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Lipohypertrophien (LHT) sind Veränderungen des subkutanen Fettgewebes, die durch die Langzeitanwendung von Insulin bei ca. 40 % der Patienten entstehen. Sie waren bisher von fraglicher klinischer Relevanz und teilweise schwierig zu diagnostizieren. Die Veröffentlichungen im Rahmen dieser kumulativen Dissertation untersuchten die pharmakotherapeutische Bedeutung von Lipohypertrophien und untersuchten erstmals die Thermographie als diagnostische Option für LHT. Dabei zeigte sich im euglykämischen Clamp-Versuch eine signifikant reduzierte Bioverfügbarkeit des Insulins nach Injektion in LHT von 78-80 % im Vergleich zur Applikation in gesundes Gewebe. Zwei der dreizehn Probanden zeigten keine Insulinwirkung. Die intraindividuelle Variabilität war signifikant höher in LHT als im gesunden Gewebe. Bei der erstmaligen systematischen Untersuchung von LHT mit einer hochwertigen Wärmebildkamera zeigte sich eine mäßige diagnostische Güte, verglichen mit den ebenfalls teilweise schwierigen Methoden der Inspektion, Palpation und des Ultraschalls. Insbesondere in der Kontrollgruppe war eine klare Abgrenzung von gesundem Gewebe schwierig. Aufgrund der Beeinflussung der Sicherheit, Effektivität und der Effizienz der Pharmakotherapie durch LHT, sollten diese als Injektionsort vermieden werden. Diese Arbeit konnte den Nutzen der Thermographie als diagnostische Option bei LHT zwar nicht klar beweisen, jedoch diesen auch nicht ausschließen.
Das Renin-Angiotensin-System (RAS) ist ein Hormonsystem, das über die Bindung von Angiotensin-Peptiden an ihre spezifischen Rezeptoren vielfältige physiologische Prozesse beeinflussen kann. In den letzten Jahren gelangte die alternative Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2)/Angiotensin (Ang)-(1-7)/Mas-Rezeptor-Achse des RAS aufgrund ihrer protektiven Rolle bei pathophysiologischen Zuständen in den Fokus der Forschung. Wenig untersucht war bislang die Relevanz der lokalen ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse für die Funktion von Langerhans-Inseln, besonders in Hinblick auf die Produktion und Sekretion von Insulin. Daher sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Einfluss des Mas-Rezeptors und seines Liganden Ang-(1-7) auf die β-Zell-Funktion bestimmt und verantwortliche molekulare Mechanismen aufgeklärt werden. Dazu wurden isolierte Langerhans-Inseln von Wildtyp (WT) und Mas-defizienten Mäusen genutzt, die zunächst umfassend hinsichtlich der Expression der Komponenten der ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse charakterisiert wurden. Dann wurde der Einfluss des Ang-(1-7) sowie der Ang-(1-7)-Antagonisten D-Ala7-Ang-(1-7) (A779) und D-Pro7-Ang-(1-7) (D-Pro) auf die Insulinproduktion und Glucose-stimulierte Insulinsekretion (GSIS) bestimmt. Isolierte Inseln von Mas-defizienten Mäusen zeigten im Vergleich zu WT-Inseln eine signifikant reduzierte GSIS. Entsprechend bewirkte in WT-Inseln die Inkubation mit A779 und D-Pro eine Reduktion der GSIS, wohingegen der Mas-Ligand Ang-(1-7) diese signifikant steigern konnte. Diese Befunde unterstreichen die Bedeutung der ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse für die Modulation der Insulinsekretion in Langerhans-Inseln.
Unter Verwendung pharmakologischer Hemmstoffe wurden zugrunde liegende Signal-Transduktionswege untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sprechen für die Beteiligung von cyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) an der Mas-abhängigen Regulation der Insulinsekretion. Ergebnisse weiterführender Experimente machen wahrscheinlich, dass diese Ang-(1-7)-stimulierte Insulinsekretion hauptsächlich über das exchange protein directly activated by cAMP 2 (EPAC2) verläuft. Auch nach Langzeit-Applikation von Ang-(1-7) in vivo zeigte sich ein stimulierender Effekt von Ang-(1-7) auf die GSIS von WT-Inseln. Es wurden auch Hinweise auf Mas-Rezeptor-unabhängige Ang-(1-7)-Wirkungen erhalten, die Gegenstand weiterführender Untersuchungen sind. Der Einfluss von Ang-(1-7) und A779 auf die Glucosetoleranz in vivo war dagegen marginal.
Um weitere Signalwege und Komponenten zu identifizieren, die an der Mas-abhängigen Regulation der GSIS beteiligt sind, wurde eine Massenspektrometrie-basierte Proteomanalyse von Langerhans-Inseln aus WT- und Mas-defizienten Mäusen ohne und unter Einwirkung von Ang-(1-7) und A779 durchgeführt. Die Kandidaten mit signifikanten Mengenänderungen wurden anschließend über die Ingenuity® Pathway Analyse (IPA) in molekulare Netzwerke und funktionelle Kategorien eingeordnet. Die stärkste Beeinflussung konnte bei den funktionellen Kategorien Zelltod und Zellüberleben, gastrointestinale Erkrankungen, Erkrankungen des endokrinen Systems, Stoffwechselerkrankungen und Zellzyklus festgestellt werden.
Die Sekretions-Maschinerie wurde als ein wahrscheinlicher Angriffspunkt der Ang-(1-7)/Mas-vermittelten Signale in den Langerhans-Inseln identifiziert, da einige regulierte Proteine sekretionsassoziierte Signalwege, vesikelassoziierte Faktoren, Komponenten des Endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparates sowie Regulatoren des Zytoskeletts betreffen oder als potenziell übergeordnete Regulatoren vorhergesagt werden konnten. Als eines der interessantesten Proteine wurde dabei das Golgi-reassembly stacking protein 2 (GORASP2) identifiziert, das für die akkurate Golgi-Stapelung in der Zelle verantwortlich ist und auch in die unkonventionelle Proteinsekretion involviert ist. Eine Mas-Rezeptor-abhängige Beeinflussung von GORASP2 und damit der Insulinsekretion erscheint möglich und sollte in weiterführenden Analysen verifiziert und hinsichtlich der molekularen Prozesse detailliert untersucht werden.
Die vorgelegten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse des RAS sowohl in vitro als auch in vivo einen positiven Einfluss auf die β-Zell-Funktion ausübt. Inwieweit sich daraus neue Ansatzpunkte für die Behandlung von Erkrankungen mit gestörter β-Zell-Funktion ergeben können, müssen Folgeuntersuchungen zeigen. Denkbar wäre die Steigerung der GSIS bei Typ-2-Diabetes mellitus mittels stabilen Ang-(1-7)-Agonisten. Diese Möglichkeit zeigt die Wichtigkeit zur weiteren Erforschung der ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse in Langerhans-Inseln und ihrer genauen Wirkungen auf die Funktion von β-Zellen.
The term diabetes mellitus comprises a group of metabolic diseases all distinguished by their main characteristic hyperglycaemia. With a steadily increasing prevalence diabetes displays an enormous burden for patients and health systems and is therefore of special interest for research. The development of the two main types of diabetes, type 1 and type 2, is closely linked to the formation of reactive species, especially hydrogen peroxide, inside different compartments of pancreatic beta cells. However, these cells are especially vulnerable towards oxidative stress mediated by hydrogen peroxide due to a low expression of antioxidative enzymes.
The main aims of the present thesis were to analyse the intracellular generation and to enable the site-specific detection of hydrogen peroxide to evaluate its role in the delicate equilibrium between redox signalling and oxidative stress under certain pathophysiological conditions, and moreover to monitor its movement through compartments and subcellular membranes of insulin-producing cells. Additionally, a new methodology for an artificial site-specific generation of hydrogen peroxide inside living cells was developed.