nachweisbar. Aufgrund der ebenfalls darstellbaren deutlich reduzierten Serokonversionsraten nach eingeführter Immunisierung gegen Hepatitis B bei den Hämodialysepatienten und präterminal niereninsuffizienten Patienten blieb die Prävalenz der Hepatitis B-Infektion im Dialysezentrum weiter hoch. Erst die Möglichkeit einer konsequenten Distanzierung von Patienten mit serologischen Zeichen einer Virushepatitis B gestaltete die Prävention neuer Infektionen erfolgreich. In der Untersuchung konnte gezeigt werden, dass sich die SCN‾-Spiegel der Dialysepatienten vor der Hämodialyse im unteren Bereich der physiologischen Norm und nach erfolgter Hämodialyse unter der physiologischen Norm befinden. Mittels oraler Substitution von SCN‾ gelingt ein vollständiger Ausgleich des hämodialysebedingten SCN‾-Verlustes und führt zu durchgängig physiologischen Spiegeln. Die Serokonversionsrate nach erfolgter Boosterung der Hepatitis BImmunisierung konnte bei den mit zusätzlich SCN‾ versorgten Patienten signifikant gesteigert werden. Bei 12 der 14 in den Versuch einbezogenen Hämodialysepatienten konnte ein stimulierender Effekt unabhängig von der Zahl der vorangegangenen Boosterimpfungen beobachtet werden. Eine Beziehung zwischen Impferfolg und Parametern des Dialysestatus der untersuchten Patienten konnte nicht hergestellt werden. Somit gelingt auch mittels dieser Untersuchung die wünschenswerte Unterscheidung zwischen Respondern und Nonrespondern nicht. In der vorliegenden Untersuchung konnte bestätigt werden, dass bei Hämodialysepatienten die Neopterinspiegel gegenüber der Norm erhöht sind. Dabei war die individuelle Streuung der Neopterinspiegel dieser Patienten hoch. So macht erst die Kenntnis der individuellen Neopterinspiegelverhältnisse der Hämodialysepatienten eine diagnostische Verwertung hinsichtlich Erkennung von Viruserkrankungen möglich. Die Neopterinspiegel stiegen nach Immunisierung gegen Hepatitis B an, das Maximum dieses Anstieges trat jedoch zu unterschiedlichen Zeiten nach der Impfung auf. Diese erhöhten Neopterinspiegel blieben noch mehrere Tage nach der Impfung nachweisbar. Zudem konnte eine Beziehung zwischen Anstieg des Neopterinspiegels nach erfolgter Immunisierung und Anstieg des Antikörpertiters nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Hämodialysepatienten wiesen überwiegend stabile, geringradig über der physiologischen Norm liegende Procalcitoninspiegel auf. Signifikante Unterschiede der Procalcitoninspiegel vor und nach Hämodialyse waren nicht nachweisbar. Berücksichtigt man die geringradige Erhöhung der stabil nachweisbaren Procalcitoninspiegel bei Hämodialysepatienten, kann das Procalcitonin als diagnostisches Merkmal bei bestimmten inflammatorischen Reaktionen genutzt werden. Beziehungen zwischen Höhe der Procalcitoninspiegel und der erfolgten Immunisierung gegen Hepatitis B bei den Hämodialysepatienten ergaben sich nicht.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliäre Elimination nimmt eine Schlüsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliär eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singuläre Substanzeffekte auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch Veränderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschränkter Bioverfügbarkeit führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, für die frühe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliärer Elimination auf indirektem Weg über die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierfür war es zunächst unerlässlich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primäre Hepatozyten nur befähigt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-ähnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulären Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfür als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollständigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewählte Transportproteine und Cytochrome umfassend, über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validität des Zellsystems zu gewährleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund für die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, über die Bestimmung der funktionellen Aktivität unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate über einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivität der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Moleküle in den Lumina der Gallenkanälchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verstärkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivität der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestätigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abhängigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivität konzentrationsabhängig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurückzuführen war. Dies konnte mittels des Zelltoxizitätsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemäß auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frühen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwählen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliären Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.
Die Implantation von Arzneistoff-freisetzenden (drug-eluting) Stents in durch Ballonangioplastie revaskularisierte Koronararterien stellt heutzutage eine der wichtigsten Methoden zur Prävention von Restenosen der betroffenen Gefäßabschnitte dar. Die Erzielung wirksamer Konzentrationen der hochpotenten Wirkstoffe in der Gefäßwand unter Vermeidung von unerwünschten systemischen Arzneimittelwirkungen soll durch die kontrollierte Arzneistofffreisetzung im stenosierten Gefäßabschnitt gewährleistet werden. Aufgrund der Unzugänglichkeit des Wirkortes für direkte Konzentrationsbestimmungen liegen bis dato jedoch nur wenige Daten bezüglich der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Humanstudien vor. Da die zur Verfügung stehenden offizinellen und nicht offizinellen Methoden zur Untersuchung des In vitro-Verhaltens von Arzneiformen lediglich ein Akzeptorkompartiment aufweisen, sind sie ebenfalls nur bedingt zur Vorhersage der Freisetzung aus einem Stent am Implantationsort geeignet. Verteilungprozesse können mit diesen Methoden nicht beschrieben werden. Aus diesem Grund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen an die In vivo-Bedingungen am Implantationsort adaptierten In vitro-Freisetzungstest für Arzneistoff-freisetzende Stents basierend auf den Methoden des Europäischen oder US-Amerikanischen Arzneibuchs zu entwickeln. Der Freisetzungstest sollte dazu geeignet sein, sowohl die Wirkstofffreisetzung und -verteilung zwischen verschiedenen Kompartimenten als auch räumliche Verteilungsmuster innerhalb eines Gefäßwand-simulierenden Kompartiments zu untersuchen. Als Basis für die Modellentwicklung wurde aufgrund der am Implantationsort in vivo vorliegenden Bedingungen die Durchflusszellen-Apparatur ausgewählt, die die einzige offizinelle Methode darstellt, bei der ein gerichteter Fluss erzeugt wird. Zur Simulation der Gefäßwand sollte ein zusätzliches Akzeptorkompartiment in die Durchflusszelle eingebracht werden. Da das Kompartiment einerseits formstabil sein sollte und andererseits die Aufnahme und den Transport des Arzneistoffs durch Diffusion ermöglichen sollte, wurden verschiedene Hydrogele hinsichtlich ihrer Eignung zur Integration in die Durchflusszelle untersucht. Calciumalginat wurde als geeignetes Hydrogel für das zusätzliche Akzeptorkompartiment identifiziert und durch Veränderungen an der Durchflusszellen-Apparatur erfolgreich in den Freisetzungstest integriert. Es wurde eine zentrale Aussparung im Hydrogel geschaffen, die im Modell das Gefäßlumen simuliert und in die ein Stent mittels Ballonkatheter implantiert werden kann. Nach der Implantation des Stents kann die Öffnung im Hydrogel mit dem Freisetzungsmedium mit einer Flussrate von 35 ml/min, die dem Blutfluss in Koronarien entspricht, perfundiert werden. Durch Einsatz geeigneter Medienvolumina kann die Einhaltung von Sinkbedingungen, die als das größte Problem der häufig eingesetzten nicht offizinellen Testsysteme gilt, sichergestellt werden. Nach erfolgter Entwicklung wurde die Eignung des Modells durch die Testung verschiedener Stentmodelle geprüft werden. Neben der Bestimmung der Freisetzung der Modellsubstanzen ins Durchflussmedium während der Perfusion und der am Versuchsendpunkt in der Stentbeschichtung verbliebenen Modellsubstanz-Anteile wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung des Hydrogels nach Beendigung der Perfusion entwickelt. Zur direkten Quantifizierung der ins Hydrogel diffundierten Modellsubstanz wurde eine geeignete Methode zur Verflüssigung des Gels identifiziert. Zur Untersuchung der räumlichen Verteilung innerhalb des Hydrogels wurden zwei Methoden zur Präparation des Hydrogels entwickelt, die die Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop ermöglichten. Einerseits wurde anhand von Mikrotomschnitten die Diffusionstiefe im Querschnitt untersucht. Unter Verwendung von Alginatfilmen war andererseits die Untersuchung der Innenseite des simulierten Gefäßlumens parallel zur Flussrichtung möglich. Unter Verwendung einer Finite-Elemente-Methode konnten zudem ausgewählte Freisetzungsversuche mathematisch modelliert werden. Für die Berechnungen wurden im Rahmen dieser Arbeit experimentell bestimmte Diffusionskoeffizienten zu Grunde gelegt. Die Ergebnisse der Freisetzung mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Testsystem wiesen im Vergleich zur Testung mit offizinellen Methoden eine Verlangsamung der Entleerung der Stentbeschichtung bei allen Modellsubstanzen durch die an die In vivo-Situation adaptierten Einbettungs- und Flussbedingungen auf. Diese Beeinflussung der Freisetzungsgeschwindigkeit durch die Freisetzungsbedingungen unterstreicht die Notwendigkeit, für die In vitro-Evaluation von Arzneistoff-freisetzenden Stents spezialisierte, an die In vivo-Bedingungen adaptierte Testsysteme einzusetzen. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Freisetzungsmodell steht erstmals ein solches Testsystem zur Verfügung.
Marine Organismen haben sich im Laufe der Evolution hervorragend an die besonderen Bedingungen unter Wasser angepasst. Diese Tatsache führte aufgrund von Adaptationsprozessen unter anderem zur Bildung neuer biologisch aktiver Naturstoffe, die sich in ihrer Struktur und Wirkung häufig von bekannten terrestrischen Naturstoffen unterscheiden. Während Makroorganismen marinen Ursprungs schon länger intensiv untersucht werden, nahm das Interesse an marinen Mikroorganismen erst in den letzten zehn Jahren stark zu. Pilze im marinen Habitat wurden sehr spät beschrieben. Die ersten Funde wurden 1869 bekannt, doch erst in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde langsam klar, dass auch im marinen Lebensraum eine reichhaltige Pilzflora zu finden ist. Hierbei stellen besonders Mikroorganismen des marinen Habitats wichtige potentielle Quellen auf der Suche nach neuen pharmakologisch aktiven Wirkstoffen dar, da ihre biotechnologische Fermentation in nahezu unbegrenzter Menge möglich ist, ohne dass eine Ausbeutung begrenzter natürlicher Ressourcen erfolgen muss. Im Vordergrund dieser Arbeit stand daher die Isolierung bioaktiver Naturstoffe aus marinen Pilzen. Die Pilze wurden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert, mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert und die Extrakte chemisch analytisch sowie auf ihre antimikrobielle Aktivität hin untersucht. Biologisch aktive sowie analytisch aussichtsreich erscheinende Extrakte wurden zur Isolierung der in ihnen enthaltenen Sekundärstoffe ausgewählt. Die Naturstoffisolierung sowie die nachfolgende Strukturaufklärung erfolgten mithilfe verschiedener chromatographischer sowie spektroskopischer Methoden (HPLC, LC-MS, NMR, DC, verschiedene säulenchromatographische Techniken). Isolierte Reinsubstanzen wurden auf ihre biologische Aktivität gescreent. Aus dem Ethylacetat-Extrakt des taxonomisch bis jetzt nicht einordenbaren marinen Pilzes 222 konnten insgesamt elf verschiedene Verbindungen strukturell aufgeklärt werden. Dabei stellten sich 6-Deoxybostrycoidin (1), 5-Deoxyanhydrofusarubin (2) und Altechromone A (3) als bereits bekannte Verbindungen heraus. Die acht Verbindungen Balticol A-F (4, 5, 6, 7, 8, 9), Balticofuran (10) und Balticolid (11) stellten sich als neue Naturstoffe heraus. In Biotests zeigte 6- Deoxybostrycoidin antibakterielle Aktivität gegen humanpathogene Keime (Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis) und fischpathogene Keime (Vibrio anguillarum, und Pseudomonas anguilliseptica). Die antimikrobielle Aktivität dieser Ver¬bin¬dun¬g gegen fischpathogene Erreger wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. Die neuen Verbindungen Balticol A-F (4-8) und Balticolid (11) zeigten starke antivirale Aktivität gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und Influenza Virus Typ A. Am stärksten war die Wirkung von Balticol E (8) mit einem IC50-Wert von 0,01 µg/ml gegen HSV 1. Balticol D (7) zeigte auch antiinflammatorische Eigenschaften. Die neue Verbindung Balticofuran A (10) zeigte gute Radikalfängereigenschaften. Aus dem Pilz Lophiostoma sp. konnten drei Verbindungen isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei stellten sich Oxasetin (12) , Erogosterolperepoxid (13) und Cerebrosid C (14) als bereits bekannte Verbindungen heraus, die aber zum ersten Mal aus Lophpiostoma sp. isoliert wurden. Das antibakteriell aktive Oxasetin war vorher nur aus dem Pilz Vaginatispora aquatica beschrieben worden. Oxsetin erwies sich im Test als antiviral aktiv gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und Influenza Virus Typ A . Die antimikrobielle Aktivität dieser Ver¬bin-dun¬g gegen fischpathogene Erreger und die antivirale Aktivität wurden in der Literatur bisher nicht beschrieben.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
With the development of new functional genomics methods that can access the whole genome, transcriptome, proteome and metabolome more comprehensive insights in cellular processes are possible. Largely based on these advances, our knowledge about molecular constituents for many organisms is increasing at a tremendous rate. Until today, the genomes of several organisms including pathogenic bacteria are already sequenced and pave the way for metabolic network constructions. Interest in metabolomics, the global profiling of metabolites in a cell, tissue or organism, has been rapidly increased. A range of analytical techniques, including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS), liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS), Fourier Transform mass spectrometry (FT–MS), high performance liquid chromatography (HPLC) are required in order to maximize the number of metabolites that can be identified in a matrix. With the help of microbial metabolomics (qualification and quantification of a huge variety of metabolites from a bacterium) deciphering of the bacterial metabolism is feasible. The metabolome pipeline or workflow encompasses the processes of (i) sample generation and preparation, (ii) establishment of analytical techniques (iii) collection of analytical data, raw data pre-processing, (iv) data analysis and (v) data integration into biological questions. The present work contributes to the above mentioned steps in a metabolomics workflow. A specific focus was set to the exo- and endometabolome analysis of Gram-positive bacteria
In der heutigen Arzneimitteltherapie stellt die orale Verabreichung die bevorzugte Applikationsart dar, folglich ist die orale Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe für den Therapieerfolg von großer Bedeutung. Eine Vielzahl der neuen Arzneistoffe ist lipophil und schlecht wasserlöslich, somit weisen sie oft schlechte Voraussetzungen für die orale Therapie auf. Gleichermaßen können intestinaler Metabolismus und Efflux-Transporter die systemische Verfügbarkeit von Arzneistoffen vermindern. Nichtionische Tenside beeinflussen die orale Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen auf unterschiedliche Weise. Lange Zeit herrschte die Annahme, dass Hilfsstoffe wie Tenside pharmakologisch inert sind, und sie wurden hauptsächlich in klassisch technologischem Sinn als Solubilisatoren eingesetzt. Diese Annahme ist widerlegt, jedoch sind derzeit nur wenige Studien publiziert, in denen die Stabilität von nichtionischen Tensiden im Gastrointestinaltrakt oder Interaktionen mit Enzymen untersucht wurde. Ein Ziel dieser Arbeit war es, pharmazeutisch genutzte nichtionische Tenside unterschiedlicher Struktur hinsichtlich ihrer Stabilität unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Ausgewählt wurden die ethoxylierten Verbindungen Polysorbat 80 und D-α-Tocopherol Polyethylenglykol (1000) Succinat (TPGS) sowie der Saccharosefettsäureester Surfhope® SE D 1216 (Saccharoselaurat). Kapitel 1 und 2 beschreiben die Entwicklung analytischer Methoden für diese sehr heterogen zusammengesetzten Verbindungen, die auf chromatographischer Trennung mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) und Detektion mit einem Charged Aerosol-Detektor (CAD), massenselektiven Detektor (MSD) und UV-Detektor basieren. Die Inkubation von Polysorbat 80 und TPGS in HCl-Lösung (pH 1,0) bei 37°C, wodurch die physiologischen Bedingungen im Magen dargestellt werden sollten, ergab einen geringfügigen Abbau von 9,5% (± 3,0%) bzw. 3,4% (± 0,4%) innerhalb von 8 h. Saccharoselaurat unterlag einem Abbau von über 50% innerhalb von 8 h, während sich alle drei Verbindungen in Wasser stabil zeigten. In den letzten Jahren erlangten neue Technologien, die schlecht wasserlösliche Wirkstoffe oral verfügbar machen sollen, immer mehr an Bedeutung. Umfassende Entwicklungsarbeit kommt dabei selbst-emulgierenden Lipidsystemen zu. SEDDS (Self-emulsifying Drug Delivery Systems) enthalten mitunter große Mengen an nichtionischen Tensiden. Da der Erfolg dieser Formulierungen maßgeblich vom Ausmaß des Triglyceridabbaus sowie Entstehung und Art der Abbauprodukte abhängt, wurde ein Einfluss durch diese amphiphilen Verbindungen getestet. In Kapitel 3 wird die inhibitorische Wirkung von nichtionischen Tensiden auf den Triglyceridabbau durch die Pankreaslipase untersucht. Als weitere Tenside wurden die Macrogolglycerolfettsäureester Cremophor® EL und Cremophor® RH 40 hinzugezogen. Alle Verbindugen hemmen den Triglyceridabbau konzentrationsabhängig bereits unterhalb der kritischen Mizellbildungskonzentration. Weiterhin wurde die Stabilität der Tenside selbst gegenüber Pankreasenzymen getestet, da ein Abbau ebenfalls die Solubilisierungskapazität der gastrointestinalen Flüssigkeit vermindern kann. Die Fettsäureester von Polysorbat 80 sind zu 14,0% (± 1,0%) hydrolysiert worden. Im Fall von Cremophor EL wurden 14,4% (± 3,3%) hydrolysiert, während sie bei Cremophor RH 40 zu einem geringeren Anteil von 6,1% (± 2,8%) abgebaut wurden. TPGS und Saccharoselaurat zeigten sich stabil gegenüber Pankreasenzymen. Gegenstand neuester Forschung ist ferner die Möglichkeit der Beeinflussung intestinaler arzneistoffmetabolisierender Enzyme durch nichtionische Tenside. In Kapitel 4 werden Wechselwirkungen mit dem Arzneistoffmetabolismus durch die Cytochrom P450 Isoenzyme CYP 3A4 und CYP 2C9, die beim intestinalen Metabolismus die bedeutendste Rolle spielen, untersucht. Bei allen Tensiden konnte eine konzentrationsabhängige Inhibition hinsichtlich des Metabolismus eines Modellsubstrats bereits unterhalb der kritischen Mizellbildungskonzentration festgestellt werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgern, dass das Kriterium der pharmakologischen Indifferenz von Hilfsstoffen in vielen Fällen nicht gegeben ist. Des Weiteren verdeutlichen sie die Notwendigkeit, im Rahmen der Entwicklung von komplex zusammengesetzten Formulierungen zunächst eine Untersuchung und quantitative Bewertung des Stabilitätsverhaltens durchzuführen. Insbesondere bei selbst-emulgierenden Lipidsystemen muss berücksichtigt werden, dass sowohl der Abbau der Tenside als auch die inhibitorische Aktivität dieser gegenüber der triglyceridabbauenden Pankreaslipase maßgeblichen Einfluss auf die Arzneistoffsolubilisierung haben. Die Fähigkeit, intestinale CYP450 Enzymen zu inhibieren, eröffnet die Möglichkeit, diese nichtionenschen Tenside zur gezielten Metabolismushemmung einzusetzen. Dadurch kann die Bioverfügbarkeit von „Problemarzneistoffen“, sofern sie Substrate dieser Enzyme darstellen, erhöht werden.
Summary Cyanobacteria are a diverse and ancient group of photosynthetic prokaryotic organisms that can inhabit a wide range of environments including extreme conditions such as hot springs, desert soils and the Antarctic. They are abundant producers of natural products well recognized for their bioactivity and utility in drug discovery and biotechnology applications. Novel intracellular and extracellular compounds from various cultured and field cyanobacteria with diverse biological activities and a wide range of chemical classes have considerable potential for development of pharmaceuticals and other biomedical applications. However, cyanobacteria are still viewed as unexplored source of potential drugs. Especially the collections of cyanobacterial strains from South East Asia where biodiversity is high are still largely unexplored. Thus, we investigated twelve soil cyanobacterial strains isolated from soil samples collected from rice, cotton, and coffee fields in Dak Lak province of Vietnam and one marine strain, Lyngbya majuscula collected from Khanh Hoa province of Vietnam for the search for new compounds with antimicrobial and cytotoxic activities. From the 12 soil cyanobacterial strains, 48 extracts prepared with n-hexane, methanol, and water for biomasses and ethyl acetate for growth media were screened for antibacterial activity against Gram-positive bacteria (Bacillus subtilis ATCC 6051 and Staphylococcus aureus ATCC 6538) and Gram-negative bacteria (Escherichia coli ATCC 11229, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Of 48 extracts, 47.92% and 45.83% showed activity against Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus, respectively, while 22.92% and 6.25% exhibited activity against Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, respectively. All investigated cyanobacteria (12/12) showed antibacterial activity to at least one of the test organisms applied. Among the active extracts, extracts obtained from 5 cyanobacterial strains, Westiellopsis sp. VN, Calothrix javanica, Scytonema ocellatum, Anabaena sp. and Nostoc sp. showed the highest strength and range of antibacterial activity and therefore were selected for chemical investigation with an emphasis on the isolation and structure elucidation of antimicrobial compounds. Bioassay-guided fractionation of the methanol extract prepared from biomass of Westiellopsis sp. VN by silica gel chromatography, followed by sephadex LH-20 chromatography and reversed-phase HPLC led to isolation and identification of 6 compounds as ambiguine D isonitrile, ambiguine B isonitrile, dechloro-ambiguine B isonitrile, fischerellin A, hydroxy-eicosatetraenoic acid and methoxy-nonadecadienoic acid. Identification of these active compounds was established by direct comparison of our spectroscopic data, including 1H NMR and HR-ESI-MS with those reported in the literature. All these compounds showed biological activity. The identification of fatty acids and other volatile components by GS-MS in the active MeOH fraction obtained from EtOAc extract of growth medium was done before commencing further fractionation processes. Culture optimization of Westiellopsis sp.VN showed that NaNO3 deficiency increased accumulation of antimicrobial compounds. Biosynthesis of antimicrobial compounds increased over cultivation time resulting in increased diameter of inhibition zone of the methanol extract towards the end of the 7-to 8- week growth period, but the most clear inhibition zone of this extract was detected after cultivation time of 8 weeks. Bioassay-guided fractionation of the methanol extract prepared from biomass of either Calothrix javanica by C18 chromatography followed by reversed-phase HPLC or Scytonema ocellatum by C18 chromatography followed by silica gel chromatography and reversed-phase HPLC led to isolation and structure elucidation of new cyclic peptide named daklakapeptin. Structure of daklakapeptin was elucidated by exhaustive 1D (1H) and 2D (COSY, TOCSY, NOESY, HMQC, HMBC) NMR spectroscopy in combination with HR-ESI-MS. Daklakapeptin was found to have totally 12 residues including 6 proteinogenic amino acids (Pro, Tyr, Ile, Leu, Gln, Thr), 4 complexes (X,Y,T,Z) and the methyl derivative of Ile. The exact sequence of daklakapeptin is shown in following figure with X: (CH3)2CHCH2CH2CH(NH-)CH2CO-, Y:(CH3)2CHCH(OH)CH(NH-)CO-, T: HOCH2CH2CH(NH-)CO-, Z: HOCH2CHOHCH(NH-)CO- This new cyclic peptide exhibited antibacterial activity against Staphylococcus aureus with diameter of inhibition zone of 12.5 mm in concentration of 200 mg/disc. Further test for activity to other bacteria and for cytotoxic activity are in progress. Using reversed-phase HPLC to separate compounds in the crude ethyl acetate extract obtained from culture medium of Anabaena sp. led to isolation and structure elucidation of flourensadiol. The structure of flourensadiol was established using an extensive array of 1D (1H, 13C, DEPT-135) and 2D (HMQC, COSY, HMBC) NMR and HR-ESI-MS experiments. Flourensadiol was isolated previously from the common western shrub Flourensia cernua. However, only MS, IR, and proton NMR data but no reports on biological activity were available. In this study, we report the complete NMR data of flourensadiol for the first time. Flourensadiol was found to be very strong antibacterial active against Escherichia coli with diameter of inhibition zone of 20.0 mm in concentration of 200 mg/disc. Further test for activity to other bacteria and cytotoxic activity are in progress. Bioassay-guided fractionation of the methanol extract from biomass of Nostoc sp. by silica gel chromatography followed by C18 chromatography and reversed phase HPLC led to isolation of the active fraction NsF2 which exhibited antibacterial activity against Staphylococcus aureus with diameter of inhibition zone of 10.0 mm in concentration of 500 mg/disc. The low resolution ESI-MS of fraction NsF2 showed signal at m/z 426 [M+H]+. The NMR and MS characterization of compounds in fraction NsF2 is in progress. Bioassay-guided fractionation of the methanol extract prepared from biomass of marine cyanobacterium Lyngbya majuscula collected from Khanh Hoa province of Vietnam by various chromatographic methods (CC, PTLC, HPLC) afforded 3 cytotoxic compounds anhydrodebromoaplysiatoxin, debromoaplysiatoxin, and anhydroaplysiatoxin. Identification of these cytotoxic compounds was established by direct comparison of our spectroscopic data, including (1H, 13C) NMR and HR-ESI-MS with those reported in the literature. In our study, debromoaplysiatoxin and anhydroaplysiatoxin exhibited cytotoxic activity against bladder cancer cell line 5637 with IC50 of 86 ng/ml and 40 ng/ml, respectively but anhydrodebromoaplysiatoxin was not yet tested for cytotoxic activity. The identification of fatty acids by GS-MS technique in the n-hexane extract obtained from biomass of this marine cyanobacterium was undertaken before commencing further fractionation processes. The presented results prove that soil cyanobacteria are a promising source to yield chemical and pharmaceutical interesting compounds.
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Ermittlung eines neuartigen Verfahrens zur Vorhersage des Langzeitklebverhaltens von Transdermalen Pflastern (TTS) auf Humanhaut. In einer In-vivo-Studie wurden zwölf verschiedene Polyacrylat-Haftkleber im Hinblick auf Klebkraft und Größe des dunklen Randes untersucht. In einer zweiten In-vivo-Studie wurde der Einfluss der Elastizität der Deckfolie sowie der Pflastergröße überprüft. Für die Entwicklung einer neuartigen In-vitro-Methode zur Charakterisierung von Haftklebern wurde der Probe-Tack-Test verwendet. Zur Auswertung wurden zwei neuartige Kurvenkennwerte definiert. Es ergab sich ein Zusammenhang zwischen den In-vitro-Ergebnissen und dem realen Langzeitklebverhalten der Pflaster. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde die Wiederanheftbarkeit von TTS untersucht. Dafür sind rasterelektronische und lichtmikroskopische Aufnahmen von Pflastern eines viskosen, unvernetzten und eines hochkohäsiven, vernetzten Klebertyps nach wiederholtem Abstrippen vom Unterarm eines Probanden verglichen worden. Die Pflaster beider Klebertypen weisen eine generell schlechte Wiederanheftbarkeit auf. Die Vermutung, dass die Wiederanheftung eines TTS von der Viskosität der Klebermatrix abhängt, konnte nicht bestätigt werden.
Die Bekämpfung der „most neglected diseases“ stellt die Menschheit vor eine große Herausforderung. Besonders betroffen sind Menschen in den Ländern der Dritten Welt. Zur Behandlung vieler dieser Erkrankungen gibt es bis jetzt noch keine ausreichend aktiven Arzneistoffe. Außerdem stellt die Resistenzentwicklung der Erreger gegen vorhandene Antiinfektiva ein äußerst großes Problem dar. Gegenstand dieser Arbeit war die Synthese von Substanzen, die als Inhibitoren der tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT) untersucht werden sollten und solche, die auf ihre antiplasmodiale Aktivität in vivo getestet werden sollten. Das Target des TGT-Projekts, die tRNA-Guanin-Transglycosylase von Shigella-Spezies, ist ein bakterielles Enzym, das verantwortlich für Pathogenitätsmechanismus virulenter Shigellen ist. Die TGT hat eine Schlüsselfunktion bei der Expression von Virulenzfaktoren der Shigellen und spielt somit eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Bakterienruhr (Shigellose). Sie katalysiert den Austausch der Purinbase Guanin durch die modifizierte Base preQ1 in der Anticodon-Wobble-Position bakterieller tRNA. Bei Untersuchungen von Shigellen mit mutiertem TGT-Gen konnte eine signifikante Abnahme der Pathogenität dieser Erreger festgestellt werden. Dieses Enzym kann deshalb prinzipiell als mögliches Target für neuartige biologisch aktive Substanzen betrachtet werden, denn die Hemmung der TGT führt zum Verlust der Pathogenität der Erreger, allerdings nicht zu deren Tod. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Abkömmlinge der Leitstruktur 5-Nitro-1,3-dihydro-2H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-on, die aus einem virtuellen In-silico-Screeningexperiment hervorgegangen ist, synthetisiert um diese in einem Radioligandenassay auf TGT-Inhibition zu untersuchen. In vorangegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der Austausch des Pyridinstickstoffatoms der Leitstruktur durch ein Kohlenstoffatom zu einer Verbindung mit vergleichbarer inhibitorischen Aktivität führt. Ausgehend von dieser veränderten Leitstruktur wurden Benzimidazol-2-one und -thione synthetisiert. Diese Verbindungen weisen unterschiedliche Gruppen in Position 5 auf und unterscheiden sich zudem durch die Substitution an Position 1. Die Synthese der Verbindungen mit Benzimidazol-Grundkörper erfolgte durch die initiale Einführung der Substituenten durch nukleophile Substitution an ortho-Nitro-Halogenbenzen-Derivaten. Für diesen Reaktionsschritt erwies sich die Synthese im Mikrowellenreaktor als besonders günstige Methode. Die Reduktion der entstandenen 2,4-Dinitroanilin-Derivate erfolgte selektiv unter Verwendung von Natriumsulfid als Reduktionsmittel, wobei die ortho-Nitrogruppe unverändert blieb. Die Anilinderivate mit Cyano- und Trifluormethylgruppe in para-Position wurden durch eine palladiumkatalysierte Hydrierung zu ortho-Phenylendiaminen reduziert, die anschließend ohne Isolierung dem Ringschluss unterzogen wurden. Die Ringschlussreaktionen erfolgten mit Triphosgen oder Kohlenstoffdisulfid zu Benzimidazol-2-onen beziehungsweise -thionen. Eine Auswahl an hergestellten Derivaten konnte hinsichtlich ihrer Aktivität als TGT-Inhibitoren untersucht werden. Einige Verbindungen wurden auf ihre Zytotoxizität an vier Krebszelllinien hin untersucht. Das zweite Teilgebiet der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit N-substituierten 7-Chlorchinolin-4-aminen, die auf ihre antiplasmodiale Aktivität hin untersucht werden konnten. Diese Verbindungen wurden in einer Zweistufensynthese mit abschließender säulenchromatographischer Reinigung synthetisiert. Verbindungen, die in vorangegangenen In-vitro-Untersuchungen eine Aktivität gegen chloroquinresistente Plasmodium-falciparum-Stämme zeigten, konnten in vivo an Mäusen getestet werden. Dabei zeigten einige Vertreter guten Aktivitäten gegen den eingesetzten Erreger.
Bacillus licheniformis is one of the most important hosts used in the biotechnological industry for the production of technical enzymes, antibiotics and a number of biochemicals. Although this bacterium has been used for a long time as an expression host, only little information on expression systems of this host is available. An expression system could be controlled by a cell density signal, a specific chemical inducer or a thermal shift. A limiting substrate such as glucose or phosphate limitation is suggested to use as the signal for the induction of an expression system. When B. licheniformis cells are subjected to nutrient limitation conditions, numerous genes involved in the metabolism of alternative nutrient sources are induced in order to keep cell survival. Therefore, the main topic of this study was to identify and investigate the regulation of genes or operons which are strongly induced in B. licheniformis cells grown under nutrient limitation conditions in order to apply for the construction of potential new expression systems. The research includes studies on the regulation of genes which are responsible for the acetoin and 2,3-butanediol utilization in B. licheniformis cells grown under glucose limitation conditions. Furthermore, we also analyzed the regulation of phytase gene expression as well as investigated the function of a putative ribonuclease expressed in B. licheniformis under phosphate limitation conditions. From this study, it was shown that in B. licheniformis, the utilization of acetoin and 2,3-butanediol was mainly mediated by enzymes encoded by the acoABCL operon. The transcription of this operon was regulated by sigma L transcription factor and was induced by acetoin. The acuABC operon was suggested to play as an indirect regulatory role for the acetoin utilization in B. licheniformis. This operon was controlled by a typical sigma A dependent promoter, however, acetoin was not an inducer for its expression. Furthermore, the regulation of phytase gene expression was suggested to be controlled by PhoPR-two component systems. The results showed that phytate, which is the substrate of phytase enzyme, was not an inducer for the expression of phy gene. However, growth experiments revealed that phytate served as a good alternative phosphate source for the growth of B. licheniformis cells under these conditions. Finally, the inactivation of BLi03719 gene, coding for a putative ribonuclease, resulted in an increase of the total RNA concentration of B. licheniformis cells grown in phosphate limited medium. However, the mutation did not affect the expression of the heterologous reporter gene. Therefore, it could be speculated that the putative ribonuclease BLi03719 plays a role in ribosomal RNA degradation under these conditions.
Die Magen-Darm-Passage von Arzneiformen ist ein komplexer Vorgang, der durch starke Variabilität gekennzeichnet ist. Die Inhomogenität der Passagebedingungen betrifft sowohl die physiko-chemischen Eigenschaften des Milieus der einzelnen Abschnitte des Magen-Darm-Traktes als auch deren spezifische Motorik und kann das Wirkstoffabgabeverhalten fester peroraler Arzneiformen beeinflussen. Die Komplexität der Gegebenheiten in vivo macht es notwendig, die peroralen Arzneiformen hinsichtlich der Applikationsbedingungen zu optimieren, um ein gezieltes Wirkstoffabgabeverhalten und somit die therapeutische Wirkung bei Patienten zu erzielen. Dies gilt besonders für Arzneiformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung, die gewöhnlich hohe Dosen von Arzneistoffen enthalten. Die Wirkstoffabgabe und somit die Anflutung in die systemische Zirkulation werden bei solchen Präparaten von der Arzneiform determiniert. Deswegen erscheint die zuverlässige Funktion der Arzneiform von essentieller Bedeutung für die Sicherheit und Optimierung der Therapie. Die Untersuchung des Wirkstoffabgabeverhaltens einer Zubereitung wird vor Anwendung am Menschen laut Arzneibüchern in so genannten Freisetzungstests überprüft. Basierend auf den physiologischen Erkenntnissen wurde versucht die Freisetzungstests an die physiologischen Verhältnisse stärker anzupassen. In zahlreichen Studien wurde der Einfluss der Freisetzungsmedien auf das Freisetzungsverhalten der Arzneiformen erforscht. Diese Adaptation der Freisetzungsuntersuchung an die physiologischen Verhältnisse wurde bereits im Arzneibuch in Form von „biorelevanten Freisetzungsmedien“ berücksichtigt. Die Relevanz des Einflusses der Hydrodynamik und der Mechanik des Magen-Darm-Traktes auf das Freisetzungsverhalten der Arzneiformen ist zwar akzeptiert aber unzureichend untersucht. Zum Anfang dieser Arbeit wurde eine Hypothese formuliert die besagt, dass vor allem die mechanischen Aspekte der Magen-Darm Passage, aber auch der unterbrochene Medienkontakt das Freisetzungsverhalten fester peroralen Arzneiformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung beeinflussen können. Die Stressfaktoren konnten in den bisher entworfenen Testverfahren und Arzneibuchmethoden nicht auf biorelevante Weise simuliert werden. Deswegen wurde in dieser Arbeit ein Freisetzungstestgerät entwickelt, das vermag, die mechanischen Aspekte der GI-Passage monolithischer Arzneiformen realistisch nachzubilden. Die Konstruktion ermöglicht eine parallele Simulation von GI-spezifischen Druckverhältnissen, Diskontinuität und Intensität der physiologischen Transportvorgänge und des unterbrochenen Kontaktes der Arzneiformen zu den Freisetzungsmedien. Das Gerät ist geeignet, vor allem die monolithischen Arzneiformen wie zum Beispiel Tabletten oder Kapseln mit modifizierter Wirkstofffreisetzung zu testen. Im Laufe der Arbeit wurden entsprechende Testprogramme etabliert, die die kritischen Momente der GI-Passage von Arzneiformen simulieren. Die Programme sind Kombinationen aus Ruhephasen, die durch kurze Stressereignisse unterbrochen werden. Die zeitliche Abfolge der Stressphasen wurde so programmiert, dass die physiologischen Passagezeiten der Arzneiformen realistisch imitiert werden. Die Intensität der Stressereignisse wurde dabei so definiert, dass die Maxima der physiologisch relevanten Belastungswerte nachgebildet werden können. Gezeigt wurde, dass die Simulation des biorelevanten Stresses der Magen-Darm-Passage sowohl in Form von Transportvorgängen als auch variablen Druckverhältnissen die Freisetzungscharakteristika der getesteten Retardarzneiformen bedeutend beeinflusste. Die Ergebnisse belegen, dass die mechanische Beständigkeit der hydrophilen Matrixtabletten von entscheidender Bedeutung für deren Freisetzungsverhalten in vitro und in vivo ist. Ferner wurde gezeigt, dass durch Simulation nüchterner Passagebedingungen das In vivo-Freisetzungsverhalten einer Modellarzneiform nachgebildet werden kann. Die Testergebnisse weisen darauf hin, dass die starken Fluktuationen der Plasmaspiegel durch die Anfälligkeit der Arzneiform auf den biorelevanten Stress hervorgerufen werden. Diese Anfälligkeit scheint eine der wichtigsten Ursachen für arzneiformbedingte Interaktionen darzustellen, besonders für dose dumping in vivo, und kann unter Anwendung der offiziellen Methoden nicht erfasst werden. Gezeigt wurde, dass durch den Einsatz des biorelevanten Freisetzungs-Testgerätes die risikobehafteten Formulierungen mit unerwünschter Wirkstoffsfreisetzungscharakteristik in einem einfachen Testverfahren identifiziert werden können. Nachgewiesen wurde, dass die Veränderungen der Freisetzungscharakteristika der Arzneiformen, die durch die Stressereignisse biorelevanter Intensität ausgelöst werden, eine klinische Relevanz aufweisen. Nunmehr wurde die Einsetzbarkeit des Gerätes in den Screeninganalysen von bioäquivalenten Produkten bestätigt.
In the search for bioactive compounds, 32 fungal strains were isolated from Indonesian marine habitats. Ethyl acetate extracts of their culture broth were tested for cytotoxic activity against a urinary bladder carcinoma cell line and for antifungal and antibacterial activities against fish and human pathogenic bacteria as well as against plant and human pathogenic fungi. Bioassay-guided fractionation led to the isolation of bioactive compounds. Altogether 14 compounds were isolated and further elucidated. The compounds were obtained from the ethyl acetate and dichloromethane extracts of six fungal strains. They included 9 polyketides, 2 terpenes, 1 alkaloid and 2 till now undefined structures.
Transition metal complexes play a crucial role in antitumor therapy. Complexes of platinum, ruthenium as well as lanthanum and gallium have been investigated in preclinical as well as in clinical studies. The best known platinum(II) agents approved worldwide, cisplatin or carboplatin, are used in nearly 50% of all cancer therapies. This work focused on the development of new metal-based drugs that could act against human cancer cells. It was motivated in part by previous work with Cu(II) complexes, reporting new coordination compounds of SOD mimicking and cytotoxic activities. On the basis of this work we chose several commercially available heterocyclic ligands to synthesize new metal ion complexes in search of their interesting biological activity. New as well as previously reported Cu(II), Co(II), Pt(II) and Zn(II) complexes were synthesized using various ligands (1-6). Almost all chelating 2:1 ligand-metal complexes were obtained generally in water at room temperature in the reaction of metal(II) chloride with corresponding aromatic nitrogen ligands bearing an O-carboxylate group ligand. The synthesized chelating complexes were characterized by the use of spectroscopic methods, elemental analyses and HPLC chromatography and some by X-ray crystallography. Such coordination compounds are easily formed by transition metals with free orbitals d that can accept the donor electron pairs. The coordination is through the heterocyclic nitrogen and carboxylate oxygen donor atoms, which was shown by analysis of the characteristic functional groups in the IR spectra. The d-d transitions and absorption of visible light in Cu(II) and Co(II) complexes make them highly colored, blue, green or green-blue, respectively. The configuration of the coordination center was established in some cases by X-ray crystallography. Most of the already published structures possess the trans configuration. This led to the assumption that other uncrystallized complexes were also trans configured. However, X-ray data of the Cu(II) complex of 5 showed quite unexpectedly the cis configuration. On the other hand, the LC/MS experiments with the Pt(II) complex of 5 indicated that this complex exists in two isomeric forms, i.e., cis and trans at the Pt(II) center. Through the use of density functional calculations we optimized the structures and calculated the energies and dipole moments. The differences in energy for all complexes were about 6 to 15-fold lower when compared to cis and transplatin. The DFT calculations confirmed that the trans-isomers are more stable than their cis-isomers. UV-Vis stability studies with most of the synthesized complexes as well as some other Cu(II) complexes were performed to study the spectral changes over 24 h in addition of glutathione, a tripeptide present in the cancer cells and ascorbate that were added to the incubations. The results indicated time-dependent changes and instability of the complexes in the cells and their possible decomposition to lose the ligand and release the metal ion. In the case of Cu(II) complexes, reduction of Cu(II) to Cu(I) may take place. New species such as GSSG could arise and the complexes may decarboxylate, but these structures were not elucidated. The synthesized coordination metal(II) complexes were tested for their potential antiproliferative activities by using the crystal violet staining method in a panel of human cancer cell lines. Out of all complexes, three Pt(II) complexes of 2, 5 and 6 showed satisfactory activity and for these complexes the IC50 values were additionally determined in new RT-4, DAN-G and MCF-7 cancer cell lines. Interestingly, the active complexes were the chelating trans complexes which is quite unexpected, based on the difference in activities between cis and transplatin. All of the complexes were tested for their potential antimicrobial activities in comparison to the standard antibiotics on such bacterial strains as Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and yeast Candida maltosa. Co(II) complexes have been especially known to act against bacterial strains. The activity of the Co(II) complexes was indeed the highest of all metal(II) complexes. The ligand 2 (a nicotinic acid isomer) was also found active. This fact could explain why some antibacterial activity was found in the MIC assay. In addition to the complexes synthesized in this work, several novel heterocyclic metal(II) complexes of copper, ruthenium, platinum, gallium, osmium and lanthanum from other research groups were screened for their antiproliferative activity, some of which exhibited very potent activity in the cancer cell lines. In conclusion, Pt(II) complexes with bis-chelating heterocyclic carboxylate ligands represent a particularly interesting new class of compounds from the view point of their structural and biological properties.
In dieser Arbeit wurden systematisch mehrdimensionale chromatographische Systeme unter Verwendung von Alkyl-, Calixaren- und Resorcinarenphasen untersucht. Deren Analyse bildet einen grundlegenden Schritt on-line gekoppelte Trennungen in der HPLC schneller und effektiver planen und optimieren zu können. Neue Ergebnisse über den Einfluss der Säulenschaltsysteme auf die Retention der Analyten wurden dargestellt. Sowohl Erkenntnisse über die Retentionsmechanismen während der Schaltung als auch mathematische Modelle zur Beschreibung der Retention auf der sekundären stationären Phase wurden ermittelt. Um eine umfassende Betrachtung zu gewährleisten, wurden 43 Analyten verschiedener Struktur (unpolare, polare, ionische Analyten chemischer Leitstruktur sowie pharmazeutisch genutzte Stoffe) verwendet. Mit diesen Analyten erfolgten zunächst eindimensionale Analysen, um anschließend den exakten Einfluss der Säulenschaltungen zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden unter Berücksichtigung bestehender Retentionsmodelle interpretiert. Dabei zeigten sich Unterschiede zwischen konventionellen alkylgebundenen und neuartigen calixarengebundenen stationären Phasen. Erweiterungen und Präzisierungen der bestehenden Modelle wurden vorgeschlagen. Diese vertiefen das Verständnis der Retentionsmechanismen in der RPLC.
In Anbetracht der zunehmenden UV-Intensität und des Wissens um die Spätfolgen jedes einzelnen Sonnenbrandes besteht ein großes Interesse an UV-protektiven Wirkstoffen. Daher war es Ziel dieser Arbeit, neue Wirkstofflieferanten aus der Natur für diese Anwendung zu identifizieren. Ein breites Spektrum von verschiedenen Organismen wurde auf ihre protektiven oder regenerativen Effekte auf UVB-behandelte Keratinozyten hin gescreent und anschließend vielversprechende Naturstoffe ausgewählt und genauer untersucht. Zusätzlich war die Auffindung von vitalitätssteigernden sowie zytotoxisch wirkenden Extrakten und Reinstoffen von Interesse. Dazu wurden zunächst in vitro Testmodelle auf Basis der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT etabliert und die Wirkung von UVB-Strahlung auf diese Zellen charakterisiert. Genutzt wurden der MTT-Assay zur Bestimmung der Vitalität und Proliferation, der Neutralrot-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran und Proliferation und der Lactatdehydrogenase-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran. Mittels Durchflusszytometer wurden Zellzyklusanalysen durchgeführt, sowie zur Erfassung von DNA-Schäden die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay), außerdem wurde mit Hilfe des Interleukin-6-Assays die zelluläre Zytokinproduktion gemessen. Nach Bestrahlung der HaCaT-Zellen mit UVB ergaben sich zeit- und dosisabhängig folgende wesentliche Effekte: Ein leichter G2/M-Arrest bei geringeren UVB-Dosen (10mJ/cm2-30mJ/cm2), ein G0/G1-Arrest bei höheren UVB-Dosen (50mJ/cm2 und 100mJ/cm2), die dosisabhängige Zunahme des subG1-Peaks (Apoptoseinduktion), die Zunahme der LDH-Freisetzung mit steigender UVB-Dosis, die Stimulation der IL-6-Produktion mit steigender UVB-Dosis, sowie eine dosisabhängige Schädigung der DNA sowohl sofort nach UVB-Bestrahlung als auch nach 24 stündiger Inkubation. Nach Testung verschiedener UVB-Dosen und unterschiedlicher Inkubationszeiten wurde zur Untersuchung der Naturstoffe mit einer Dosis von 20mJ/cm2 UVB und einer Inkubationszeit von 24 Stunden gearbeitet. Die Testung auf UV-protektive Wirkungen der Extrakte gegenüber DNA-Schäden anhand des Comet Assays erfolgte direkt nach UVB-Bestrahlung. In dieser Arbeit wurden insgesamt 100 verschiedene Extrakte und 12 Reinsubstanzen allein oder in Kombination mit UVB-Strahlung untersucht. Die getesteten Naturstoffe stammten von Algen, Cyanobakterien, terrestrischen und marinen Pilzen, sowie von Pflanzen. Im Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse aufgelistet: Eine vitalitätssteigernde Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 33 Extrakte und Reinsubstanzen. Durch die Inkubation mit 12 Naturstoffen konnte ein Serummangel-induzierter G0/G1-Zellzyklusphasenarrest bei den HaCaT-Zellen verhindert oder überwunden werden. Ein durch UVB-Strahlung induzierter G2/M-Zellzyklusarrest konnte durch Inkubation der Zellen mit 9 Naturstoffen verhindert oder überwunden werden. 11 Naturstoffe führten zu einer verminderten Lactatdehydrogenase-Freisetzung UVB-bestrahlter Zellen. 5 Naturstoffe hemmten die UVB-induzierte IL-6-Produktion der Zellen. 15 Naturstoffe führten auf unterschiedlichen Wegen zu einer Verminderung UVB-bedingter DNA-Schäden an HaCaT-Zellen. Eine zytotoxische Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 58 Extrakte und Reinsubstanzen Anhand der Ergebnisse sind die drei terrestrischen Pilze Inonotus nodulosus, Piptoporus betulinus und Tricholoma equestre, sowie die beiden Pflanzen Annona muricata und Harpephyllum caffrum aussichtsreiche Kandidaten für eine zukünftige Anwendung als Hautschutz- oder Hautpflegemittel. Des Weiteren haben auch die Extrakte von Nannochloropsis spec., Ganoderma lucidum, Ganoderma pfeifferi, Hydnotrya michaelis, Tricholoma populinum und Tamarix aphylla auffällige Ergebnisse geliefert und verdienen weiteres Interesse. Die Ergebnisse zeigen die Eignung der etablierten Testmodelle zur Auffindung von Wirkstoffen mit UV-protektiven und weiteren Effekten auf Hautzellen. Gleichzeitig wird auch das große Potential von Organismen verschiedener Gruppen zur Bildung von Naturstoffen mit derartigen Eigenschaften deutlich.
Lungenkrebs ist mit rund 40.000 Todesfällen pro Jahr die häufigste Krebstodesursache in Deutschland. Daher ist es nötig neue Behandlungsmethoden zu entwickeln, die gezielt am Tumor angreifen und möglichst geringe Nebenwirkungsraten aufweisen. Dazu eignet sich möglicherweise das inhalative magnetische Drug Targeting, bei dem superparamagnetische Aerosoltröpfchen als Drug Carrier dienen, welche nach der Inhalation mittels eines extern angelegten Gradientenfeldes gezielt am Wirkungsort angereichert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob es möglich ist superparamagnetische Aerosole mit Hilfe von Magnetfeldgradienten von ihrer Flugbahn abzulenken, um sie an einer definierten Abscheidefläche vor dem Magneten abzuscheiden. Dabei wurden einige Parameter, wie die Kerngröße der magnetischen Nanopartikel, der Tröpfchendurchmesser, die Gradientenfeldstärke, die Ferrofluidkonzentration und die Strömungsgeschwindigkeit der Luft variiert, um deren Einfluss auf die Abscheidung zu beobachten. Die Grundlage dieses magnetischen Aerosols bildet ein Ferrofluid, welches mittels Ammoniak aus Eisen(II)- und Eisen(III)-chlorid-Lösung gefällte Magnetit-Nanopartikel enthält, die durch eine Citrathülle vor Agglomeration und Sedimentation geschützt werden. Nach dem Vernebeln mit zwei Geräten, die auf unterschiedlichen Verneblungsprinzipien beruhen, sind die magnetischen Nanopartikel im Aerosoltröpfchen eingeschlossen. Die mittels Laserdiffraktometrie bestimmten mittleren Massendurchmesser betragen dabei zwischen 2,5 µm mit dem Pari Boy und 5 µm mit dem eFlow. Diese sollten durch Zusatz von Substanzen, die die Oberflächenspannung senken (Cremophor RH 40 und Ethanol), die Viskosität erhöhen (Glycerol, Cremophor RH 40 und Ethanol) oder den Dampfdruck erhöhen (Ethanol) gesenkt werden. Deutliche Effekte zeigen sich insbesondere bei Zugabe von 20 % Cremophor RH 40 und 40 % Ethanol zum Ferrofluid. Dadurch konnten die Durchmesser auf jeweils 2 µm beim Pari Boy und circa 3,4 und 3,9 µm beim eFlow reduziert werden. Die prozentuale Abscheidung des Ferrofluids wurde in verschiedenen Magnetfeldgeometrien unterschiedlicher Gradientenfeldstärke untersucht. Die Variation der Tröpfchengröße des superparamagnetischen Aerosols führt zu unterschiedlichen Ausmaßen der Ferrofluidabscheidung. Tatsächlich ist die Abscheidung des Ferrofluides nach dem Vernebeln mit dem eFlow, dessen Tröpfchendurchmesser etwa doppelt so groß wie der des Pari Boy ist, wesentlich höher. Während mit dem Pari Boy vom 1 molaren Ferrofluid im Gradientenfeld zweier gleichpoliger Stabmagnete (r x l = 15 x 25 mm) mit einer Remanenz von 1450 mT nur circa 30 % des Aerosols impaktiert werden kann, sind es mit dem eFlow unter gleichen Versuchsbedingungen etwa 80 %. Das liegt einerseits an der größeren Magnetitmasse im Tröpfchen und andererseits an der geringeren Aerosolgeschwindigkeit. Je stärker das verwendete Gradientenfeld war, desto mehr Ferrofluid konnte impaktiert werden. Desweiteren wurde die Abscheidung verschieden konzentrierter Ferrofluide (0,5; 1, 2 und 6 M) untersucht. Diese war umso größer, je konzentrierter das Ferrofluid war. Unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten konnten durch Verwendung einer Vakuumpumpe untersucht werden. Es wurden zwei sehr kleine Strömungsgeschwindigkeiten (0,03 und 0,1 m/s) eingestellt, um möglichst nahe an die realen Strömungsgeschwindigkeiten in den terminalen Bronchien zu kommen. Dabei zeigte sich, dass die prozentuale Ferrofluidabscheidung bei langsamen Strömungsgeschwindigkeiten besonders hoch ist. Allerdings weisen die in dieser Arbeit verwendeten Magnete in größerer Entfernung nur noch sehr schwache Gradienten auf und sind daher für eine Anwendung an der menschlichen Lunge nicht geeignet. Die Einführung eines Modellimplantats in die Versuchsröhre sollte die Abscheidung des Ferrofluides erhöhen. Die erzielte Erhöhung der Ferrofluidabscheidung ist allerdings unbefriedigend. Die Simulation mit Mathematica® hat ergeben, dass die experimentelle Ferrofluidabscheidung geringer ist als die theoretische Abscheidung. Beim Pari Boy und 0,1 m/s unterscheiden sie sich um maximal 10 %. Beim eFlow beträgt die Differenz bis zu 8 %. Die Abweichungen zur Simulation werden durch Sedimentation des Ferrofluides verursacht. Diese ist stärker ausgeprägt als in der Berechnung, da sich die Luft beim Vernebeln durch Verdunsten von Wasser und Ausdehnung der Luft aufgrund des Joule-Thomson-Effektes abkühlt. Die kalte Luft bewegt sich nach unten und reißt das Ferrofluid mit herab. Es konnte gezeigt werden, dass sich superparamagnetische Aerosole mit Hilfe von magnetischen Gradientenfeldern gezielt in definierten Bereichen abscheiden lassen. Das Ausmaß der Abscheidung lässt sich durch Erhöhung des Gradienten und des magnetischen Momentes steigern. Mit größeren Permanentmagneten oder starken Elektromagneten ist auch ein pulmonales Drug Targeting an der humanen Lunge denkbar.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein auf dem Promotor Pdes basierendes Kälte-induzierbares Expressionssystem für B. subtilis konstruiert und sukzessive optimiert. Dazu wurden verschiedene Kälte-regulatorische DNA-Sequenzen aus B. subtilis an das entsprechende Zielgen fusioniert, was neben der Kälte-Induzierbarkeit in einem positiven Einfluss auf die Expressionsstärke durch eine effizientere Translation bzw. Stabilisierung der mRNA resultierte. Vorausgehend wurde in vergleichenden Versuchen die Eignung unterschiedlicher Galaktosidasen zur Verwendung als Reporterenzyme für B. subtilis untersucht. Hierbei wurde erstmals die heterologe Expression einer Kälte-angepassten β-Galaktosidase aus P. haloplanktis TAE79 in B. subtilis durchgeführt und diese durch die Integration der DB-Sequenz sowie einer stem-loop-Struktur aus der 5‘-UTR des B. subtilis cspB-Gens gesteigert. Somit konnte nachgewiesen werden dass sowohl die additiven Sequenzen der cspB-DB und der cspB-sl-UTR als auch des bkdB-Terminators zu einer deutlich erhöhten Synthese der entsprechenden Zielproteine führt. Anhand der Überexpression einer Xylanase aus B. subtilis sowie einer α-Glucosidase aus S. cerevisiae wurde abschließend die Eignung des konstruierten Systems für die sekretorische und intrazelluläre Proteinsynthese in B. subtilis demonstriert. Diese Ergebnisse bestätigen die Eignung von B. subtilis als Wirtsorganismus auch für die Überproduktion kritischer, schwer zu faltender Proteine.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Herstellungsverfahren der wässrig-fermentativen Frischpflanzenextraktion nach HAB, Vs. 33 und 34 sowie die dabei ablaufenden biochemischen und mikrobiologischen Reaktionen zu betrachten. Neben der Extraktion findet begleitend eine Fermentation statt und die daraus entstehende Urtinktur wird bis zur Weiterverarbeitung mindestens 6 Monate gelagert. Diese drei Prozessschritte -Extraktion, Fermentation, Lagerung- können Einfluss auf die Qualität der Urtinktur nehmen. Es sollte daher geklärt werden, welche bio- und phytochemischen Reaktionen bei der Herstellung und anschließenden Lagerung einer wässrig-fermentierten Urtinktur ablaufen und welche Mikroorganismen daran maßgeblich beteiligt sind.
In diesem Zusammenhang wurden Extrakte aus Atropa belladonna, blühendes Kraut hergestellt und durch Variation bestimmter Herstellungsparameter die Robustheit des Verfahrens überprüft.
Folgende Parameter wurden variiert:
Rezepturbestandteile:
· Honig und Lactose-Monohydrat
· Molke
· Starterkultur
· Asche
Herstellungsschritte:
· Erntezeitpunkt
· Waschen der Pflanze
· Mazerationstemperatur
· Zeitpunkt des Abpressens
· Sauerstoffzutritt
· Dauer der Reifezeit
Weiterhin erfolgte ein Vergleich zwischen diesem Extraktionsverfahren mit der verbreiteten ethanolischen Frischpflanzenextraktion. In den Jahren 2006-2009 wurden insgesamt 106 wässrig-fermentierte Urtinkturen und 4 ethanolische Auszüge hergestellt.
Da im Verlauf der Lagerung in einigen wässrig-fermentierten Urtinkturen Abnahmen des Atropingehaltes beobachtet wurden, wurde zur Klärung das Verhalten von Milchsäurebakterien in atropinhaltigen Lösungen untersucht.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass an der Fermentation in erster Linie Milchsäurebakterien beteiligt sind, die durch Zuckerabbau Milchsäure, daneben auch Acetat und Ethanol, bilden. Als verantwortliche Milchsäurebakterien konnten vor allem der homofermentative Lactobacillus plantarum und der heterofermentative Lactobacillus brevis isoliert und identifiziert werden. Hierbei war in der Hauptfermentationsphase eine Dominanz von Lactobacillus plantarum erkennbar. Die Kultivierung von Milchsäurebakterien in atropinhaltigen Lösungen zeigte, dass das Wachstums- und Fermentationsverhalten der gewünschten Milchsäurebakterien durch Atropin nicht negativ beeinflusst wird.
Bei dem betrachteten Herstellungsverfahren kann ein Verlust des Wirkstoffs Atropin unter Einhaltung einer ausreichenden Säuerung ausgeschlossen werden. Damit ist die wässrig-fermentative Urtinkturherstellung hinsichtlich der Atropinextraktion unter Einhaltung bestimmter Herstellungsregeln als ebenso effektiv und robust anzusehen wie die ethanolische Frischpflanzenextraktion. Unterschiedliche Gehalte zwischen ethanolischen und wässrig-fermentierten Extrakten ließen sich bei Scopoletin, Flavonoiden und einer im Rahmen der Arbeit nachgewiesenen Substanz X feststellen.
Das untersuchte Herstellungsverfahren führte in den meisten Fällen zu einem stabilen Extrakt, wobei sich Mikroflora und Fermentationsverläufe trotz Variation der Herstellungsparameter ähnelten. Auf Grund der Variabilität der mikrobiologischen Flora des Pflanzenmaterials unterliegt die Fermentation unter den Bedingungen des Homöopathischen Arzneibuchs allerdings natürlichen Schwankungen. Dies führte in einigen Fällen zu einer nicht spezifikationskonformen Urtinktur. Deswegen wurden für eine optimierte Herstellung die Zugabe einer Starterkultur, der Zusatz von Molke, eine durchgängige Mazeration bei 37 °C, eine flexible Anpassung des Kohlenhydratbedarfs, Sauerstoffausschluss während der Mazerationswoche, eine kürzere, für den Fermentationsverlauf individuelle Lagerungszeit und die Berücksichtigung des Wassergehaltes des Pflanzenmaterials empfohlen. Da die Ergebnisse der Arbeit mit den Untersuchungen anderer pflanzlicher Materialien Sauerkraut, Sauerteig, Silage) in Einklang stehen, ist davon auszugehen, dass diese Empfehlungen auch bei anderen Pflanzen die Herstellsicherheit erhöhen und zu einer reproduzierbaren Extraktqualität führen.
Abschnitt I: Die Klasse II-Adenylylcyclasen (AC) stellen eine Gruppe von löslichen Toxinen dar, welche die Pathogenität einer ganzen Reihe von Krankheitserregern vermitteln, darunter Bacillus anthracis (Milzbrand), Bordetella pertussis (Keuchhusten) und Pseudomonas aeroginosa (u. a. Pneumonien). Im Rahmen des ersten Abschnittes dieser Arbeit wurde der aus B. anthracis stammende, sogenannte "Ödemfaktor" als Modellenzym ausgewählt, um die biologische Aktivität eines experimentellen Nucleotidanalogons gegenüber Adenylylcyclasen zu testen. Die gestellten Anforderungen an diese Verbindung, sowie die entsprechenden Lösungsansätze waren: 1) Einführung einer sterisch anspruchslosen, fluoreszierenden Reporterfunktion für in vitro-Bindungsstudien (N-Methylanthranylsäure), 2) Verhinderung von Acylübertragungsreaktionen des Fluorophors (Amid- statt Esterbindung) und 3) Erhöhung der Hydrolysestabilität des Triphosphatrestes (bioisosterer Austausch der terminalen Phosphoranhydridbindung). Die Synthese des Nucleotides ging von 2'-Amino-2'-Desoxyadenosin aus und wurde in zwei Schritten vollzogen. Zunächst wurde mit Hilfe eines Festphasenreagenz-unterstützten Protokolls N-Methylanthranilsäure amidartig an die 2'-Position geknüpft. Anschließend wurde dann in einem Ein-Topf-Verfahren an die 5'-Position eine triphosphatanaloge Seitenkette angebracht, in der die beta- und gamma-Phosphoratome statt über eine Dichlormethylenbrücke verbunden waren. Der Ki-Wert der so erhaltenen Verbindung (2'-MANT-2'-dAppCCl2p) gegenüber der isolierten AC-Domäne des B. anthracis-Ödemfaktors wurde in einem alpha[32P]-ATP-basierten kinetischen Assay mit 8,8 mM ermittelt. Diese Untersuchungen wurden durch einen FRET-basierten Bindungsassay ergänzt. Obwohl die Aktivität der Zielverbindung damit um ein bis zwei Größenordnungen niedriger war, als die von unmittelbar verwandten Substanzen, konnten nichtsdestotrotz die gestellten strukturellen Anforderungen an ein molekulares Werkzeug realisiert werden. Abschnitt II: Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies, wie z. B. von Wasserstoffperoxid, ist ein unvermeidbarer Vorgang in allen anaerob lebenden Organismen. Daher entstanden im Laufe der Evolution eine ganze Reihe von biologischen Mechanismen, welche diese i. d. R. toxischen Verbindungen effektiv zu beseitigen vermögen. Ein Vertreter ist das selenhaltige Enzym Glutathionperoxidase (GPx), welches Wasserstoffperoxid und andere organische Hydroperoxide zu Wasser bzw. den korrespondierenden Alkoholen unter Verbrauch von Glutathion abbaut. Darüber hinaus wird aber auch zunehmend die Rolle von Wasserstoffperoxid als einem proapoptotischen Signalstoff diskutiert, was GPx zu einem interessanten pharmakologischen Ziel werden lässt. Durch Überexpression von GPx könnte die Apoptoseneigung eines Tumors gesenkt und somit dessen Vitalität erhöht werden, was sich unter anderem in einer gesteigerten Resistenz gegenüber bestimmten Zytostatika äußern kann. Auf dieser Arbeitshypothese aufbauend wurde die Synthese eines reversiblen GPx-Inhibitors angestrebt. Als Leitstruktur diente N'-(4-Hydroxybenzyliden)-2-(2-Methylimidazol-1-yl)essigsäurehydrazid, welches in einer Vorarbeit in einem in silico-Screening aufgedeckt worden war. In einem kombinatorischen Ansatz wurde sowohl die Arylessigsäure-Untereinheit (5 Varianten), als auch die Benzyliden-Komponente (7 Varianten) abgewandelt. Zur Darstellung der so projektierten Substanzbibliothek mussten zunächst die benötigten Arylessigsäurehydrazide synthetisiert werden. Diese wurden anschließend unter Einsatz eines Mikrowellen-gestützten Syntheseprotokolls mit den entsprechenden Benzaldehyden kombiniert. Von allen theoretisch möglichen Kombinationen konnten 30 Acylhydrazone in ausreichender Menge und Reinheit synthetisiert werden. Aufgrund technischer Probleme bei der Durchführung des Mikrotiterplatten-basierten GPx-Assays lagen zum Abschluss dieser Arbeit noch keine biologischen Daten vor.
Das Pankreaskarzinom hat mit einer durchschnittlichen Lebenserwartung von vier bis sechs Monaten nach der Diagnosestellung und einer 5-Jahres-Überlebensrate von lediglich 6 % eine extrem schlechte Prognose. Neben Umweltfaktoren beeinflussen verschiedene Mutationen (p53, Kras), die die Entstehung und Progression eines Pankreaskarzinoms. Aufgrund der geringen chirurgischen Möglichkeiten konzentriert sich die Behandlung auf chemotherapeutische, radiotherapeutische und alternative Maßnahmen. Einen großen Schwerpunkt in der Karzinombehandlung bildet dabei das Signalnetzwerk der EGF-Rezeptoren, die zelluläre Prozesse, wie Wachstum, Differenzierung, Zellmotilität und das Überleben der Zelle regulieren. Viele Therapeutika gegen das EGFR Signalnetzwerk befinden sich zurzeit in der klinischen Testphase, zeigten jedoch bisher nur marginale Überlebensvorteile für die behandelten Patienten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den therapeutischen Nutzen einer Anti-EGFR-Therapie bei der Tumorbehandlung näher zu bestimmen. In Zellkulturanalysen konnte nachgewiesen werden, dass auch bei Vorliegen einer Kras-Mutation die Signaltransduktion der EGF-Rezeptoren durch externe Wachstumsfaktoren zusätzlich aktiviert wird und einen Einfluss auf die Zellproliferation und Migration haben kann. In beiden Tiermodellen (p48+/cre; LSL-KrasG12D / p48+/cre; LSL-Trp53R172H/+; LSL-KrasG12D) kommt es zu endogenen pankreasspezifischen Veränderungen, die durch die Kras-Mutation hervorgerufen und durch die zusätzliche p53-Mutation verstärkt wurden. Die Analyse der Histologien zeigte eine Zunahme der Expressionsraten einzelner Rezeptoren und Liganden vom prämalignen Stadium zum Tumorgewebe. Die Expression der Rezeptoren korrelierte mit den Dysplasiegraden der Zellen in den duktalen Läsionen. Dabei wurden die Rezeptoren HER-1 und HER-2 nur zu Beginn der Tumorentstehung exprimiert, die Rezeptoren HER-3 und HER-4 überwiegend im späteren Verlauf der. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass einige der Läsionen durch Transdifferenzierung auch aus Inselzellen entstanden sind. Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen die Individualität einzelner Tumore die aus einem Gewebe entstehen und verdeutlichen die Notwendigkeit einer Protein-Expressionsanalyse vor Beginn einer Antitumorbehandlung. Dadurch können Therapeutika gegen das EGFR-System spezifischer eingesetzt, ihre Effizienzen erhöht, Nebenwirkungen reduziert werden und unnötige bzw. wirkungslose Therapien vermieden werden.
Acute pancreatitis is a common clinical inflammatory disease with variable severity from mild, self-limiting attacks to a severe lethal attack with a high mortality. In most of the cases, acute pancreatitis is either caused by gallstone obstruction or excessive alcohol consumption. Clinical symptoms include elevated levels (minimum 3 times than normal) of pancreatic enzymes such as amylase or lipase in serum. It is generally believed that earliest event in acute pancreatitis occur in acinar cells which includes premature protease activation and cytoplasmic vacuole formation. Premature trypsinogen activation has been considered as chief culprit as it can activate other proteases in a cascade like manner in acinar cells. Trypsin activity takes place in a biphasic curve with elevated levels at 1 h and 8 h in the initial stages up to 24 h in caerulein induced pancreatitis in mice. It has been shown that cytoplasmic vacuoles observed in pancreatitis are of autophagic nature. The role of autophagy for the disease onset and its role in trypsinogen is much of a debate. Hence, we studied the relation between autophagosome formation and trypsinogen activation in first 12h of pancreatitis. Although autophagosomes were found to be co-localised with trypsin in vivo, this was found to be a late event occuring only by 4 h. Substrate specific trypsin activity and western blotting from both sub-cellular fractions over the time course of pancreatitis and multiple fractions prepared from 1 h caerulein induced pancreatic tissue revealed that trypsin activity observed at 1 h occured in a zymogen enriched fraction. In line simultaneous confocal imaging of trypsin activity and autophagosome formation in hyperstimulated acini isolated from GFP-LC3 mice showed that both processes are independent and take place in parallel. Furthermore, protease inhibition by gabexate mesilate did not prevent autophagosome formation indicating that trypsinogen activation is not a prerequisite for vacuole formation. Even though, autophagosomes and active trypsin were found to be co-localised around 30 minutes to some degree upon cholecystokinin hyperstimulation, the earliest trypsin activation started to appear by 15 minutes and was independent of autophagosomes. The earliest active trypsin was found to be co-localised along with the cis-Golgi complex suggesting that the Golgi apparatus and its pre-condensed zymogen granules are the compartment responsible for the trypsinogen activation. 2) Protease activation in pancreatic acinar cells considered as the early hallmark event in the acute pancreatitis. However, the disease is aggravated by the infiltration of the leukocytes. Activated proteases mediate acinar cell injury and hereby cause the release of chemokines, which in turn attract inflammatory cells. Transmigrated inflammatory cells cause systemic damage that deteriorates the condition of the disease. Neutrophil elastase has been reported to be involved in the dissociation of cell-cell contact at adherens junctions by the extracellular cleavage of E-cadherin. This subsequently leads to transmigration of leukocytes into the epithelial tissue during the initial phase of experimental pancreatitis and aggravates the disease condition. On the other hand, pancreatic elastase substantially contributes to acinar cell necrosis. In this study, ZD0892, an orally bioavailable dual inhibitor against both elastases was tested for its efficacy to ameliorate severity in acute pancreatitis. ZD0892 orally fed mice showed increased survival compared to the control group in the taurocholate model of severe pancreatitis. In the initial stages of pancreatitis up to 24 h, the severity markers were found to be significantly lower in the inhibitor treated group. Treatment of mice with ZD0892 did not impede the defensive property of the leukocytes such as phagocytosis or oxidative burst. In caerulein induced pancreatitis, a mild form of acute pancreatitis, in rats, the local damage measured as serum amylase and lipase, wet dry ratio, and pancreatic myeloperoxidase levels were significantly lower in the inhibitor group. Systemic inflammatory parameters such as myeloperoxidase activity in lung was found to be significantly lower in the inhibitor fed rats. Inhibitor feeding resulted in lesser elastolytic activity compared to control group indicating that extracellular matrix was less damaged. Prophylactic treatment of pancreatitis with an orally available inhibitor with a dual specificity against pancreatic elastase and PMN-elastase was shown to ameliorate both local and systemic damage. Hence, in overall, ZD0892 treatment is proved to be beneficial to the mice and rats in experimental pancreatitis and should be considered for treatment in humans as the substance has been already studied in phase I and II trails for other indications.
The biological decontamination and sterilization is a crucial processing step in producing and reprocessing of medical devices. Since polymer-based materials are increasingly used for the production of medical devices, the application of conventional sterilization processes are restricted to a certain extent. Conventional sterilization techniques on the basis of high temperatures, toxic gases, or ionizing radiation can be detrimental to the functionality and performance of polymeric materials. For this reason, alternative, gentle, and efficient decontamination processes are required. One possible approach is the use of non-thermal physical plasmas. Especially atmospheric pressure plasma is receiving great interest due to the absence of vacuum systems which is highly attractive for the practical applicability. Its mechanisms of action enable the efficient killing and inactivation of micro-organisms which are attributed to the interaction of plasma-generated reactive oxygen and nitrogen species (ROS, RNS) as well as plasma-emitted (V)UV radiation. Owing to the moderate gas temperatures (near or at room temperature) so-called cold plasmas are well-suitable for the treatment of heat-sensitive materials, such as polymers, without affecting their bulk properties. The present work focuses on the investigation of atmospheric pressure plasma processes for the biological decontamination of polymers. The objective is to help elucidate on the one hand the impact of varied plasma process parameters on the inactivation of micro-organisms and on the other hand the influence of plasma on the surface properties of the substrate. The investigations were performed by means of a high-frequency driven plasma jet (from the product line kINPen) operated with argon and argon-oxygen mixtures. Three main aspects were analyzed: 1. The effect of plasma on the viability of micro-organisms dependent on working gas, treatment time, and the sample distance (distance between the jet nozzle and the substrate). 2. The plasma-based removal of microbial biofilms. 3. The effects of the plasma treatment on the surface properties of selected polymers. Additionally to the capability of the applied plasma jet in killing microbes the efficacy of this plasma jet for the removal of complex biological systems (e.g. biofilms) is shown. To model cell constituents of bacteria different synthetic polymers were chosen to gain insight into the decomposition process responsible for biofilm degradation. By investigating the impact of atmospheric pressure plasma on physico-chemical surface properties of various synthetic aliphatic and aromatic polymers the interaction mechanisms between plasma and plasma-exposed material are discussed. These studies are accompanied by applying different optical plasma diagnostic techniques (optical emission spectroscopy and two-photon absorption laser induced fluorescence spectroscopy) to obtain information on the plasma gas phase which contributes to the elucidation of the reaction mechanisms occurring during plasma exposure. Moreover, it is presented to which extent the plasma treatment influences the surface properties of polymers during the plasma-based bio-decontamination process and further, the benefits of surface-functionalized polymers for biomedical application is discussed.
In der Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung von trans-Platin(IV)-Diaziden beschrieben. Es wird gezeigt, dass sie durch die Verwendung von UV- und Weißlicht photoaktiviert werden können, wobei Photoreduktionen, Photosubstitutionen oder Photoisomerisierungen auftreten können. Ähnlich wie der bekannte Antitumorwirkstoff Cisplatin, sind die Verbindungen in der Lage irreversiblel an DNA zu binden. In Zellversuchen konnte zusätzlich eine antiproliferierende Aktivität festgestellt werden, wenn mit Licht bestrahlt wurde. Im Dunkeln zeigten die Verbindungen keine Wirkung. Durch Zellzyklusanalysen und der Beobachtung von morphologischen Veränderung nach der Behandlung mit Platin(IV)-Diaziden kann jedoch auf einen zu Cisplatin unterschiedlichen Wirkmechanismus geschlossen werden.
Die Pflanze Pittosporum angustifolium („GymbiGymbi“) wird von der indigenen Bevölkerung Australiens für verschiedene medizinische Indikationen verwendet. Anwendungsbeobachtungen und erste zellbiologische Untersuchungen geben Hinweise auf den potentiellen Nutzen dieser Pflanze für die Therapie maligner Neoplasien. Ziele dieser Arbeit: Erkenntnisse zu den zellbiologischen Interaktionen zwischen Pittosporum angustifolium und der Tumorzelllinie (U-5637). Material: vier alkoholische, ein wässriger und ein mit Amylase behandelter Extrakt, außerdem sieben isolierte Reinsubstanzen. Methoden: Neutralrottest, Durchflusszytometrie. Wichtige Ergebnisse: Neutralrottest: IC50-Werte zwischen 10 µg/ml (Hydrolysat des Aq.EtOH-Extraktes ) und 66 µg/ml (Amylase-Extrakt). Substanz 4 mit IC50 : 4 µg/ml, Substanz 6 mit IC501 µg/ml. Durchflusszytometrie: Keine Zellphasenarretierung durch die Extrakte. Als Wirkmechanismus zeigten sich sowohl Apoptose- als auch Nekroseinduktion sowohl durch die Extrakte als auch durch Substanz 4 [12 µg/ml] und Substanz 6 [1 µg/ml].
Bacteria are an integral part of modern biotechnology. They are used to make a variety of products, such as foods, drugs, as well as a multitude of chemicals. In order to increase their production rates molecular biotechnology offers many tuning points, starting from the selection of an applicable host, over its geno- and phenotypical characterization, followed by genetic manipulations for an optimized metabolism and stabilisation of production processes. This work comprises the optimization of Bacillus subtilis as an expression system. It describes the steps taken for selection and genomic characterization of the B. subtilis wild type strain ATCC 6051, the subsequent optimizations of the strain in respect to growth and productivity, as well as the characterization of its behaviour in a variety of cultivation conditions. The B. subtilis strain most commonly found in laboratories around the world is the first sequenced Gram-positive organism B. subtilis 168. Zeigler et al. showed that strain 168 is not a real wild type. Instead it was created through random mutagenesis with X-rays and selected for transformability. This strain has been used as the basis for popular B. subtilis strains in heterologous gene expression such as the extracellular protease deficient WB strains. Growth experiments showed the real wild type strain ATCC 6051 to be superior to its mutated ancestor 168, making it a solid basis for the construction of an optimized B. subtilis expression system. In order to gain a full understanding of the genomic and corresponding physiological differences between the two systems, B. subtilis ATCC 6051 was sequenced and compared to the genome of B. Subtilis 168. Several variations on geno- and phenotypic level could be revealed, that resulted in particular from genes involved in natural competency, the metabolism of amino acids and chemotaxis. This genomically well characterized B. subtilis ATCC 6051 was improved in respect to its application as an expression host. Improvements were achieved through the inactivation of both sporulation and reduction of autolysis, leading to a more robust behaviour during the overproduction and secretion of a reporter enzyme. A positive effect on the activity of an acetoin induced promoter by the addition of second copies for its transcription factors SigmaL and AcoR could be observed. Anaerobic zones and areas with excess glucose caused by insufficient mixing are common conditions in large scale bioprocesses and lead to oscillating conditions for the cells. In turn, this oscillation provokes an excretion of so called overflow metabolites, which can negatively affect the bacterial productivity. Detailed scientific characterizations of industrial scale processes under such oscillating conditions are scarce due to the high costs and logistics involved. A B. Subtilis sporulation mutant was thus examined in respect to its extra- and intracellular metabolites in a scale-down, two-compartment reactor giving hints about conditions the host is exposed to and how it reacts. To improve tolerance thresholds and utilization capacity for such metabolites in B. subtilis, the glyoxylate cycle was transferred from its close relative Bacillus licheniformis into the genome of B. subtilis. This feature enabled our B. subtilis ACE mutant to grow on acetate. The improved strain showed higher tolerance towards excess glucose in a fed-batch as well as higher productivity during the expression of a reporter enzyme in comparison to the wild type. The ACE strain and B. licheniformis showed an increased formation of glycolate during growth with the glyoxylate cycle. This with regard to bacteria undescribed metabolite seems to play a role as a by-product of the glyoxylate cycle. Summarizing, this thesis deals with the characterization and optimization of B. subtilis for growth on overflow metabolites, enhancements of the acoA-expression system and the influence of sporulation and lysis mutants on its activity. Complementary, the host was begun to be characterized in respect to its behaviour in industrial scale processes.
Massebilanzdefizite
(2013)
Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig systematische Untersuchungen zum Thema „Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen“ dargestellt. Es gelang mit Hilfe einer geeigneten kalten Atmosphärendruckplasmaquelle in Form einer dielektrisch behinderten Oberflächenentladung (DBE) ein Plasma in verschiedenen Arbeitsgasen zu zünden und Flüssigkeiten ohne direkten Plasmakontakt zu behandeln. Um einen Einblick in die komplexen Mechanismen zu bekommen, wurde im analytischen Teil dieser Arbeit das Plasma mittels OES untersucht, die angrenzende Gas-Phase mittels FT-IR-Spektroskopie und MS, und anschließend die Flüssigkeit unter Nutzung photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen. Auf der Basis dieser Untersuchungen folgten theoretische Ausführungen zu möglichen Wechselwirkungen der detektierten Komponenten mit der Flüssigkeit. Theoretisch entstehen bei der Luftplasmabehandlung von Wasser, über Zwischenprodukte (ROS und RNS) wie z. B. HO•, HOO•, NO•, NO2•, schlussendlich H+, NO3-, NO2- und H2O2. Bei der Argon- und Argon-Sauerstoff-Plasmabehandlung von Wasser dürften aufgrund des Stickstoffmangels nur ROS entstehen, die in der Entstehung von H+ und H2O2 enden. Diese Hypothesen zur Bildung der Spezies NO3-, NO2- und H2O2, sowie die Ansäuerung der Flüssigkeit wurden mittels photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen überprüft und bestätigt. Im anschließenden biologischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Plasmabehandlungen in den verschiedenen Arbeitsgasen auf in physiologischer NaCl-Lösung und PBS suspendierte Mikroorganismen (E. coli, S. aureus und B. atrophaeus Sporen) untersucht. In ungepuffertem Medium wurden die vegetativen Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten Plasmabehandlung inaktiviert. In PBS hingegen wurden längere Behandlungszeiten benötigt. Das Plasma hatte auf die suspendierten Sporen wie erwartet kaum eine inaktivierende Wirkung. Die zwei vermutlichen Hauptwege laufen einerseits über reaktive Stickstoffspezies (RNS) und andererseits über reaktive Sauerstoffspezies (ROS). RNS können in Wechselwirkung mit Wasser über diverse zelltoxische Zwischenprodukte wie z. B. NO•, NO2•, N2O3, ONOOH, ONOO- zu NO3- und NO2- umgesetzt werden. ROS in Interaktion mit Wasser resultieren in Bildung von H+ und H2O2. Auch hier wird angenommen, dass eine Vielzahl an antimikrobiellen Komponenten entsteht, z. B. HO•, HOO•, O2•-. Es gibt folglich sehr viele Reaktionen und Interaktionen zwischen plasmagenerierten reaktiven Spezies und Wasser, welche in zelltoxischen Komponenten enden und die inaktivierende Wirkung des Plasmas auf suspendierte Mikroorganismen erklären. Um die Interaktionen zwischen den Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit besser zu verstehen und Hypothesen zu prüfen, wurden einerseits die Mikroorganismen-Suspensionen und destilliertes Wasser nur mit plasmabehandeltem Gas behandelt und andererseits die Mikroorganismen plasmabehandelter Flüssigkeit ausgesetzt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die plasmainitiierte Chemie und damit die biologischen Effekte des Plasmas auf das Gas bzw. in Flüssigkeit übertragen werden. Folglich werden biologische Effekte des Plasmas über die Gas- und Flüssigkeits-Phase vermittelt und Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen müssen immer im zusammenhängenden chemischen System Plasma-Gas-Flüssigkeit(-Zelle) betrachtet werden. Weiterhin wurden chemische und mikrobiologische Effekte durch den Einfluss von gasförmigem NO• und O3 auf Wasser bzw. suspendierte Mikroorganismen untersucht und mit der Luftplasmabehandlung verglichen. Hierbei zeigten beide Begasung deutlich geringere inaktivierende Effekte als die Luftplasmabehandlung. Die Begasung von Mikroorganismen mit NO• und O3 und die Analytik von begastem Wasser geben einen detaillierten Einblick in die Chemie und Mechanismen der RNS und ROS. Die Behandlung mit der dielektrisch behinderten Oberflächenentladung in Luft vereint diese zwei Hauptwege über RNS und ROS und resultierte somit in effektiveren antimikrobiellen Wirkungen. Durch die Experimente der vorliegenden Arbeit wurde ein geeignetes biologisches Modell gefunden und validiert, um den Einfluss von Plasma auf lebende Zellen zu untersuchen und Mechanismen von Plasmabehandlungen aufzudecken. Anhand des Modells „Mikroorganismen-Suspension“ konnte gezeigt werden, dass die Gas-Phase (Behandlungen mit DBE-Abgas) und die extrazelluläre Flüssigkeit (Behandlungen mit plasmabehandelter Flüssigkeit) eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Plasmaeffekte spielen. Die Spezies aus dem Plasma gelangten über die Gas-Phase durch Diffusion/Penetration/ Interaktion in die Flüssigkeits-Phase, reagierten teilweise zu anderen reaktiven Spezies weiter und erreichten so die Zellen. Die verschiedenen analytischen Methoden und anschließende theoretische Betrachtungen der Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit gaben einen detaillierten Einblick in die chemischen Mechanismen von Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen und zeigten biologisch wirksame Komponenten auf.
There is a growing interest in the application of non-thermal atmospheric pressure plasma for the treatment of wounds. Due to the generation of various ROS and RNS, UV radiation and electric fields plasma is a very promising tool which can stimulate skin and immune cells. However, not much is known about the mammalian cell responses after plasma treatments on a molecular level. The present work focusses on the impact of plasma on cell signaling in the human keratinocyte cell line HaCaT by using the methods DNA microarray, qPCR, ELISA and flow cytometry. Here, cell signaling mediators such as cytokines and growth factors which could promote wound healing by enhancing angiogenesis, reepithelization, migration and proliferation were of major interest. Additionally, the crosstalk between keratinocytes and monocytes was studied using a co-culture. For the first time extensive investigations on the impact of plasma on cell signaling in human keratinocytes were conducted. The most prominent cytokines and growth factors which were regulated by plasma at gene and protein level were VEGF-A, GM-CSF, HB-EGF, IL-8, and IL-6. The latter was not activated due to the JAK/STAT-pathway but probably by a combined activation of MAPK- and PI3K/Akt-pathways. By the use of conditioned medium it was found out that ROS and RNS generated directly after plasma treatment induced larger effects on cell signaling in keratinocytes than the subsequently secreted growth factors and cytokines. Furthermore, monocytes and keratinocytes hardly altered their secretion profiles in co-culture. From these results it is deduced that the plasma generated reactive species are the main actors during cell signaling. In order to differentiate the impact of ROS and RNS on the cellular response the ambience of the plasma effluent was controlled, varying the ambient gas composition from pure nitrogen to pure oxygen. Thereby a first step towards the attribution of the cellular response to specific plasma generated reactive species was achieved. While IL-6 expression correlated with ROS generated by the plasma source, the cell signaling mediators VEGF-A, GM-CSF and HB-EGF were significantly changed by RONS. Above all hydrogen peroxide was found to play a dominant role for observed cell responses. In summary, plasma activates wound healing related cell signaling mediators as cytokines and growth factors in keratinocytes. It was also shown that the generated reactive species mainly induced cell signaling. For the first time cell responses can be correlated to ROS and RONS in plasma treated cells. These results underline the potential of non-thermal atmospheric pressure plasma sources for their applications in wound treatment.
Die zielgerichtete Steuerung einer Arzneiform zu einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltraktes ist ein wesentlicher Punkt, wenn es um die Erhöhung der Bioverfügbarkeit und um die Verringerung von möglichen Nebenwirkungen geht. Im Zuge dessen macht man sich die physiologischen Unterschiede entlang des Verdauungstraktes zu Nutze, die unter anderem den pH-Wert, die Transitzeiten oder die Enzymausstattung betreffen. Verschiedene Faktoren wie Nahrungsaufnahme oder pathophysiologische Veränderungen können allerdings dazu führen, dass pH-, Zeit- oder Enzym-getriggerte Darreichungsformen versagen und ihren Wirkstoff entweder zu früh, zu spät oder gar nicht freisetzen. Durch die Entwicklung neuer Arzneiformen, die ihren Wirkstoff aufgrund eines definierten Drucks freigeben, könnten diese Probleme unter Umständen vermieden werden. Weiterhin kann die Bioverfügbarkeit besonders von schwer löslichen Wirkstoffen negativ beeinflusst werden durch den Zeitpunkt und die Dauer der Desintegration einer Arzneiform und das Fehlen der dafür erforderlichen Wassermengen im Gastrointestinaltrakt. Besonders bei Wirkstoffen mit einem engen Absorptionsfenster im oberen Dünndarm ist ein schneller Lösungsprozess des Wirkstoffs einer Arzneiform wichtig, um eine optimale Absorption zu gewährleisten. Aus diesem Grund bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Entwicklung neuer drucksensitiver Darreichungsformen, die ihren Inhalt bei einem definierten Druck von 300 mbar, wie er am Pylorus vorherrscht, schlagartig und komplett freisetzen. Dabei sollten die Arzneiformen vor ihrer Entleerung weder durch eine verlängerte Magenverweilzeit noch durch den sauren pH-Wert des Magens angegriffen werden, um eine verfrühte Wirkstofffreisetzung zu vermeiden. Die entwickelten Darreichungsformen sollten den Wirkstoff entweder in bereits gelöster Form oder dispergiert in einer flüssigen Grundlage enthalten, die sich nach Zerplatzen über die Dünndarm-Schleimhaut verteilen und durch eine verlängerte Kontaktzeit die Absorptionsrate erhöhen kann. Für die entwickelten Arzneiformen wurden Methoden zur Gehaltsbestimmung entwickelt, um die Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit einschätzen zu können. Weiterhin wurde ein dreistündiger Freisetzungsversuch in der Paddle-Apparatur zur Simulation einer verlängerten Magenverweilzeit durchgeführt. Bruchfestigkeitsuntersuchungen am Texture Analyser sollten die Beeinflussung der aufzuwendenden Kraft in Bezug zu individuellen Parametern, wie Polymerbeladung oder Konzentration beurteilen. Mit Hilfe der Stresstest-Apparatur wurde die direkte Einwirkung von Druck im Bereich zwischen 100 und 500 mbar untersucht, und unter Verwendung eines Magenentleerungsprogramms das Verhalten der Darreichungsformen im nüchternen Magen und bei der Pyloruspassage simuliert. Es wurden sechs unterschiedliche Darreichungsformen entwickelt, deren Eignung als drucksensitive Arzneiform anhand der genannten Prüfungen untersucht wurde. Die Entwicklung der Agar-Kugeln beruhte auf der Eigenschaft des Gelbildners spröde Matrizes zu bilden, deren Bruchverhalten durch Veränderung der Konzentration oder durch eine definierte Trocknungszeit beeinflusst werden konnte. Das Prinzip der Hartfett- und PEG-Kugeln beruhte darauf, dass Hilfsstoffe, die bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur schmelzen, mit einem wasserunlöslichen Polymer überzogen wurden, der aus der Arzneiform bei Eintritt in den Körper einen flüssigkeitsgefüllten Ballon bildete. Die mit Ethylcellulose überzogenen Paraffin-Kapseln sollten durch das Einfügen einer Sollbruchstelle in Form von acht radial angeordneten Löchern zerplatzen und ihren Inhalt freigeben. Das wässrige Medium sollte durch die Löcher eindringen, die innere Gelatinekapsel anlösen und somit zu einer dünnen Polymer-Schicht führen, die auf Druck nachgeben und den Inhalt komplett freisetzen sollte. Die entwickelten Tristearin-Kapseln bestanden aus einer festen, spröden, wasserabweisenden Hülle aus einem hochschmelzenden Hartfett, mit welchem in flüssiger Form handelsübliche Gelatine-Kapseln innenbeschichtet werden konnten und wurden mit einem wirkstoffhaltigen Hydrogel gefüllt. Bei den Kaugummi-Tabletten sollte ein dünner Mantel aus lipophiler Kaugummi-Grundmasse die Arzneiform vor dem Einfluss wässriger Medien schützen. Ein enthaltener Kern aus Hartfett, welcher bei Körpertemperatur schmilzt, sollte zusätzlich dafür sorgen, dass das Gerüst der Tablette instabil wird und sie durch definierte Druckeinwirkung zum Platzen gebracht wird. Eingefügte Sollbruchstellen sollten das Platzen steuern und ein anschließendes Dippen in eine heptanhaltige Kaugummilösung sollte die Arzneiformen soweit stabilisieren, dass sie nicht bereits bei zu niedrigen Drücken zerbrachen. Unter den entwickelten Darreichungsformen erwiesen sich vor allem die Tristearin-Kapseln und die Hartfett-Kugeln als sehr geeignet für eine drucksensitive Freisetzung, während für die anderen Arzneiformen weitere Modifikationen notwendig wären.
Rich knowledge about global nutrient cycles and functional interactions can be gained from the perspective of complex microbial proteomes. In this thesis, the application of environmental proteomics allowed for a direct in situ analysis of habitat-specific proteomes expressed by respective microbial communities from two different marine ecosystems. In the first part of this thesis, unculturable symbiont populations from tubeworms that colonize hydrothermal vents of the Pacific deep sea became accessible by use of community proteomics. This branch of environmental proteomics is generally employed to ascertain simple microbial assemblages derived from in situ samples. The proteome study was aimed at analyzing adaptations of seemingly monospecific symbionts to different hosts, the tubeworms Tevnia jerichonana und Riftia pachyptila. A comparison of the newly sequenced genomes of symbiont populations from both hosts confirmed that both symbioses involve the same bacterial species. Also the proteome analysis by 2D-PAGE showed a high physiological homogeneity for symbionts from both worm species, although the hosts are exposed to different geochemical conditions. Thus, the hosts provide their symbionts with a relatively stable internal environment by attenuation of external influences. Only minor variations in the symbionts proteomes reflected the differential environmental conditions outside the worms. Hence, the symbionts were able to fine-tune major metabolic pathways and oxidative stress in response to only minor chemical changes within their hosts. Moreover, new components of important physiological processes of the bacterial symbionts, like the sulfide oxidation and carbon fixation, were identified by in-depth proteomics of the Riftia symbiosis model system. The in situ protein samples showed as well that, in contrast to an earlier hypothesis, nitrate is used as an alternative electron acceptor. In the second part of this thesis, another branch of environmental proteomics called metaproteomics was applied to investigate the response of a bacterioplankton community to a spring phytoplankton bloom in the North Sea. Recurrent plankton blooms are a common phenomen of coastal areas, which however has only been investigated with limited resolution in biodiversity. Based on large-scale proteomic data sets it was found that specialized populations of Bacteroidetes, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria exhibited differential protein expression patterns. These involved oligomer transporters, glycoside hydrolases and phosphate acquisition proteins. A successive utilization of algal organic matter by microbes indicated a series of ecological niches occupied by the heterotrophic picoplankton. Key proteins, identified by metaproteomics, were further investigated by studying a model bacterium to define their specificities regarding the utilization of algal glycans. By isotope labeling of proteins, quantitative proteomics of the North Sea isolate Gramella forsetii KT0803, a Bacteroidetes representative could be conducted. The adaptation to the algal polysaccharides alginate and laminarin in comparison with glucose was analyzed. G. forsetii proved to be a specialist for the chosen algal polymers, in particular for glucans like laminarin. Primarily comprehensive clusters, the so-called polysaccharide utilization loci (PULs) were activated. The results of this model study complemented the basic concepts obtained by the metaproteomic approach about carbon cycling in coastal systems. The accessibility of numerous unculturable marine microbes by environmental proteomics allows to improve our understanding of interactions that drive symbioses or complex communities. Adaptations to environmental parameters, such as the abundance of substrates, can be analyzed and associated with respective populations. Thus statements can be made for functional groups of microorganisms, their ability for the creation of niches and their flexibility to respond to varying environmental impacts. The increasing number of marine model bacteria enables targeted analysis of specificities and adaptations and hence to support the environmental proteomics approach.
Das In vitro-Testsystem der Gefäß-simulierenden Durchflusszelle (vessel-simulating flow-through cell, vFTC) ermöglicht die Untersuchung der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Arzneistoff-freisetzenden Stents (drug-eluting stents, DES) zwischen dem Perfusionsmedium, dem Hydrogelkompartiment und dem in der Stentbeschichtung verbliebenden Wirkstoffanteil. Die vorliegende Forschungsarbeit hatte zum Ziel, die physikochemischen Eigenschaften des Gefäß-simulierenden Gelkörpers (ein 3 %iges Alginat-Gel) unter Erhaltung definierter Materialeigenschaften wie Elastizität, Festigkeit und Formstabilität der Hydrogelkompartimente unter Perfusionsbedingungen zu verändern und den Einfluss der Einbettungsbedingungen auf die Wirkstofffreisetzung und -verteilung von mit Modellwirkstoffen-beschichteten Stents in der vFTC zu untersuchen. Die Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften des Alginat-basierten Hydrogelkompartimentes konnte durch Integration des hydrophoben Adsorbens LiChroprep® RP-18 sowie durch den Austausch der wässrigen Phase durch die o/w-Emulsion Lipofundin erfolgreich abgeschlossen werden. Dabei zeigte die 5 %ige LiChroprep-Formulierung eine schnelle Gelierung, ergab formstabile Gelkörper und beobachte Auswaschungseffekte des inkorporierten Adsorbens (bei einem Masseanteil im Gel von ≤ 10 %) unter Perfusion in der vFTC blieben aus. Eine maximale Änderungen der Verteilungseigenschaften ergab sich für die Kombination der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren mit dem LiChroprep-Gel (Verteilungskoeffizient von ~ 5). Im Rahmen der Freisetzungs- und Verteilungsuntersuchungen in der vFTC konnte eine Anreicherung im LiChroprep-Gel (gegenüber dem Alginat-Gel) beziehungsweise eine Änderung der Wirkstoffverteilung zwischen den Kompartimenten Freisetzungsmedium, Hydrogel und Stentbeschichtung jedoch nicht bestätigt werden. Die numerische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente zeigte jedoch, dass im Fall von Triamteren der Einfluss einer Gelhydrophobisierung auf die Freisetzung und Verteilung mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit des Modellwirkstoffes aus der Stentbeschichtung zunimmt. Für die In vitro-Testung von DES in der vFTC über einen verlängerten Versuchszeitraum von 28 Tagen konnten geeignete, Langzeit-stabile Gelformulierungen aus Agar, Agarose, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol gefunden werden. Diese unterschieden sich hinsichtlich ihrer Herstellungstechnik, ihren Quellungseigenschaften, ihrer makroporösen Gelstruktur, ihren Verteilungs- und Diffusionseigenschaften sowie den Materialeigenschaften, Gelfestigkeit und Elastizität. Der Vergleich der mit Hilfe des Texture Analyser ermittelten Kraft-Deformations-Profile der Gelkörper vor und nach 28-tägiger Perfusion in der vFTC zeigte, dass die untersuchten Materialeigenschaften, Festigkeit und Elastizität, im Fall der Agarose-, Polyacrylamid- und Polyvinylalkohol-Gelkörper trotz kontinuierlicher Scherbeanspruchung durch Perfusion des Gellumens nahezu unverändert waren. Aufgrund der schnellen und simplen Herstellungstechnik, der milden Gelierungsbedingungen, der elastischen Eigenschaften und der nahezu unveränderten mechanischen Stabilität unter Flussbedingungen in der vFTC erscheint das Agarose-Gel der vielversprechendste Kandidat der für die vFTC neu entwickelten Gelformulierung zu sein. Die Untersuchung der Diffusions- und Verteilungseigenschaften in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten ergab eine Gleichverteilung der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren zwischen dem Agar-, dem Agarose- beziehungsweise dem Polyacrylamid-Gel und dem flüssigem Kompartiment, während für die Polyvinylalkohol-Formulierung eine minimale Anreicherung (Verteilungskoeffizient von ~ 2) im Hydrogel gezeigt werden konnte. Die Wirkstoffdiffusion im Gel variierte von 2 x 10-4 mm2/s für Polyvinylalkohol, 5 x 10-4 mm2/s für Alginat und Polyacrylamid bis 8 x 10-4 mm2/s für Agarose. Die theoretische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente-Methode ergab in Abhängigkeit unterschiedlicher Entleerungsgeschwindigkeiten aus dem Wirkstoffreservoir und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verteilungs- und Diffusionseigenschaften von Triamteren in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten die schnellste Wirkstofffreisetzung in das Gel und die höchste Wirkstoffanreicherung im Gel im Fall des Polyvinylalkohol-Gelkörpers. In Abhängigkeit unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Modellgel (bei konstantem Verteilungskoeffizienten- und gleichbleibenden Entleerungsgeschwindigkeiten aus der Polymerbeschichtung) konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Wirkstofffreigabe ins Freisetzungsmedium mit steigender Wirkstoffdiffusion im Hydrogel reduziert ist. Gleichzeitig ist die Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir gesenkt, während der absolut ins Hydrogel eluierte Wirkstoffanteil steigt sowie terminal anschließend langsamer ins Medium rückverteilt wird. So scheinen die physikochemischen Eigenschaften des Hydrogelkompartimentes im Rahmen der experimentell durchgeführten Gelmodifikationen/Gelbildnersubstitution eine untergeordnete Rolle auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten der Modellwirkstoffe aus DES in der vFTC zu spielen. Die numerischen Modellierungen der experimentellen Wirkstofffreisetzung zeigen jedoch, dass eine Änderung der Verteilungs- und Diffusionskoeffizienten im Hydrogel und in der Stentbeschichtung zu Konzentrationsunterschieden in den Verteilungskompartimenten führen kann. So nimmt mit zunehmender Hydrophobisierung des Hydrogelkompartimentes, mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir und einer verlangsamten Diffusion im Hydrogel der Einfluss des Hydrogelkompartimentes auf die Wirkstofffreisetzung und verteilung in der vFTC zunimmt.
In many industrial sectors biotechnological production processes have replaced pure chemical methods and allowed new, ecologically friendly and enzyme-based processes. Microorganisms, such as modified Bacillus strains are used in particular for the industrial enzyme synthesis. The two organisms Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus are of great industrial importance. B. licheniformis is able to secrete proteins in large amounts, while B. pumilus shows high resistance to oxidative stress. During production processes different conditions can occur that affect the physiology of the production hosts and may result in a quantitative, but also a qualitative impairment of the products. This influence is based on e.g. chemical processes, the setting of temperature, pH, or oxygen availability and can lead to various stress situations for the bacteria. Cells respond to changes in their environment by sensing stressors and initiate a response to the stress, which is usually implemented by an induction or derepression of various regulons. In order to conduct an optimal production process, the metabolism and stress responses of the utilized bacteria should be known exactly. The aim of this study was to analyze of the stress response of B. licheniformis to heat and salt stress, and the stress response of B. licheniformis and B. pumilus to oxidative stress. These analyses were performed at the level of transcriptomics using cDNA microarrays, which is the most direct and global method for the analysis of changes in the physiology of a cell. The identification of stress specific markers genes and their differentiation from the SigB regulated general stress response has been another purpose of this work. Knowledge of these marker genes enables a prompt analysis of the fermentation conditions and thus a possible optimization of the process. The transcriptome analyses of this work show that B. licheniformis responds to heat stress by the induction of heat shock genes belonging to different regulons. These include the htpG gene, the HrcA regulon or the CtsR regulon, encoding chaperones and proteases, which mainly contribute to the protein quality control. The heat stress response of B. licheniformis revealed no fundamental differences to the heat stress response of the Gram-positive model organism Bacillus subtilis. The general stress response (SigB regulon), which is activated by heat stress, could be analyzed in more detail by the study of a ΔsigB mutant of B. licheniformis. Salt stress also provokes a strong induction of the general stress response in B. licheniformis. Genes for the transport and synthesis of compatible solutes were strongly induced, as well as several genes for transport systems with more or less known functions. The synthesis of the osmoprotective metabolites proline and glycine betaine could be verified in more detail by a metabolomics approach. The response to oxidative stress showed differences between both B. licheniformis and B. pumilus, and also to the oxidative stress response of B. subtilis. In B. licheniformis, the genes of the glyoxylate cycle are induced during oxidative stress. An activation of the glyoxylate bypass under oxidative conditions could be confirmed by a metabolome analysis of B. licheniformis. In addition, the PerR regulon of B. licheniformis is extended to include another two genes compared to B. subtilis. In contrast, several genes of the PerR regulon lack in the genome of B. pumilus, such as katA (vegetative catalase) or ahpCF (alkyl hydroperoxide reductase). However, other genes were induced in B. pumilus that were upregulated under oxidative stress conditions neither in B. subtilis nor in B. licheniformis. In addition, known regulons, regulated by e.g. Spx, CtsR or SOS were induced in both organisms. In summary, this dissertation transcriptionally analyzes the stress responses of B. licheniformis to heat, salt and oxidative stress, and in addition the oxidative stress response of B. pumilus. Several stress-specific regulons were identified in both, B. pumilus and B. licheniformis, which also correspond to the stress response of B. subtilis. However, it was possible to additionally assign genes to the stress specific responses of both organisms and to find differences, such as the absence of parts of the PerR regulon of B. pumilus, or the activation of the glyoxylate pathway in B. licheniformis during oxidative stress.
The investigated bacterial strain 64G3 was isolated from an offshore oil reservoir in Vung Tau, Vietnam. By means of 16S rDNA sequence alignment and DNA-DNA hybridization with Petrotoga mexicana DSM 14811, the isolate was identified as Petrotoga mexicana species. Morphologically, the 64G3 cells were rod-shaped and cell sizes varied widely from 1.0 µm up to 60 µm in length and from 0.6 to 1.2 µm in width. The cells appeared single, pairwise or in chains within a sheath-like structure (a typical characteristic of the order Thermotogales) that ballooned over the cell ends. Cells were immobile and no flagella were observed. Strain 64G3 grew anaerobically at temperatures ranging from 30 to 65°C and within the pH range of 5.0 to 8.5 with optimum growth at 55°C and the pH 7.0. Elemental sulfur and thiosulfate served as alternative electron acceptors whereas sulfate did not. Cellular extract of strain 64G3 grown in a basal medium containing soluble starch displayed hydrolytic activity towards soluble starch. The amylase system includes at least two individual enzymes. Amylase activity of the cell extract was detected in a wide temperature range (30-80°C), with optimal enzyme activity at 75°C. By using degenerate primer for PCR amplification of GH13 enzyme coding regions in combination with other molecular methods, a full amylase coding gene containing four conserved regions of α-amylase was obtained. The deduced sequence showed low identities (up to 40%) to other known amylases. This 1992 bp coding gene was heterologously expressed in E. coli and its product (amylase) was characterized. Under common expression conditions, the 77 kDa amylase (rAmyA) was predominantly produced as inclusion bodies (insoluble protein). The minor amount of soluble active amylase was used for purification and characterization of the enzyme. rAmyA was active on starch at temperatures between 30-55°C, with an optimum at 45oC. It is not thermostable because it was completely inactive after incubation at 65°C for 15 min. The enzyme was active over a pH range from 4.5-8.0, with an optimum at pH 6.5. Beside starch, rAmyA also hydrolysed glycogen, amylose, amylopectin and other oligosaccharides. Pullulan and cyclodextrins were not the substrates for this amylase. The enzyme hydrolyzed starch in an endo-acting manner, releasing maltose and maltotriose as major products and a lesser amount of glucose. On the basis of the primary structure, the substrate specificities and the hydrolysis pattern, rAmyA was classified as an endo-acting α-amylase (EC. 3.2.1.1). The cpn10/60 operon from psychrophilic O. antarctica was cloned and expressed in B. subtilis using a multi-copy plasmid. The amounts of soluble 60 kDa Cpn60 and 10 kDa Cpn10 produced at temperature ranging from 10 - 30°C were high and stable during cell growth. To investigate the impact of psychrophilic chaperonin on cold adaptation, cells with (cpn+) and without (cpn-) cpn10/60 operon were grown at 10 and 15°C. Growth comparison between two strains revealed that psychrophilic chaperonin did not support cold adaptation of B. subtilis at 10 and 15°C as it did in E. coli. A single copy of O. antarctica cpn10/60 operon was integrated into the amyE locus of the B. subtilis chromosome. The yeast α-glucosidase, a theoretic protein substrate for this chaperonin, was heterologously produced in B. subtilis at temperatures ranging from 15-30°C. Within this temperature range, the major amount of this protein appeared as inclusion bodies. Co-expression of O. antarctica cpn10/60 operon at 15°C, however, did not result in a higher activity of glucosidase. Moreover, SDS-PAGE analysis of cellular insoluble fractions revealed that the amount of insoluble enzyme produced in cpn+ cells did not decrease in comparison with that produced in cpn- cells, indicating that the recombinant chaperonin had no impact on recovery of active α-glucosidase from the inclusion bodies.
Der Naturstoff Splitomicin war als selektiver Inhibitor (der Aktivität) der NAD+- abhängigen Histon-Desacetylase des Sir2-Proteins Ausgangspunkt der Untersuchungen, ist aber an humanen Enzymen inaktiv und aufgrund der im menschlichen Körper zu erwartenden Hydrolyse der Verbindung weder als Arzneistoff noch als Grundgerüst für Analoga geeignet. Da die Stabilität der Verbindung Voraussetzung dafür ist, dass die Verbindungen ihre Wirkung entfalten können, und eine Verschiebung der Selektivität hin zu humanen Enzymen beabsichtigt war, wurde im Rahmen dieser Arbeit Splitomicin zwar als Leitstruktur übernommen aber das heterocyclische Ringsystem auf der Grundlage von Struktur-Aktivitätsbeziehungen modifiziert. Der in Splitomicin enthaltene Sechsring des Pyranons wurde durch einen Fünfring ersetzt. Neben anellierten Imidazolonen wurden Imidazolthione und Chinolinimidazolthione dargestellt, um die Stabilität der Verbindungen gegenüber Hydrolyseeinflüssen zu erhöhen.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
Ein Netzwerk aus Rezeptoren und Signalkaskaden reguliert Wachstum, Differenzierung und Überleben von Zellen. Wird dieses Netzwerk aus dem Gleichgewicht gebracht, können die Zellen zu Tumorzellen transformieren. Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) stellt eine treibende Kraft in diesem Netzwerk dar und ist ein Ziel zahlreicher Tumortherapeutika. Aufgrund weitläufiger Resistenzbildung ist die Identifizierung verantwortlicher Strukturen von großer Bedeutung um die entarteten Signalkaskaden synergistisch einzudämmen. Nach Aktivierung des EGFR wird eine signalspezifische Antwort durch Rekrutierung von Adapterproteinen an die intrazelluläre Domäne initiiert. Die veränderte Zusammensetzung der Signalproteine könnte Angriffspunkte für neue Therapieansätze enthüllen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu entschlüsseln, wurden mehrere Proteom-Untersuchungen auf Zelllysate angewendet. Ungeachtet der Sensitivität moderner Geräte stellt die Identifizierung niedrig-abundanter Proteine im Proteom einer Zelle jedoch eine Herausforderung dar. Die Identifizierung differentieller Proteinmuster des EGFR-Interaktom in Abhängigkeit von Resistenz und Rezeptor variante war das Ziel dieser Arbeit. Der EGFR samt seiner Interaktionspartner wurde aus Zelllysaten präzipitiert. Anschließend wurden die Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und nach in-Gel-Verdau mit LC-MS/MS analysiert. Aus Lysaten von A431-Zellen wurden 183 Proteine in vier Bioreplikaten detektiert. Darunter 15 direkte Interaktionspartner, wie GRB2, SHC1, SOS1/2, STAT1/3, AP2 sowie P85B. Die Berechnung des normalized spectral abundance factor (NSAF) anhand der Anzahl gemessener Spektren und der Molekularmasse eines Proteins ermöglichte eine relative Quantifizierung der Proteinmenge. Die Menge der copräzipitierten Proteine war nach EGFR-Aktivierung durch EGF für 14 Proteine mehr als zweifach erhöht. Davon waren Untereinheiten des AP2 Komplexes am stärksten an aktivierten EGFR assoziiert. Abschließend wurde die Interaktion mit AP2 und die neu aufgedeckte Interaktion mit CIP2A durch Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse bestätigt. Nachdem die Funktionalität der Methode gezeigt werden konnte, wurde die Anwendung um das Modell einer akuten Afatinib-Resistenz erweitert. Im A431-Zellmodell wurde durch die Inkubation in Fibroblasten-konditioniertem Medium eine Resistenz gegen Afatinib beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ermittelt werden, ob sich der Einfluss der temporären Resistenz am Interaktionsmuster des EGFR widerspiegelt. Die MS-Analyse identifizierte 145 Proteine deren Assoziation an EGFR durch Afatinib mindestens zweifach verringert wurde, darunter GRB2, SOS1, SHC1, STAT2/3 sowie PK3CB und P85B. Aus dieser Analyse wurde ein Pool aus 137 Proteinen ermittelt, die potentiell Teil des induzierten Resistenzmechanismus sein könnten. 32 Proteine, darunter TNAP2, AHNK, SPTCS und der Tumorsuppressor DIDO, weisen funktionelle Ähnlichkeit zu Lungenkrebs auf. Daraufhin wurde die Methode auf das Modell einer chronisch erworbenen Resistenz der Lungenkarzinom-Zelllinie HCC4006 gegen Erlotinib angewendet. Die Analyse sollte zunächst differentielle Proteinmuster des Grundzustandes in Abhängigkeit zur erworbenen Resistenz identifizieren. Die Morphologie der Erlotinib-resistenten HCC4006-Zellen weist Merkmale einer EMT auf, die als Resistenzmechanismus für verschiedene Tumore beschrieben ist. Im Einklang mit dieser Beobachtung wurden Hinweise auf rege Veränderungen des Zytoskeletts in der vorliegenden MS-Analyse der resistenten HCC4006-Zellen gefunden. In unbehandelten Zellen wurden abhängig vom Resistenz-Status der Zellen 178 Proteine mit mindestens zweifach veränderter Assoziation an EGFR detektiert. Darunter fanden sich die Proteine der Zytoskelettreorganisation Plectin, Spectrin und ZO1, welche in resistenten Zellen bis zu 70 fach erhöht waren. Das Angiogenese-Protein Nostrin ist hingegen nach Resistenzentwicklung stark vermindert. Nach Behandlung mit Erlotinib und EGF war die Assoziation von 148 Proteinen durch Erlotinib Resistenz verändert. Darunter befanden sich HEAT1, EF1A1, UBS3B und AP3B1 die in sensitiven Zellen durch Erlotinib stärker dissoziierten als in den resistenten Zellen. Abschließend wurde die differentielle Analyse auf zwei EGFR VarianteIII (vIII) transfizierte Glioblastomzelllinien übertragen. In den P3-Zellen sind 95 Proteine in Abhängigkeit der Rezeptorvariante zweifach verändert an EGFR assoziiert. Darunter waren JAK1, GRB2, PRKDC und SNX-3, 17 und 27 vermehrt an vIII assoziiert, wohingegen PHB2 bevorzugt an Wildtyp-EGFR assoziiert. In den NCH421k Glioblastomzellen ist die Affinität für vIII bei 245 Proteinen zweifach verändert. Darunter die Phosphokinasen P85A und P85B mit stark erhöhter vIII-Affinität. Für vIII ist eine bevorzugte Initiierung des PI3K/AKT Signalweges, sowie eine konstitutive Aktivität bereits beschrieben. Mit dem Abschluss dieser Arbeit liegt ein Protokoll zur differentiellen Analyse der EGFR Interaktionsmuster vor
Natürliche Metabolite sind Ausgangsstoff für eine Reihe von Arzneimitteln wie zum Beispiel Antibiotika. Doch bis zur Anwendung am Menschen sind viele Analyseschritte notwendig. Da viele Naturstoffe nicht in ausreichenden Mengen zur Verfügung gestellt werden können, wird deren Funktionsanalyse und Anwendung erschwert. Für dieses Defizit sind im Wesentlichen zwei Ursachen zu nennen. Entweder ist eine Vielzahl der Produzenten nicht kultivierbar oder eine ausreichende Synthese ist unter Laborbedingungen im Ausgangsstamm nicht möglich. Aus diesem Grund sind alternative Strategien wie zum Beispiel eine heterologe Expression dieser Synthese-Cluster in geeigneten Wirten notwendig. Dies war der Ansatzpunkt für die vorliegende Arbeit. Eine besondere Bedeutung innerhalb der Naturstoffe kommt der strukturell diversen und mitunter sehr komplexen Gruppe der Polyketide und nichtribosomalen Peptide zu, die oft pharmazeutisch relevante Wirkungen aufweisen. Die für ihre Synthese verantwortlichen Enzyme (PKS und NRPS) sind häufig beachtliche Multienzymkomplexe, die durch Gencluster codiert werden, deren Größe von 10–100 kbp reichen kann. Bisher wurden für die heterologe Produktion dieser Metabolite in erster Linie Actinomyceten wie zum Beispiel Streptomyces coelicolor und Myxococcus xanthus, die selbst eine Vielzahl an Polyketiden und nichtribosomalen Peptiden synthetisieren, oder Escherichia coli genutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde Bacillus subtilis, der bereits breite Anwendung in der industriellen Herstellung von technischen und pharmazeutischen Proteinen findet, erstmals als heterologer Wirt für die Synthese eines Polyketids (6-Desoxyerythronolid B) und eines nichtribosomalen Peptids (Enniatin B) eingesetzt. Zu diesem Zweck wurde ein Klonierungsprotokoll für die schnelle und wiederholte Genommodifizierung entwickelt. Dieses basiert auf der Kombination von transformationssteigernden Elementen (sogenannten six-sites) mit der chromosomalen Integration einer induzierbaren Kopie des Kompetenzfaktors ComS. Zur Markerentfernung wurde das Cre-lox-System implementiert. Durch die zusätzliche Deletion des Restriktions- und Modifikationssystems wurde eine weitere Voraussetzung zur chromosomalen Integration großer Gencluster geschaffen. Damit steht nun ein optimiertes Protokoll für die Konstruktion von B. subtilis-Expressionsstämmen und deren weiterer genomischer Modifizierung zur Verfügung. Als Vertreter einer komplexen Polyketidsynthase wurde die Desoxyerythronolid B-Synthase (DEBS) aus Saccharopolyspora erythraea ausgewählt. Dieser aus drei ca. 300–350 kDa großen Proteinen (DEBS1–3) bestehende Enzymkomplex ist für die Bildung des Makrolids 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) verantwortlich, das die Vorstufe des antibiotisch wirksamen Erythromycins darstellt. Das korrespondierende Gencluster umfasst drei ca. 10 kb große Gene (eryAI–III) und konnte erfolgreich in drei Operonstrukturen im Genom von B. subtilis lokalisiert werden: als i) natürliches Operon, ii) modifiziertes Operon mit optimierten RBS und iii) drei separate Expressionskassetten. Unter fed-batch-simulierenden Bedingungen (EnBase-System) gelang dabei ein positiver Metabolitennachweis für den Stamm mit drei separaten Expressionskassetten. Um das Zellwachstum und die 6dEB-Synthese zu verbessern, wurden weiterführende Genommodifizierungen des Produktionsstammes vorgenommen, von denen sich einige positiv auf die Produktbildung auswirkten. Mit diesem Versuch wurde erstmals die prinzipielle Eignung von B. subtilis als heterologer Produzent für komplexe Polyketide erbracht. Die Enniatin-Synthetase (ESyn) aus dem filamentösen Pilz Fusarium oxysporum wurde als Beispiel einer nichtribosomalen Peptidsynthetase in die Arbeit einbezogen. Aufgrund der handhabaren Größe des esyn-Gens (10 kb) wurde die Expression auf single- und multi-copy-Level untersucht. Dabei wurde auch der Einfluss verschiedener Genommodifizierungen und Änderungen in den Wachstumsbedingungen auf die Produktbildung analysiert. Die Kultivierungsversuche inklusive Metabolitenanalyse wurden in Kooperation mit dem Institut für Biologische Chemie an der TU Berlin durchgeführt. Abschließende Konzentrationen des entsprechenden Metaboliten (Enniatin B), einem zyklischen Hexadepsipetid mit zahlreichen antiinfektiven Wirkungen, wurden auf 4,5 µg/L (single-copy) bzw. 1,2mg/L (multi-copy) beziffert. Damit konnte in B. subtilis zum ersten Mal die heterologe Produktion eines gattungsfremden nichtribosomalen Peptids demonstriert werden. Zusammengefasst beschreibt die präsentierte Arbeit die erfolgreiche Produktion eines komplexen Polyketids und eines nichtribosomalen Peptids. Obwohl weitere Untersuchungen notwendig sind, um einige unerwartete Effekte bestimmter Genommodifizierungen aufzuklären und eine weitere Steigerung in der Produktausbeute zu erreichen, konnte eindeutig belegt werden, dass sich B. subtilis als Wirt für die heterologe Produktion von Sekundärmetaboliten eignet.
Chemistry and biology of Phenolics isolated from Myricaria germanica (L.) Desv. (Tamaricaceae)
(2014)
In accordance with the recent worldwide interest in plant phenolics, which emerges from their broad range of biological activities, particular emphasis has been focused, in the present thesis, on the constitutive phenolics of the extract of Myricaria germanica (L.) Desv. (Tamaricaceae). During the current thesis twenty phenolics (1 – 20) were isolated and identified from the aqueous/ethanol extract of the whole Myricaria germanica plant. The isolates include four hitherto unknown natural phenolics (2, 10, 12 and 20). Also, the cytotoxic activities of M. germanica extract, column fractions, and one new natural isolate against three different solid tumor cell lines, namely, breast cancer (MCF-7), prostate (PC-3), and liver (Huh-7) cancer cell using SRB viability assay have been investigated and first insights into mode of action have been obtained.
Oral drug delivery is the preferred route of administration for the majority of drugs. Solid dosage forms arewell-accepted because of ease of administration, accurate dosing and high degree of patient compliance. The orodispersible technology platform has attracted increasing interest. Fast disintegrating in the mouth before swallowing, orodispersible dosage forms like orodispersible tablets (ODTs) address the need for patient-compliant medicines. ODTs represent a convenient alternative to conventional tablets or capsules. ODTs are an interesting approach when a rapid onset of therapeutic action is important. So far, ODTs have often been considered as an innovative variant of conventional oral solid dosage forms. Still, the development of ODT formulations is typically assisted by compendial in vitro test methods. However, the techniques described in international pharmacopoeias are non-specific for ODTs. After administration, the dispersion of an ODT in the mouth may provide effects which might influence the absorption of the drug. The performance of ODTs is more comparable to solutions/suspensions than to traditional tablets. To better guide the development of a new ODT formulation, this lack needs to be addressed. It is the aim of this work to design more specific in vitro test methods helping to improve understanding ODT formulations. To reflect the physiological conditions experienced by an ODT after administration, particular attention was given to the mouth where the ODT disperses and releases the drug before swallowing. In vitro biorelevant test setups simulating in vivo conditions were designed. An electronic tongue system was used to assess taste properties of ODTs. These test methods were applied in different stages of the ODT formulation development. Diclofenac being a poorly soluble and weakly acidic NSAID which is a standard medication for acute painful inflammatory conditions was used as a drug model. Three forms, i.e. the free acid and its sodium/potassium salt, were investigated for the formulation of palatable and fast acting ODTs. In Chapter 1, the development of biorelevant test setup reflecting the physiological conditions experienced by ODTs is described in detail. The newly-designed in vitro models successfully discriminated the different diclofenac forms in successive in vitro compartments simulating the mouth, the stomach and the small intestine. It was possible to identify peculiar dissolution profiles with diclofenac salts. Characterizing in-depth the diclofenac free acid and salt particles provided a better understanding of the peculiar dissolution profiles. Critical behaviors of diclofenac salts on their way from the mouth to the stomach and passing different pH conditions were extensively evaluated. Reasons for pH-dependent API precipitation and particle agglomeration were studied in detail. In pre-formulation studies, the proposed biorelevant test setups succeeded in helping to early identify critical pharmaceutical properties for diclofenac salts and to select diclofenac free acid as the most appropriate drug form providing the most stable in vitro performance. In Chapter 2, the electronic tongue method as an in vitro taste assessment tool for ODTs is proposed. Using the TS-5000Z taste sensing system (Insent Inc., Japan), the method was able to differentiate between the taste/aftertaste qualities and intensities of the three diclofenac candidates. The electronic tongue was also successfully used to differentiate different ODT formulations. The results obtained proved that valuable information can be gained. By this means, the taste perception of the diclofenac drug candidates were classified and rank against each other. For manufacturing taste-masked ODTs, diclofenac free acid, could be selected easily. The electronic tongue found out to be a precious tool in assisting the development of a new ODT product and finding the most appropriate multi-component formulation. Both proposed methods successfully showed their discriminative ability and also their utility in pre-formulation studies of ODTs. In the previous chapters, it was indeed possible to early select diclofenac free acid as the most suitable drug candidate for the targeted product profile. In Chapter 3, said methods were further used to guide the development of the taste masked diclofenac ODT formulation. This study highlights the importance of considering in vitro the physiological aspects which may have an impact on the in vivo performance of ODT dosage forms. The contact of ODTs with the mouth should be simulated in vitro for a better understanding of the in vivo behavior. With feasible biorelevant in vitro dissolution methods, an optimized correlation of in vitro and in vivo results may be achieved. The proposed in vitro test methods may provide data of predictive value and may support the rational development of ODT formulations.
Heparin is an anticoagulant drug. It is important in the treatment of deep vein thrombosis,pulmonary embolism and during surgeries. Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is a severe adverse reaction caused by the formation of ultralarge complexes of platelet factor 4 (PF4) with unfractionated heparin (UFH). It can lead to limb loss or fatal events like stroke, myocardial infarction or pulmonary embolism. HIT has an incidence of about 3% in patients receiving anticoagulative heparin treatment. PF4 is a tetrameric protein, released from the α-granules of platelets upon activation. PF4 is known to form antigenic complexes with UFH accompanied by structural changes of PF4. In this thesis, the size and size distribution of PF4 and PF4/heparin complexes were analyzed using asymmetrical flow field-flow-fractionation (AF4), photon correlation spectroscopy (PCS) and atomic force microscopy (AFM). PF4 tends to form auto-aggregates and to adsorb to different surfaces, including regenerated cellulose, polyethersulfone, quartz and glass. The aggregates are less pronounced in solutions at isotonic NaCl concentration. Arginine and Tween 20 were identified as possible ingredients to hinder the auto-aggregation of PF4. Also, it is shown by combining circular dichroism (CD) spectroscopy, atomic force microscopy (AFM) and isothermal titration calorimetry (ITC) with UFH and defined chain length (16-, 8-, 6-, 5-mer) heparins that structural changes (i.e., increase in β-sheets) alone are not sufficient to induce antigenicity. While UFH, 16-, 8-, and 6-mer heparins all induced an increase in the antiparallel β-sheet content to > 30% (as determined by CD spectroscopy), complex antigenicity as measured by anti-PF4/heparin antibody binding in an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) was only induced by UFH and 16-mer heparin. Fondaparinux (5-mer heparin), which forms in vitro non-antigenic complexes with PF4, did not induce structural changes of PF4. Interestingly, the structural changes induced by antigenic UFH and 16-mer heparin but not by non-antigenic shorter heparins were reversible at higher heparin concentrations. Furthermore, the complexes formed by PF4 with longer heparins were larger than those formed with shorter heparins as shown by atomic force microscopy (AFM). UFH, HO16 and HO08 are able to form ultralarge multimolecular complexes with PF4. ITC data indicated strong electrostatic interactions and energetically unfavorable conformational changes of PF4 with longer heparins, while for the short heparins, favorable conformational changes in the structure of PF4 are induced. This explains the reversibility of the structural changes seen for UFH and HO16 upon addition of an over-saturating amount of heparin. Finally, using differential scanning calorimetry (DSC) the thermal stability of PF4 and PF4/heparin complexes was assessed. Despite its tendency to form auto-aggregates, PF4 is a heat-stable protein. This stability is, length dependently, even increased in complex with heparins. This work shows important differences in the binding between PF4 and heparins of different chain length and might be relevant for the understanding of other biological functions of heparins (e.g., involvement in allergic and inflammatory reactions).
Untersuchungen zur Phytochemie und zur biologischen Aktivität von Pittosporum angustifolium Lodd.
(2014)
Pittosporum angustifolium Lodd. (Pittosporaceae) ist ein kleiner Baum, welcher ursprünglich in Australien beheimatet ist, wo er in den meisten inländischen Gebieten zwar zerstreut, aber lokal nie gehäuft vorkommt. Von dieser Spezies, welche oft auch mit der Trivialbezeichnung „Gumby Gumby” betitelt wird, werden im Bereich der Ethnomedizin Zubereitungen für verschiedenste Indikationsbereiche wie Schmerzen, Krämpfe, Erkältungen oder Hauterkrankungen verwendet. Auch in der Komplementärmedizin werden Präparationen dieser Pflanze als Additivum bei malignen Erkrankungen eingesetzt. Zielstellung der vorliegenden Dissertation war eine exakte Charakterisierung der Phytochemie von Pittosporum angustifolium sowie eine Untersuchung von Extrakten, Fraktionen und Isolaten auf deren biologische Aktivitäten. Neben zwei grundlegenden Diplomarbeiten [35,36] lagen zu Beginn dieser Arbeit (Januar 2010) keinerlei wissenschaftliche Publikationen diesbezüglich vor. Im Rahmen der Untersuchungen zur Phytochemie wurden aus australischem Drogenmaterial (Blätter und Samen) sowie aus selbstgezogenen Pflanzen (Blätter) insgesamt 55 Triterpensaponine isoliert. Von diesen konnten 33 vollständig und fünf teilweise strukturell aufgeklärt werden, wobei 29 Verbindungen, welche als Pittangretoside A-Z und A1-C1 bezeichnet wurden, erstmalig als Naturstoffe beschrieben werden konnten. Hierbei handelt es sich um Aglyka vom Oleanan-, 17,22 seco Oleanolsäure- und Taraxasterol-Typ, welche mono- oder bisdesmosidisch vorliegen. Zwischen den verwendeten Drogen-Chargen konnten sowohl quali- als auch quantitative Unterschiede hinsichtlich der Phytochemie festgestellt werden. In allen untersuchten Pflanzenteilen (Blatt, Samen, Spross, Wurzel) wurden Triterpensaponine nachgewiesen. Von weiteren 13 isolierten Polyphenolen konnten drei als glykosylierte Flavonole und weitere drei als Derivate von mit Kaffeesäure substituierter Chinasäure identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um bekannte Verbindungen. Über weitere Bestimmungen konnten Fettsäuren sowie als Bestandteile des ätherischen Öls Mono- und Sesquiterpene sowie C13 Isoprenoide bestimmt werden. Über verschiedene Testsysteme und Assays wurden Überprüfungen hinsichtlich biologischer Aktivitäten der Polyphenole und insbesondere der Triterpensaponine durchgeführt. Für letztere konnten über Agardiffusionstests antimikrobielle Wirkungen gegen mehrere Candida Arten, hämolytische und gegen mehrere tumorigene Zelllinien zytotoxische Effekte nachgewiesen werden. Weiterhin wurde eine Hemmung der humanen Topoisomerase I belegt. Alle beobachteten Aktivitäten sind an strukturelle Voraussetzungen der Triterpensaponine wie das Acylierungsmuster und die Zuckerverknüpfung gebunden. Hierzu konnten interessante Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet werden. So scheint für viele der gezeigten biologischen Effekte eine Acylierung mit hauptsächlich C5-Resten an Position C-22 bzw. C-21 und C-22 des Aglykons essentiell zu sein, während sich Verbindungen mit fehlender oder an C-28 vorhandener Acylierung in den durchgeführten Untersuchungen als vergleichsweise schwächer oder nicht aktiv erwiesen. Unterschiedliche Zuckerkompositionen zeigten hierbei einen abschwächenden oder verstärkenden Einfluss. Für die isolierten Polyphenole wurde eine antioxidative Aktivität nachgewiesen. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche Induktion von IL8 durch den Rohextrakt der australischen Blattdroge. Eine Überprüfung von Saponinen und Polyphenolen via NMDA-Rezeptor- und Cholinesterase-Inhibitionsassay erbrachte keinen Anhaltspunkt für eine antidementive Wirkung. Ebenso konnte kein Nachweis für eine antiphlogistische Wirkung (Bestimmung von TNFalpha) und für die Beeinflussung weiterer Zytokine (IL1beta und IL10) erbracht werden. Über einige dieser Ergebnisse lassen sich Anwendungsbebiete im Bereich der Komplementärmedizin wie z. B. bei malignen Erkrankungen erklären. Für andere ethnomedizinische Indikationen konnten aufgrund nicht zur Verfügung stehender oder nicht adequater Testsysteme keine abschließenden, beurteilenden Aussagen getroffen werden.
Die Verlängerung des Aufenthalts einer Arzneiform im Magen kann enorme Vorteile insbesondere für Arzneistoffe mit einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm oder schlechter Bioverfügbarkeit bieten. Bei gleichzeitig kontrollierter Freisetzung eines enthaltenen Wirkstoffs können Plasmaspitzen und Fluktuationen im Blutplasma vermieden werden. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung solcher potentiell gastroretentiver Darreichungsformen in vitro und in vivo. Der Hauptteil der Arbeit umfasste die Entwicklung einer neuartigen Arzneiform, die bei nüchterner und postprandialer Gabe eine zuverlässige Gastroretention über mehrere Stunden zeigen und den Wirkstoff kontrolliert im Magen freigeben sollte. Das System bestand aus einer wirkstoffhaltigen Kerntablette und einem den Kern umgebenden, quellenden Mantel, welcher durch Expansion die angestrebte Gastroretention ermöglichen sollte. Im Rahmen der Formulierungsentwicklung erwies sich die Mischung aus einem hoch- und niedrigmolekularen Polyethylenoxid als geeignet für die Kontrolle der Wirkstofffreisetzung aus dem Kern. Die Ergänzung wasserlöslicher, osmotischer Hilfsstoffe ermöglichte eine weitgehend pH-unabhängige und vollständige Wirkstofffreigabe. In vitro-Quellungsstudien mit den entwickelten Manteltabletten ergaben eine schnelle und ausgeprägte Größenzunahme bei Testung in einfachen Freisetzungsmedien. Zur Prüfung des tatsächlichen gastroretentiven Potentials der entwickelten Manteltabletten mit dem Diuretikum Furosemid wurde eine Magnetic Marker Monitoring (MMM)-Studie durchgeführt. Das MMM basiert auf der magnetischen Markierung einer Arzneiform und der Bestimmung ihrer Lokalisation im Gastrointestinaltrakt mittels empfindlicher Sensoren. Nach Nüchterneinnahme wurden die Manteltabletten innerhalb von 38 ± 12 min aus dem Magen der Probanden entleert. Bei Applikation der Manteltabletten nach Einnahme einer hochkalorischen, standardisierten Mahlzeit konnte eine durchschnittliche Gastroretentionszeit von 8 ± 3 h erzielt werden. Die AUC(0-24 h) konnte im Studienarm mit Nahrung im Vergleich zur Nüchterneinnahme von 89 ± 56 ng·h/mL auf 708 ± 304 ng·h/mL gesteigert werden. Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuartiges mechanisches Antrummodell entwickelt, mit dem der Einfluss antraler Kontraktionswellen auf die Tendenz zur Entleerung von Objekten untersucht wurde. Große, starre Objekte wie eine Glaskugel wurden aufgrund ihrer geringen Reibung vor der Welle hergeschoben und aus dem Modell entleert. Auch die reibungsverminderte Oberfläche eines Cryogel-Schaums erhöhte die Tendenz zur Entleerung aus dem Modell. Vielversprechend war dagegen die unter allen variablen Testbedingungen beobachtete Gastroretention eines Trichobezoars. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass weiterhin eine große Herausforderung in der Entwicklung von Arzneiformen besteht, die eine nachweisliche Gastroretention beim Menschen in Abwesenheit von Nahrung zeigen.
Der Einfluss der Nahrungsaufnahme auf die Wirkstofffreisetzung aus oral applizierten Darreichungsformen ist eine der zentralen Fragestellungen der Biopharmazie. In der vorliegenden Arbeit wurden die physiologischen Faktoren, die die Wirkstofffreisetzung aus festen oralen Darreichungsformen im postprandialen Magen beeinflussen können, näher charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde ein biorelevantes In vitro-Freisetzungsmodell (Fed Stomach Model, FSM) entwickelt, das die Simulation mechanischer Beanspruchungen bei der Passage des postprandialen Magens ermöglicht. In speziellen Durchflusszellen konnten die Bewegungen der Arzneiform im Magen, intragastral auftretende Drücke sowie der Mediendurchfluss individuell kontrolliert und in physiologischen Größenordnungen simuliert werden. Die Eignung des FSM wurde anhand einer Zweischicht-Retardtablette mit dem Wirkstoff Diclofenac-Natrium untersucht. Die regionalen Besonderheiten des Magens hinsichtlich der mechanischen Beanspruchungen wurden dabei in Testprogrammen für den Fundus, das Antrum und die Magenentleerung berücksichtigt. Diese wurden, basierend auf den Ergebnissen einer Magnetic Marker Monitoring-Studie, ferner in drei verschiedenen Testszenarien, die das gastrale Lokalisationsverhalten einer oralen Arzneiform im postprandialen Magen über eine Dauer von 4 h beschreiben, in unterschiedlicher Abfolge miteinander kombiniert. Es konnte in Abhängigkeit der simulierten Testszenarien ein verschiedenartiges Freisetzungsverhalten der untersuchten Arzneiform beobachtet werden. Dabei führte die Simulation der milden Beanspruchungen im Fundus zu relativ geringen Freisetzungsraten. Aus den starken mechanischen Beanspruchungen, die die physiologischen Bedingungen im Antrum und während der Magenentleerung abbildeten, resultierten hingegen höhere Wirkstofffreigaberaten. Der Physiologie des Magens entsprechend, vermag das FSM die mechanischen Beanspruchungen, die potentiell auf eine feste orale Arzneiform einwirken, mit geringen Scherraten, aber mit kurzzeitig hohen Scherkräften zu simulieren. Das FSM wurde erfolgreich als ein biorelevantes In vitro-Freisetzungsmodell etabliert, das speziell die mechanischen Besonderheiten der Magenpassage einer festen oralen Darreichungsform berücksichtigt. Es kann dementsprechend die Entwicklung robuster Arzneimittel mit minimiertem Nahrungsmitteleffekt unterstützen, indem ein ungewünschtes Wirkstofffreigabeverhalten einer Formulierung frühzeitig identifiziert werden kann. Eine Magnetresonanztomographie (MRT)-Studie mit 12 gesunden Probanden lieferte erstmals Erkenntnisse zu den Volumina und Fettgehalten des Mageninhaltes nach Einnahme der hochkalorischen und fettreichen FDA-Standardmahlzeit. Der Mageninhalt wird gemeinhin als Auflösungsmedium für den in der Arzneiform enthaltenen Wirkstoff betrachtet, weshalb das zur Verfügung stehende Volumen ein entscheidender Faktor bei der Wirkstofffreisetzung ist. Das Mageninhaltsvolumen (gastric content volume, GCV) betrug nüchtern 31 ± 19 mL. Die Einnahme der Standardmahlzeit führte zu einem Anstieg des GCV auf 580 ± 38 mL. Verbunden mit dem nach Nahrungsaufnahme ebenfalls hohen Fettgehalt des Mageninhaltes von durchschnittlich 9,5 ± 1,0 %, kann dies eine Erhöhung der oralen Bioverfügbarkeit schlecht wasserlöslicher Arzneistoffe im Vergleich zur Nüchternapplikation bedingen. Während das GCV aufgrund der sich initial ausgleichenden Sekretions- und Entleerungsraten über 50 - 90 min relativ konstant war, überwog im Anschluss die Magenentleerung. Das GCV nahm dabei mit einer Rate von 1,7 ± 0,3 mL/min ab. Die Gabe von 240 mL Wasser 30 min nach Beginn der Nahrungsaufnahme führte zu einer kurzzeitig veränderten Magenentleerungskinetik. Das zugeführte Wasser wurde jedoch innerhalb kurzer Zeit aus dem Magen entleert. Bei entsprechend schneller Freisetzung eines Wirkstoffes aus der Arzneiform besteht somit die Möglichkeit, dass der Arzneistoff den Magen zügig mit dem parallel eingenommenen Wasser verlässt. Es wurde ferner gezeigt, dass selbst mehr als 6 h nach Nahrungsaufnahme sowohl das GCV als auch der Fettgehalt des Mageninhaltes im Vergleich zum Nüchternzustand signifikant erhöht waren. In klinischen Studien, bei denen die hochkalorische und fettreiche Standardmahlzeit verwendet wird, kann dementsprechend für mindestens 5 - 6 h von postprandialen Bedingungen ausgegangen werden. Die sich daraus ergebenden mechanischen und physikochemischen Besonderheiten müssen bei der Beurteilung der Studienergebnisse unbedingt berücksichtigt werden. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse zur Optimierung der Testbedingungen von biorelevanten In vitro-Freisetzungsmodellen beitragen. Die In vitro- und In vivo-Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegten, dass die Bedingungen innerhalb des postprandialen Magens kritisch für die Wirkstofffreisetzung aus festen oralen Darreichungsformen sind. Die genaue Charakterisierung der Magenpassage ist für die Beurteilung von Nahrungsmitteleffekten somit von großer Bedeutung.
In the search for new antifungal agents, this study dealt with the antimicrobial screening, extraction, isolation, structural elucidation as well as selective biological investigations of the isolated compounds. In addition, the impact of the culture conditions on growth and on biosynthesis of bioactive compounds was also studied. Besides, selective cyanobacteria were axenized and the taxonomy as well as the genetic relationship of axenic cyanobacteria that produced bioactive compounds with some other cyanobacteria was identified basing on the 16S rRNA gene sequences. 22 Vietnamese and 6 German cyanobacterial strains were screened for their antifungal activity using the agar diffusion assay. Among them, the MeOH/water extract from the biomass obtained from a laboratory culture of strain Bio 33, isolated from the Baltic Sea near Rügen Island, exhibited a specific antifungal activity against Candida maltosa and others human pathogenous fungi such as Candida albicans, Candida krusei, Aspergillus fumigatus, Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum and Mucor sp. Besides, it was very impressed that extracts of strain Bio 33 showed no antibacterial activity against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, and Staphylococcus aureus. The taxonomy basing on 16S rRNA gene sequence of the axenic Bio 33 identified this strain as Anabaena cylindrica species. As a result of the bioassay-guided fractionation of the crude MeOH/water extract, four new lipopeptides, named balticidins A – D, were isolated. These lipopeptides represent a new structural type with the co-occurrence of a glycosylated cyclic peptide, a fatty acid containing chlorine and a disaccharide moiety. The main active fraction isolated from the MeOH/water extract of the biomass of Bio 33 which contains the four lipopeptides exhibited only marginal cytotoxic activity against the human bladder carcinoma cell line 5637 (IC50 = 93 μg/ml). The weak cytotoxic activity and the absence of antibacterial effects in the used in vitro test systems opens a promising future for further investigations to clarify the antifungal mechanism and for in vivo applications of the new lipopeptides. Different media, temperature, light intensity and period of irradiance, the depletion of nitrate and the trace element cobalt were investigated to figure out conditions at which Bio 33 produces maximum of balticidins under laboratory conditions. Temperature was the most apparent factor influencing the growth of Bio 33 and the production of balticidins. Bio 33 grew best in BG 11 medium plus 0.5% NaCl at 26°C, under white fluorescent continuous light and a light intensity of 20 μmol photons m-2 s-1. Nevertheless, under the same conditions, 22.5°C was the best temperature for the production of balticidins. Besides, harvesting of Bio 33 during the logarithmic growth phase, particularly at 20th day, should supply approximately maximum quantity of balticidins. At 22.5°C and 20 μmol photons m-2 s-1 under 24 h continuous irradiance, the depletion of nitrate had no negative effect on the growth and concentration of balticidin A but increased balticidin B and decreased balticidin C; the absence of cobalt slightly decreased the growth but had no clear effect on the production of balticidins. On the other hand, extracts of the culture medium of the Vietnamese cyanobacterium TVN40, exhibited antifungal activity against Candida maltosa and weak antibacterial activity. Extraction of the culture medium with XAD-16 and elution of the XAD-bounded compounds by different solvents resulted in five fractions (water, 80% MeOH, 100% MeOH, acetone, dichloromethan). Four compounds have been isolated from the 80% MeOH fraction and one was identified as a dioxindole derivative. Structural elucidation of the other three compounds is still in progress. TVN40 was formerly identified as an Anabaena sp. according to the morphological properties, but the 16S rRNA gene sequence confirms that the strain belongs to the genus Nostoc. Microscopic examination of TVN40 revealed that the filamentous strain was not a unialgal but a mixed culture with strange round cells (SRCs) - a unicellular cyanobacterium belonging to the order Chroococcales. Laboratory cultures of the pure filamentous strain TVN40, the isolated SRCs and the mixed culture of both strains were established. Both TVN40 and SRC culture media were responsible for the antibacterial activity against B. subtilis, S. aureus and E. coli. However, only the extract of the culture medium of TVN40 was active against C. maltosa. The supplement of cobalt enhanced the antimicrobial activity of the culture medium. Pure strains showed higher activity in comparison to the mixed culture of TVN40 and SRC.
Im Fokus dieser Arbeit standen die Wechselwirkungen zwischen nicht-thermischem Atmosphärendruck-Plasma und in-vitro kultivierten Keratinozyten (HaCaT-Keratinozyten) und Melanomzellen (MV3). Für die Untersuchungen wurden drei Plasmaquellen unterschiedlicher Bauart genutzt; ein Plasmajet (kINPen 09) und zwei Quellen, die das Plasma mittels der dielektrisch behinderten Entladung (Oberflächen-DBE, Volumen-DBE) generieren. Um grundlegende Effekte von Plasma auf Zellen analysieren zu können, wurde zunächst der Einfluss von physikalischem Plasma auf die Vitalität; die DNA und die Induktion von ROS untersucht. Folgende Methoden wurden verwendet: - Vitalität: - Neutralrotassay, Zellzählung (Zellzahl, Zellintegrität) - BrdU-Assay (Proliferation) - Annexin V und Propidiumiodid- Färbung, Durchflusszytometrie (Induktion von Apoptose) - DNA: - Alkalischer Comet Assay (Detektion von DNA-Schäden) - DNA-Färbung mit Propidiumiodid, Durchflusszytometrie (Zellzyklusanalyse) - ROS: - H2DCFDA-Assay, Durchflusszytometrie (Bestimmung der ROS-positiven Zellen) Neben den Folgen die die Plasmaquellen induzieren wurde weiterhin untersucht, welchen Einfluss das Behandlungsregime (direkt, indirekt, direkt mit Mediumwechsel), das Prozessgas (Argon, Luft) und die zellumgebenden Flüssigkeiten (Zellkulturmedien: IMDM, RPMI; Pufferlösungen: HBSS, PBS) auf das Ausmaß der Plasma-Zell-Effekte hatten. Die Verwendung aller Plasmaquellen führte in HaCaT-Keratinozyten und Melanomzellen (MV3) zu Behandlungszeit-abhängigen Effekten: - Verlust an vitalen Zellen und verminderte Proliferationsfähigkeit - Induktion von Apoptose nur nach den längsten Plasmabehandlungszeiten - DNA-Schäden 1 h nach Plasmabehandlung, nach 24 h deutlich weniger bzw. nicht mehr nachweisbar, Hinweise für DNA-Reparatur vorhanden - Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase zulasten der G1-Phase 24 h nach Plasmabehandlung - Anstieg der ROS-positiven Zellen 1 h und 24 h nach Plasmabehandlung Es wurde gezeigt, dass in RPMI-Medium kultivierte Zellen sensitiver, in Form von verminderter Vitalität und vermehrten DNA-Schäden, reagierten als in IMDM-Medium gehaltene Zellen. Aber auch während der Plasmabehandlung in Pufferlösungen (HBSS, PBS) gehaltene HaCaT-Zellen wiesen DNA-Schäden auf. Die direkte und indirekte Plasmabehandlung führte zu nahezu gleichen Ergebnissen. Ein Wechsel des Zellkulturmediums direkt nach der Plasmabehandlung schwächte alle gemessenen Effekte ab. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass neben der Art der Flüssigkeit und Behandlungszeit auch der Inkubationszeitraum der Zellen mit der in Plasma in Kontakt gekommenen Flüssigkeit von essentieller Bedeutung ist. Die durch Plasma induzierten reaktiven Spezies gelangen in die Flüssigkeit und interagieren mit den Wassermolekülen und den organischen Molekülen der Zellkulturmedien, welche langlebige Radikale (z.B. H2O2) bilden, die dann ihrerseits mit zellulären Molekülen reagieren. Die anderen Plasmakomponenten wie UV-Licht und elektrische bzw. magnetische Feldern scheinen nur eine untergeordnete Rolle in der Plasma-Zell-Interaktion zu spielen, da diese nur bei der direkten Behandlung mit den Zellen in Berührung kommen und die starken Auswirkungen nach der indirekten Behandlung nicht verursachen können. Die in diesen Untersuchungen verwendete Oberflächen-DBE konnte mit Luft oder mit Argon als Prozessgas betrieben werden. Wurde Argon als Prozessgas genutzt, kam es zu milderen Auswirkungen im Vergleich zur Plasmabehandlung im Luftmodus. Mit Luft generiertes Plasma weist neben ROS auch RNS in der Gasphase auf, letztere lassen sich im Argon-Plasma nicht nachweisen und stehen für Plasma-Zell-Interaktionen nicht zur Verfügung. Zusätzlich zu den humanen Keratinozyten wurden auch humane Melanomzellen mit Plasma (Oberflächen-DBE/Luft) behandelt. Im Vergleich zu den HaCaT-Zellen sind bei den MV3-Zellen geringere Behandlungszeiten nötig, um biologisch gleichwertige Effekte zu bewirken. Die hier verwendeten Testmethoden eignen sich für die biologische Charakterisierung von neuen Plasmaquellen bzw. für die Analyse von Plasma-Zell-Wechselwirkungen weiterer Zelllinien. Tiefergehende Untersuchungen, z.B. bezüglich der genaueren Spezifizierung der durch Plasma hervorgerufenen oxidativen DNA-Schäden und den daraus resultierenden Reparaturmechanismen, sollten folgen.
In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has drawn more and more attention to the field of wound healing research during the last two decades. It is characterized by a unique composition, which includes amongst others free radicals, ions and electrons. Furthermore, non-thermal plasma exhibits temperatures that are below those inducing thermal cell damage. Next to its well-established anti-bacterial properties, plasma can have lethal as well as stimulating effects on mammalian cells. Therefore, the medical application of non-thermal plasma on chronic wounds seems to be a promising tool to enable healing processes. However, less is known about the plasma-mediated induction of intracellular signaling pathways in human immune cells, which play a leading part in the process of wound recovery and removal of pathogens. Therefore, this thesis examined the cellular effects of a non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on human immune cells using the argon plasma jet kinpen 09. Here, the CD4+ T helper cell line Jurkat, the monocyte cell line THP-1 as well as the corresponding primary cells were investigated. First, cell survival and apoptosis induction was assessed in response to non-thermal plasma treatment by growth curves and flow cytometric assays. On the one hand it could be shown that primary cells are more susceptible to plasma treatment than the respective cell lines. On the other hand, monocytes responded less sensitive to plasma exposure than lymphocytes. Furthermore, this thesis outlined the impact of non-thermal plasma treatment on the gene expression level of immune cells. Therefore, DNA microarray analysis was performed with the cell lines Jurkat and THP-1. It became obvious that plasma exposure modulated the expression of several genes in both cell types. Differential expression of distinct target genes was further validated by quantitative PCR in the immune cell lines. Here, elevated gene expression levels of JUN and FOS in Jurkat cells and increased transcription of JUND in THP-1 cells in response to plasma treatment were made visible. JUN, FOS and JUND are components of the transcription factor AP-1, which is involved amongst others in gene expression of IL-8 and HMOX-1. Consequently, transcriptional induction of the inflammatory cytokine IL-8 as well as the enzymes HMOX-1 and GSR was detected in plasma-treated THP-1 cells. In addition, alterations in the protein activation levels were analyzed in plasma-treated Jurkat, THP-1 cells and primary monocytes. Since some of the identified target genes are known to be associated with the MAPK pathways, the regulation of these cascades was further investigated by western blot analysis. In all investigated cell types the pro-proliferative signaling molecules ERK 1/2 and MEK 1/2 as well as the pro-apoptotic signaling proteins p38 MAPK and JNK 1/2 were activated in a plasma treatment time dependent manner. In contrast to Jurkat and primary monocytes, the anti-apoptotic HSP27 was only induced in THP-1 cells in response to plasma exposure. Moreover, modulation of cytokine production and secretion was examined in the different immune cell types and co-cultured THP-1 and HaCaT keratinocytes by ELISA or flow cytometry. While Jurkat cells showed no plasma-mediated regulation of cytokine expression, THP-1 cells revealed an increased IL-8 secretion after long plasma time duration (360 s). Additionally, the intracellular expression levels of IL-6 and IL-8 were modulated in primary monocytes by plasma exposure. While short plasma treatment caused no alteration of the number of cells expressing IL-8 an up-regulation of the intracellular IL-6 level occurred after 30 s of plasma treatment. Long plasma treatment times resulted in a significant decrease of the intracellular IL-8 and IL-6 production levels. Furthermore, co-cultured THP-1 and HaCaT cells as well as mono-cultured THP-1 and HaCaT cells were examined regarding their cytokine secretion profile. Here, cells treated with plasma (180 s) as well as LPS and plasma (180 s and LPS) were compared with untreated cells. IL-6, IL-8 and GM-CSF secretion was induced by both plasma and plasma combined with LPS treatment in mono-cultivated HaCaT cells and co-cultured cells. Though, the highest cytokine secretion levels were reached in the plasma and LPS exposed co-culture. In contrast, mono-cultivated THP-1 cells only showed an increased secretion of IL-6, IL-8 and TNFa after incubation with plasma together with LPS exposed medium. In conclusion, this study revealed for the first time the non-thermal plasma-modulated expression of numerous genes and cytokines and the activation state of various signaling cascades in human immune cells. Thus, it contributes to gain a better understanding of the immune-modulatory impacts of plasma that might promote the wound healing process.
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
Accelerated drug release tests are essential for quality control (QC) of long acting (non-oral) controlled release formulations. Real-time release experiments are usually required for product development, to understand the mechanism of release and to establish a correlation with in vivo release. Ideally, the accelerated test should maintain the biorelevant aspect of the in vitro method and the mechanism of release should not change under accelerated test conditions. At the same time adequate discriminatory ability is a prerequisite as the accelerated test should be able to discriminate between batches with respect to manufacturing variables that can impact on bioavailability. The objective of this thesis was to develop accelerated drug release tests for intravaginal rings (IVRs) and to gain a mechanistic understanding of the principles that facilitate in vitro drug release under accelerated test conditions. A detailed evaluation of the in vitro release characteristics of the formulations under real-time test conditions was considered as a prerequisite for developing predictive accelerated tests. Two formulations were subject of this study, in which the mechanism of release is primarily governed by drug diffusion. One formulation was the commercially available Nuvaring®, a combined hormonal contraceptive IVR that releases etonogestrel and ethinylestradiol with a constant rate over a duration of 3 weeks. The second formulation was a prototype of an investigational IVR that is supposed to be bioequivalent to the marketed formulation. The Nuvaring® provides an example of a reservoir system in which a membrane mediates diffusion, resulting in release rates that are almost constant with time, whereas the investigational IVR is a matrix-type IVR. In these devices drug release is driven by Fickian diffusion through a homogeneous matrix and decays with time. Both IVRs are based on different grades of polyethylene vinyl acetate (PEVA). Accelerated drug release tests were performed at elevated temperature and in hydro-organic solvents since these two parameters were expected to increase drug diffusion through the semicrystalline EVA copolymer. Release experiments with IVRs or endcapped segments were performed in an incubator shaker. The devices were placed in stoppered flasks containing an adequate release medium that was continuously shaken and completely replaced at predetermined time points. Release experiments with endcapped segments were also performed in a small volume version of UPS apparatus 7 (the Reciprocating Holder). Results from release experiments in these two setups were in general comparable when the release from segments was standardized to release per ring with respect to the mass ratio (segment/IVR). Real-time drug release in an aqueous release medium at a temperature of 37 °C from the Nuvaring® was slightly affected by variations in the in vitro test conditions, i.e. media volume and composition (addition of solubility enhancing agents). These variations, however, did not affect the release kinetics that continued to be zero-order with exception of the initial burst. In contrast, real-time drug release from the matrix IVR was affected by the steroid solubility in the release medium, increased with increasing media volume and reached a maximum in release media containing solubility enhancing agents, resulting in distinct release kinetics. Interestingly the steroid solubility had a distinct influence on the release rate under conditions that are commonly assumed to provide sink conditions. Even under experimental conditions that provided minimum drug solubility, the concentration of ethinylestradiol in the receptor medium never exceeded 3 % of the saturation solubility. Accelerated drug release from both IVRs could be observed after exposure to elevated temperature and/or hydro-organic release media. Overall, increased drug release in different hydro-organic media correlated with polymer swelling. The higher swelling capacity of the investigational IVR, when compared with the Nuvaring®, was accounted for a stronger degree of acceleration in different hydro-organic release media. These observations were in agreement with literature sources that report that swelling as well as diffusivity in EVA copolymers increases with increasing VA content, which is lower in the rate-controlling membrane of the Nuvaring®. For the investigational IVR a good correlation between accelerated and real-time release profiles could be obtained if changes in steroid solubility under accelerated conditions were taken into consideration. For example, a good correlation could be observed between accelerated release profiles in hydro-organic media and real-time release profiles in media containing surfactants that provide maximum drug solubility and thus eliminate boundary layer effects. This observation appears reasonable since hydro-alcoholic release media also enhance steroid solubility in the receptor compartment. In case of the Nuvaring® variations in the in vitro test parameters under real-time test conditions did not affect the release kinetics. For this IVR, the mechanism of release was maintained in hydro-organic release media and at elevated temperature. The quantitative relationship between the zero-order release constants and the test temperature could be described by the Arrhenius equation, indicating that accelerated release is governed by an increase in drug diffusion. Validation of the accelerated method with a prototype of the investigational IVR with a different drug load demonstrated that the accelerated methods were able to detect formulation changes with similar discriminatory ability as the real-time test. However, the temperature-controlled accelerated method was less sensitive to detect changes in the release characteristics of a Nuvaring® that have been induced by preliminary heat-treatment, indicating that the accelerated method may be less sensitive to detect changes in IVRs that are a result of physical aging. When the aim is to develop an accelerated method for batch release it is therefore crucial to validate the accelerated method with appropriate samples from non-conforming batches that are out of specification under real-time test conditions and have been obtained by small but deliberate variations in the critical process parameters. In both formulations the degree of acceleration could be further increased by combining the effect of hydro-organic release media with an increase in temperature. Under these test conditions the ability to differentiate between the different prototypes of the investigational IVR was maintained. Moreover, in both IVRs the mechanism of release was not affected by an additional increase in temperature when compared with release profiles in hydro-organic solvents. In conclusion, the results of this study indicate that both temperature and hydro-organic release media are valid parameters to accelerate drug release from delivery systems in which the mechanism of release is primarily governed by diffusion through dense (inert) polymer matrices (i.e. inserts, implants). A correlation between real time and accelerated release will be facilitated if drug release under real-time test conditions is independent of the test parameters. To assure the outcome of the test with respect to quality and safety it is crucial to validate the accelerated method with appropriate batches.
Die Bedeutung der endothelialen Mechanotransduktion für vaskuläre Implantate: Das Apelin/APJ-System.
(2014)
Bei der Behandlung atherosklerotischer Gefäße mit vaskulären Implantaten spielt nicht nur die endotheliale Dysfunktion eine wichtige Rolle. Auch die Fähigkeit des Implantatmaterials, sich an die Gefäßwand anzupassen und dessen Biokompatibilität, sind von großer Bedeutung. Die Entwicklung von wirkstofffreisetzenden Stents (DES) konnte die Risiken nach Stentimplantation signifikant reduzieren. Jedoch gibt es Hinweise darauf, dass diese polymerbeschichteten DES Ursache für die Entstehung von Stent Thrombosen (ST) sein können - eine potentiell tödliche Komplikation. Die mechanischen Eigenschaften eines Materials, das in ein Gefäß eingebracht wird, können einen großen Einfluss auf die umliegenden Zellen haben. Die Bedeutung einer solchen Veränderung in der Umgebung einer Zelle und der Einfluss auf deren mechanische Eigenschaften und biologische Funktionen wird immer häufiger als Ursache für die Entstehung von In-Stent-Restenose (ISR) und ST diskutiert. Das Endothel dient als einzigartige Barriere zwischen dem fließenden Blut und der Gefäßwand, wodurch es permanent mechanischen Reizen ausgesetzt ist. Mechanosensitive Strukturen auf der Zelloberfläche übersetzen diese Stimuli in biochemische Signale. Die anschließende Translation in downstream Effekte moduliert die Zellfunktion. Zu dem mechanosensorischen Komplex um PECAM-1 gehören auch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), welche an der flussabhängigen Regulation der NO-Freisetzung beteiligt sind. Im kardiovaskulären System werden der GPCR APJ und sein spezifischer Ligand Apelin vor allem von Endothelzellen und endokardialen Zellen exprimiert. Die Apelin-Isoformen Apelin-12 und Apelin-13 wurden in diesem Zusammenhang bisher als bioaktiv beschrieben. Obwohl das apelinerge System in vielen vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, wurde es bisher nicht als Überträger mechanischer Reize in Betracht gezogen. In diesem Kontext ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, zunächst die physiologische Rolle des Apelin/APJ-Systems als Mechanotransducer in humanen Endothelzellen in einem in vitro Zellperfusionsystem zu charakterisieren. Weiterhin soll der Einfluss von Stentpolymeren auf die Zellfunktion und die endotheliale Mechanotransduktion untersucht werden.
HPMC (Hydroxypropylmethylcellulose) based hydrophilic gel matrix tablets are one of the most commonly used monolithic extended release dosage forms used in the pharmaceutical industry. Drug release from the hydrated HPMC matrix is generally controlled by either diffusion or erosion, or a combination of both. Several studies have shown that for HPMC-based matrices with a high amount of poorly water-soluble additives, erosion is the predominant release mechanism. Erosion rates of these formulations vary significantly with changes in the matrix composition. Depending on the erosion rate, the drug delivery might occur over a shorter or longer time span and thus to different sites of action that are proximal or distal gastrointestinal tract (GIT). Erosion rates of HPMC-based matrices can be modulated by changing the amount and molecular weight of the HPMC. In the present study, four different HPMC-based hydrophilic matrix formulations developed by AstraZeneca R&D, Sweden, were investigated for in vitro as well as in vivo erosion behavior. Formulations F1, F2, and F3 consist of 40% HPMC, which is a mixture of two different HPMC viscosity grades (Methocel K100LV and Methocel K4M). Formulations F1, F2, and F3 contained 23%, 10%, and 0% of Methocel K4M, respectively, while formulation F4 was composed of 20% Methocel K100LV. Calcium hydrogen phosphate dihydrate (a poorly water-soluble compound) was used as the filling excipient. The in vitro HPMC release from the matrices was investigated using a USP dissolution apparatus II equipped with a stationary basket in a phosphate buffer (PB) pH 6.8 and simulated gastric fluid without pepsin (SGFsp) pH 1.2 at various rotation speeds. The HPMC concentration in the dissolution samples were analyzed using size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering and refractive index detectors (SEC-MALS/RI). In order to establish a correlation function between the magnetic moment and HPMC release, the formulations were tested in a magnetic moment dissolution tester (MMDT), a modified in vitro dissolution apparatus equipped with a magnetometer. The in vivo gastrointestinal imaging and erosion behavior of the tablets were investigated by magnetic marker monitoring (MMM) using a superconducting quantum interference devices (SQUIDs) sensor system in five healthy male volunteers at Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB), Berlin. All formulations were administered after an overnight fast of at least 10 hours. However, formulations 3 and 4 were also administered 30 minutes after a standard FDA breakfast. The in vivo HPMC release was calculated using the correlation function from the recorded in vivo magnetic moment data. A linear correlation function was not observed, since the decrease of the magnetic signal was driven by both erosion and diffusion. The in vitro and in vivo erosion-time profiles show that erosion was strongly dependent on the composition of the formulation. The formulations containing a larger proportion of high molecular weight HPMC, or a higher content of HPMC, exhibited relatively slower erosion rates and vice versa. However, unlike in vitro erosion rates, the in vivo erosion rates for different formulations did not always significantly differ from each other. In vivo erosion rates of the investigated formulations were significantly higher under postprandial administration than under fasted state administration. No rapid disintegration of any of the formulations (that is, formulation failure that can potentially cause dose dumping) was observed. A good linear (point-to-point) correlation between the in vitro HPMC release at 50 rpm in PB pH 6.8 and the in vivo HPMC release was observed for all formulations in the individual volunteers for both administration conditions. The predictability of the in vivo HPMC release for all formulations in fasting as well as postprandial administrations was better with phosphate buffer pH 6.8 at 50 rpm in comparison to SGFsp pH 1.2 or higher stirring rate in phosphate buffer pH 6.8. In postprandial administrations, the gastric emptying time was significantly delayed compared to fasting administrations. For postprandial administrations, the localized erosion rate in the distal stomach was significantly higher than in the proximal stomach. The in vivo HPMC release of the investigated formulations under both intake conditions was not dependent on the motility of the tablet in the gastrointestinal tract. The in vivo HPMC release for all the investigated formulations when administered under fasting conditions was underestimated, while under postprandial conditions, the HPMC release was overestimated by the in vitro dissolution method in PB pH 6.8 at 50 rpm.
Die vorliegende kumulative Dissertation beschäftigt sich mit Anwendungstechniken und Strategien in der HPLC mit dem Ziel, die Möglichkeiten moderner pharmazeutischen Analytik aufzuzeigen und zu optimieren. Schwerpunkte der Untersuchungen liegen dabei einerseits auf dem Gebiet der Enantiomerenanalytik mittels Circulardichroismus-Spektroskopie (CD) sowie ferner auf dem wichtigen Aspekt der Charakterisierung und Auswahl stationärer Phasen, unter erstmaliger Einbeziehung neuartiger calixaren-gebundener Phasen. Ein weiterer Schwerpunkt in der Arbeit war es, Optimierungsstrategien für die Entwicklung von HPLC-Methoden zu erarbeiten, wozu chromatographische Modelling-Programme genutzt wurden. Auch hier wurden neue Erkenntnisse durch die Testung der Calixarenphasen im Vergleich mit einigen anderen kommerziellen Packungsmaterialien gewonnen. Die Bewertung der Fähigkeit von verschiedenen Calixarenen zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen mit chiralen pharmazeutischen Wirkstoffen in verschiedenen Lösungen (Acetonitril, Methanol und Wasser), einschließlich der Vergleiche von wasserlöslichen Calixarenen und drei pharmazeutisch relevanten Cyclodextrinen mittels CD-Spektroskopie wurde durchgeführt. Dabei konnte ein Beitrag zum Verständnis des Mechanismus der Komplexbildung, basierend auf den CD-Spektren der Wirkstoffe mit unterschiedlichen Wirtsmakrozyklen geleistet werden. Eine systematische Bewertung der Anwendbarkeit einer chromatographischen Modellierungssoftware für calixaren- und resorcinaren-gebundene stationäre Phasen und einiger anderer relativ neuer Umkehrphasensäulen im Vergleich mit konventionellen Alkyl-gebundenen Phasen wurde erstmals durchgeführt, um die Genauigkeit der Vorhersage der Retentionszeiten zu überprüfen und die Ergebnisse von zwanzig verschiedenen Säulen zu vergleichen. Als praktische Anwendung wurden HPLC-Methoden für die simultane Trennung von einigen der wichtigsten Lokalanästhetika auf der Grundlage QbD-Prinzipien mit einer systematischen Vorgehensweise und experimentellem Design entwickelt, wobei ein oder mehrere Faktoren gleichzeitig geändert wurden. Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Relevanz moderner Anwendungstechniken und Optimierungsstrategien in der HPLC für die erfolgreiche Entwicklung von analytischen Methoden dargestellt werden. Ein grundlegendes Instrument ist die Computersimulation, die das Verständnis und die Visualisierung von chromatographischen Verhalten in silico ermöglicht und damit die experimentelle Belastung deutlich reduziert, was aber in der Regel mit der Erreichung robuster Methoden verbunden ist.
Koronare Drug-eluting Stents sind röhrenförmige, netzartig aufgebaute, medizinische Implantate aus meist metallischen Grundkörpern, die zur Vermeidung eines erneuten Gefäßverschlusses mit Wirkstoff beschichtet sind. Derzeit finden die Beschichtungen der Stents typischerweise über speziell entwickelte Einzelbeschichtungsverfahren statt, die es ermöglichen, die feingliedrige und fragile Struktur der Implantate zu beschichten. Wesentliche Nachteile dieser Verfahren liegen allerdings in hohen Materialverlusten und geringer Fertigungs¬menge, die zu hohen Produktionskosten führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung von Stents eingesetzt werden kann. Die Wirbelschichttechnologie stellt ein etabliertes Verfahren zur Beschichtung von Partikeln im Großmaßstab mit geringen Verlusten dar. Obwohl in der Literatur das Verhalten verschiedener Partikel (Größe, Form, Dichte) in der Wirbelschicht beschrieben ist, wurde das Verhalten von netzartig aufgebauten Hohlkörpern noch nicht untersucht. Inwiefern sich die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung der fragilen Stents eignet, ist daher nicht vorhersagbar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine Beurteilung hinsichtlich der Anwendbarkeit des Wirbelschichtverfahrens zur Beschichtung von Stents erfolgen. Dazu wurde das Fluidisierungs-verhalten der Körper unter Verwendung verschiedener Anströmböden untersucht. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Prozessparameter, verschiedener Beschichtungsrezepturen und Stenttypen auf die Qualität der Beschichtung untersucht. Dazu wurden die beschichteten Körper hinsichtlich Homogenität und Defekte der Oberfläche, ihrer Robustheit gegenüber mechanischen Einflüssen, der Schichtverteilung und Gehaltsgleichförmigkeit und des Wirkstofffreisetzungsverhaltens untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Stents den Partikel der Geldart- Klasse D zugeordnet werden und die Beschichtungen der Stents erfolgte unter Verwendung eines speziell angefertigten konisch ausgeformten Anströmbodens. In Versuchen mit verschiedenen Beschichtungsmaterialien war es möglich typischer Weise auftretende Beschichtungsdefekte und präventive Gegenmaßnahmen zu identifizieren. So zeigte sich, dass es unter Verwendung von wässrig dispergierten Beschichtungsmaterialien die Bildung von Brücken oder Schwimmhäuten ausblieb, während diese typischer Weise unter Verwendung von organisch gelösten Beschichtungsrezepturen auftraten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es durch Anpassung der Prozessparameter möglich war Beschichtungen mit hoher Qualität zu erzeugen. Dabei wurden unabhängig von der Lackrezeptur leichter Abrieb, Risse oder Deformationen der Stentgrundkörper vor allem an den Stentenden beobachtet, da die Stents während des Beschichtungsprozesses einer starken mechanischen Belastung ausgesetzt waren. In Versuchen mit unterschiedlichen Auftragsmengen beziehungsweise Prozesszeiten und unterschiedlich langen Stents konnte gezeigt werden, dass die Defekte unter gleichbleibenden Bedingungen mit zunehmender Prozesszeit und abnehmender Stentlänge zunehmen. Zudem zeigte sich, dass auch die Prozessparameter und Flexibilität der Beschichtung Einfluss auf den Anteil defekter Stents nimmt. Durch Adaptierung des Beschichtungsprozesses ist es entsprechend möglich die Defekte zu reduzieren. In der Regel wurde ein etwas höherer abluminaler Schichtauftrag erzielt, wobei die Schicht homogen über die gesamte Stentlänge verteilt war. Es resultierten üblicherweise Abscheideraten des Beschichtungslackes von 40 - 50 % und darüber hinaus konnten durch die gleichzeitige Beschichtung einer hohen Stückzahl von Grundkörpern Fertigungsmengen von umgerechnet bis zu 25 Stents pro Minute erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Wirbelschichttechnologie ein vielversprechendes Verfahren zur Beschichtung von Stents im Großmaßstab darstellt, das in Bezug auf Ausbeute und Fertigungsmenge den derzeit herkömmlich verwendeten Beschichtungstechnologien überlegen ist, wobei die Qualität der erzeugten Beschichtungen vergleichbar mit der Beschichtungsqualität herkömmlich beschichteter Stents ist.
Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten Methoden und Systeme kombinieren. Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus 30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen. Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen Schlauch zugeführt wurde, separiert. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt, während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen ausschließlich bei Körpertemperatur. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden. In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse¬systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden. Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten Pumpen lieferte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.
Das Ziel biorelevanter Freisetzungsmethoden ist es, bereits in vitro prädiktive Aussagen zu treffen, wie die Freisetzung einer Arzneiform in vivo aussehen wird. Während basierend auf den physiologischen Gegebenheiten des Gastro-Intestinal-Traktes von Erwachsenen in den vergangenen 15 Jahren bereits viele solcher Methoden etabliert worden sind, fehlen sie für Kinder verschiedenster Altersklassen. Im Fokus dieser Arbeit stand deswegen, die Grundlagen sowohl der gastro-intestinalen Physiologie als auch der Ernährung der pädiatrischen Population zu legen und erste biorelevante Freisetzungskonzepte und –medien für diese Altersgruppen zu entwickeln. Entwickelt wurden verschiedene Methoden und Medien zur Simulation des Magens, sowohl unter nüchternen als auch unter postprandialen Bedingungen, von Neugeborenen (Kinder im ersten Lebensmonat) sowie Kleinkindern (2. bis einschließlich 24. Lebensmonat). Der Magensaft eines Neugeborenen hat kurz nach der Geburt oft einen neutralen pH. Der pH-Wert im Magen wird schrittweise immer saurer, doch diese Entwicklung ist sehr inkonsistent. Somit muss für einen Freisetzungstest von einer großen, möglichen pH-Spanne ausgegangen werden. In dem entwickelten Testszenario werden sechs pH-Werte zwischen 1,8 und 7,0 mit verschiedenen Medien dargestellt. Die untersuchten Wirkstoffe wiesen eine pH-abhängige Löslichkeit auf und zeigten deswegen auch sehr unterschiedliche Freisetzungsverläufe in den verschiedenen Medien. Die Ernährung in den ersten Lebensmonaten basiert ausschließlich auf Milch, so dass darauf als Freisetzungsmedium für postprandiale Bedingungen zurückgegriffen wurde. Es wurden verschiedene Formulamilcharten sowie Kuhmilch (3,5 % Fettgehalt) getestet, wobei sich Unterschiede zwischen den einzelnen Milcharten gezeigt haben. Außerdem wurde ein Testszenario etabliert, das mit einer Mischung aus Magensaft und zur Arzneiform co-administrierten Flüssigkeiten arbeitet. Hier zeigte sich, dass die Gabe von Milch die unterschiedlichen pH-Werte des Magensafts nivellieren kann und die Freisetzung maßgeblich von den Eigenschaften der Milch dominiert wird. Für Kleinkinder wurde in die Entwicklung von Freisetzungsszenarien miteinbezogen, dass bei Einnahme einer Arzneiform unter nüchternen Bedingungen unterschiedliche Mengen Flüssigkeit dazu getrunken werden. In allen Testverfahren wurde neben der Variabilität des Trinkvolumens außerdem noch die Variabilität des pH-Wertes des Magensaftes zwischen pH 1,8 und 4,0 berücksichtigt. Hierbei zeigte sich, dass die variable Magenphysiologie als auch unterschiedliche, dazu eingenommene Flüssigkeiten bzw. -volumina das Ausmaß der Freisetzung beeinflussen können. Für die Entwicklung eines Freisetzungstests zur Simulation der postprandialen Bedingungen im Magen eines Kleinkindes wurden drei Frühstücksmahlzeiten von einjährigen Kindern ausgesucht. Aus den pürierten Mahlzeiten wurden verschiedene physikochemische Eigenschaften sowie deren Nährstoffgehalt bestimmt. Diese Informationen wurden genutzt, um neue Medien zu entwickeln, die die Eigenschaften der homogenisierten Mahlzeiten zum großen Teil imitieren, aber einfacher und einheitlicher herzustellen sind. Die Freisetzung in diesen neu entwickelten Medien wurde mit dem Standardmedium für die Freisetzung im postprandialen Magen von Erwachsenen sowie wässrigen Medien verglichen. Weder das bisherige Standardmedium noch die wässrigen Medien wiesen die gleichen Freisetzungsverläufe wie die neu entwickelten Medien auf.
Einleitung: Ausgangspunkt dieser Dissertation war das hepatotoxische Analgetikum Flupirtin, dessen Wirkung auf einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit neuronaler KV7-Kaliumkanäle beruht. Ein Vergleich mit dem ebenfalls hepatotoxischen Arzneistoff Paracetamol warf die Frage auf, ob sich dessen Toxizitäts-Mechanismus, der auf der Bildung des aktiven Metaboliten NAPQI, welcher durch oxidativen Metabolismus entsteht, auf Flupirtin übertragen lässt. Durch Synthese von Flupirtin-Analoga mit veränderten oxidativen Eigenschaften sollten neue Erkenntnisse bezüglich der Oxidierbarkeit, Wirksamkeit und Toxizität des Arzneistoffs erhalten werden. Als zusätzliche Leitstruktur wurde die mit Flupirtin verwandte, wirksame Verbindung ICA-027243 verwendet. Synthesen: Im Fokus der Derivatisierungen standen die N-Atome von Flupirtin, da diese bei der Oxidation eine entscheidende Rolle spielen. So gelang es vor allem durch gezielte Neusynthese, alle drei N-Atome um den Pyridin-Ring unabhängig voneinander einzeln oder in Kombination zu alkylieren. Ausgangspunkt des hierfür benötigten Fluorbenzylamin-Bausteins war der entsprechende Benzaldehyd, welcher durch reduktive Aminierung umgesetzt wurde. Als Pyridin-Baustein wurde 2,6-Dichlorpyridin verwendet, an welchem nach der Nitrierung ein Chloratom durch Ammoniak oder Dimethylamin substituiert werden konnte. Nach der Kondensation beider Bausteine erfolgte die Reduktion der Nitrogruppe mit anschließender Acylierung zum entsprechenden Flupirtin-Derivat. Die Alkylierung des Carbamat-NH folgte gegebenenfalls als letzter Reaktionsschritt. Weitere Verbindungen wurden auf mehr oder weniger abgewandelten Syntheserouten hergestellt. Dabei wurde Flupirtin teilweise in Richtung ICA-027243 abgewandelt und Desamino-Flupirtin-Derivate hergestellt. Variiert wurde unter anderem die Position des Pyridin-N-Atoms und die Methylenamino-Brücke zwischen den aromatischen Ringen wurde teilweise durch eine Amid-Brücke ersetzt. Neben weiteren Derivaten wurden auch bizyklische Flupirtin-Derivate durch Pyrolyse von Flupirtin und Retigabin synthetisiert. Testungen: Getestet wurden die synthetisierten Verbindungen auf ihre Oxidierbarkeit mit Cyclovoltammetrie und einer Peroxidase, auf ihre Wirksamkeit mit einem kommerziellen Thallium-Flux-Assay (durchgeführt von der Firma ChanTest, USA) und auf ihre Toxizität mit einer Mäuseleber-Zelllinie (TAMH) in einem MTT-Assay. Im Rahmen einer Masterarbeit in Kooperation mit der Firma Hoffmann-La Roche in Basel sind einige Derivate weitergehend in vitro auf ihre Toxizität untersucht worden. Das zentrale Ergebnis der Testungen war, dass es eine Korrelation zwischen der Oxidierbarkeit der Verbindungen und ihrer Fähigkeit, eine bestimmte Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kaliumkanäle zu erhöhen (Thallium-Flux-Assay), zu geben schien. Hingegen konnte kein entsprechender Zusammenhang zwischen Wirksamkeit der getesteten Verbindungen und ihrer Toxizität im MTT-Assay festgestellt werden.
Hintergrund der Studie ist der demografische Wandel in ländlichen Regionen Mecklenburg-Vorpommerns. Dieser Wandel ist mit Konsequenzen für das Gesundheitswesen verbunden, etwa einer Nachfrage nach Gesundheitsdienstleistungen, die durch das jetzige Gesundheitssystem nicht mehr vollständig abgedeckt werden können. Insbesondere im medizinischen Versorgungssektor Mecklenburg-Vorpommerns sind strukturelle Umwandlungen notwendig, da dies durch Abwanderungen von Einwohnern im erwerbstätigen und gebärfähigen Alter im Gesundheitssektor gekennzeichnet ist. Mangelnde Infrastrukturen sind insbesondere bei Älteren risikobehaftet, da diese neben einer Vielzahl an Erkrankungen häufig Einschränkungen in der Mobilität unterliegen. Da viele von ihnen zudem über ein lückenhaftes familiäres Netzwerk im direkten Umfeld verfügen und sie häufig nicht mehr in der Lage sind, ihre Arzneimittel selbständig in der Apotheke abzuholen, erfahren sie oft weder eine direkte Beratung noch eine pharmazeutische Betreuung durch einen Apotheker. Dies bedeutet, dass sie hinsichtlich ihrer Arzneimitteltherapie häufig auf sich allein gestellt sind, was eine erhöhte Prävalenz an Arzneimittel-bezogenen Problemen (ABP) nach sich zieht. Dies verlangt nach Strukturen zur pharmazeutischen Betreuung im häuslichen Umfeld. Diese Strukturen wurden im Rahmen der Vorarbeiten zu einer Pilotstudie in mehreren Teilprojekten entwickelt. Sie umschlossen eine Querschnittserhebung zur Arzt-Apotheker-Kooperation in Mecklenburg-Vorpommern, ein Experten-gestütztes Delphi-Verfahren zur Konsensfindung hinsichtlich der Erhebungs- und Analyseverfahren, vier Patientenfokusgruppen sowie Probandeninterviews zur Gewährleistung der Inter-Rater- und Test-Retest-Reliabilität der Instrumente. Auch Fallvignetten wurden generiert, anhand derer die Detektionsleistung des Analyseleitfadens getestet wurde. Als Hilfsmittel für Lösungsstrategien wurden patientenzentrierte Instruktionen, zusammengefasst unter dem Begriff „Memory Tool“, konstruiert und in aufwändigem, multizentrischem Verfahren einer Überprüfung auf Validität unterzogen. In einer Pilotstudie wurde dann untersucht, ob eine pharmazeutische Betreuung eingeschränkt mobiler Patienten zu einer signifikanten Abnahme an ABP führt. Dazu wurden Apotheken in Mecklenburg-Vorpommern rekrutiert, die auf Kontroll- oder Interventionsgruppe randomisiert wurden. Es folgte die Rekrutierung von Patienten nach definierten Ein- und Ausschlusskriterien, welche daraufhin im Abstand von 6 Monaten je zweimal durch einen Apotheker in der Häuslichkeit einem Anamnesegespräch unterzogen wurden. Anhand des Analyseleitfadens ermittelte der Apotheker auf Basis der in den Medikationsanamnesen erhaltenen Daten die ABP des Patienten. In der Interventionsgruppe wurden zusammen mit dem Arzt Lösungsstrategien für die ABP entwickelt. Nach dem Follow-up-Interview wurde analysiert, ob die pharmazeutische Betreuung zu einer hypothetisch angenommenen Reduktion an ABP um 37,5% führte. Die Umfrage zur Arzt-Apotheker-Kooperation ergab, dass Interaktionen zwischen beiden Mitgliedern des Gesundheitssystems zum Zeitpunkt der Umfrage zwar niedrig frequentiert erfolgten, aber, hatten sie einmal stattgefunden, von beiden Seiten als nützlich eingestuft wurden. Ebenso wurde dem Apotheker ein vergleichsweise geringerer Anteil bezüglich der Förderung der Adhärenz durch den Arzt zugesprochen, welches sich in dem mehrheitlichen ärztlichen Wunsch nach einem Ausmaß von 25 (Apotheker) zu 75 Prozent (Arzt) in der Verantwortung niederspiegelte. Durch die sich anschließenden vielfältigen Verfahren zur Generierung und Validierung konnten verständliche, zuverlässige und valide Mess- und Analyseinstrumente für häusliche Medikationsanamnesen erhalten werden. So wurden nach der abschließenden Runde des mehrstufigen Delphi-Verfahrens 92% der Items des Interviewbogens und 72% der des Analyseleitfadens von den 6 beteiligten Experten akzeptiert. Die Überprüfung der Test-Retest- und der Inter-Rater-Reliabilität des Interviewbogens mittels doppelt durchgeführter Interviews mit demselben Patienten aber unterschiedlichen Interviewern ergab, dass unterschiedlich beantwortete Fragen zu 40% Interviewer-induziert, zu 60% Patienten-induziert, zu keinem Anteil jedoch Fragebogen-induziert waren.Die konstruierten und realen Fallvignetten ergaben eine hohe Test-Retest- und Inter-Rater-Reliabilität (Cohens κ>0,7). In der Interventionsgruppe (N=29) erfolgte eine durchschnittliche Abnahme der Anzahl an ABP um 4,6 (52,0%). In der Kontrollgruppe (N=18) nahm die Anzahl der ABP hingegen um 0,4 (2,9%) zu. Es war somit eine signifikante Abnahme (p<0,0001, 95% CI; Mann-Whitney-U-Test) an ABP in der Interventions- gegenüber der Kontrollgruppe zu beobachten, sodass die Alternativhypothese angenommen werden kann. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass eine pharmazeutische Betreuung zur signifikanten Abnahme an ABP bei älteren Patienten führt.
Trotz aller Erfolge in der Chemotherapie mit platinhaltigen Antitumormitteln bestehen dennoch viele Nachteile. Ein Fortschritt brachte die Entwicklung von lichtempfindlichen Pt(IV)-Verbindungen, die sich selektiv in Tumorzellen aktivieren lassen. Durch die geringe Eindringtiefe von kurzwelligem Licht wäre das Anwendungsgebiet auf oberflächige Tumore limitiert. Durch die Kopplung von Pt(IV)-Prodrugs mit upconversion-lumineszierende Nanopartikel (UCNPs) könnte die aktivierte Pt(II)-Spezies durch Bestrahlung mit NIR-Licht, welches durch UCNPs aufwärtskonvertiert wird, freigesetzt werden. Daher wurden sechs Bistetrazolatoplatin(II)-Komplexverbindungen sowie zwölf Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe synthetisiert und charakterisiert. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe stellen die ersten Beispiele für mononukleare Diamminbistetrazolato-Pt(II) Komplexe dar. Untersuchungen der Synthese ließen vermuten, dass es während der Synthese zur cis/trans-Isomerie kommt. Durch die Röntgenkristallstruktur konnte eine N2-Koordination des Tetrazolatliganden nachgewiesen werden. Entgegen der Erwartung, konnte keine eine lichtinduzierte Aktivierung der hergestellten Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe nachgewiesen werden. Trotzdem wurden die Eigenschaften der synthetisierten Verbindungen im Hinblick auf eine potenzielle Anwendung als Pt-basierte Zytostatika weiter untersucht wurde. Es zeigte sich, dass cis/trans-[Pt(OH)2(5-phenyltetrazolato)2(NH3)2] durch Ascorbinsäure in eine Spezies, die irreversibel an DNA bindet, umgewandelt werden kann. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe waren gegen adhärente Zelllinien nicht sonderlich aktiv, wohingegen nahezu alle der getesteten Bistetrazolato-Pt(IV) diammine antiproliferierende Aktivität gegen humane adhärente Krebszelllinien zeigten und dabei (IC50-Werte < 20 µM) gefunden wurden. Auch wenn einige der vorgestellten Syntheserouten eine Optimierung bedürfen und die gefundene Zytotoxizität durch die Einführung anderer Tetrazolderivate in Pt(II)-Komplexverbindung sicherlich weiter gesteigert werden kann, konnten die Befunde einen relevanten Beitrag zum Verständnis der Komplexierung von Tetrazolatanionen an ein Pt-Zentrum leisten. Aufgrund dessen, dass die Lichtempfindlichkeit von Diiodido-Pt(IV) Komplexen bekannt war, wurden fünf neuartige Diiodido-Pt(IV) diamine (25, 26, 27, 28 und 29) synthetisiert. Daraufhin wurde sich mit der Herstellung von seltenerd-dotierten NaYF4/NaGdF4-UCNPs sowie mit der Kopplung dieser mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen beschäftigt. Zunächst wurde überprüft, ob die Bestrahlung mit einem NIR-Laser (λ = 980 nm) in Gegenwart von UCNPs tatsächlich zu einem Abbau der Diiodido-Pt(IV) Komplexe sowie zu einer erhöhten DNA-Platinierung führt. Nachdem dies bestätigt war, wurden drei verschiedene Kopplungsmethoden angewandt. Für die kovalente Kopplung (Konjugatherstellung) wurden Diiodido-Pt(IV) Komplexe mit freier Carboxygruppe über eine Amidbindung mit amino-modifizierten NaGdF4:Yb,Er/Tm-UCNPs verknüpft. Der zweite Kopplungsansatz beinhaltet den Austausch der an der Nanopartikeloberfläche koordinierten Oleatliganden mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen (Herstellung von Konstrukten). Durch die XPS-Analyse der Kopplungsprodukte kann gefolgert werden, dass beide Strategien eine Kopplung zwischen Pt Komplex und UCNPs ermöglichen, da Platin auf der Nanopartikeloberfläche nachgewiesen werden konnte. Allerdings liegt, unabhängig von der angewandten Kopplungsmethode, Pt zu 70–80 % im Oxidationszustand II vor. Die Verbindungen wiesen ohnehin eine gewisse Instabilität in Lösung auf. Die dritte Methode umfasst den Einschub des hydrophoben Pt(IV) Komplexes 29 in die Oleathülle. Der Nachweis von Pt auf diesem Konstrukt ist noch nicht gelungen, in vitro-Testungen ließen jedoch das Vorhandensein einer aktiven Pt-Spezies auf der Oberfläche vermuten. Für die Evaluierung der Zytotoxizität der NIR-Licht-vermittelten Antitumor-Aktivierungssysteme (Konjugate/Konstrukte) wurden diverse Methoden mit Variation im Bestrahlungsablauf vorgestellt. Hierbei stellte sich heraus, dass die Viabilität bei Bestrahlung der Konjugate/Konstrukte in Anwesenheit von Zellen im Vergleich zu Dunkelkontrollen signifikant herabgesenkt werden konnte. Allerdings besaß der NIR-Laser selbst einen toxischen Effekt gegenüber HL-60-Zellen. Die zunehmende Pt-Freisetzung der Konjugate mit der Bestrahlungsdauer und die geringe Pt-Freisetzung von Konstrukten, macht die Konjugate, insbesondere NaGdF4:Yb,Er-OA-SiO2-NH-28, zu besseren Kandidaten für die PACT. Dies wird bekräftigt durch die leicht höhere gefundene Toxizität der Konjugate im Vergleich zu den entsprechenden Konstrukten. Die dargestellten Konjugate/Konstrukte sind die ersten Beispiele für eine Kopplung von Diiodido-Pt(IV) Komplexen mit NaGdF4-UCNPs. Damit sich allerdings das vorgestellte Konzept der NIR-Aktivierung von lichtempfindlichen Diiodido-Pt(IV) Komplexen durchzusetzen kann, bedarf es noch Optimierungen hinsichtlich der Kopplungsstrategien.
Im Rahmen des Verbund-Forschungsprojektes KOKON wurde nach systematischer Literaturrecherche eine Datenbank entwickelt; in der KOKONbase sind sowohl die Interaktionsprofile als auch die Interaktionsmatrix die wesentlichen Elemente der Vorhaltung von primärem und bewertetem Wissen. In der Interaktionsmatrix wird mit Hilfe eines Ampelschemas die Möglichkeit der Beeinflussung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen durch ausgewählte Drogen dargestellt. Die Droge und die Arzneistoffe werden paarweise abgebildet. Die Interaktionsmatrix wird durch praktisch tätige Onkologen als sehr wertvolles Instrument in der onkologischen Beratungspraxis angesehen, um schnell einen Überblick über das von einer Droge ausgehende Gefahrenpotential bzgl. der Beeinflussung der Wirksamkeit eines in der Onkologie genutzten Arzneistoffs zu bekommen.
Tricholoma populinum, der Pappel-Ritterling, ist ein einheimischer, eine Mykorrhiza mit Populus sp. ausbildender Speisepilz. Als in-vitro-Testmodell diente die Quantifizierung der Degranulation von RBL-2H3-Zellen nach Sensibilisierung mit einem IgE-Antikörper und Stimulierung mittels DNP-HSA. Anschließend wurde die Aktivität eines membranständigen Enzyms, der β-Hexosaminidase, im Überstand bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass der DCM-Extrakt aus Fruchtkörpern des Pappel-Ritterlings eine signifikante Inhibition der Degranulation aufwies. Nach Säulenchromatographie an offener Säule konnten aktive und nicht-aktive Fraktionen ausgemacht werden. Eine Aufreinigung des DCM-Extraktes geschah durch SPE, präparative TLC und Säulenchromatographie. Der letzte Aufreinigungsschritt geschah bei allen Substanzen durch semipräparative HPLC. Reinsubstanzen wurden mit MS- und NMR-Techniken charakterisiert. Die aus dem Pappel-Ritterling isolierten Reinsubstanzen aus den Klassen der aliphatischen Säuren und C28-Sterole wiesen einzeln keine Degranulationshemmung im in-vitro-Modell auf. Ein weiterer untersuchter Organismus war Armillaria ostoyae, der Dunkle Hallimasch. Auch der DCM-Extrakt aus Fruchtkörper und Myzel von A. ostoyae zeigte eine signifikante Reduktion der Degranulation. Dieser Effekt konnte erstmals für A. ostoyae festgestellt werden. Fruchtkörper wurden in Wildsammlung erhalten, das Myzel kultiviert und durch molekularbiologische Untersuchung identifiziert. Aus dem Myzel des Dunklen Hallimaschs konnten Sesquiterpen-Arylester isoliert werden. Hierbei handelte es sich um die Melleolide C, H und J, Melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, Armillarin und Armillaridin sowie einen bisher unbekannten Naturstoff, dessen Struktur durch weitere IR- und CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden sollte. Des Weiteren wurde auch das Fettsäure-Derivat Linolsäure-Methylester isoliert und mittels NMR identifiziert. Die Substanzen Melleolide H und J verminderten die Degranulation von RBL-2H3-Zellen, Linolsäure-Methylester wies diesen Effekt nicht auf. Eine Zytotoxizitäts-Untersuchung von Extrakten und Reinsubstanzen wurde mittels des Neutral-Red-Uptake-Assay durchgeführt. Die Extrakte von T. populinum und A. ostoyae zeigten zytotoxische Wirkungen. Nach 24 h Inkubationszeit war diese deutlich stärker als nach 1 h. Auch die isolierten Reinsubstanzen wiesen eine Zytotoxizität auf. Der zytotoxische Effekt kann nicht für die Verminderung der Degranulation verantwortlich gemacht werden. Schädigende Effekte wären bereits im Degranulationsassay sichtbar, konnten jedoch bei Konzentrationen um den IC50-Wert nicht beobachtet werden. Der DCM-Extrakt aus dem Fruchtkörper des Pappel-Ritterlings zeigte einen inhibierenden Einfluss auf die Interleukin-2-Freisetzung stimulierter Jurkat-T-Zellen. Die in der mykologischen Literatur als essbar deklarierten Arten T. populinum und A. ostoyae könnten mittel- bis langfristig zumindest unterstützend bei allergischen Reaktionen Anwendung finden. Bei den Untersuchungen zur Qualitätssicherung standen Methoden zur Gehaltsbestimmung von Polysacchariden, β-Glucanen und Agaritin im Mittelpunkt. Diese wurden etabliert, optimiert und validiert. Einen guten Überblick über allgemeine Kohlenhydratgehalte gibt die Anthron-Methode. Bei dieser werden Polysaccharide hydrolysiert und zu Furfuralen umgewandelt, welche mit Anthron zu einem photometrisch bestimmbaren Produkt reagieren. Validierung erwies die Methode als geeignet für die Bestimmung des Gehaltes von Polysacchariden in Pilzextrakten. Weitergehende Informationen über die dreidimensionale Struktur der in Extrakten enthaltenen β-Glucane können durch die Anilinblau-Fluoreszenz-Methode erhalten werden. Die Methode erwies sich als selektiv für β-1,3-d-Glucane und bewies auch bei Untersuchung anderer Validierungsparameter ihre Eignung für eine β-Glucan-Gehaltsbestimmung. Mit der Kongorot-Methode sollen verzweigte β-1,3;1,6-d-Glucane erfasst werden. Diesen Glucanen wird häufig eine immunologische Aktivität zugerechnet. Allerdings erwies sich die Kongorot-Methode für die Informationsgewinnung über eine 3D-Struktur als weniger geeignet, da ihre Sensitivität zu gering und ihre Selektivität zu schwach ausgeprägt ist. Agaritin als Substanz mit interessanten und widersprüchlichen biologischen Effekten. Es wurde eine Methode etabliert, bei der Agaritin aus pulverisierten Fruchtkörpern extrahiert, durch SPE aufgereinigt und mittels LC-MS/MS und MRM im positiven Ionisationsmodus bestimmt wurde. Die Quantifizierung geschah mithilfe der Extern-Standard-Kalibration mit Agaritin als Referenzsubstanz. Die untersuchte Methode ist dazu geeignet, Agaritin zu quantifizieren, was durch die durchgeführte Validierung belegt wurde.
In der Arzneimitteltherapie nehmen parenteral zu applizierende Arzneimittel einen immer größer werdenden Stellenwert ein. Diese Entwicklung beruht vor allem auf der steigenden Anzahl von Peptiden und Proteinen als Wirkstoffe, deren perorale Applikation aufgrund unzureichender Resorptionsraten aus dem Gastrointestinaltrakt unmöglich ist, aber auch auf der Möglichkeit Depotformulierungen anzuwenden, die Wirkstoffe nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion über einen langen Zeitraum freisetzen können. Dennoch sind Arzneimitteltransportwege nach subkutaner oder intramuskulärer Applikation im Detail weitestgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf die intramuskuläre Applikation gelegt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine tierexperimentelle Studie an Ratten durchgeführt, die es zum Ziel hatte, ausgewählte physiologische Einflussparameter auf die Wirkstoffresorption nach intramuskulärer Injektion zu untersuchen. Die Tiere erhielten sowohl wässrige Lösungen als auch ölige Suspensionen von Paracetamol, Prednisolon und Diclofenac-Natrium in die rechte Oberschenkelmuskulatur und das jeweilige Placebo in den Muskel des linken Oberschenkels. Anschließend wurde das intramuskuläre Arzneistoffdepot erstmals mittels Magnetresonanztomographie (MRT) als bildgebendes Verfahren zeitabhängig untersucht und parallel die Anflutungskinetik der Wirkstoffe ins Blut bestimmt. Die Volumina und Oberflächen der Depots sowie die Zeit bis zu deren Abtransport aus dem Muskelgewebe wurden mit den Blutspiegelkurven verglichen. Allen Formulierungen war gemein, dass der Wirkstoff deutlich schneller resorbiert wurde als das Depot. Daraus lässt sich schließen, dass die Wirkstoffaufnahme nicht über die Resorption des Depots erfolgte. Ein schnelleres Verschwinden der Depots führte nicht zu höheren Blutspiegelmaxima oder zu einer beschleunigten systemischen Wirkstoffresorption. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Volumen und der Oberfläche der Depots und den Blutspiegelkurven gefunden. Ein weiterer Aspekt, der während der durchgeführten Studie näher untersucht wurde, ist die Möglichkeit, mit Hilfe der MRT lokale Reaktionen in Folge der Injektion zu detektieren. Bei Diclofenac-Natrium wurde in allen Fällen eine Ansammlung interstitieller Flüssigkeit am Ort der Injektion beobachtet. Histopathologische Untersuchungen des Muskelgewebes konnten einen Zusammenhang zwischen der Größe des visualisierten Ödems und dem Ausmaß der Entzündung belegen. Im zweiten Teil dieser Arbeit galt es, mit den gewonnenen In vivo-Daten möglichst biorelevante Methoden für Freisetzungstests intramuskulärer Arzneiformen zu entwickeln. Dabei sollte sowohl die Simulation der Durchblutung des Muskelgewebes Berücksichtigung finden als auch die Simulation des Muskelgewebes oder der Depots im Muskelgewebe. Es wurden verschiedene Versuchsaufbauten entwickelt, adaptiert und modifiziert. Darunter zählen Gel-Schaum-Blöcke in der Durchflusszelle, die Keramikmembran und der Membranadapter in der Durchflusszelle. Während die Simulation der Durchblutung und der injizierten Depots in allen Testmethoden möglich war, konnte das Muskelgewebe nicht befriedigend nachgebildet werden. Die Anwendung verschiedener Freisetzungstest-Methoden hatte auf die Verteilung der Wirkstoffe aus den wässrigen Lösungen keinen nennenswerten Einfluss. Der größte Einfluss auf die Verteilungsgeschwindigkeit wurde bei der öligen Suspension von Prednisolon beobachtet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nicht abschließend geklärt werden, welche Parameter der Situation in vivo entscheidend für das Anflutungsverhalten der Wirkstoffe nach intramuskulärer Injektion sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Kombination aus pharmakokinetischen Untersuchungen mit MRT-Bildgebung eine vielversprechende Möglichkeit darstellt, Einblicke in die Biopharmazie intramuskulärer Depots zu erhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung der MRT zur Feststellung der lokalen Verträglichkeit, vor allem neu entwickelter Arzneiformen, eine sehr gut geeignete nicht-invasive Methode darstellt. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen verdeutlichen, dass die Freisetzungstestmethode vor allem bei langsam freisetzenden Arzneiformen einen erheblichen Einfluss ausüben kann. Eine universelle Testmethode, mit der zuverlässig das In vivo-Freisetzungsverhalten nach intramuskulärer Injektion vorhergesagt werden kann, ist derzeit nicht verfügbar. Die entwickelten Modelle stellen einen ersten Schritt zur Entwicklung biorelevanter Freisetzungstestmethoden für intramuskulär applizierte Darreichungsformen dar. Zur Verbesserung dieser Modelle sind ein umfassenderes Verständnis der Arzneimittelverteilungs- und -Transportmechanismen notwendig und weitere Studien, die bildgebende Verfahren mit der pharmakokinetischen Analyse kombinieren, wünschenswert.
Cyanobakterien sind eine vielversprechende Quelle an strukturell diversen und biologisch hochaktiven Naturstoffen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Bislang konnte die Strukturklasse der [7.7]Paracyclophane nur in fädigen Cyanobakterien der Gattungen Nostoc und Cylindrospermum nachgewiesen werden. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass gerade die Carbamidocyclophane chemisch und biologisch interessante Verbindungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vor allem die Carbamidocyclophane produzierenden Cyanobakterien Nostoc sp. CAVN2 und Nostoc sp. CAVN10 unter besonderer Berücksichtigung der strukturellen Vielfalt an biosynthetisierten Metaboliten sowie deren antimikrobieller Aktivität umfassend charakterisiert. Um das biosynthetische Potenzial auf der metabolischen Ebene zu untersuchen, wurde im Vorfeld eine spezifische [7.7]Paracyclophan-Analytik etabliert, die skalierbare Methoden für alle Aufarbeitungsschritte beinhaltet. Die Optimierung endete in einem validierten sowie arbeits- und zeitsparenden einstufigen Extraktions- und Aufreinigungsverfahren mittels eines Zweiphasensystems und anschließender LC-UV-Analyse, um biologische Proben reproduzierbar zu analysieren und enthaltene Carbamidocyclophane zu quantifizieren. Kultivierungsstudien zum Einfluss der Temperatur an metabolisch aktiven und defizienten Nostoc-sp.-CAVN10-Kulturen ergaben einen direkten Zusammenhang zwischen der Biomassezunahme und der Temperaturerhöhung. Im Gegensatz dazu zeigten die einzelnen Carbamidocyclophan-Gehalte ein eher differenzierteres Bild über die verschiedenen Wachstumsphasen und Temperaturen hinweg. Da nur eine geringe Korrelation zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Carbamidocyclophan-Produktionsrate ermittelt werden konnte, ist eine Relevanz dieser Verbindungen für den primären Zellstoffwechsel nicht ersichtlich. Bei Kultivierungsexperimenten an Nostoc sp. CAVN2 hatte der Zusatz von Chlorid- oder Bromid-Ionen eine drastische Erhöhung der Basalrate und Strukturdiversität der [7.7]Paracyclophane zur Folge. Das gleichzeitige Vorhandensein beider Halogenide im Medium zeigte kompetitive Effekte, wobei Chlorid als Substrat für den Halogenierungsprozess favorisiert wurde. Mit Hilfe eigens entwickelter Kultivierungsprozedere und Separierungsstrategien konnten insgesamt 25 Verbindungen aus Stamm CAVN2 isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei bilden die Carbamidocyclophane H–U neue chlorierte, bromierte und nicht halogenierte Naturstoffe. Zusätzlich konnten aus Stamm Cylindrospermum stagnale PCC 7417 neben den bekannten Cylindrocyclophanen A, B und D die drei neuen Cylindrofridine A–C erhalten werden. Diese stellen den Cylindrocyclophanen strukturell eng verwandte lineare Mono- und Dialkylresorcinole dar. Die vergleichende Evaluierung der Bioaktivität von 30 Reinsubstanzen ergab, dass viele Verbindungen sehr starke antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien zeigen – besonders gegen Antibiotika-resistente Kokken mit minimalen Hemmkonzentrationen von oftmals deutlich unter 1 µM. Dabei bedingten die verschiedenen Substituenten (Carbamoyl- und Acetoxy-Reste sowie Hydroxygruppen oder Halogene) z.T. signifikante Aktivitätsunterschiede. Die Zytotoxizität der [7.7]Paracyclophane ist vor allem an das Vorhandensein des Makrozyklus gebunden, da lineare Derivate (Cylindrofridine B/C) kaum biologisch aktiv waren. Eine Ausnahme stellt dabei das nicht zytotoxische, aber antimikrobiell aktive Cylindrocyclophan-D-Monomer Cylindrofridin A dar. Die phylogenetische Analyse der 16S-rDNA-Daten bestätigte die morphologisch-taxonomische Identifizierung der Stämme CAVN2 und CAVN10 als Cyanobakterien der Gattung Nostoc und ergab weiterhin, dass alle Carbamido- und Cylindrocyclophane produzierenden Nostoc-Stämme Bestandteil einer monophyletischen Gruppe sind, die phylogenetisch distinkt zu anderen [7.7]Paracyclophan-Produzenten ist. Des Weiteren konnten keine Nukleotidunterschiede zwischen Stamm CAVN2 und CAVN10 auf den untersuchten Markergen-Sequenzen festgestellt werden, was beide auf der phylogenetischen Ebene als identisch erscheinen lässt und sie somit nur metabolisch aufgrund der strukturellen Diversität und Quantität an [7.7]Paracyclophanen differenzierbar sind. Mit Hilfe von molekulargenetischen Analyseverfahren und bioinformatorischer Auswertung konnte in Stamm CAVN2 das Carbamidocyclophan-Biosynthesegencluster mit einer Gesamtgröße von ca. 26,9 kbp identifiziert werden. Dieses beinhaltet 13 offene Leserahmen (cabA-cabM), wobei das Gen cabL für eine putative Carbamoyltransferase codiert. Ein neuer Halogenase-Typ in Verbindung mit einer Tandem-ACP-Domänen-Struktur in der Typ I Polyketidsynthase CabD könnte für die Ausbildung halogenierter Derivate verantwortlich sein. Der Nachweis eines codierenden Bereichs mit Rieske-Domäne (cabM) lässt eine direkte oxidative intermolekulare Makrozyklisierung bei der Assemblierung vermuten.
Viele Arzneistoffe haben eine sehr geringe orale Bioverfügbarkeit. Ein Lösungsansatz ist die Formulierung dieser Arzneistoffe mukoadhäsiven Darreichungsformen wie zum Beispiel Wafern. Diese können unter anderem auf vaginalen als auch auf intestinalen Schleimhäuten appliziert werden. Allerdings ist eine Herausforderung die Gewährleistung des vollständigen Schleimhautkontaktes nach der Applikation. Eine mögliche Lösung ist die Kombination von Wafern mit expandierbaren Systemen. Dafür müssen die Wafer jedoch bestimmte Anforderungen erfüllen. Sie müssen dünn und flexibel sein und außerdem durch einen unidirektionalen Wirkstofftransport gekennzeichnet sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ein- und zweischichtige Wafer hergestellt mittels Casting Solvent Technik. Die hergestellten Wafer wurden charakterisiert bezüglich ihrer äußeren Erscheinung, mechanischen Eigenschaften, Zerfallszeit und Wirkstofffreisetzung. Außerdem wurde bestimmt welche Faktoren einen Einfluss auf die Wirkstoffübertragung vom Wafer auf eine simulierte Schleimhaut haben und ob die ausgewählten Wafer die Fähigkeit zum unidirektionalen Wirkstofftransport aufweisen. Weiterhin wurde die Wirkstoffpermeation durch Schweinedünndarm nach Appplikation eines zweischichtigen Wafers und einer Referenzdarreichungsform untersucht sowie eine Stabilitätsstudie und eine Proof of Principle Studie durchgeführt. Die finale Waferformulierung war ein zweischichtiger Wafer bestehend aus einem wasserunlöslichen Backing Layer und einer wirkstoffhaltigen, mukoadhäsiven Schicht. Der Backing Layer bestand aus Ethylcellulose (500 µg/cm²) und die mukoadhäsive Schicht wurde hergestellt aus einer Mischung aus Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol 400 im Verhältnis 1:2:4.
Epigenetische Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Gleichgewichtes zwischen dem Vorliegen von Eu- und Heterochromatin. Neben Acetylierungsprozessen kommt dabei vor allem Methylierungen von Histonen eine entscheidende Bedeutung zu. Die im Fokus der vorliegenden Dissertation stehenden Demethylierungen können dabei zum einen durch sogenannte Lysin-spezifische und zum anderen durch JumonjiC-Domäne enthaltende Histon-Demethylasen katalysiert werden. Bei der zweiten Gruppe handelt es sich um Fe(II)- sowie 2-Oxoglutarat-abhängige Enzyme, welche unter anderem die Oxidoreduktase KDM4A umfassen. In gesundem Gewebe übernimmt diese wichtige Aufgaben im Rahmen der Regulierung des Zellzyklus und der -differenzierung, während daneben jedoch eine Überexpression in diversen Tumorzellarten, wie z. B. Prostata-, Brust- oder Lungenkrebs detektiert wurde.
Aus diesem Grund bestand das Ziel jener Arbeit in der Auffindung eines potentiellen KDM4A-Inhibitors in Anlehnung an literaturbekannte Hemmstoffe wie Daminozid oder N-Oxalylglycin, welcher im Folgenden als Leitstruktur für die Erstellung einer Substanzbibliothek dienen sollte. Diese Aufgabe konnte durch die Synthese von drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden erfüllt werden, welche zu einer Inhibition von KDM4A mit IC50-Werten im zweistelligen mikromolaren Bereich in der Lage waren. Die kürzeste dieser drei Verbindungen, 2-(1H-Tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid, wurde aufgrund des kleinsten IC50-Wertes als Leitstruktur für folgende Derivatisierungen ausgewählt. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass es sich bei dieser fragmentartigen Verbindung um einen kompetitiven Inhibitor handelt, welcher zudem eine gewisse Subtypselektivität für KDM4A aufweist. Durch die Synthese und Charakterisierung des am Tetrazolring methylierten Derivates sowie des korrespondierenden Esters wurde die Notwendigkeit des Vorhandenseins eines Komplexbildners in definiertem Abstand zu einer sauren Funktion für eine Hemmwirkung gegenüber KDM4A belegt.
Aufgrund der in der Literatur beschriebenen komplexbildenden Eigenschaften von Acylhydrazonen wurde ausgehend von den drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden durch Umsetzung mit verschiedenen Aldehyden und Ketonen eine Substanzbibliothek bestehend aus 46 Verbindungen synthetisiert. Neben der Hydrazonbildung konnte die Leitstruktur durch das Einfügen von α-C-C- und α-C-N-verknüpften Seitenketten derivatisiert werden. Dadurch wurden insgesamt 14 Endverbindungen synthetisiert, wobei die beiden potentesten Substanzen, bei denen es sich um amidhaltige Strukturen handelt, IC50-Werte im Bereich der Leitstruktur aufweisen. Des Weiteren war eine Abwandlung der Leitstruktur infolge des Ersatzes der Methylengruppe durch einen Benzenring möglich.
Die biologische Testung der Substanzen erfolgte mithilfe von zwei verschiedenen Assays: Zum einen dem enzymgekoppelten Formaldehyd-Dehydrogenase- und zum anderen dem Antikörper-basierten LANCE-Assay. Des Weiteren wurden im Helmholtz-Zentrum Berlin zehn ausgewählte Verbindungen zusammen mit der zu KDM4A weitestgehend homologen KDM4D kristallisiert und röntgenkristallographisch vermessen. Durch Aufklärung der Bindungsmodi konnte die Grundlage für ein rationales Ligandendesign hinsichtlich der gezielten Synthese weiterer potentieller KDM4x-Inhibitoren gelegt werden.
Eine Auswahl von 88 Substanzen der synthetisierten Verbindungen wurde in der Screening Unit des FMP (Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie) in Berlin, welches Teil des EU-Openscreen-Netzwerkes ist, eingelagert und steht damit für Testungen gegen weitere Targets zur Verfügung. Da die betreffenden Substanzen in Arzneistoffen unterrepräsentierte Strukturen, wie z. B. Hydrazide und aliphatisch gebundene Tetrazole beinhalten, könnten dadurch interessante neue Leitstrukturen für andere Forschungsprojekte identifiziert werden.
Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Dissertation wurde in zwei Publikationen veröffentlicht.
Eukaryotische Mikroalgen werden seit einigen Jahrzehnten hinsichtlich ihrer Eignung als Wirkstoffproduzenten intensiv untersucht, wobei bisher nur wenige potentiell nutzbare Verbindungen identifiziert wurden. Trotzdem lässt alleine die riesige Artenvielfalt die Vermutung zu, dass es Produzenten interessanter Sekundärstoffe geben muss. In den letzten Jahren zeigte sich außerdem, dass Mikroalgen Lieferanten von Wertstoffen, beispielsweise im Bereich der regenerativen Energien, sein können. Hier sind vor allem die hohen Kultivierungskosten und die geringe Produktausbeute noch zu überwindende Hürden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden 70 eukaryotische Mikroalgenstämme auf ihre Eignung als Produzenten neuartiger Wirk- und Wertstoffe untersucht. Außerdem wurde durch Variation der Kultivierungsbedingungen ermittelt, ob die Kultivierungskosten gesenkt und die Ausbeuten an relevanten Produkten aus Mikroalgen gesteigert werden können. Die untersuchten Mikroalgen stammten aus der Stammsammlung der Pharmazeutischen Biologie der Universität Greifswald, aus kommerziellen Stammsammlungen oder wurden aus Gewässerproben der Greifswalder Umgebung isoliert. Neue Isolate wurden mit molekulargenetischen Methoden identifiziert. Alle Mikroalgen wurden zunächst unter Standardbedingungen kultiviert, die Biomasse-Raum-Zeit-Ausbeute bestimmt und bewertet. Anschließend wurde die biochemische Zusammensetzung der Biomasse analysiert. Dazu wurden im Rahmen der Arbeit sechs Methoden zur Gesamtlipid-, Gesamtkohlenhydrat- und Gesamtproteingehaltsbestimmung sowie zur Analytik der Lipid- und Kohlenhydratzusammensetzung etabliert.
Die Algen zeigten bei Kultivierung unter Standardbedingungen Biomasseausbeuten bis 90 mg L-1 d-1. Die höchsten Wachstumsraten erreichten verschiedene Scenedesmus spp. Die biochemische Zusammensetzung der Algenbiomasse war sehr variabel. Häufig war jedoch der Proteinanteil mit ca. 50 % am höchsten, gefolgt von Kohlenhydraten mit etwa 30 % und einem Lipidanteil von ca. 10 %. Anhand der Modellalge Scenedesmus obtusiusculus konnte gezeigt werden, dass die Biomassezusammensetzung durch Variation der Kultivierungsbedingungen beeinflusst werden kann. So führten erhöhte Beleuchtung sowie Nitrat- und Eisenmangel zu vermehrter Lipid- und Kohlenhydratakkumulation. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein neues Kulturmedium entwickelt, in dem die Modellalge lipid- und kohlenhydratreiche Biomasse ohne Wachstumseinbußen im Vergleich zum Standardmedium produziert. Durch Verwendung natürlicher Wasserquellen als Basis für das Kulturmedium konnten darüber hinaus die Kultivierungskosten deutlich reduziert werden. Durch die gleichzeitige Steigerung der Produktausbeute und Senkung der Kultivierungskosten konnte gezeigt werden, dass auch eine großtechnische Produktion von Wertstoffen aus Mikroalgen wirtschaftlich sein kann.
Zur Bewertung des Potenzials der Mikroalgen als Produzenten von interessanten Sekundärstoffen wurde beispielhaft die antimikrobielle Aktivität von Extrakten der Algenbiomasse untersucht. Es zeigte sich, dass vor allem lipophile Extrakte gegen grampositive Bakterien wirksam waren, wofür wahrscheinlich die in den Extrakten nachgewiesenen mehrfach ungesättigten FS verantwortlich sind. Einige Mikroalgenarten wiesen zudem einen hohen Betaglucangehalt auf. Diesen Polysacchariden werden, wenn bestimmte Strukturvoraussetzungen erfüllt sind, diverse gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen konnten bei einigen Algenarten mit einem Gehalt von bis zu 35 % deutlich höhere Werte im Vergleich mit anderen betaglucanreichen Lebensmitteln wie Getreide (bis 10 %) oder Pilzen (bis 25 %) erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass Mikroalgen neben ihrer Eignung als Wertstoffproduzenten auch interessante Wirkstoffe liefern können.
In der vorliegenden Arbeit sollen bekannte und neuartige Inhibitoren der Glutathionperoxidasen sowohl in ihrer Eigenschaft als Inhibitor, als auch deren Effekte in Tumorzellen näher charakterisiert werden. Dabei standen zu Beginn die Mercaptobernsteinsäure sowie Tiopronin besonders im Fokus. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen effektiv bovine Glutathionperoxidase inhibieren, wobei die Effektivität sowohl in IC50-Werten als auch in Inhibitionskonstanten (Ki) ausgedrückt werden konnten. Durch Adaption des GPx-Assays auf humane GPx-Aktivität konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Mercaptobernsteinsäure in der Lage ist, humane GPx-Aktivität zu reduzieren, allerdings nicht Tiopronin. Kombinationen von Mercaptobernsteinsäure mit Wasserstoffperoxid auf Tumorzellen zeigten erhöhte Akkumulationen reaktiver Sauerstoffspezies in Relation zu Zellen, die nur mit Wasserstoffperoxid inkubiert wurden. Die Glutathionperoxidase könnte in zellulären Systemen durch Mercaptobernsteinsäure gehemmt sein. Entsprechende Kombinationen mit Tiopronin zeigten den gegenteiligen Effekt, Tiopronin scheint als Antioxidans zu fungieren. Auch Kombinationen von Tiopronin mit Cisplatin, Doxorubicin und Methotrexat zeigten teilweise Wirkungsverluste der Zytostatika. Weiterführend wurde im Rahmen der Arbeit eine neue Klasse von Inhibitoren der Glutathionperoxidase identifiziert, die Pentathiepine. Durch unterschiedliche heteroaromatische Grundkörper sowie verschiedenen Substituenten konnten interessante Struktur-Wirkungsbeziehungen detektiert werden. Bei der Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase stellte sich heraus, dass es sich offenbar um irreversible- sowie kompetitive Inhibitoren handelt. Die inhibitorischen Eigenschaften sind dabei in Bezug auf inhibitorische Potenz sowie Selektivität aller bisher bekannten Inhibitoren überlegen. Pentathiepine zeigen aber auch auf zellulärer Ebene interessante Eigenschaften, da sie in einer Vielzahl verschiedener Tumorzellen viabilitäts- bzw. proliferationsinhibierende Eigenschaften besitzen, mit IC50-Konzentrationen im unteren mikromolar-Bereich. Korrelationsanalysen zeigten, dass offenbar die Proliferationsinhibition der Pentathiepine mit der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase einhergeht. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass Pentathiepine massiv reaktive Sauerstoffspezies in den Zellen induzieren und Apoptose auslösen. Die Apoptose-Einleitung wurde durch Annexin-V/Propidiumiodid-Markierung, Detektion von PARP-Spaltprodukten sowie durch die Bestimmung der Mitochondrien-Funktionalität durch Visualisierung des mitochondrialen Membranpotentials bestätigt. Zusammenfassend scheint eine Apoptoseauslösung über den intrinsischen Signalweg vorzuliegen. Durch die Zelllinie HAP-1 sowie deren Glutathionperoxidase-1 ausgeknockten Variante konnten Zytostatika identifiziert werden, auf die knockout-Zellen besonders sensitiv reagieren. Zu diesen gehören Cisplatin-Analoga, Lomustin und Temozolomid. In Kombinationsuntersuchungen mit diesen Zytostatika konnte gezeigt werden, dass für die Kombination von Cisplatin mit Pentathiepinen kein positiver Effekt resultiert. Die Zytotoxizität von Cisplatin wurde dabei in verschiedenen Tumorzellen durch die gleichzeitige Inkubation mit Pentathiepinen abgeschwächt. Kombinationen von Lomustin bzw. Temozolomid mit Pentathiepinen und Mercaptobernsteinsäure führten zu signifikanten Wirkverstärkungen in den untersuchten Zelllinien. Zusammenfassend lässt sich verfassen, dass die neuen Glutathionperoxidase-Inhibitoren ein nützliches Werkzeug zur Aufklärung biologischer Prozesse in Tumorzellen in Bezug auf den Umgang mit oxidativem Stress darstellen können. Gezeigt wurde, dass die kombinatorische Gabe von Inhibitoren der Glutathionperoxidase mit verschiedenen Tumortherapeutika durch eine verstärkte Toxizität aussichtsreich erscheint und in Hinblick auf die häufig sehr schlechten Prognosen verschiedener Tumorerkrankungen, die Tumortherapie durch Zusatz von Pentathiepinen verbessert werden könnte.
Pharmaceutical residues are found in increasing concentrations in the environment and in potable water where they have verifiable effects on aquatic life. Conventional methods for water treatment are not able to sufficiently abate these generally stable compounds. It was found that physical plasma generated directly in water can degrade several of these recalcitrant organic pollutants. Studies on the basic plasma chemical processes for the model system of phenol showed that the degradation is primarily caused by hydroxyl radicals. This was confirmed by reaction chemistry and spin trap enhanced electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR). The degradation of diclofenac and its by-products were investigated in detail to perform a first risk-assessment of the new technology. Findings are not limited to the application of plasma but applicable to other advanced oxidation processes (AOP) that are based on the generation of hydroxyl radicals as well. Additionally, pulsed corona plasma and pulsed electric fields were assessed for their capacity to kill Legionella pneumophila in water. Whereas it was possible to kill L. Pneumophila with both methods, plasma treatment resulted in an enhanced bacterial killing. Therefore, advanced oxidation processes (AOP) and plasma treatment in particular are some of the few feasible approaches to decompose recalcitrant compounds in water.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
Ein neuer vielversprechender Ansatz, die Resistenz von Tumorzellen gegen Zytostatika zu umgehen, stellte die Hemmung von selenhaltigen Redoxenzymen, Glutathionperoxidase (GPx) und Thioredoxinreduktase (TrxR), dar. Das Ziel dieser Arbeit war, neuartige GPx-Inhibitoren zu entdecken und zu entwickeln. Der erste Ansatz war die Synthese und biologische Testung einer Zuckeracetal-Struktur, die als GPx-1-Inhibitor postuliert wurde. Synthetische Abwandlungen ergaben vier Acetale aus Glucosederivaten und Benzaldehyden. Jedoch zeigten diese ersten hergestellten Verbindungen keinerlei Hemmwirkung auf die bovine GPx-1. Der zweite Ansatz war, bereits bekannte, schwach aktive Leitstrukturen durch Koordinierung von Pt(II) an den Heterozyklus (2-Methylimidazol, Imidazol oder Pyrazol) zu stärkeren Hemmstoffen der GPx abzuwandeln, wobei das Platin(II)-atom an das Selen des Enzyms koordiniert und dies irreversibel hemmt. Es wurde eine Substanzbibliothek aus 15 heterozyklischen Liganden synthetisiert, welche anschließend mit Cis- oder Transplatin zu den cis- bzw. trans-Monochlorido-Platin(II)-Komplexen umgesetzt wurden. So wurden 28 Platinverbindungen in guter Reinheit erhalten und verschiedenen biologischen Testungen unterzogen. Diese Testungen umfassten Versuche zur Hemmung der bovinen GPx-1, wobei jedoch festgestellt wurde, dass dieses Enzym nicht gehemmt wurde. Weiterhin wurde untersucht, ob die TrxR, ein weiteres Selen-abhängiges Redoxenzym, durch diese Verbindungen inhibiert wird, was teilweise der Fall war, auch wenn keine eindeutigen Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgestellt werden konnten. Die Pt(II) enthaltenden Substanzen wurden auch auf ihre Fähigkeit, die Proliferation von humanen Krebszelllinien zu hemmen, getestet. Es wurde festgestellt, dass einige der Verbindungen in der Lage sind, die Zellteilung mit IC50-Werten unterhalb 1 µM zu unterbinden. Dabei handelte es sich meist um cis-konfigurierte Platin(II)-Verbindungen, aber auch manche trans-Pt-Komplexe waren aktiv. Auch konnte gezeigt werden, dass der Zelluntergang durch Apoptose herbeigeführt wird Diese ermutigenden Ergebnisse belegen, dass ein Platinkomplex nicht zwangsläufig bifunktionell sein muss, um das Zellwachstum effektiv zu hemmen. Weiterhin wurde eine starke Kreuzresistenz zu Cisplatin nur bei ein paar Substanzen beobachtet, manche Verbindungen konnten die Kreuzresistenz sogar vollständig umgehen. Ein paar Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnten beschrieben werden. Zwei cis-trans-Paare der Platin(II)-Komplexe wurden dann für weitergehende Bindungsstudien an DNA ausgewählt. Hierzu wurde die Bindung an Kalbsthymus-DNA untersucht, ebenso wie die Bindung an zelluläre DNA, das Aufwinden von supercoiled DNA, die Veränderung des DNA-Schmelzverhaltens und des Circulardichroismus (CD) von DNA durch Bindung der Platinkomplexe, sowie die Veränderung der Ethidiumbromid-Fluoreszenz durch Hinzugabe der Verbindungen. Es stellte sich heraus, dass die strukturell ähnlichen Verbindungen sehr unterschiedliche Einflüsse auf die DNA haben, was auch in Zusammenhang mit ihrem hydrolytischen Zerfall während der Assays stehen könnte. Da Stabilitätsprobleme bemerkt wurden, wurden die hergestellten Verbindungen mittels HPLC und UV/Vis-Spektroskopie genauer untersucht um ihre Stabilität in wässrigen Medien beurteilen zu können. Es wurde festgestellt, dass die verwendeten Hydrazone in wässrigen Medien zu Benzaldehyden bzw. Acetophenonen und wahrscheinlich zu den korrespondierenden Hydraziden zerfallen. Die Stabilität der Verbindungen könnte starke Einflüsse auf die Ergebnisse der biologischen Testungen haben, sodass dies immer mit berücksichtigt werden sollte, wenn die Ergebnisse interpretiert werden. Es kann nicht aus-geschlossen werden, dass (i) die dargestellten Ergebnisse in Wirklichkeit die Ergebnisse der Zerfallsprodukte sind, und dass (ii) es einen gemeinsamen Grund für den Zerfall und die Auswirkungen im DNA- und Zellmodell gibt. Trotzdem oder auch deswegen handelt es sich um eine vielversprechende Substanzklasse, bei der sich eine nähere Untersuchung hinsichtlich Aufnahme in die Zelle, DNA-Bindung und -Reparatur lohnt, um zu ergründen, ob Resistenzen umgangen werden können. Auch die Zerfallsprodukte sollten hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität untersucht werden. Eine weitere Verbindungsklasse, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, waren N-heterozyklische Carben (NHC)-Au(I)-Komplexe. Sie basierten hauptsächlich ebenfalls wie die Platinverbindungen auf Hydrazonen, auch hier sollte durch die Koordinierung des Metallatoms an den Heterozyklus Imidazol eine Wirkungssteigerung erreicht werden. Die untersuchten Verbindungen zeigten eine starke Inhibition der GPx, der Glutathionreduktase (GR) sowie der TrxR. Eine Selektivität für ein bestimmtes Redoxenzym ist somit mit diesen Verbindungen nicht gegeben, weshalb sie keine guten Kandidaten für weitere Wirkstoffentwicklungen darstellen.
Introduction: Ketamine (KET) is widely used as anaesthetic drug. Beside its pronounced an-aesthetic effects as caused by antagonism of NMDA receptors, ketamine also causes potent analgesia. Moreover, There are ample new evidences, firstly, that 2R,6R/2S,6S-enantiomers of hydroxynorketamine (HNK), exert neuro-modulating effects by AMPA-receptor activation and, secondly, that the plasma levels of norketamine (n-KET) after oral dosing are higher than after intravenous administration. From the physicochemical point of view ketamine is expected to be a substrate of drug transporters. Thus, it was the aim of this study to separate and quantify KET and its metabolites in human serum, urine and feces; investigate the role of transporter proteins in the intestinal absorption, distribution and elimination of ketamine; and evaluate pharmacokinetics and metabolism of a newly developed prolonged-release keta-mine dosage form to confirm its suitability for chronic treatment of CNS-diseases (e.g. de-pression) according to the new “ketamine metabolite paradigm”. Materials and methods: Quantification of ketamine was done by a LC-MS/MS-based quantifi-cation method on the QTRAP4000 instrument. Samples were extracted by methyl tert-butyl ether after addition of sodium carbonate to liberate the free base; Single transfected MDCKII cells overexpressing OCT1, OCT2, OCT3, and MATE1 or MATE2K, and HEK293 cells over-expressing OATP2B1 were used to study the cellular uptake of ketamine. Inside-out lipovesi-cles were used to determine the affinity of ketamine to the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp). Uptake into cells or vesicles was determined by liquid scintillation counting. Func-tionality of all in vitro systems was assured by using in each case appropriate probe sub-strates; The dose-escalation study was performed in five consecutive periods (7 days wash-out) in 15 healthy subjects (5 females and 10 males. 20-35 years, BMI 19.4-27.6 kg/m2). Results: We introduce for the first time the separation and quantification of the active me-tabolites 2R,6R/2S,6S-HNK; Ketamine was shown to be taken up significantly in a time- and concentration-dependent manner by OCT1-3. The affinity to OCT transporters at pH=6.5 was several fold higher than that at pH=7.4. ), ketamine showed a significant but low affinity to P-gp. In contrast to this, we could not detect any transport of ketamine by MATE1 / 2K or OACPT2B1; and PR-KET was safe and well tolerated with higher metabolites productivity, different pharmacokinetic properties and longer T1/2 when compared to IV-KET or IR-KET. Conclusion: the uptake transporters OCT1 & 3 and the efflux transporter P-gp may play a role in the intestinal absorption of the drug. On the other side, P-gp, MATE1 / 2K and OCT are not expected to contribute significantly to tissue (brain) distribution or renal excretion of ketamine; Moreover, the prolonged-release ketamine undergoes dose-dependent “first-pass” metabolism which generates substantially increased plasma exposure of downstream me-tabolites with potential neuro-modulating effects compared to ketamine after intravenous administration.
Die Zusammenhänge zwischen der Aktivität Epigenetik-assoziierter Enzyme und Krankheitsgeschehen neoplastischer Art konnten nicht nur experimentell bestätigt, sondern auch spätestens mit der Zulassung von Inhibitoren der DNA-Methyltransferase und Histon-Desacetylasen kausal bewiesen werden. Die weniger gut untersuchten 2-Oxoglutarat- und Eisen(II)-abhängigen JumonjiC-Domänen enthaltenden Histon-Demethylasen (KDMs) werden aufgrund von Überexpression in einigen Tumorzellen ebenfalls als mögliches epigenetisches Target in der Tumortherapie angesehen.
Die in dieser Arbeit synthetisierten KDM4-Inhibitoren basierten zum einen auf Tetrazol- und Hydrazid-haltigen Motiven, für welche synthetische Routen in weitergehenden Untersuchungen entwickelt wurden, um das aliphatische Rückgrat der Moleküle mit aromatischen Resten zu modifizieren oder komplett durch eines auf Basis der Anthranilsäure zu ersetzen. Zum anderen sollten Synthesewege für verschiedenartige (1H-Tetrazol-5 yl)pyridine gefunden werden. Dafür wurde ein Tetrazol in Position vier des Pyridinrings eingefügt, um anschließend systematische Untersuchungen der Seitenkette in Position zwei des Pyridinrings vorzunehmen. Neben direkten Heteroatomverknüpfungen wurden auch Carbonylverbindungen wie Carbonsäureamide oder eine Hydroxamsäure dargestellt. Über zahlreiche Wege konnten ebenfalls Methylengruppen-haltige Verbindungen erfolgreich synthetisiert werden.
Die biologische Testung der Verbindungen erfolgte mit einem Antikörper-basierten LANCE-Assay gegen KDM4A. Zusätzlich konnten vier der Substanzen röntgenkristallographisch in der Isoform KDM4D vermessen werden. Eine in Position zwei des Pyridinrings eingefügte Hydroxamsäure zeigte relevante Interaktionen im Enzym und veranschaulichte zugleich, dass (1H-Tetrazol-5 yl)pyridine zu einer hohen Affinität bestimmter Isoformen der Histon-Demethylasen neigen können.
Zusätzlich zu den bereits ansatzweise verstandenen Zusammenhängen zwischen Epigenetik und neoplastischen Krankheiten, weisen Experimente im Nagermodell darauf hin, dass epigenetisch modifizierende Enzyme auch an der Entstehung von depressionsartigen Phänotypen beteiligt sind. Die grundsätzliche Erforschung neuer Therapieoptionen abseits der Monoaminhypothese für die Indikation Depression ist jedoch auch deshalb notwendig, weil zugelassene medikamentöse Behandlungsoptionen zum Teil zu starken Nebenwirkungen führen und bis zur Entfaltung der vollen Wirkung oftmals mehrere Wochen vergehen können. Mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten Ketamin behandelte depressive Patienten zeigten häufig eine rasche Symptomlinderung bei vergleichsweise günstigem Nebenwirkungsprofil. Welche Moleküle für diese Effekte ursächlich sind, ist noch Gegenstand aktueller Forschung, da neben Ketamin selber auch Metaboliten wie 2R,6R-Hydroxynorketamin mit antidepressiven Wirkungen assoziiert werden. Für die qualitativen und quantitativen Analyse von R- und S-Ketamin sowie den Metaboliten R- und S-Norketamin, R- und S-Dehydronorketamin und 2R,6R- und 2S,6S Hydroxynorketamin in menschlichem Urin wurde in der vorliegenden Arbeit eine chromatographische Methode entwickelt und validiert, welche die Techniken der überkritischen Fluidchromatographie und Massenspektrometrie nutzt (SFC-MS). Die für die SFC charakteristischen Eigenschaften wie hohe Flussraten und Trenneffizienz sowie die Nutzung von Kohlenstoffdioxid als mobile Phase konnten ausgenutzt werden, um das Trennproblem in nur einer Methode mit kurzer Laufzeit zu lösen. Gleichzeitig wurde der Verbrauch von organischen Lösungsmitteln reduziert. Damit kann die erarbeitete Methode einen nachhaltigen Beitrag für zukünftige Ketaminforschung leisten.
Neu isolierte und synthetisierte Wirkstoffe müssen neben ihrer biologischen Wirksamkeit auch auf ihre Unbedenklichkeit für den Menschen hin untersucht werden. Ein Bestandteil der Untersuchungen zur Unbedenklichkeit ist die Prüfung auf mögliche Immuntoxizität. Die Risikobewertung und -klassifizierung von (immun-)toxischen Substanzen erfolgt derzeit in Tierversuchen, die, abgesehen von ethischen Bedenken, zeit- und kostenintensiv sind und deren Übertragbarkeit auf den Menschen nicht vollständig gewährleistet ist.
Im Fokus dieser Arbeit stand die Etablierung und Anwendung eines Methodensets basierend auf funktionalen in vitro Methoden zur Charakterisierung immunologischer Wirkungen ausgewählter Naturstoffe. Dieses sollte der Beurteilung der immuntoxischen Wirkungen der getesteten Naturstoffe und der Entwicklung eines Entscheidungsbaums, der die Vorhersage des immuntoxischen Potentials mithilfe von in vitro Versuchen gestattet, dienen. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien (Jurkat-Zellen als Beispiel für T-Zellen, THP-1-Zellen als Beispiel für Monozyten) und für einige Versuche vergleichsweise primäre Blutzellen eingesetzt. Es wurden Methoden zur Untersuchung folgender Parameter etabliert und angewendet: Vitalität, Zellzyklusverteilung, Induktion von Apoptose, iROS, DNA-Schäden (Genotoxizität), Zytokinfreisetzung und mitochondriale Funktion. Folgende Naturstoffe wurden für die Untersuchungen ausgewählt: Mannitol und Urethan als Negativkontrollen, Cyclosporin A, Deoxynivalenol und Mycophenolsäure als Positivkontrollen, ausgehend von Hinweisen auf Wirkungen im Immunsystem Tulipalin A, Helenalin, Vincristin, Cannabidiol, Agaritin und p-Tolylhydrazin als Testsubstanzen.
Es zeigten sich nur geringfügige Unterschiede der Substanzwirkungen zwischen den Immunzelllinien, welche v.a. auf Zytokinebene nachweisbar waren. Die Substanzen besaßen zeit- und konzentrationsabhängige Effekte. Die Negativkontrolle Mannitol hatte eine geringe Wirkung auf die Immunzelllinien, während Urethan die Zytokinfreisetzung supprimierte/¬stimulierte. Die untersuchten Positivkontrollen zeigten einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung und führten weiterhin zu immuntoxischen Effekten durch eine konzentrationsabhängige Apoptoseinduktion. Die Testsubstanzen Vincristin, Agaritin und p-Tolylhydrazin besaßen nur eine geringe toxische Wirkung auf die Immunzellen. Weitere Substanzen wie Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A wiesen immunspezifisch und - unspezifisch vermittelte Immuntoxizität durch einen Einfluss auf die Zytokinfreisetzung, Apoptose und iROS auf.
Funktionale in vitro Untersuchungen zur Vitalität, Zellzyklusverteilung, Apoptose und Zytokinfreisetzung waren zum Nachweis bzw. Ausschluss von Immuntoxizität geeignet und neben Proteom- und Metabolomanalysen wesentlicher Bestandteil eines Entscheidungsbaums zur Klassifizierung von direkt immuntoxischen Substanzen. Es zeigte sich, dass die Zytokinmessung der wichtigste Parameter zur Klassifizierung von immuntoxischen Substanzen im subtoxischen Bereich ist. Es konnte sowohl Cyclosporin A als Positivkontrolle als auch Mannitol als Negativkontrolle in beiden Zelllinien bestätigt werden. Von den hinreichend untersuchten Testsubstanzen wurde Cannabidiol, Helenalin und Tulipalin A in Jurkat-Zellen sowie Cannabidiol und Tulipalin A in THP-1-Zellen unter Verwendung des Entscheidungsbaums als immuntoxisch klassifiziert.
Darüber hinaus konnte die hautsensibilisierende Wirkung von Farnesol und Tulipalin A durch Anwendung von weiteren in vitro Methoden bestätigt werden.
Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Vorscreening Testung neuer Substanzen ermöglichen und nicht nur zu einer Reduktion von Tierversuchen führen, sondern auch eine Zeit- und Kostenersparnis bedeuten.
Chemosymbiosis in marine bivalves – unravelling host-symbiont interactions and symbiotic adaptions
(2018)
Symbiosis essentially forms the cornerstone of complex life on earth. Spearheading
symbiosis research in the last few decades include the exploration of diverse mutualistic
animal-bacterial associations from marine habitats. Yet, many facets of symbiotic
associations remain under-examined. Here we investigated marine bivalves of the genera
Bathymodiolus and Codakia, inhabiting hydrothermal vents and shallow water
ecosystems, respectively, and their bacterial symbionts. The symbionts reside
intracellularly within gill epithelia and supply their host with chemoautotrophically fixed
carbon. They oxidize reduced substrates like sulfide (thiotrophic symbionts) and methane
(methanotrophic symbionts) from surrounding fluids for energy generation. The nature of
interactions between host and symbiont at the metabolic and physical level, as well as
between the holobiont and its environment remain poorly understood. In vitro cultivations
of both symbiont and host are difficult till date, hampering the feasibility of targeted
molecular investigations.
We bypassed culture-based experiments by proteogenomically investigating physically
separated fractions of host and symbiont cell components for the bivalves Bathymodiolus
azoricus, Bathymodiolus thermophilus and Codakia orbicularis. Using these
enrichments, we sequenced the symbionts’ genomes and established semi-quantitative
host-symbiont (meta-) proteomic profiles. This combined approach enabled us to resolve
symbiosis-relevant metabolic pathways and adaptations, detect molecular factors
mediating physical interactions amongst partners and to understand the association of
symbiotic traits with the environmental factors prevailing within habitats of the respective
bivalve.
Our results revealed intricate metabolic interdependence between the symbiotic partners.
In Bathymodiolus, these metabolic interactions included (1) the concentration of essential
substrates like CO2 and thiosulfate by the host for the thiotrophic symbiont, and (2) the
host’s replenishment of essential TCA cycle intermediates for the thiotroph that lacks
biosynthetic enzymes for these metabolites. In exchange (3), the thiotroph compensates
the host’s putative deficiency in amino acid and cofactor biosynthesis by cycling aminoacids
derived from imported precursors back to the host. In case of Codakia orbicularis,
the symbionts may metabolically supplement their host with N-compounds derived from
fixation of molecular nitrogen, a trait that was hitherto unknown in chemosynthetic
thiotrophic symbionts.
Individual proteogenomic investigations of the bivalves Bathymodiolus azoricus and
Bathymodiolus thermophilus showed that their symbionts are able to exploit a multitude
of energy sources like sulfide, thiosulfate, methane and hydrogen to fuel chemosynthesis.
The bivalves and their thiotrophic symbionts, however, are particularly adapted to
thiosulfate-utilization, as indicated by mitochondrial production and concentration of
thiosulfate by host and dominant expression of thiosulfate oxidation enzymes in the
symbiont. This may be advantageous, because thiosulfate is less toxic to the host than
sulfide. The central metabolic pathways for energy generation, carbon and nitrogen
assimilation and amino acid biosynthesis in thiotrophic symbionts of both Bathymodiolus
host species are highly conserved. Expression levels of these pathways do, however, vary
between symbionts of both species, indicating differential regulation of enzyme synthesis,
possibly to accommodate differences in host morphology and environmental factors.
Systematic comparison of symbiont-containing and symbiont-free sample types within
and between B. azoricus and B. thermophilus revealed the presence of ‘symbiosisspecific’
features allowing direct host-symbiont physical interactions. Host proteins
engaged in symbiosis-specific functions include 1) a large repertoire of host digestive
enzymes predominant in the gill, possibly facilitating symbiont population control and
carbon acquisition via direct enzymatic digestion of symbiont cells and 2) a set of host
pattern-recognition receptors, which may enable the host to selectively recognize
pathogens or even symbionts “ripe” for consumption. Symbiont proteins engaged in
symbiosis-specific interactions included 3) an enormous set of adhesins and toxins,
putatively involved in symbiont colonization, persistence and host-feeding.
Bathymodiolus symbionts also possess repertoires of CRISPR-Cas and restrictionmodification
genes for phage defense that are unusually large for intracellular symbionts.
Genomic and proteomic comparisons of thiotrophic symbionts of distinct Bathymodiolus
host species from different vent sites revealed a conserved core genome but divergent
accessory genomes. The B. thermophilus thiotroph’s accessory genome was notably more
enriched in genes encoding adhesins, toxins and phage defense proteins than that of other
Bathymodiolus symbionts. Phylogenetic analyses suggest that this enrichment possibly
resulted from horizontal gene acquisition followed by multiple internal gene duplication
events. In others symbionts, these gene functions may be substituted by alternate
mechanisms or may not be required at all: The methanotrophic symbionts of B. azoricus,
for example, has the genetic potential to supplement phage defense functions. Thus, the
accessory genomes of Bathymodiolus symbionts are species- or habitat-associated,
possibly facilitating adaptation of the bivalves to their respective micro- and macroenvironments.
In support of this, we show that symbiont biomass in B. thermophilus,
which hosts only one thiotrophic symbiont phylotype, is considerably higher than in B.
azoricus that hosts thiotrophic and methanotrophic symbionts. This suggests that different
symbiont compositions in each species produce distinct microenvironments within the
holobiont.
Our study presents an exhaustive assessment of the genes and proteins involved in this
bivalve-microbe interaction, hinting at intimate host-symbiont interdependencies and
symbiotic crosstalk between partners. The findings open novel prospects for
microbiologists with regard to mechanisms of host-symbiont interplay within highly
specialized niches, origin and distribution of prokaryote-eukaryote interaction factors
across both mutualistic and pathogenic associations.
In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften von atmosphärendruckplasmaaktivierten Natriumchloridlösungen (NaCl-Lösungen), unter Anwendung von nass-chemischen und mikrobiologischen Analysenverfahren, untersucht. Es zeigte sich, dass plasmaaktivierte NaCl-Lösungen sowohl mit kurzzeitigen als auch mit langzeitigen antimikrobiellen Effekten generiert werden können. Diese Effekte korrelieren mit einer Änderung der chemischen Zusammensetzung der flüssigen Phase. Molekularbiologische Untersuchungen zeigten, dass die antimikrobiellen Effekte auf unterschiedlichen Wirkmechanismen, vor allem auf oxidativem und nitrosativem Stress, beruhen. Anwendungsorientierte Untersuchungen haben gezeigt, dass plasmaaktivierte NaCl-Lösungen über ein enges Wirkspektrum (grampositive und gramnegative Erreger) verfügen, sich keine schnellen Resistenzen gegen den Testorganismus ausbilden und eine Kombination mit handelsüblichen Antibiotika ein vielversprechender Ansatz für eine Wirkungssteigerung der verwendeten Antibiotika ist.
Die Verlängerung des Magenaufenthalts von oralen Arzneiformen steht seit mehr als 30 Jahren im Fokus internationaler Forschungsgruppen. Trotz der Vermarktung diverser Systeme gelang es bislang nicht, eine sichere und reproduzierbare Gastroretention von Arzneiformen zu realisieren. Dies würde jedoch enorme Möglichkeiten für die Therapie mit oral applizierten Arzneimitteln mit sich bringen. Die Reduktion der Einnahmefrequenz, das Vermeiden von Plasmaspiegelspitzen sowie die gesteigerte Patientenadhärenz sind nur einige der denkbaren Vorteile. Die größte Hürde gastroretentiver Systeme ist dabei die Motilität des menschlichen Magens. Starke Kontraktionswellen sind für eine rasche Entleerung insbesondere unter Nüchternbedingungen verantwortlich. Daneben kommt es zu höchsten Belastungen auf Arzneiformen, was wiederum die Wirkstofffreisetzung beschleunigen kann, mit drastischen Folgen für den Patienten. In der präklinischen Testung neu entwickelter Systeme fehlt häufig der Bezug zur Physiologie des Magens und die Vorhersagekraft von Freisetzungstests ist dementsprechend gering. Ziel der Arbeit war daher die Charakterisierung der relevanten Parameter im Magen im Rahmen einer Humanstudie. Die aus dieser Humanstudie gewonnenen Daten zu pH-Werten, Temperaturen und insbesondere Drücken im Magen sollten anschließend genutzt werden, um die im Arbeitskreis verfügbaren, biorelevanten Freisetzungsmodelle weiterzuentwickeln. Abschließend sollten verschiedene, kommerziell erhältliche gastroretentive Arzneiformen unter Berücksichtigung der Magenphysiologie auf ihr Freisetzungsverhalten getestet werden. Die Ergebnisse der Humanstudie zeigten die enorme Abhängigkeit der Magenaufenthaltszeit einer telemetrischen Kapsel vom prandialen Status der Probanden. Nach Einnahme der Standardmahlzeit, wie sie in klinischen Studien zu Nahrungsmitteleffekten Verwendung findet, kam es zu Magentransitzeiten von über 20 h. Dagegen wurde die Kapsel unter Nüchternbedingungen spätestens nach 2,7 h aus dem Magen entleert. Die intragastralen Drücke nach postprandialer Einnahme der Kapsel betrugen mindestens 240 mbar und waren aufgrund des verlängerten Magenaufenthalts deutlich zahlreicher im Vergleich zur Nüchterneinnahme. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen zeigten, dass die herkömmlich verwendeten Freisetzungstestgeräte nicht in der Lage sind, biorelevante Belastungen auf eine telemetrische Kapsel auszuüben. Maximale Drücke von 14 mbar waren im eintauchenden Zylinder zu beobachten, welche wir jedoch auf den hydrostatischen Druck beim Eintauchen zurückführen konnten. Im Gegensatz dazu waren wir mit Hilfe unserer neuartigen In vitro-Freisetzungsmodelle in der Lage, vollständige Druckprofile nachzustellen, wie sie auch in vivo beobachtbar waren. Die Freisetzungsuntersuchungen der gastroretentiven Präparate Glumetza® 1000 und Madopar® Depot unter biorelevanten Bedingungen offenbarten die extreme Drucksensitivität dieser Systeme. Hierfür definierten wir auf Basis der In vivo-Daten drei realistische Druckprofile und stellten diese in vitro nach. Früh auftretende, leichte Belastungen während der Freisetzungstests führten bei der flotierenden Arzneiform Madopar® Depot bereits zur vollständigen Wirkstofffreisetzung. Glumetza® 1000 schien abhängig vom Quellungszustand auf die Belastungen zu reagieren, wobei spätestens stärkere Belastungen nach 6 h zur vollständigen Freisetzung des Wirkstoffs führten. Auf Basis dieser Ergebnisse ist anzuzweifeln, dass die bislang erhältlichen gastroretentiven Systeme über einen längeren Zeitraum im Magen intakt bleiben und kontrolliert ihren Wirkstoff freisetzen. Daneben können die entwickelten Testmethoden dazu genutzt werden, um die Entwicklung neuartiger gastroretentiver Systeme voranzutreiben.
Der Einsatz von 3D-Druckverfahren für die Herstellung von Arzneimitteln und Medizinprodukten stellt eines der größten neu entstandenen Forschungsgebiete dieses Jahrzehnts dar und gilt als ein technologischer Meilenstein im Bereich der personalisierten Medizin. Neben der Formindividualisierung von Implantaten können durch 3D-Druckverfahren wie dem in dieser Arbeit untersuchten Fused deposition modeling (FDM) auch die Wirkstoffdosis angepasst, deren Freisetzung gesteuert oder mehrere Wirkstoffe und/oder Freisetzungsprofile in einer Darreichungsform patientenindividuell kombiniert werden. Voraussetzung für diese Formulierungsentwicklungen sind geeignete pharmazeutische Polymere und eine genaue Kenntnis ihrer Extrudier- und Druckbarkeit und ihrer Wirkstofffreisetzung, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollten. Neben der Identifikation und Evaluation von druckbaren Polymeren sollte auch das Potenzial des FDMs für die Produktion von wirkstoffhaltigen Darreichungsformen sowohl für die parenterale als auch die perorale Applikation mit besonderem Augenmerk auf anspruchsvolle Wirkstoffe geprüft werden. Mit der Aufnahme dieser Arbeit belief sich die Auswahl an druckbaren Materialien für pharmazeutische Anwendungen primär auf die auch im technischen FDM verwendeten Polymere Polylactid und Polyvinylalkohol. Das zunächst begrenzte Spektrum möglicher Freisetzungsprofile der inkorporierten Arzneistoffe konnte unter anderem durch die in dieser Arbeit dargelegten Untersuchungen erweitert werden. Im Bereich des FDMs von Implantaten ergaben das bei nur 53 °C gedruckte Polycaprolacton eine vielversprechende Freisetzung des im Polymer komplett gelösten Modellarzneistoffs Chinin über einen Zeitraum von etwa 7 Wochen mit einer initial schnelleren Freisetzung, die sich sowohl durch die Wirkstoffbeladung als auch durch wasserlösliche Zusätze steuern ließ. Als Alternative zum klassischen FDM wurde darüber hinaus eine Spritzenextrusionsmethode zur Herstellung von flexibleren Hydrogel-Implantaten untersucht. Es konnten erfolgreich wirkstoffhaltige Glycerol-Gelatine-Modellimplantate gedruckt und anschließend quervernetzt werden. Abgesehen von ihrer guten Komprimierbarkeit für eine mögliche endoskopische Applikation sind jedoch die sehr schnelle Wirkstofffreisetzung innerhalb von 6 h und die beobachteten lagerungsabhängigen Volumenveränderungen nur schwer mit einer Anwendung als patientenindividuell angepasstes Implantat vereinbar. Im Bereich des FDMs von oralen Darreichungsformen lag der Fokus dieser Arbeit auf einer sehr schnellen Wirkstofffreisetzung aus der Polymermatrix und der Entwicklung von Lösungsstrategien für das FDM von anspruchsvollen Wirkstoffen, mit denen Forscher auch bei zukünftigen FDM-Anwendungen umgehen werden müssen. Eine der größten Limitationen der thermischen Verfahren Schmelzextrusion und FDM lag bis dato in der Notwendigkeit thermisch stabile Wirkstoffe einzusetzen. Durch ein ausführliches Screening von wasserlöslichen, pharmazeutischen Polymeren bei gleichzeitigem Einsatz des thermolabilen Modellarzneistoffs Pantoprazol-Natrium konnten in dieser Arbeit erfolgreich Formulierungen entwickelt werden, die bei Temperaturen unter 100 °C extrudier- und druckbar sind und eine schnelle Wirkstofffreisetzung aufweisen. Zu den vielversprechendsten Kandidaten gehören die amorphen festen Lösung des Polymers Polyethylenglycol 6000 mit einer sehr niedrigen Drucktemperatur von 54 °C und einer abgeschlossenen Freisetzung innerhalb von 30 min und die Formulierung des Polyvinylpyrrolidons K12, die neben den 10 % Pantoprazol auch 15 % Triethylcitrat enthielt und den kompletten Wirkstoff in etwa 10 min freisetzte. Durch Änderung des Druckdesigns der biplanen Tablette durch Senkung der Füllungsrate und Erhöhung der Tablettenporosität konnte diese Freisetzungszeit noch weiter auf sehr schnelle 3 min reduziert werden. Da das verwendete Pantoprazol zusätzlich säurelabil ist, erfolgte in einem nächsten Schritt eine magensaftresistente Ummantelung dieser schnell freisetzenden Tablettenkerne mittels Zweidüsen-FDM. Aufgrund der hohen Drucktemperatur des dafür verwendeten Celluloseacetatphthalats ergab sich ein zweigeteiltes Manteldesign, das jedoch in anschließenden Freisetzungsuntersuchungen keine komplette Magensaftresistenz erzielen konnte. Für eine ausreichende Dichtigkeit sollte für zukünftige Untersuchungen eine Veränderung im Düsenwechsel und/oder der Druck eines dickeren Mantels in Betracht gezogen werden, der wiederum eine weitere Verzögerung der Arzneistofffreisetzung nach dem pH-Anstieg bei Übertritt der Tablette in den Darm bedingen würde. Zusammenfassend betrachtet, liefert die vorliegende Arbeit wertvolle Erkenntnisse über den Einsatz von verschiedenen Polymeren für das FDM von Tabletten und Implantaten, die für eine gezielte Freisetzung - auch von anspruchsvollen Arzneistoffen – für kommende FDM-Anwendungen genutzt werden können.
Die Wirksamkeit und Sicherheit einer Arzneitherapie wird durch zahlreiche pharmakokinetische Prozesse beeinflusst. Neben den durch CYP-450-Enzym vermittelten Biotransformationsvorgängen sind zunehmend Transportprozesse durch Arzneimitteltransporter aus der ABC- sowie SLC-Familie in den Fokus getreten, welche unter anderem in den Membranen der Enterozyten, aber auch in weiteren Organen exprimiert sind. Die Expression und Funktion der Arzneimitteltransporter kann beispielsweise durch Arzneistoffe beeinflusst werden und somit in Arzneimittelwechselwirkungen resultieren. Dass diese Regulationsmechanismen eine hohe Komplexität aufweisen, ist aus einer Vielzahl von klinischen Interaktionsstudien ersichtlich. In diesen führte die Applikation von bekannten Induktoren des Arzneistoffmetabolismus und -transports zu organspezifischen Veränderungen in der Pharmakokinetik der gleichzeitig verabreichten Arzneistoffe.
Ziel dieser Arbeit war es, zu einem besseren Verständnis der Expression und Regulation intestinaler Arzneimitteltransporter beizutragen, um somit Auswirkungen auf die Pharmakokinetik besser vorhersagen zu können. Dies beinhaltete zum einen die Mitarbeit an der Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-basierten Methode zur Proteinquantifizierung, mit welcher auch in limitierten Gewebemengen die am stärksten exprimierten Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC2 (MRP2), ABCG2 (BCRP) und SLC15A1 (PEPT1) quantifiziert werden konnten. Parallel dazu wurden die Prozesse zur mRNA-Isolierung und -Quantifizierung optimiert.
In der präklinischen Forschung wird weitverbreitet das Caco-2-Zellmodell zur Prädiktion der intestinalen Absorption genutzt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Caco-2-Zellmodell dahingehend untersucht werden, ob es ein geeignetes Modell zur Prädiktion der intestinalen Absorption darstellt, auch in Bezug auf Induktionsvorgänge. In bereits publizierten Arbeiten wurde häufig eine gute Korrelation des Transporterexpressionsmusters auf mRNA-Ebene zwischen Caco-2 und Jejunum gezeigt. Die vorliegenden vergleichenden Ergebnisse zur mRNA- und Proteinexpression von Arzneimitteltransportern zeigten, dass sowohl im Zellmodell als auch im jejunalen Gewebe in Teilen deutliche Diskrepanzen zwischen mRNA und Transporterexpression bestehen. Auf der für die Funktion der Arzneimitteltransporter relevanten Proteinebene zeigten sich für ABCB1, ABCC2 und ABCG2 relativ gute Übereinstimmungen, während die Proteinexpression anderer Transporter, insbesondere OATP2B1, im Zellmodell deutlich abwich. Dies verdeutlicht, dass insgesamt Vorsicht geboten ist in der Prädiktion der intestinalen Absorption mittels Caco-2-Zellmodell, da zudem bereits auf mRNA-Ebene gezeigt worden ist, dass die Expression der Transporter sowohl von dem Zellklon als auch von den Kulturbedingungen anhängig ist. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression der Transporter in dem Zellmodell sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeitlich variabel ist. Somit empfiehlt sich ein noch vorsichtiger Umgang mit Daten zur intestinalen Absorption, welche auf Basis eines Caco-2-Modells mit verkürzter Kultivierungszeit erhoben worden sind. Induktionsprozesse konnten weder auf Ebene der mRNA-Expression oder des Proteingehaltes noch auf Ebene der Funktion in dem Caco-2-Zellmodell durch Inkubation mit prototypischen Induktoren des Arzneistoffwechsels (Carbamazepin, Efavirenz, Johanniskrautextrakt, Rifampicin) simuliert werden.
Weiterhin wurde die Induktion von intestinalen Arzneimitteltransportern in vivo untersucht. Chronische Gabe von Rifampicin führte zu einem Anstieg von ABCB1 und ABCC2 auf mRNA Ebene, welches nur im Fall von ABCB1 (P-gp) auf Proteinebene umgesetzt wurde. Die chronische Applikation von Carbamazepin resultierte ausschließlich in einer Induktion auf mRNA Ebene. Im Vergleich zu Rifampicin war diese jedoch auch geringer ausgeprägt. Der PXR-Ligand Rifampicin kann aufgrund einer hohen intestinalen PXR-Expression eine stärkere Induktion hervorrufen als Carbamazepin, welches präferentiell den nukleären Rezeptor CAR aktiviert. Begünstigt wird dies darüber hinaus dadurch, dass Rifampicin, nicht aber Carbamazepin, einem enterohepatischen Kreislauf unterliegt und Rifampicin somit über einen längeren Zeitraum im Intestinum in einer Konzentration vorliegt, welche notwendig ist, um eine Aktivierung der nukleären Rezeptoren zu erreichen. Regulationsvorgänge durch miRNAs können dafür verantwortlich sein, dass eine erhöhte Expression der mRNA nicht parallel mit einem Anstieg des Proteingehaltes einhergeht. Durch Korrelationsanalysen, in silico-Prädiktion sowie Untersuchungen mittels Reportergen-Assays konnten in der vorliegenden in vivo-Studie drei Interaktionen zwischen miRNAs und mRNAs (ABCB1 - miR-485-3p; ABCC2 - miR-26a-5p; ABCG2 - miR-577) identifiziert werden, welche potentiell den Translationsprozess verhindert bzw. abgeschwächt haben. Korrelationsanalysen mit bereits zuvor erhobenen Daten zur Pharmakokinetik der applizierten probe drugs deuten darauf hin, dass die systemische Verfügbarkeit von Ezetimib und dessen Glukuronid durch intestinales ABCB1 (P-gp), nicht jedoch wie zuvor angenommen durch intestinales ABCC2 (MRP2) beeinflusst wird. Insgesamt konnten nach chronischer Gabe von Rifampicin Korrelationen entlang der Signalkaskade ausgehend von der mRNA-Expression von PXR, über die mRNA Expression von ABCB1, unter Berücksichtigung der Expression der miRNA 485-3p bis hin zum Gehalt und der Funktion von ABCB1 (P-gp) gezeigt werden. Veränderungen des Plasmaspiegels von Talinolol nach chronischer Gabe von Carbamazepin sind hingegen nicht auf Induktionsvorgänge intestinaler Transportprozesse zurückzuführen. Die Ursachen dafür sind u.a. in der Erhöhung der renalen Clearance zu suchen. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass nukleäre Rezeptoren, miRNAs und die pharmakokinetischen Eigenschaften der Induktoren selbst maßgeblich an der differenziellen Regulation von Transportprozessen beteiligt sind.
Profiling the activity and hepatotoxicity of flupirtine through medicinal chemistry approaches
(2019)
Drug induced liver injury (DILI) and tissue discoloration led to the recent discontinuation of the therapeutic use of the closely related drugs flupirtine and retigabine, respectively. Experience gained with these drugs strongly suggests that heterodimer, voltage‐gated potassium channels 2 and 3 (KV2/3) are valid targets for effective treatment of pain and epilepsy. Because the adverse effects are not related to the mechanism of action, it appears promising to investigate chemical modifications of these clinically validated, drug‐like leads. In the present retro metabolic drug design study, a series of 44 compounds were
synthesized and characterized with regards to KV7.2/3 opening activity and efficacy. The most active compounds displays excellent potency (EC50 = 4 nM) and efficacy (154%) as an Kv7.2/3 opener. Limited aqeous solubility hampered toxicity testing at concentrations higher than 63 μM, but this concentration was nontoxic to two hepatocellular cell ilnes (HEP‐G2 and TAMH) in culture.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmethoden sind im Laufe der letzten Jahrzehnte zu einem unverzichtbaren Hilfsmittel in der Entwicklung von innovativen und generischen oralen Formulierungen geworden. Sie dienen in einer frühen Phase der Produktentwicklung u.a. zur Selektion von geeigneten Formulierungskandidaten im Vorfeld von Bioverfügbarkeits- und Bioäquivalenzuntersuchungen. Mithilfe biorelevanter Freisetzungsmethoden sollen dabei der menschliche Gastrointestinaltrakt (GIT) oder Teile davon simuliert werden, um somit Aussagen zum In-vivo-Freisetzungsverhalten der untersuchten Formulierung treffen zu können. Im Zuge der Entwicklung biorelevanter In-vitro-Testmethoden lag der Fokus bisher vorrangig in der Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden Erwachsenen. Inter- und intraindividuelle Unterschiede und andere Faktoren, die das Freisetzungsverhalten im GIT beeinflussen können, wie beispielsweise das Alter des Patienten oder zusätzliche Erkrankungen, blieben hingegen größtenteils unberücksichtigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten daher individualisierte In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt werden, welche die In-vivo-Variabilität des gastrointestinalen Transitverhaltens von Darreichungsformen und die variablen pH-Bedingungen des GIT nach Nüchterneinnahme widerspiegeln sollen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Modelle sollte es demnach möglich sein, die Robustheit des Freisetzungsverhaltens von modifiziert freisetzenden Arzneiformen gegenüber inter- und intraindividuellen Unterschieden im Passageverhalten und den vorherrschenden pH-Bedingungen zu untersuchen. Am Beispiel von magensaftresistenten Acetylsalicylsäure (ASS)-Formulierungen wurde zunächst im Rahmen eines systematischen Screenings der Einfluss der Zusammensetzung des Freisetzungsmediums auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf dem Vergleich phosphatgepufferter Medien mit dem physiologisch für den nüchternen Dünndarm relevanten Kohlensäure (H2CO3)/Hydrogencarbonat (HCO3-)-Puffersystem. Auf Basis von Literaturdaten zur Elektrolytzusammensetzung der intestinalen Flüssigkeiten wurde als Resultat des systematischen Screenings mit Carbonate-based Fasted State Simulated Intestinal Fluid (CarbFaSSIF) ein Freisetzungsmedium entwickelt, welches die Elektrolytzusammensetzung der luminalen Flüssigkeiten des nüchternen Dünndarms widerspiegelt und auf dem H2CO3/HCO3--Puffersystem basiert. Der Einsatz eines automatischen pH-Regulationssystem (pHysio-grad®) zur Stabilisierung von thermodynamisch instabilen HCO3--basierten Freisetzungsmedien ermöglichte es, mit CarbFaSSIF dynamische intestinale pH- und Transitprofile in hoher zeitlicher Auflösung in einer kompendialen Blattrührerapparatur zu simulieren. Am Beispiel von magensaftresistenten Mesalazin- und Natriumvalproatformulierungen wurde die Robustheit des Freisetzungsverhaltens gegenüber der Variabilität gastrointestinaler pH- und Passagebedingungen untersucht. Mit dem lokal im GIT wirkenden Mesalazin und dem systemisch wirkenden Natriumvalproat wurden zwei Arzneistoffe mit unterschiedlichen Wirkprinzipien ausgewählt, die aufgrund eines individuell variablen Freisetzungsverhaltens zu teils schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen oder zu einem Therapieversagen führen könnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden beispielhaft individuelle pH- und Transit-Bedingungen von vier individuellen Probanden einer in der Literatur beschriebenen In-vivo-Studie für die In-vitro-Simulationen ausgewählt, welche einerseits den Durchschnitt der In-vivo-Studie widerspiegelten, aber auch extreme Passage- und pH-Bedingungen aufwiesen. Die untersuchten Formulierungen zeigten abhängig von der Art der magensaftresistenten Überzüge eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber den individuellen simulierten pH- und Transit-Profilen. Für die Mesalazinformulierungen war es möglich, den Ort und das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung, die für eine erfolgreiche Therapie ausschlaggebend sind, in individuellen Probanden in vitro zu bestimmen. Im Gegensatz zu den lokal im GIT wirkenden Mesalazinformulierungen sind für die antiepileptische Therapie mit magensaftresistenten Natriumvalproatformulierungen neben dem Ausmaß insbesondere der Zeitpunkt der Wirkstofffreisetzung für konstante Plasmaspiegel von entscheidender Bedeutung. Darauf basierend wurden unter Verwendung der ermittelten Freisetzungsdaten und mithilfe von individuellen pharmakokinetischen Parametern für die natriumvalproathaltigen Darreichungsformen In-silico-Simulationen mit einem neuen Simulationsprogramm (BioavailabilityDesign expert) zur Vorhersage von Natriumvalproatplasmaprofilen durchgeführt. Die ermittelten In-silico-Plasmaprofile wurden dabei mit dem mathematischen Verfahren des durchschnittlichen Euklidischen Abstands mit In-vivo-Daten aus der Literatur verglichen, um die In-vivo-Vorhersagekraft des Freisetzungsmodells beurteilen zu können. Abhängig von der Art des magensaftresistenten Überzugs und dem daraus resultierenden unterschiedlichen Ansprechen auf die Bedingungen der In-vitro-Freisetzungstests konnten für zwei der drei untersuchten Natriumvalproatformulierungen vielversprechende Vorhersagen zu den resultierenden Plasmaspiegeln getroffen werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit lag in der Implementierung des pHysio-grad®-Systems und der neu entwickelten HCO3--basierten Medien in prädiktiven Freisetzungstestmethoden für pädiatrische Darreichungsformen. Um vor allem das im GIT von Kindern, insbesondere bei Neugeborenen und Kleinkindern, im Vergleich zum Erwachsenen für die Wirkstofffreisetzung zur Verfügung stehende geringere Flüssigkeitsvolumen in einem In-vitro-Test hinreichend wiedergeben zu können, wurde für diesen Zweck eine neue Freisetzungsapparatur entwickelt. Das konstruierte System basierte auf standardisierten Prüfgefäßen und ermöglichte Freisetzungsuntersuchungen in einem Volumen von 30 bis 110 mL. Durch die Einbindung von miniaturisierten Komponenten des pHysio-grad®-Systems konnten zur Simulation der intestinalen Bedingungen von Kindern unterschiedlicher Altersgruppen auch physiologisch-relevante HCO3--Medien eingesetzt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen, dass individualisierte Freisetzungsmethoden basierend auf physiologischen HCO3--Medien einen vielversprechenden Ansatz zur Beurteilung der Robustheit der Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Arzneiformen hinsichtlich der Variabilität von gastrointestinalen Transit und pH-Bedingungen darstellen. Darüber hinaus wurde mit einem Freisetzungsmodell für pädiatrische Arzneiformen ein erster Ansatz entwickelt, um die Besonderheiten, die mit der Arzneimittelapplikation an Kindern in Verbindung stehen, in einem In-vitro-Maßstab wiederzugeben. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten In-Vitro-Methoden basieren auf physiologischen Daten von gesunden erwachsenen Probanden, stellen aber eine universelle Plattform dar, die perspektivisch auch zur Simulation von individuellen Patienten eingesetzt werden kann. Die neu konzipierten Freisetzungsmodelle würden daher zukünftig sehr von systematischen In-vivo-Studien an Patienten profitieren, die Einflussfaktoren, wie Alter oder Erkrankungen, auf die Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten und das gastrointestinale Passageverhalten von Arzneiformen untersuchen.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Arzneiformen mit neuartigen, auf der Mechanik des GIT basierenden Freisetzungsmechanismen. Für die Herstellung dieser Arzneiformen sollten additive Fertigungsprozesse entwickelt und etabliert werden. Für die Herstellung von Arzneiformen wurden 3D-Drucker modifiziert, sodass es möglich war, pharmazeutische Polymere als Ausgangsstoff nutzen zu können. Die Polymere wurden mittels eines eigens zu diesem Zweck entworfenen und gebauten Extruders in Filamente überführt. Die Mechanik der verwendeten 3D-Drucker wurde an die Materialeigenschaften der Polymere angepasst. Insbesondere die geringe Flexibilität und erhöhte Sprödigkeit machten Modifikationen notwendig. Mit Eudragit® RS konnte ein Prozess etabliert werden, der die Herstellung von drucksensitiven Arzneiformen ermöglicht. Eine speziell für den Druck dieser Objekte entwickelte Software wurde angewendet, um den Steuercode für den 3D-Drucker zu erzeugen und die Freisetzungsparameter der Arzneiform einstellen zu können. Vorversuche mit technischem PLA Filament dienten der Entwicklung der Herstel- lungsmethode. Aus Eudragit® RS wurden anschließend Arzneiformen hergestellt und auf ihr Bruchverhalten untersucht. Drei Chargen wurden in der Stresstest- apparatur für orale Arzneiformen einer Freisetzungprüfung unterzogen. Es konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Prozess Arzneiformen mit verschiedenen Bruchdrücken produzieren kann. Alle Chargen wiesen allerdings geringere Belastbarkeiten auf, als für eine Anwendung am Menschen notwendig wäre. Freisetzungssysteme dieser Art könnten auch verwendet werden, um wirkstoffhaltige Filme gezielt auf die Dünndarmschleimhaut aufzubringen. Die Geometrie von Objekten, die mittels additiver Verfahren gefertigt werden, ist in weiten Bereichen variabel. Der Einfluss der äußeren Form auf die Freisetzungsrate ist bereits Gegenstand der Forschung. Wie sich von bekannten Arzneiformen abweichende Geometrien auf die Schluckbarkeit auswirken, war ein weiterer Bestandteil der Untersuchungen
dieser Arbeit. Zur Beurteilung der Schluckbarkeit wurde eine Humanstudie durcheführt, in der gesunde Probanden Schluckvorgänge von verschiedenen Objekten bewerteten. Die untersuchten Geometrien orientierten sich zum Teil an bekannten Arzneiformen. Zusätzlich wurden neuartige Geometrien untersucht, die aufgrund ihrer Eigenschaften interessant für die Entwicklung von Arzneiformen erschienen und durch additive Fertigungsverfahren zugänglich sind. Die Herstellung der Arzneiformen aus Isomalt erfolgte mittels eines modifizierten 3D-Druckers. Dieser als Lebensmittelzusatzstoff zugelassene Stoff eignet sich zum Einsatz in Fused Deposition Modelling Prozessen aufgrund der hohen Viskosität bei Temperaturen im Schmelzbereich. Das 3D-Drucksystem zur Verarbeitung spröder Filamente wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt und bot die Möglichkeit, vier identische Objekte zur gleichen Zeit zu produzieren. Auf diese Weise konnte der Herstellungsprozess der für die Studie benötigten Testkörper verkürzt werden. Neben einem mechanisch stark überarbeiteten Düsensystem kam an diesem Drucker auch eine modifizierte elektronische Steuereinheit zum Einsatz, die den Einsatz der höheren Düsenanzahl zuließ und Funktionen für die komfortable Einrichtung und Reinigung des Druckers bereitstellte.
In der Humanstudie wurde gezeigt, dass die Geometrie einen starken Einfluss auf die Schluckbarkeit der Testkörper und das Empfinden während des Schluckvorgangs hat. Als negativ haben sich Geometrien erwiesen, deren Kanten in spitzen Winkeln zulaufen und keine längliche Form aufweisen, die eine parallele Orientierung im Rachenbereich zulässt. Vorteilhaft hingegen sind Formen, die sich in Schluckrichtung ausrichten können und in einer Schnittebene einen deutlich kleineren Querschnitt aufweisen, als in den rechtwinklig dazu angeordneten Schnittebenen. Neben der Einwirkung von Druck durch den GIT wurde auch die Bewegung einer oralen Arzneiform in Relation zur Oberfläche des Lumens des GIT für das drug targeting genutzt. Die entwickelte Arzneiform sollte die gezielte Arzneistoffapplikation auf der Mukosa des Ösophagus ermöglichen. Erkrankungen in diesem Bereich des GIT können bislang lokal kaum behandelt werden, da die Kontaktzeit eines oral verabreichten Arzneistoffes sehr kurz ist. Die aus diesem Grund notwendige systemische Behandlung ist mit einer hohen Arzneistoffbelastung des Organismus und damit einhergehenden unerwünschten Wirkungen verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein schluckbares mechanisches System entwickelt, welches die gesteuerte Applikation eines Films über die gesamte Länge des Ösophagus auf dessen Schleimhaut ermöglicht. Die mukoadhäsiven Eigenschaften des Films können zu einer erhöhten Kontaktzeit führen, wodurch lokale Erkrankungen des Ösophagus einer topischen Therapie zugänglich gemacht werden könnten. Die entwickelte Arzneiform besteht aus einem Film, der mit Wirkstoff beladen werden kann und einer Hülle, die gleichzeitig das orale Applikationssystem dar- stellt. Mittels eines speziellen Applikators wird die Arzneiform geschluckt. Der Film ist in seiner Hülle so gelagert, dass er durch den Transport durch Mund- und Rachenraum sowie den Ösophagus aus dem Applikationssystem gezogen wird. Bei Kontakt mit dem kollabierenden Ösophagus verweilt der Film aufgrund seiner mu- koadhäsiven Eigenschaften auf der Schleimhaut, während das Applikationssystem den Magen erreicht und rasch disintegriert. Der Film quillt auf der Schleimhaut und kann den Arzneistoff über längere Zeit freisetzen. Es konnte gezeigt werden, dass neben den etablierten Freisetzungsmechanismen zur Steuerung oraler arznei- stoffbeladener Systeme auch die Mechanik des GIT für das drug targeting genutzt werden kann. In Verbindung mit additiven Fertigungsverfahren lassen sich orale Arzneiformen entwickeln, deren Freisetzungsparameter ausschließlich mittels digitaler Informationen variiert werden können.
From a biopharmaceutical point of view, poor oral bioavailability of a drug is one of the greatest challenges for formulation scientists. The majority of new chemical entities (NCEs) are weakly basic drugs. Consequently, these drugs exhibit pH-dependent solubility, being higher under acidic conditions in the fasted stomach and lower under neutral conditions in the small intestine, the main site of drug absorption. For theses compounds, pH-dependent precipitation testing represents a key parameter during early development stages. In this development phase, the amount of drug available is limited, and fast and detailed investigations of simulated drug solubility are desired. Therefore, an automated small-scale in vitro transfer model, simulating drug transfer from a donor (stomach; simulated gastric fluid, SGF pH 2.0) to an acceptor (small intestine; fasted state simulated intestinal fluid, FaSSIF-phosphate pH 6.5) compartment, has been developed. In contrast to the originally published transfer model, this model allowed a detailed investigation of drug supersaturation and precipitation in a small-scale, feasible for pre-formulation purposes, through miniaturization and automation in an in-line analytical set-up. In-line drug concentration analysis in turbid samples, due to pH-dependent drug precipitation, was achieved by a pre-filtration step, the use of flow-through cuvettes and the application of UV derivative spectroscopy. Compared to the common procedure of manual sampling followed by HPLC-UV analysis for concentration determination, the supersaturation and precipitation of the model drug ketoconazole was more accurately captured by the newly developed in-line analytical set-up. In addition, the newly developed small-scale model was compared to a USP II-based transfer model, representing an established scale of the transfer model. Using a physiologically relevant simulated gastric emptying rate of 5 min half-time, supersaturation and precipitation of the model drugs ketoconazole and a new chemical entity from the research laboratories of Merck Healthcare KGaA, MSC-A, were observed to be highly comparable. Following miniaturization and automation, the developed small-scale model was used to establish eight physiologically relevant test-sets. These test-sets were used to assess the impact of gastrointestinal (GI) variability, i.e. gastric pH, gastric emptying, and GI fluid volumes, on supersaturation and precipitation of two weakly basic model compounds, ketoconazole and MSC-A. The experiments revealed that variations in all GI parameters investigated affected the in vitro supersaturation and precipitation of ketoconazole. For example, faster gastric emptying yielded higher supersaturation and faster precipitation of ketoconazole. In contrast, MSC-A supersaturation and precipitation was only affected by variability in gastric pH. Consequently, the effect of varying GI parameters was found to be drug-specific. Elevated gastric pH, as it can result from co-medication with acid-reducing drugs, resulted in lower degrees of supersaturation for both substances. For ketoconazole, this result is in agreement with the observation that the oral bioavailability of ketoconazole is lowered when proton pump inhibitors are co-administered. In addition to the physiological considerations, the small-scale model developed herein was used to establish an in vitro screening assay for precipitation inhibitors (PIs). The use of PIs represents one option of reducing the process of pH-dependent drug precipitation during simulated GI transfer. For this purpose, ketoconazole and five orally administered kinase inhibitors (i.e. pazopanib, gefitinib, lapatinib, vemurafenib, and MSC-A) were analyzed with and without the polymeric PIs HPMC, HPMCAS, PVPK17 and K30, PEG6000, and Soluplus® in the small-scale transfer model. This screening revealed that at least one effective PI could be identified for each model drug. Moreover, HPMCAS and Soluplus® were the most effective PIs. Another outcome of these studies was that gefitinib expressed highly variable amorphous precipitation which was confirmed by powder X-ray diffraction (PXRD). During the transfer model experiments, the intermediate amorphous and supersaturated state of gefitinib was stabilized using HPMCAS and Soluplus®. After the polymer investigations, the impact of the buffer species in the simulated intestinal medium on drug supersaturation and precipitation was assessed. Since luminal fluids are mainly buffered by hydrogen carbonate ions, a USP II-based transfer model equipped with the pHysio-grad® device was proposed. This allowed the use of a complex bicarbonate buffer for the preparation of FaSSIF-bicarbonate in an in vitro transfer model. Results of transfer model experiments using standard phosphate-based FaSSIF and a more physiologically relevant bicarbonate-based FaSSIF were compared. Therefore, ketoconazole, pazopanib, and lapatinib were analyzed with and without the precipitation inhibitor HPMCAS. While HPMCAS was found to be an effective precipitation inhibitor for all drugs in FaSSIF-phosphate, the effect in FaSSIF-bicarbonate was much less pronounced. Additionally, performed rat PK studies revealed that HPMCAS did not increase the exposure of any of the model compounds significantly, indicating that the transfer model employing bicarbonate-buffered FaSSIF was more predictive compared to the model using phosphate-buffered FaSSIF. The in vitro and in vivo results of these studies demonstrated that the supersaturation precipitation of poorly soluble weakly basic drugs can be significantly affected by GI variability. Furthermore, the use of the automated small-scale transfer model enabled the identification of effective precipitation inhibitors for the model drugs involved in these studies. At the same time the buffer species has been observed to be especially important to reliably predict the in vivo solubility/dissolution behavior of HPMCAS and the weakly basic model drugs.
The aim of the present dissertation was to investigate the biological and chemical potential of two European mushroom species: Fomitopsis betulina and Calvatia gigantea. For this purpose, different extracts of both fungi were tested for: antimicrobial, antifungal, cytotoxic, in vitro wound healing, and anti-adhesive properties. Bioassay-guided fractionation led to the isolation of bioactive compounds, altogether 20 compounds were isolated and identified. The compounds were obtained from the ethyl acetate extracts, they included triterpenes, sterols and aromatic compounds. The separated substances from both fungi were proved for biological activities, some of them showed antimicrobial and cytotoxic activities.
Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus verschiedenen Arzneiformen hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Einerseits werden diese Methoden im Rahmen der routinemäßigen Qualitätskontrolle genutzt, andererseits können diese Methoden auch in einer frühen Phase der Entwicklung einer neuartigen Darreichungsform hilfreich sein. Weiterhin werden heutzutage auch biorelevante Aspekte in Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung eingebracht, um aus den Ergebnissen der In-vitro-Wirkstofffreisetzung mögliche In-vivo-Profile vorherzusagen. Aufgrund der steigenden Anzahl an langwirksamen Arzneimitteln auf dem Markt wird die Nachfrage nach beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung auch von Seiten der Behörden steigen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von diskriminierenden und beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unterschiedlicher Partikelgrößen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Methode sollte es demnach möglich sein, trotz Beschleunigung der Methode zwischen den verschiedenen Partikelgrößen, welche in einem Bereich von 8-41 μm lagen, zu unterscheiden. Zunächst wurde die Sättigungslöslichkeit von LNGB in verschiedenen Medien, welche später in den Freisetzungsuntersuchungen eingesetzt werden sollten, bestimmt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von LNGB in den Freisetzungsmedien wurde diesen eine variierende Menge an SDS zugesetzt, um die Löslichkeit zu steigern. Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung wurden Methoden sowohl für die Blattrührer-Apparatur als auch für die Durchflusszelle entwickelt.
In einer ersten Versuchsreihe in der Blattrührer-Apparatur wurde der Einfluss der zugesetzten Tensid-Menge auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Um in den Versuchen mindestens dreifache Sink-Bedingungen einzuhalten, wurden alle nachfolgenden Versuche mit einem Zusatz von 0,75 % SDS zu dem entsprechenden Freisetzungsmedium durchgeführt. In einem systematischen Screening wurde der Einfluss der Umdrehungsgeschwindigkeit, des Freisetzungsmediums und der Temperatur in der Blattrührer-Apparatur untersucht. In allen durchgeführten Versuchen konnten signifikante Unterschiede in den MDTs zwischen der Gruppe der kleineren Partikel (Suspensionen mit sehr kleinen und kleinen LNGB-Partikeln) und der Gruppe der größeren Partikel (Suspensionen mit mittleren und großen LNGB-Partikeln) beobachtet werden. Den größten Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen zeigte die Erhöhung der Temperatur von 37,0 °C auf 50,0 °C.
Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung in der Durchflusszelle wurde sowohl eine Methode unter Verwendung eines offenen Systems als auch eine Methode für die Verwendung der Durchflusszelle im geschlossenen System entwickelt. Für beide Modi wurde der Einfluss der Flussrate (10 mL/min vs. 20 mL/min) untersucht. Die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen im offenen System brachte einige Nachteile mit sich. So wurden innerhalb der ersten Minuten trotz entsprechender Filterpackung die LNGB-Partikel aus der Zelle herausgespült. Darüber hinaus wurde durch die relativ hohe Flussrate eine große Menge an Freisetzungsmedium benötigt. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der Temperaturerhöhung auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unter Verwendung der Durchflusszellen-Methoden nur im geschlossenen System untersucht. Ähnlich wie bei den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung in der Blattrührer-Apparatur zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung aus den Suspensionen bei 37,0 °C und 50,0 °C. Eine Unterscheidung zwischen der Gruppe der kleineren LNGB-Partikel und den größeren LNGB-Partikeln war bei den verschiedenen Flussraten und auch unter den Testbedingungen der erhöhten Temperaturen möglich.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuen bioprädiktiven Freisetzungsmodells für Vaginalringe. Dieses neue Modell sollte in der Lage sein, den sogenannten burst release, welcher für Vaginalringe des Reservoir-Typs beobachtet werden kann, in vitro zu erfassen. Als burst release wird eine im Vergleich mit der täglichen Freisetzungsrate initial höhere Freisetzungsrate bezeichnet, welche zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Die untersuchten Formulierungen, der NuvaRing® und der Cyclelle®-Ring, sind Vertreter der Vaginalringe vom Reservoir-Typ. Vaginalringe vom Reservoir-Typ bestehen aus einem Kernpolymer, welches die beiden Steroidhormone EE und ENG enthält. Das Kernpolymer wird wiederum von einer wirkstofffreien Membran umgeben, welche die Wirkstofffreisetzung der Steroidhormone aus dem Kernpolymer maßgeblich steuert. Während der Lagerung solcher Vaginalringe vom Reservoir-Typ diffundieren EE und ENG in die Membran, bis in dieser die beiden Wirkstoffe in einem gesättigten Zustand vorliegen. Aufgrund der Sättigung der Membran kommt es nach Einsetzen des Vaginalrings zum Auftreten des burst release. In bisherigen Versuchen zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen mit einfachen Shake-flask-Methoden wurde der burst release nicht erfasst, da häufig nur alle
24 h eine Probennahme und anschließend ein kompletter Tausch des Freisetzungsmediums erfolgte.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell sollte biorelevanter gestaltet werden als die bisherigen Shake-flask-Methoden. Daher wurden in dem neuen Modell zwei weitere Kompartimente integriert, welche die Absorption der Steroidhormone ähnlich der In-vivo-Situation, berücksichtigen sollten. Da die Daten, welche mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erhoben wurden, später mit In-vivo-Plasmaspiegeln aus klinischen Studien mit dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring korreliert werden sollten, wurden die Probennahmezeitpunkte für die In-vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus den klinischen Studien adaptiert. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von EE und ENG und der geringen Volumina, welche im neuen Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, wurde den Freisetzungsmedien 0,5 % SDS zugesetzt, um zehnfache Sink-Bedingungen zu gewährleisten. Die Wirkstofffreisetzung aus dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring wurde sowohl mit der modifizierten Shake-flask-Methode als auch mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell bestimmt. Der burst release wurde mit dem neuen Freisetzungsmodell besser als mit der modifizierten Shake-flask-Methode erfasst. Auch die deklarierten täglichen Freisetzungsraten von 120 μg ENG und 15 μg EE aus den untersuchten Vaginalringformulierungen wurden in dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erreicht. Nach dem sogenannten burst release setzten beide untersuchte Formulierungen EE und ENG nach einer Kinetik 0. Ordnung frei. Die In-vitro-Freisetzungsdaten, welche einer Kinetik 0. Ordnung folgten, wurden mit den dekonvulierten In-vivo-Plasmaspiegeln korreliert. Für beide In-vitro-Methoden konnte für EE ein linearer Zusammenhang gefunden werden.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prüfung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen dar. Mit Hilfe des neuen Modells konnte der burst release aus Vaginalringen vom Reservoir-Typ besser erfasst werden als mit den bisher verwendeten Shake-flask-Methoden. Trotz der geringen Volumina, welche im neu entwickelten Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, konnten durch den Zusatz von 0,5 % SDS zehnfache Sink-Bedingungen in beiden Kompartimenten erreicht und während der Versuche eingehalten werden. Erste Korrelationen mit den aus In-vivo-Plasmaspiegeln berechneten absorbierten EE-Fraktionen und den kumulativ freigesetzten EE-Mengen zeigten einen linearen Zusammenhang zwischen der in vivo absorbierten Fraktion und der in vitro kumulativ freigesetzten Wirkstoffmenge.
Das Porphyrin-Derivat 5,10,15,20-tetra(m-Hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC, Temoporfin), in Europa zugelassen unter dem Handelsnamen Foscan®, stellt einen der vielversprechendsten Photosensibilisatoren (PS) in der Photodynamischen Therapie (PDT) dar. Während einige Publikationen über die Aktivität von Temoporfin in einzelnen Krebszelllinien in der Fachliteratur erschienen sind, fehlen systematische Studien über die Temoporfin-basierte PDT, die mithilfe eines Sets aus mehreren Krebszelllinien durchgeführt wurden. In der vorliegenden Dissertation wurden fünf humane, adhärente Krebszelllinien aus dem Kopf-Hals-Bereich und weiteren PDT-relevanten Geweben eingesetzt, um die Auslösung von oxidativem Stress und die zugrundeliegenden Zelltodmechanismen der Temoporfin-basierten PDT in vitro zu untersuchen. Dafür wurde zunächst die Viabilität der Zellen nach Temoporfin-Behandlung (0,001–5,0 µmol/L) und Bestrahlung mit einer LED-basierter Apparatur (0,2–5,5 J/cm2) im MTT-Test ermittelt und Konzentrations-Wirkungskurven zur Bestimmung von IC50- und IC90-Werten aufgenommen. Zur Untersuchung und zum Vergleich der Zelltodmechanismen in den Zelllinien wurden diese anschließend mit äquitoxischen Konzentrationen des Temoporfins behandelt und mit vorrangig mit einer Lichtdosis von 1,8 J/cm2 (vereinzelt auch 3,5 oder 7,0 J/cm2) bestrahlt. Die Analytik der Zellen erfolgte direkt, 6, 24, oder 48 h nach der Bestrahlung. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation bestätigen die Auslösung von oxidativem Stress nach der Temoporfin-PDT durch die Detektion eines Totalverlustes des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) sowie einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Eine Lipidperoxidation (LPO) sowie die Beteiligung einer Nekrose am Zelltod spielen hingegen in den meisten Zelllinien eine untergeordnete Rolle. Vor allem die ausbleibende Nekrose nach einer hochdosierten PDT mit Temoporfin steht dabei in Kontrast zu den Resultaten vieler publizierter Studien. Als vorherrschender Zelltodmechanismus wurde nach Temoporfin-vermittelter PDT stattdessen über eine Phosphatidylserin-Externalisierung, eine Caspase 3-Aktivierung und eine PARP-Spaltung eine Auslösung von Apoptose identifiziert. Zudem kann parallel zur Apoptose eine Autophagie ausgelöst werden bzw. kann diese zunächst sogar dominieren, bevor sie zu einer Autophagie-assoziierten Apoptose führt. Als Anzeichen der späten Phase einer Apoptose ist zudem früher oder später eine DNA-Fragmentierung nachweisbar, und der Zelltod wird in einigen Fällen von einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase begleitet.
Neben der Auswertung der Zelltodmechanismen wurde ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation auf den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen, identisch behandelten Zelllinien gelegt. Obwohl die Zellen unter äquitoxischen Bedingungen behandelt wurden und die PDT über eine vergleichsweise unspezifische Bildung von ROS wirkt, wurden sehr heterogene Resultate in den unterschiedlichen Zelllinien erhalten. Die vorliegende Untersuchung zeigt deshalb außerdem, dass generelle Schlussfolgerungen nach einer PDT eine Analytik in mehreren unterschiedlichen Zelllinien benötigt, um verlässlich zu sein. Dieser Umstand ist in der Vergangenheit in In-vitro-Studien zur PDT jedoch viel zu häufig ignoriert worden.
Die Pt(II)-Komplexe Carboplatin (CBDCA), Cisplatin (CDDP) und Oxaliplatin (1-OHP) werden als Zytostatika in einer Vielzahl chemotherapeutischer Verfahren eingesetzt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Pt(II)-Komplexe CBDCA, CDDP, oder 1-OHP in fünf humanen, adhärenten Krebszelllinien mit einer Temoporfin-basierten PDT kombiniert. Die Zellviabilität wurde im MTT-Test bestimmt und synergistische Effekte der Kombination mithilfe der Berechnung von Combination Indices (CI) ermittelt. Synergismus wurde dabei nach einigen Kombinationen, z.B. mit 1-OHP in drei der fünf getesteten Zelllinien, beobachtet, aber auch antagonistische Effekte wurden für einige Kombinationen in bestimmten Zelllinien detektiert. Im Fall einer Synergie wurden erhöhte ROS-Level nachgewiesen, jedoch wurde die Auslösung von Apoptose im Vergleich zu einer Behandlung mit den Pt(II)-Komplexen bzw. der PDT allein dadurch nicht notwendigerweise verstärkt. Eine Analyse der Zellzyklusverteilung ergab, dass nach kombinierter Behandlung sub-G1-Populationen mit fragmentierter DNA, die für eine späte Phase der Apoptose charakteristisch sind, gebildet werden, und zudem S-Phase und G2/M-Arreste vorliegen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Behandlung mit einer Temoporfin-basierten PDT das Potential besitzt, einige Typen von Tumorzellen gegenüber Pt(II)-Komplexen, vor allem 1-OHP, zu sensibilisieren und so besser für die Tumortherapie zugänglich zu machen. Das Erreichen synergistischer Effekte hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab und es können sogar antagonistische Effekte auftreten.
Die Glutathionperoxidase 1 (GPX1) kann bei einer Überexpression in Tumorzellen zu einer Inhibition von Apoptose führen, was zum Überleben der Tumorzellen beiträgt. Zudem kann eine erhöhte GPX-Aktivität zu einer Resistenzentwicklung gegenüber oxidativen Schäden beitragen, was den Tumor z.B. vor Chemotherapeutika schützen kann. Potential in der Tumortherapie besitzen deshalb GPX-Inhibitoren, die einer Überexpression der GPX1 durch Verringerung der Gesamtaktivität entgegen¬wirken. In Kombination mit Chemotherapeutika führten GPX-Inhibitoren so bereits zu einer Re-Sensibilisierung Zytostatika-resistenter Zelllinien. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Kombination der GPX-Inhibitoren 9-Chlor-6-ethyl-6H-[1,2,3,4,5]pentathiepino[6,7-b]indol (CEPI), ein kürzlich synthetisiertes trizyklisches Pentathiepin, oder Mercaptobernsteinsäure (MBS), der klassische Inhibitor der GPX in vielen veröffentlichten Studien, mit einer Temoporfin-PDT eingesetzt, um durch die Blockierung eines effektiven Abbauweges für H2O2 eine vermehrte Akkumulation von ROS zu erzeugen und so den phototoxischen Effekt des Temoporfins zu verstärken. Synergismus wurde dabei nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren, jedoch nicht in allen fünf Zelllinien, beobachtet. Auf der anderen Seite wurden mit beiden Inhibitoren auch antagonistische Effekte in bestimmten Zelllinien detektiert. Die ROS-Level konnten nach kombinierter Behandlung mit CEPI, nicht jedoch mit MBS, in einigen Zelllinien gesteigert werden, was darauf hindeutet, dass die Inhibition der GPX durch CEPI tatsächlich zu einer zusätzlichen Akkumulation von ROS führt. Beide Inhibitoren erzeugen allein keine Steigerung der ROS-Spiegel. Überraschenderweise wurde eine vermehrte Apoptoseauslösung anschließend jedoch nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien erreicht, was darauf schließen lässt, dass weitere Faktoren die Induktion von Apoptose fördern, z.B. eine Autophagie-assoziierter Zelltodmechanismus oder eine Ferroptose, die durch LPO nach Verlust der GPX4-Aktivität eingeleitet wird. Die erhöhte Apoptoseauslösung wurde zudem in der Zellzyklusanalyse bestätigt, in der nach kombinierter Behandlung mit beiden GPX1-Inhibitoren erhöhte Anteile apoptotischer sub-G1-Frak¬tionen mit fragmentierter DNA nachweisbar waren. Zudem wurde die DNA-Fragmentierung nach Kombination mit MBS von einem gesteigerten G2/M-Arrest begleitet.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Kombination von Inhibitoren der GPX mit einer Temoporfin-basierten PDT zu synergistischen Effekten führen kann, wodurch eine Verstärkung der Phototoxizität möglich ist. Da die Inhibitoren in nicht-toxischen Konzentrationen eingesetzt werden, werden zudem keine zusätzlichen Nebenwirkungen erwartet. Der Erfolg des kombinierten Ansatzes hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab, aber auch antagonistische Effekte können auftreten.
Microalgae are aquatic, unicellular, eukaryotic organisms, which perform photosynthesis. They have gained interest within the last decades not only for biofuel production due to their high amount of lipids, but also for pharmaceutical and for nutraceutical purposes. Interesting compounds are proteins, carbohydrates, or pigments, such as carotenoids. However, microalgae possess strong and rigid cell walls, which hinder a sufficient and yet, gentle extraction of those valuable compounds. Although standard extraction techniques are available, several shortcomings occur, e.g. high energy demand, use of environmentally harmful solvents or alteration of compounds due to heat or chemicals. Therefore, an alternative method is needed, which is able to address these disadvantages. Physical plasmas were thus studied to answer the question whether they are able to disintegrate the cell walls of microalgae effectively and yet, without degradation of the extractives.
First step of the thesis was to find a suitable plasma source that has an effect on the cell walls because plasma effects, such as electric fields, shockwaves, UV light emission, and the generation of reactive species can be tailored with the respective setup. It was found that spark discharges are most effective for the extraction of Chlorella vulgaris, which was chosen as model organism. All extraction yields were compared to reference methods, whereat microwave radiation was found to be the most effective reference method and were hence, applied for comparative studies.
For the next step, proteins were selected as targets to answer the question, which differences can be determined between plasms-treated and microwave-radiated proteins are observable although the extraction yields were equal. Furthermore, plasma effects, especially the effects of reactive species on the extracted proteins had to be studied. Findings indicate that heat sensitive proteins, such as photosystem-related proteins, or histones are better extractable with spark discharges than with microwave exposure and the effect of reactive species is only minor.
The last step was to determine, which plasma effect is responsible for the observed cell wall disintegration. Therefore, the tensile strength of Chlorella vulgaris was determined and compared to the shockwave pressure, which is generated from the spark channel. It was proven that the shockwave pressure exceeds by far the tensile strength of the microalgae an can be thus held responsible for mechanism for cell wall rupture.
In this thesis, it was found that spark discharges are a promising alternative for the extraction of valuable compounds from microalgae. The discharges are not only effective, but also gentle enough for sensitive compounds, such as proteins or pigments.
Bis heute ist die Haupterblindungsursache in den westlichen Industrienationen, die altersbedingte Makuladegeneration, nicht heilbar und aufgrund der zunehmenden Lebenserwartung der Bevölkerung wird die Anzahl an Neuerkrankungen zukünftig weiter steigen. Die intravitreale operative Medikamentengabe gilt als aktuelle Standardtherapie um das Fortschreiten eines Visusverlusts zu verzögern und kann in manchen Fällen eine deutliche Sehverbesserung bewirken. Überwiegend werden antiinflammatorische und antineovaskuläre Wirkstoffe in Form von intravitrealen Injektionen verabreicht, deren Nachteil jedoch ein verhältnismäßig kurzer Therapieeffekt in Hinblick auf die chronische Erkrankung des hinteren Augenabschnitts ist. Für längerfristig erfolgreiche Therapien sind zahlreiche Innovationen im Bereich der periokularen und intravitrealen Arzneistofffreigabesysteme in unterschiedlichen Phasen der Forschung und Entwicklung, deren Wirksamkeit und Sicherheit jedoch erst belegt werden muss. Für möglichst prädiktive Ergebnisse über das Verhalten von Arzneiformen in vivo sollten ausgewählte physiologische Parameter in Modellen und Testmethoden simuliert und nach aktuellem Wissensstand berücksichtigt werden können. Da die reale Situation des Glaskörpers älterer Patienten in Tiermodellen nur unzureichend widergespiegelt wird und die Nutzung von Simulationsmodellen zur Abschätzung des pharmakokinetischen Profils von Arzneistoffen oder Darreichungsformen aufgrund der lückenhaften Datenlage über den Glaskörper als Applikationsort oft limitiert ist, sollen zuverlässige In vitro-Testsysteme dazu beitragen, die unvollständige Datenlage mit In vitro Ergebnissen zu ergänzen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, humane Glaskörper aus der postmortalen Spende zu gewinnen und zu charakterisieren. Somit konnten die lückenhaften Literaturdaten zum humanen Glaskörper durch ausgewählte physikochemische Eigenschaften (pH Wert, Brechungsindex, Osmolalität, Gesamtproteingehalt, Wassergehalt) ergänzt werden. Zudem wurden Untersuchungen zur Glaskörperverflüssigung durchgeführt und erstmals eine altersbedingt zunehmende Inhomogenität des humanen Glaskörpers im Gegensatz zum Jungtiermodell (Schwein) gezeigt.
Weiterhin wurden die von Loch et al. beschriebenen Prototypen des Glaskörper- (GK-) Modells und des Eye Movement Systems (EyeMoS) in weiterer Anlehnung an die Situation in vivo modifiziert und ausgewählte Darreichungsformen hinsichtlich ihres Freisetzungs- und Verteilungsverhaltens im simulierten Glaskörper charakterisiert. In Ergänzung zu den Modellen von Loch et. al wurde neben einem standardisierten Injektionsverfahren zudem die Körpertemperatur, vielfältige Augenbewegungsmuster und der Zustand nach einer Vitrektomie in den modifizierten In vitro Modellen berücksichtigt. Für Langzeituntersuchungen bis über Monate bietet die neuartige und kostengünstige Testapparatur die Möglichkeit, 6 GK-Modelle gleichzeitig bei simulierten Augenbewegungen zu integrieren. Am Beispiel von intravitrealen Modellimplantaten mit dem klinisch häufig eingesetzten Wirkstoff Dexamethason wurde der Einfluss ausgewählter In vitro-Testmethoden und -Parameter im Hinblick auf die Wirkstofffreisetzung aus Implantaten untersucht. Je nach verwendeter Testapparatur, Testmedium und einer Probenahme- oder Transfermethode wurden erhebliche Unterschiede in den Freisetzungsprofilen von Dexamethason oder Fluorescein-Natrium aus PCL- oder PLGA-Modellimplantaten beobachtet, wodurch die Notwendigkeit zum Verständnis der zugrundeliegenden und freisetzungsbestimmenden In vivo-Parameter sowie deren Transfer in zuverlässige In vitro-Testsysteme hervorgehoben wurde.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die simulierte Glaskörperverflüssigung, wie sie für ältere Patienten beschrieben ist, im Vergleich zum homogen aufgebauten Glaskörper eine schnellere Verteilung der Injektionslösungen im GK-Modell zur Folge hat. Suspensionszubereitungen zeigten anstatt einer homogenen Verteilung im GK-Modell eine ausgeprägte Neigung zur Sedimentation, was am Beispiel des klinisch relevanten Triamcinolonacetonids verdeutlicht wurde. Der simulierte Zustand nach einer Vitrektomie mit anschließender Injektion der wirkstoffhaltigen Suspension resultierte ebenfalls in einer Sedimentation der Triamcinolonacetonid-Partikel, deren potentiell netzhautschädigende Effekte in klinischen Langzeitstudien untersucht werden sollte.
Zusammenfassend verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit kritische In vitro- und In vivo-Parameter, die die Wirkstofffreisetzung und -Verteilung aus intravitrealen Darreichungsformen beeinflussen und die von großer Bedeutung für die Abschätzung des pharmakokinetischen Profils einer Arzneiform sein können.
Die Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin wurden über viele Jahre hinweg erfolgreich als Analgetikum bzw. Antiepileptikum eingesetzt. Vor allem aufgrund ihres einzigartigen Wirkmechanismus, welcher in der Öffnung spannungsabhängiger Kv7-Kaliumkanäle liegt, konnte eine weitgehend nebenwirkungsfreie Therapie ermöglicht werden. Innerhalb der letzten drei Jahre wurden allerdings sowohl Flupirtin als auch Retigabin aufgrund von seltenen, aber schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen (UAWs) vom Markt genommen. Man geht davon aus, dass die Lebertoxizität von Flupirtin ebenso über eine oxidative Verstoffwechslung zu instabilen Metaboliten vermittelt wird, wie die reversiblen Blauverfärbungen von bestimmten Geweben unter Retigabin-Therapie. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden verschiedene Modifikationen am Triamino-Aromaten-Motiv der Arzneistoffe vorgenommen und deren Einfluss auf verschiedene Eigenschaften untersucht. So wurde die Oxidierbarkeit von 55 Verbindungen cyclovoltammetrisch bestimmt und der Aktivität und Toxizität gegenübergestellt. Die beste Substanz 3-(3,5-Difluorphenyl)-N-(6-[isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propanamid konnte dabei eine 918-fach höhere Aktivität als Flupirtin, bei gleichzeitig gesteigerter oxidativer Stabilität aufweisen. Zusätzlich wurden durch die schrittweise Derivatisierung von Flupirtin Struktur-Aktivitäts-Beziehungen für Kv7.2/3-Heterotetramere erhalten.