Refine
Year of publication
- 2021 (4) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (4)
Language
- German (4) (remove)
Has Fulltext
- yes (4)
Is part of the Bibliography
- no (4)
Keywords
- Coxiella burnetii (1)
- Genexpression (1)
- Immunologie (1)
- Inositol (1)
- Pestivirus (1)
- Phospholipids (1)
- Q-Fieber (1)
- Replikon (1)
- Yeast (1)
- Zellautonome Immunität (1)
Institute
- Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie (4) (remove)
Pestivirus-Replikons als Werkzeug für heterologe Genexpression und molekulare Charakterisierung
(2021)
Replikons sind autonom replizierende RNA-Moleküle die nicht in der Lage sind, infektiöse Viren zu bilden. Sie sind wichtige Hilfsmittel zur molekularen Charakterisierung von Viren. Außerdem werden sie erfolgreich als Expressionssystem für Proteine und zur Entwicklung von Impfvektoren eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Replikon-basiertes Testsystem für den Nachweis spezifischer Antikörper gegen das atypische porzine Pestivirus (APPV) in Schweineseren etabliert. Auf Basis eines Klons des Virus der bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV) wurden die ursprünglichen BVDV Glykoproteine E1 und E2 gegen die Glykoproteine des APPV ausgetauscht. Die Expression mittels Replikon gewährleistet die natürliche Konformation der Proteine und damit die Bindung der entsprechenden Antikörper. Dieses System ermöglichte die serologische Untersuchung von 1115 Schweineseren ohne vorherige Isolation oder Zellkulturadaptation des Virus. Mit diesem neu entwickelten System konnte eine Seroprävalenzstudie gestartet und eine hohe Prävalenz von APPV in der untersuchten deutschen Schweinepopulation gezeigt werden.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden Replikons zur Charakterisierung des atypischen Pestivirus Bungowannah Pestivirus (BuPV) eingesetzt. Während die Replikons mit Deletionen der Gene für die einzelnen Strukturproteine C, E1 und E2 oder die gesamte Strukturproteinregion keine Besonderheiten im Vergleich zu bereits untersuchten Pestivirus-Replikons aufwiesen und keine infektiösen Virionen mehr produzieren konnten, zeigten BuPV-Replikons mit ERNS-Deletion die Fähigkeit, zwei weitere Replikationszyklen zu durchlaufen und Zellen zu infizieren, allerdings mit einem sehr deutlichen Wachstumsdefizit. Dieser Defekt scheint in der Virusassemblierung und/oder der Freisetzung aus der Zelle zu liegen. Es konnte somit erstmals gezeigt werden, dass ERNS nicht essentiell für die Bildung infektiöser Bungowannah-Viren ist, jedoch sehr wichtig für eine effiziente Virusvermehrung. Diese Eigenschaft der ERNS deletieren BuPV macht diese besonders interessant als Vektoren für die Entwicklung neuer Replikon-basierter Expressionssysteme und einer Vakzinplattform. ERNS-Deletionsmutanten wurden daher auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine effiziente Expression verschiedener immunogener Proteine zu gewährleisten. Die Konstrukte waren dabei in der Lage, die ausgewählten Proteine effizient zu exprimieren und konnten zudem effizient zu Virus-Replikon-Partikel (VRP) verpackt und in einer trans-komplementierenden Zelllinie vermehrt werden.
Auch der für das parentale Virus beschrieben Zelltropismus konnte für die generierten BuPV-VRP gezeigt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Eigenschaften sind es der nicht-zytopathogene Charakter und die in den meisten Regionen fehlende Immunität gegen BuPV, die das hohe Potential dieses Systems als universellen Vakzinvektor herausstellen.
Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein erstes DNA-basiertes System zur Herstellung rekombinanter BuPVs etabliert. Dieses System ermöglicht sowohl die Virusproduktion ausgehend von einem T7-RNA-Polymerase Promotor, als auch von einem Polymerase-II-Promotor. Die infektiösen Viren zeigten gleiche Wachstumseigenschaften wie Viren, welche mit dem konventionellen RNA-System generiert wurden. Auf Basis des neuen DNA-Systems konnte auch ein Replikon mit Deletion im ERNS-Gen etabliert werden. Dieser Klon zeigte nach der Transfektion eine sehr geringe Replikationsrate, konnte jedoch zur weiteren Konstruktion eines „single round infectious particle“ (SRIP) eingesetzt werden. Diese SRIP sind durch die Koexpression des deletierten ERNS in der Lage, sich selbst zu verpacken und bilden damit ein ideales System zum Transport selbst-replizierender RNA. Durch seine selbstlimitierenden Eigenschaften könnte es zur Entwicklung und Etablierung einer effizienten und sicheren Vakzineplattform eingesetzt werden. Allerdings ist dafür eine weiterreichende Optimierung notwendig.
Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass sich pestivirale Replikons sowohl als effizientes und schnelles Testsystem für die Untersuchung der Verbreitung neu auftretender Pestiviren, als auch zur Entwicklung effizienter RNA- und DNA-basierter Transport- und Verpackungssysteme viraler Proteine, eignet.
Bisherige Analysen von RABV-Pathogenitätsdeterminanten wurden mit laboradaptierten, teils attenuierten Viren durchgeführt. Es ist unklar, ob bisher untersuchte Faktoren auch für hoch virulente RABV-Feldviren relevant sind. Der hier durchgeführte systematische Vergleich von Feldviren und Laborstämmen im infizierten Tier konnte Unterschiede hinsichtlich der Fähigkeit immunkompetente Neuroglia des ZNS zu infizieren als mögliche Pathogenitätsdeterminante aufzeigen. Darüber hinaus wurden erstmals SZ-Neuroglia peripherer Nerven als Zielzellen für die RABV-Infektion identifiziert.
Für die Analyse von RABV-infizierten Geweben wurde ein modernes 3D Imaging-Verfahren angewandt. Gehirne aus experimentell infizierten Mäusen und Frettchen wurden wie in Veröffentlichung 1 beschrieben immunfluoreszenz-gefärbt, optisch geklärt und hochauflösend mit einem konfokalen Laserscan Mikroskop untersucht. RABV N und P Protein konnten dreidimensional in räumlicher Umgebung zu zellulären Strukturen des Wirtes visualisiert werden. Diese Untersuchung bewies die besondere Eignung des Verfahrens zur Identifizierung vereinzelter Zielstrukturen und wurde für nachfolgende systematische Analysen im ZNS und PNS verwendet.
Der RABV-Zelltropismus wurde als vermutlich wichtige Pathogenitätsdeterminante in Veröffentlichung 2 untersucht. RABV Feldviren vom Hund (rRABV Dog), Fuchs (rRABV Fox) und Waschbär (rRABV Rac) konnten im Vergleich zu den laboradaptierten Viren (rCVS-11, SAD L16 und ERA) nicht-neuronale Zellen im ZNS wie Astroglia produktiv infizieren. Der Anteil infizierter Astrozyten ist mit 7-17 % nach i.m. Inokulation vergleichbar mit dem der Neuronen (7-19 %). Interessanterweise wurde eine Inokulationsroutenabhängige Infektion von Astrozyten mit dem moderat virulenten Laborstamm rCVS-11 beobachtet. Diese systematische und quantitative Analyse des RABV-Astrozyten- und Neuronentropismus zeigt, dass mit abnehmender Virulenz die Fähigkeit der Viren produktiv in Astroglia im ZNS zu replizieren abnimmt. Die Fähigkeit eine produktive Infektion in Astrozyten auszubilden, scheint demnach ein grundlegender Unterschied zwischen Feldviren und weniger virulenten Laborstämmen zu sein.
Weiterführend wurde in Veröffentlichung 3 die Virusausbreitung vom ZNS in periphere Nerven untersucht. Hinterbeine, Wirbelsäule inklusive Rückenmark, Gehirn und weitere Kopfbereiche experimentell infizierter Mäuse wurden mittels Lichtblatt- und konfokaler Laserscanmikroskopie analysiert. Zum Ersten Mal konnte eine RABV-Infektion peripherer Neuroglia dargestellt werden. Eine produktive Infektion immunkompetenter SZ im PNS ist also möglicherweise, genauso wie die Infektion von Astrozyten im ZNS, entscheidend für die RABV-Neuropathogenese. Die Detektion von RABV-Antigen im Hinterbein nach i.c. Inokulation beweist eine anterograde axonale Virusausbreitung vom ZNS in periphere Nerven. Interessanterweise konnte das Virus auch in Bereichen des Nasopharynx und des Zungenepithels nachgewiesen werden, worüber möglicherweise zusätzlich zur Speicheldrüse Virus in den Nasenrachenraum ausgeschieden wird. Zusammenfassend konnten mit dieser Arbeit neue Einblicke hinsichtlich des Zelltropismus und der Ausbreitung von RABV in vivo im Modellorganismus Maus gewonnen werden. Die Fähigkeit der untersuchten hoch virulenten Feldviren nicht-neuronale, immunkompetente Neuroglia des ZNS und PNS zu infizieren unterscheidet diese von den weniger virulenten bzw. apathogenen Virusstämmen und könnte ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer Tollwut-Enzephalitis darstellen.
Phospholipide wie Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin sind essenzielle Bestandteile aller biologischen Membranen und für deren Integrität und Funktion unerlässlich. Sind Inositol und Cholin (IC) im Medium vorhanden, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae in der Lage, diese aufzunehmen und zu verarbeiten. Unter Mangelbedingungen können diese Stoffe von der Zelle selbst synthetisiert werden. Daher ist es sinnvoll, die Phospholipid¬biosynthese-Gene differenziell zu exprimieren, was auf der Ebene der Transkriptions¬initiation geschieht. Bei IC-Mangel werden die Gene (z. B. das Inositol-3-Phosphat Synthase Gen INO1) durch Bindung des heterodimeren Aktivatorkomplexes Ino2/Ino4 an das Promotorelement ICRE („inositol/ choline responsive element“) aktiviert, um die Biosynthese zu gewährleisten. Sowohl Ino2 als auch Ino4 sind für die ICRE-Bindung nötig, während die transkriptionale Aktivierung nur durch Ino2 mit Hilfe zweier Transkriptionsaktivierungsdomänen TAD1 und TAD2 vermittelt wird. Ist dagegen ausreichend IC vorhanden, werden die Gene reprimiert, indem der Repressor Opi1 an den Aktivator Ino2 bindet, sodass es zu einer Konformationsänderung kommt und eine Dimerisierung mit Ino4 nicht mehr möglich ist.
Um eine erfolgreiche Transkriptionsinitiation zu gewährleisten, bilden neben der RNA-Polymerase II eine Reihe genereller Transkriptionsfaktoren (A, B, D, E, F und H) sowie der Mediatorkomplex im Promotorbereich der Zielgene den sog. Präinitiationskomplex (PIC). Die von diesen basalen Faktoren gewährleistete geringe Grundexpression kann von Aktivatorproteinen, die an positiv-regulatorische Elemente („upstream activation site“, UAS) binden, deutlich verstärkt werden. Hierzu nutzen Aktivatorproteine verschiedene Mechanismen, zu denen die Auflockerung der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationskomplexe wie SAGA oder Chromatinremodellierungskomplexe wie SWI/SNF, die bessere Bindung der Transkriptionsfaktoren am Basalpromotorbereich oder die Beschleunigung des Übergangs vom geschlossenen zum offenen PIC gehören.
Im Verlauf dieser Arbeit konnten zahlreiche Interaktionen zwischen dem Aktivator Ino2 und Faktoren der Transkriptionsmaschinerie nachgewiesen werden, die vermutlich die Häufigkeit der Trans¬kriptions-initiation beeinflussen. Einige der Untereinheiten des Transkriptionsfaktors TFIID interagie¬ren mit Ino2. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung der Interaktion der Ino2-TAD1 mit Taf1 und Taf12. Der Austausch der Aminosäuren Asparaginsäure-20 und Phenyl¬alanin-21 in Ino2 führte zu einem Interaktionsausfall mit beiden Tafs. In Taf1 konnten zwei basisch-hydro¬phobe Aminosäure-Bereiche (K206 Y207 und L208 L209 K210) innerhalb der minimalen Aktivator¬binde¬domäne 2 (ABD2) identifiziert werden, die kritisch für den Kontakt zum Aktivator sind. Es konnte ferner gezeigt werden, dass basische und hydrophobe Aminosäuren in Kombination für die Bindung an den Aktivator verantwortlich sind und dass der Austausch gegen Alanin (KY-AA) zu einem Abfall der Expression des INO1-Gens auf 44% führt. Darüber hinaus konnte der Bromo¬domänen¬faktor Bdf1 als Interaktionspartner von Ino2 identifiziert werden. Bdf1 vervollständigt Hefe-Taf1, während Säuger-Taf1 selbst Bromodomänen zur Erkennung von Histonacetylierungen beinhaltet. Innerhalb der Taf12-Minimaldomäne sind die Aminosäuren K150 L151 R175 und L176 wesentlich für die Bindung an Ino2. Eine Teildeletion von Taf12, die unter anderem den Verlust dieser Aminosäuren zur Folge hat, führt zu einer auf 76% reduzierten INO1-Expression.
Ein weiterer Transkriptions¬faktor, der von Ino2 kontaktiert wird, ist TFIIA mit seinen Untereinheiten Toa1 und Toa2. Die Proteine kontaktieren beide TADs des Aktivators, allerdings konnten innerhalb der minimalen Interaktionsdomänen der Toa-Proteine keine für diese Interaktion verantwortliche Aminosäuren identifiziert werden. Veränderungen der Toa1-Sequenz hatten keinen phänotypischen Einfluss auf die Phospholipidbiosynthese, allerdings führten einige Veränderungen (RKRK-Motiv im AS-Bereich 253-259) zu letalen Folgen für das Wachstum der Zellen, weil die Bildung des TFIIA-TBP-TATA-Komplexes beeinträchtigt ist. Wahrscheinlich hat die Interaktion zwischen Ino2 und TFIIA eine verstärkende Wirkung auf die Transkriptionsinitiation der Phospholipidbiosynthese-Gene, indem die Interaktion zwischen TFIIA und TFIID stabilisiert wird und TFIIA die interaktive Oberfläche am Promotor für Interaktionen mit anderen Proteinen vergrößert.
Die Verschiebung der Nucleosomen in Promotorbereichen durch Chromatinremodellierungs¬kompexe wie SWI/SNF ist ein weiterer Mechanismus der Transkriptionsaktivierung. In früheren Arbeiten wurde bereits die Interaktion zwischen Ino2, Aro80 bzw. Gal4 und der SWI/SNF ATPase-Untereinheit Swi2 beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit konnte eine minimale Interaktionsdomäne im AS-Bereich 238-307 kartiert werden. Essenzielle Aminosäuren für die Bindung an Ino2 und andere Aktivatoren konnten nicht identifiziert werden.
Sug1 und Sug2 sind ATPasen der regulatorischen 19S-Untereinheit des 26S Proteasoms. Neben der Degradation fehlgefalteter polyubiquitinierter Proteine haben sie auch eine nicht-proteolytische Bedeutung für die Transkriptionsinitiation. Bekannt ist, dass proteasomale ATPasen an aktiven Promotoren zu finden sind und mit Aktivator¬proteinen (z. B. Gal4) interagieren können. Die vorlie¬gende Arbeit zeigt, dass auch Ino2 von Sug1 und Sug2 kontaktiert wird. Möglicherweise dienen sie am INO1-Promotor als Stabilisatoren und Vermittler zwischen Ino2 und der Transkriptionsmaschi¬nerie und erleichtern den Übergang des Präinitiationskomplexes in den Elongationskomplex.
Unter reprimierenden Bedingungen bindet Opi1 an Ino2 und rekrutiert die Corepressorkomplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die ihrerseits Histondeacetylasen in Promotornähe bringen und die Transkrip¬tion durch lokale Chromatinverfestigung reprimieren. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass die Corepressoren auch mit Ino2 und weiteren Aktivatoren (Hac1 und Pho4) interagieren und dass sie in Abhängigkeit von Ino2, nicht aber von Opi1, am INO1-Promotor vorliegen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Ino2 und Sin3 bzw. Cyc8 charakterisiert. Sin3 und Cyc8 kontaktieren einen Bereich des Aktivators, der die TAD2 und die RID (Repressorinteraktionsdomäne) enthält. Es war bekannt, dass die Aminosäuren Phenylalanin-130, Leucin-131 und Asparaginsäure-132 essenziell für die Interaktion mit Opi1 sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass deren Austausch gegen Alanin auch einen Interaktionsverlust mit Cyc8 und Sin3 bewirkt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese FLD-AAA-Mutation zu einer praktisch konstitutiven Expression des INO1-Gens führt, allerdings auf niedrigerem Niveau als im Fall dereprimierter Zellen mit einem Wildtyp Ino2. In Hac1 und Pho4 konnten Aminosäuren mit vergleichbarer Bedeutung für die Corepressorbindung nicht identifiziert werden. Offenbar können die Corepressoren je nach physiologischer Situation in der Zelle positiv oder negativ auf die Transkriptionsinitiation wirken.
Der Erreger des Q-Fiebers ist C. burnetii, ein zoonotisches intrazelluläres Bakterium. Die Gram-negativen Coxiellen kommen in zwei verschiedenen antigenen Lipopolysaccharid (LPS)-Formen vor: als virulente Ph I-LPS- und/oder avirulente Ph II-LPS-Bakterien. C. burnetii wird durch Kontakt mit infizierten Tieren sowie infektiösen Stäuben übertragen. Akute fiebrige Infektionen können beim Menschen im weiteren Verlauf eine Pneumonie oder Hepatitis auslösen. Zu einem geringen Prozentsatz entstehen chronische Infektionen mit persistierenden Coxiellen. Eine C. burnetii-Infektion bewirkt sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort. Neben Monozyten und Makrophagen dienen auch dendritische Zellen (DCs) den Coxiellen als geeignete Wirtszellen. DCs gehören zu den Immunzellen der first-line-of-defense des angeborenen Immunsystems und treten während einer Coxiellen-Infektion ebenso wie die mit ihnen kooperierenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) früh mit dem aufgenommenen bakteriellen Pathogen in Kontakt. Durch Antigenpräsentation infizierter DCs wird die für die anti-Coxiellen Abwehr maßgebliche T-Zell-Immunität initialisiert und die nachgeschaltete Immunantwort funktional ausgerichtet.
Trotz dieser zentralen Immunfunktion sind die zellulären Vorgänge von DCs während einer C. burnetii-Infektion, insbesondere mit Blick auf die zelluläre Selbstverteidigung gegenüber den vermutlich initial auftretenden Ph II-LPS-Varianten, nicht ausreichend verstanden. Zudem ist bisher nicht hinreichend geklärt, welchen Einfluss FN-γ, das von aktivierten NK-Zellen produziert wird, sowie die Sauerstoffumgebung auf die zelluläre Abwehr infizierter APCs nimmt.
Das Forschungsziel dieser Promotionsarbeit war es daher, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Coxiellen-Infektionen von DCs und NK-Zellen zu erhalten und hierbei insbesondere die IFN-γ-Wirkung auf die DC-Pathogen-Wechselwirkung sowohl unter norm- als auch hypoxischen Bedingungen zu untersuchen.
Die im ersten Teil der Promotionsarbeit durchgeführten zellbiologischen, immunologischen und proteinbiochemischen Analysen im murinen Zellsystem belegen eine pathogenausgelöste Subversion der funktionalen Aktivierung/Induktion der MHC I-Antigenpräsentation Coxiellen-infizierter DCs. Die infektionsbedingte Beeinträchtigung der MHC-Antigenpräsentation infizierter DCs lässt sich in direkter Weise auf einen autokrinen Suppressionseffekt des αVβ8-Integrin-aktivierten TGF-β und nicht auf die subversive Wirkung von Coxiellen-LPS als Virulenzfaktor zurückführen. Untersuchungen im Zusammenhang mit IFN-γ zeigen, dass dieses Zytokin in infizierten DCs eine Wiederherstellung der MHC I-Induktion und -Oberflächenexpression bewirkt, welche mit einer funktionalen Prozessierung und MHC-Präsentation pathogener Peptidantigene verbunden ist. Weitere Studien belegen zudem, dass IFN-γ-behandelte DCs in der Lage sind, die Etablierung/Vermehrung intrazellulärer Coxiellen negativ zu beeinflussen. Die durchgeführten siRNA- und CRISPR/Cas9-Experimente zeigen, dass die zelluläre Selbstverteidigung infizierter DCs maßgeblich durch das IFN-γ-induzierbare iNOS/NO-System vermittelt wird. Als reaktives Stickstoffradikal scheint Stickstoffmonoxid (NO) sowohl Komponenten der bakteriellen Elektronentransportkette als auch die autophagische Ausbildung und Integrität parasitophorer Vakuolen zu beeinträchtigen. Parallel hierzu schützen sich infizierte DCs über einen metabolischen Wechsel zur aeroben Glykolyse vor mitotoxischer NO-Wirkung und sichern so während der intrazellulären Coxiellen-Eliminierung ihr eigenes Überleben.
Weitere Untersuchungen dieser Arbeit belegen zudem, dass auch C. burnetii zu einer entsprechenden Gegenwehr fähig ist. Um der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs entgegenzuwirken, induzieren Coxiellen zur Minderung antibakterieller Radikal-Effekte ihre Cytochrom bd-, Katalase- und SOD-Expression. Infektionsstudien mit T4SS-defekten Coxiellen weisen ferner darauf hin, dass das bakterielle Sekretionssystem vermutlich eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs spielt, da sich Coxiellen ohne intaktes T4SS offensichtlich dem negativen NO-Einfluss entziehen und/oder keine entsprechenden Angriffsziele für NO bieten. Studien C. burnetii-infizierter Makrophagen bestätigen, dass das iNOS/NO-System eine essenzielle antibakterielle Selbstverteidigung von APCs darstellt. So zeigen auch Makrophagen eine deutliche Beeinträchtigung intrazellulärer Coxiellen-Vermehrung unter iNOS-vermittelter NO-Synthese. Die im weiteren Verlauf der Arbeit untersuchten norm- und hypoxischen Infektionsmodelle infizierter DCs lassen vermuten, dass hypoxische Kulturbedingungen die Coxiellen dazu veranlassen, ein sporenähnliches Stadium ohne produktive Vakuolenbildung auszubilden. Diese hypoxische Überlebensform intrazellulärer Coxiellen zeichnet sich durch IFN-γ-Resistenz, eine durch modifizierte Genexpression optimierte Sauerstoffverwertung und Radikalentgiftung sowie die Erhaltung ihrer Infektiosität aus. Dies deutet darauf hin, dass Hypoxie den intrazellulären Coxiellen weitere Möglichkeiten zur effizienten Immunevasion eröffnet, die einen unentdeckten Bakterienverbleib innerhalb infizierter Wirtszellen begünstigt und so vermutlich chronische C. burnetii-Infektionen fördert.
Für die Synthese und Freisetzung des APC-stimulierenden IFN-γ sind im Zuge angeborener Immunität vor allem die mit DCs kooperierenden NK-Zellen verantwortlich. Die im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit durchgeführten Studien zur Charakterisierung der Interaktion zwischen NK-Zellen und Coxiellen belegen, dass NK-Zellen von C. burnetii infiziert werden, sie jedoch die Etablierung und Replikation internalisierter Bakterien durch Ausschleusung in die extrazelluläre Umgebung unterbinden. Dieser Prozess geht mit einer funktionalen NK-Zell-Aktivierung einher, welche durch Phospho-Aktivierung der PKC ϴ sowie IFN-γ- und Granzym B-Ausschüttung charakterisiert ist. Verschiedene mikroskopische Analysen zeigen zudem, dass die intrazellulären bakteriellen Strukturen in unmittelbarem Kontakt mit den sekretorischen Granula stehen und die Coxiellen-Freisetzung über Degranulierung infizierter NK-Zellen erfolgt. Der Abtötung innerhalb der sekretorischen Granula infizierter NK-Zellen scheint sich C. burnetii durch seine Säure- und Protease-Resistenz zu entziehen. Freigesetzte Coxiellen erhalten nach Degranulierung größtenteils ihre Integrität und Fähigkeit zur Infektion benachbarter Wirtszellen. Obschon Coxiellen der Eliminierung durch die sekretorischen Granula entgehen und dies eine kritische Achillesferse der angeborenen Immunantwort darstellt, verbleibt über das gleichzeitig ausgeschüttete IFN-γ infizierter NK-Zellen ein positiver Effekt auf die antibakterielle APC-Aktivität.
In ihrer Gesamtbetrachtung tragen die erzielten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zu einem besseren und tieferen Verständnis der C. burnetii-Infektion von DCs und NK-Zellen bei und geben neue Einsichten in die zelluläre Selbstverteidigung sowie die IFN-γ-basierte Immunkooperation innerhalb der frühen Phase der anti-Coxiellen Abwehr. Im weiteren Infektionsverlauf können jedoch diese immunologischen Prozesse durch auftretende Hypoxie vermutlich eingeschränkt und die Eliminierung intrazellulärer Coxiellen erschwert sein.