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Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
Charakterisierung plasmamembrangebundener Proteasen von Nicotiana tabacum und Hordeum vulgare
(2012)
Es wurden erstmals zwei plasmamembrangebundene Proteaseformen in den Wurzeln der Gerste massenspektrometrisch identifiziert und den Metalloaminopeptidasen der Peptidasefamilien M17 und M24 zugeordnet. Ausgehend von Enzymaktivitätstests mit verschiedenen Substraten und gelelektrophoretischer Fraktionierungen existieren darüber hinaus weitere PM-Proteasen des Aminopeptidase-, Carboxypeptidase- und Endoproteasetyps an der pflanzlichen Plasmamembran (PM). Die untersuchten PM-Proteasen stellen Triton X-114-resistente Proteine dar, die erfolgreich mit Octylglucosid solubilisiert wurden und sowohl an der inneren als auch an der apoplastischen Seite der PM lokalisiert sein könnten. Durch endogene Proteolyse werden andere PM-Proteine wie Aquaporine und P-Typ-H+-ATPasen durch die PM-Proteasen reguliert. Dabei zeigen einige dieser Proteolyseprodukte Proteaseaktivität, die für vier Proteaseformen der Gerste erst nach der Abtrennung von der PM nachweisbar war.
Kurzfassung: Im Rahmen dieser Arbeit sollten 10 verschiedene organische Schadstoffe und Lösungsmittel, darunter BTEX-Verbindungen (Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylol), (chlorierte) Phenole und aliphatische Alkanole hinsichtlich ihrer Wirkung auf das Wachstum von Modellorganismen, die unter unterschiedlichen anoxischen Bedingungen wuchsen, geprüft werden. Dabei wurden mit Thauera aromatica, Geobacter sulfurreducens und Desulfococcus multivorans – Arten untersucht, die unterschiedlichen anaeroben Stoffwechselgruppierungen angehören. Trotz geringerer Wachstumsraten der untersuchten anaeroben Mikroorganismen, wurde die Toxizität der Chemikalien mittels eines Wachstumshemmtest abgeschätzt, der bereits für aerobe Bakterien etabliert wurde. Die Toxizitäten der Verbindung wurden dabei als 50% Effektive Konzentrationen (EC50) ausgedrückt, also der Chemikalienkonzentration, die benötigt wird um die Wachstumsrate der Mikroorganismen um 50% zu vermindern. Eine direkte Beziehung zwischen der Toxizität und der Hydrophobizität (log P-Wert) der organischen Verbindungen wurde für alle drei anaeroben Bakterien erfasst. Dabei zeigte sich, dass die drei anaeroben Stämme generell etwas empfindlicher auf die Substanzen reagierten als bisher getestete aerobe Mikroorganismen. Zudem wurden Reaktionen untersucht, die den Bakterien das Überleben in Anwesenheit organischer Lösungsmittel gestattet. Da Membranen die Berührungspunkte zwischen den Mikroorganismen und dem umgebenden Medium darstellen, sind die meisten Anpassungsreaktionen mit der Aufrechterhaltung der Membranfluidität und –stabilität verbunden. Die Änderung der Membranzusammensetzung insbesondere die der Phospholipidfettsäuren (PLFA) spielt dabei eine immense Rolle. T. aromatica und G. sulfurreducens, deren Fettsäuremuster von der Palmitinsäure (C16:0) und der Palmitoleinsäure (C16:1cis) dominiert wurden, reagierten während des Wachstums in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln, mit einem Anstieg des Sättigungsgrades der zellulären Fettsäuren. Das Fettsäurespektrum von D. multivorans wurde durch Palmitinsäure (C16:0) und anteiso-verzweigte Fettsäuren charakterisiert. Insbesondere auf die Anwesenheit von BTEX-Verbindungen reagierten die Zellen des Sulfatreduzierers mit einem Anstieg des Verhältnisses zwischen unverzweigten gesättigten Fettsäuren (C14:0, C16:0, C18:0) und den anteiso-verzweigten Fettsäuren (C15:0anteiso, C17:0anteiso, C17:1anteiso). Die beobachteten Modifikationen auf Ebene der zellulären Fettsäurezusammensetzung sind jedoch nur mittels de novo Synthese der Fettsäuren möglich – einem Prozess, der eng mit Zellwachstum verbunden ist. Die Wachstumsraten der untersuchten, anaeroben Bakterien sind jedoch deutlich geringer als die bisher getesteter aerober Bakterien, somit wird für die Ausprägung der Anpassungsreaktionen mehr Zeit benötigt, was die höhere Empfindlichkeit anaerober Bakterien gegenüber Lösungsmitteln erklären könnte.
Anorganische Stickstoffformen, wie Nitrat oder Nitrit, dienen in Pflanzen als Quelle für die enzymatische Bildung des Signalmoleküls Stickstoffmonoxid (NO). In Wurzeln wird NO an der apoplastischen Seite der Plasmamembran (PM) durch die Nitrit:NO-Reduktase (NI-NOR) gebildet, die für Nitrit eine hohe Affinität aufweist. Die dafür benötigten Elektronen stammen aus der Oxidation von Succinat, wobei in vitro auch Elektronen aus reduziertem Cytochrom c akzeptiert werden. Zur fluoreszenzmikroskopischen Lokalisierung der NI-NOR (in planta) innerhalb der Tabakwurzeln (Nicotiana tabacum cv. Samsun) wurden DAF-Farbstoffe (Diaminofluoresceine) eingesetzt, die sich jedoch aufgrund zahlreicher NO-unspezifische Reaktionen zum Nachweis der NI-NOR unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht eigneten. Die Bestimmung und Quantifizierung der NI-NOR-Aktivität in vitro, an isolierten PM-Vesikeln, solubilisierten PM-Proteinen und partiell gereinigten PM-Proteinen, erfolgte mittels Chemilumineszenzanalyse. Neben NO wurde unter Anwendung der Membran-Inlet-Massenspektrometrie an PM-Vesikeln außerdem die Bildung von N2O und NO2 nachgewiesen. In Abhängigkeit von der externen Nitraternährung der Tabakpflanzen bestand ein Zusammenhang zwischen der NI-NOR-Aktivität und der Kolonisierungsrate der Wurzeln mit dem vesikulär-arbuskulären Mykorrhizapilz Glomus mosseae, wobei geringe NI-NOR-Aktivitäten unter Stickstoffmangelbedingungen mit hohen Kolonisierungsraten und umgekehrt hohe NI-NOR-Aktivitäten bei optimaler Nitraternährung mit geringen Kolonisierungsraten korrelierten. Die NI-NOR-Aktivität wurde konzentrationsabhängig und reversibel durch die Anwesenheit von Sauerstoff gehemmt und erreichte bei einer Luftsauerstoffkonzentration von 21 % noch etwa 22 % ihrer ursprünglichen, unter anoxischen Bedingungen gemessenen Aktivität. Um die Identität dieses Enzyms über massenspektrometrische Analysen zu klären, wurde die NI-NOR ausgehend von isolierten PM-Vesikeln aus Tabakwurzeln durch Solubilisierung sowie über chromatographische und gelelektrophoretische Trennungsmethoden aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie wurden vor allem verschiedene Aquaporine und Kanäle sowie einige noch unbekannte Proteine identifiziert, bei denen es sich möglicherweise um die NI-NOR handeln könnte. Eine Oxidoreduktase, als möglicher Kandidat für die NI-NOR, wurde jedoch nicht gefunden.