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Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Synthese von FettsĂ€ureestern aus Pflanzenölen mit Methanol bzw. Ethanol in Gegenwart von Wasser durch die Lipase CAL-A zu optimieren, wobei insbesondere die Bildung von freien FettsĂ€uren minimiert werden sollte. ZunĂ€chst wurde ein Hochdurchsatztest zur Bestimmung der AcyltransferaseaktivitĂ€t der CAL-A etabliert, welcher auf der Abnahme des Alkoholgehalts in Umesterungsreaktionen basiert. Dabei zeigte sich eine gute Ăbereinstimmung zwischen den UmsĂ€tzen, die mit GC und dem Oxidase-Assay ermittelt wurden, wobei die UmsĂ€tze nicht zu gering sein sollten da sonst gröĂere Schwankungen im Oxidase-Assay möglich sind. Durch das rationale Design anhand der gelösten Struktur der CAL-A konnten vier Mutagenesepositionen identifiziert werden: Thr118, Asp122, Thr221 und Glu370. Durch den Austausch der AminosĂ€urereste an diesen Positionen gegen hydrophobere AminosĂ€uren wurden 28 CAL-A Varianten generiert. Diese wurden fĂŒr eine initiales, qualitatives Screening eingesetzt, indem drei CAL-A Varianten eine Ă€hnliche bzw. erhöhte Esterbildung im Vergleich zum Wildtyp zu haben schienen. Die drei Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala wurden daraufhin fĂŒr weitere Untersuchungen in P. pastoris im Bioreaktor hergestellt und in Biokatalysen verwendet. Eine erhöhte Esterbildung fĂŒr die Varianten Thr118Ile und Thr221Ala lieĂ sich jedoch nicht bestĂ€tigen, allerdings zeigte sich, dass die CAL-A Variante Asp122Leu deutlich weniger freie SĂ€ure bildete als der CAL-A WT. In der anschlieĂenden Charakterisierung von CAL-A Asp122Leu zeigte sich, dass diese Variante wie CAL-A WT auch thermostabil ist und dass beide Enzyme das gleiche pH- und Temperaturoptimum haben. Des Weiteren wurden CAL-A WT und Asp122Leu adsorptiv auf Lewatit VP OC 1600 immobilisiert und in Biokatalysen eingesetzt, in denen CAL-A Asp122Leu erneut deutlich weniger freie SĂ€ure bildete. DarĂŒber hinaus wurde auch der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die AcyltransferaseaktivitĂ€t der CAL-A untersucht. Es wurden dazu Biokatalysen mit Ethanol oder Methanol durchgefĂŒhrt, in denen der Wassergehalt (5% oder 10% bezogen auf die Einwaage an Ăl) und die Reaktionstemperatur (30°C, 40°C oder 50°C) variiert wurden. Die Biokatalysen mit Methanol zeigten dabei generell einen hohen Umsatz zwischen 85-95%, wĂ€hrend die Biokatalysen mit Ethanol nur zu geringeren UmsĂ€tzen fĂŒhrten (55-85%). Allerdings zeigte sich in einem LangzeitstabilitĂ€tstest mit einer Biokatalysedauer von 97 h auch, dass Methanol das verwendete CAL-A Immobilisat stĂ€rker inaktiviert als Ethanol. Ebenso musste bei einem Wassergehalt von nur 5% die Methanolzugabe schrittweise erfolgen, um eine Inaktivierung des CAL-A Immobilisats zu verhindern. Somit konnte eine Optimierung der CAL A katalysierten Umesterungsreaktionen sowohl durch das Protein-Engineering des Biokatalysators als auch durch die Anpassung der Prozessbedingngen erreicht werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die auch zur Beurteilung der industriellen Anwendbarkeit eines solchen Prozesses beitragen können.
Der gesamte Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu ermöglichen. Hier werden Stoffe ohne Abtrennung oder Aufarbeitung ĂŒber verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erfolgreich eine in vivo Enzymkaskade aus drei Oxidoreduktasen etabliert, untersucht und mit Fusionsproteinen verbessert werden. Zur Etablierung der in vivo Enzymkaskade aus Alkoholdehydrogenase, Enoatreduktase und Baeyer-Villiger-Monooxygenase im Rahmen eines DFG-Projekts (Bo1862/6-1) in Zusammenarbeit mit der Technischen UniversitĂ€t Wien wurde zunĂ€chst nach den geeigneten Enzyme gesucht. Mit einer Alkoholdehydrogenase aus Laktobacillus kefir und einer Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus ruber konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Im Rahmen der Suche nach geeigneten Enzymen fĂŒr die Kaskade wurde von drei neuen Enoatreduktasen aus Pseudomonas putida ATCC 17453 das Substratspektrum untersucht. Die xenobiotische Reduktase A (XenA), die xenobiotische Reduktase B (XenB) und die N-Ethylmaleimid-Reduktase (NemA) akzeptierten sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde. Sehr gute UmsĂ€tze konnten mit Imiden und Carvonen nachgewiesen werden. Besonders die XenA und XenB zeigten mit ĂŒber 99 % EnantiomerenĂŒberschuss in der Bildung von Dihydrocarvonen exzellente StereoselektivitĂ€ten. In der Enzymkaskade setzten dann die XenB oder das Old yellow enzyme (OYEI) die α,ÎČ-ungesĂ€ttigen Ketone selektiv zu den chiralen Ketonen um. Diese wurde dann von der Cyclohexanon-monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter species in die gewĂŒnschten chirale Laktone umgesetzt. Nach erfolgreichen Klonierungen konnten alle vier Enzymkombinationen der Enzymkaskade löslich und aktiv in einem E. coli-Stamm kultiviert werden. Mit der Kombination verschiedener nicht-natĂŒrlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methyl-substituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Laktonen umgesetzt werden. Wir konnten durch Auswahlmöglichkeiten zwischen verschiedenen Alkoholdehydrogenasen und Enoat-reduktasen modular agieren und so zum Beispiel innerhalb von 20 Stunden die Reaktion von 4 Methyl-2-cyclohexenol zu 100 % in das optisch reine Lakton in E. coli katalysieren. Auch die fĂŒr die Polymerindustrie interessanten Dihydrochalconlaktone konnten mit sehr guten UmsĂ€tzen und mit ĂŒber 99 %ee hergestellt werden. Nach der erfolgreichen Etablierung der Enzymkaskade wurde die Umsatzgeschwindigkeit mit Hilfe von Fusionsproteinen noch einmal gesteigert. DafĂŒr wurde die Auswirkung von verschiedenen Linkern und die Abfolge der EnzymdomĂ€nen im Fusionsprotein aus XenB-DomĂ€ne und CHMO-DomĂ€ne untersucht. Mit dem Fusionsproteine CHMO_G_XenB konnte nach einer Stabilisierung der CHMO-DomĂ€ne ein sehr guter Biokatalysator hergestellt werden. Anwendungen in der in vivo Enzymkaskade zeigten schnellere UmsĂ€tze fĂŒr Cyclohexenol und Carveol. Ein aktives Fusionsprotein aus Alkoholdehydrogenase, XenB und CHMO konnte nicht etabliert werden, da beide Alkoholdehydrogenasen aus der Enzymkaskade bei der Fusionierung inaktiviert wurden. Auch wenn kein aktives Fusionsprotein aus drei verschiedenen EnzymdomĂ€nen hergestellt werden konnte, ist mit der erstmaligen Fusion einer Enoatreduktase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase die neue in vivo Enzymkaskade verbessert worden. Somit konnte in dieser Doktorarbeit die erfolgreiche Anwendung von einer modularen in vivo Enzymkaskaden fĂŒr die Herstellung chiraler Laktone fĂŒr die Polymerchemie gezeigt werden.
