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Dendritische Zellen (DCs) und die von ihnen geprimten T-Zellen besitzen eine zentrale Funktion in der anti-chlamydialen Immunantwort. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe gelang unter Verwendung von immortalisierten murinen DCs (JAWSII-Zellen) und dem Chlamydienstamm C. psittaci (DC15) die erstmalige Identifizierung eines zellautonomen Abwehrweges in infizierten DCs. Diese zelluläre Selbstverteidigung ist dadurch charakterisiert, dass Chlamydien aus strukturell desintegrierten Inklusionen dem Autophagieweg zugeführt werden und es zur Generierung von Antigenen kommt, die mithilfe von MHCI-Molekülen auf der Zelloberfläche von DCs entsprechenden CD8+ T-Zellen präsentiert werden.
Die exakten zellulären Prozesse und biochemischen Abläufe der Desintegration und Autophagie chlamydialer Inklusionen in DCs wurden bisher noch nicht eingehend untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, unter Einsatz des zuvor etablierten murinen Infektionssystems sowie C. psittaci (DC15), den xenophagosomalen Mechanismus der Chlamydienbekämpfung infizierter DCs aufzuklären und weitere, hieran gekoppelte Folgeprozesse und funktionale Interaktionen mit anderen Immunzellen zu charakterisieren.
Die hier in Kombination mit zellbiologischen und biochemischen Assays durchgeführten siRNA-Studien belegen eine funktionale Schlüsselrolle der Phospholipase cPLA2 in der anti-chlamydialen Abwehr infizierter DCs. Des Weiteren sprechen die Resultate dafür, dass es durch die Wirkung der von ihr synthetisierten Arachidonsäure zu einer defekten OXPHOS und verminderten ATP-Produktion der Mitochondrien kommt und dies destruktive Auswirkungen auf die energieparasitären Chlamydien hat. Der Verlust der mitochondrialen Funktion sowie der damit verbundene Vitalitätsverlust der Chlamydien scheinen unmittelbar durch den TNF-α/cPLA2-Signalweg kontrolliert zu werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse der Arbeit folgern, dass die Chlamydieninfektion mit einer metabolischen Umprogrammierung von der OXPHOS zur aeroben Glykolyse in DCs einhergeht. Durch die erhöhte Glykolyserate scheinen die infizierten DCs, den durch die geschädigten Mitochondrien entstehenden Energieverlust, kompensieren zu können.
Die Assoziation der Inklusionen mit stabilen, acetylierten Mikrotubuli spielt eine entscheidende Rolle sowohl für die erfolgreiche Etablierung der Chlamydien als auch deren vesikuläre Versorgung. Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigen in infizierten DCs eine HDAC6-vermittelte Deacetylierung von Mikrotubuli. Dies führt zu einem Verlust des peri-nukleären Transports bakterieller Vakuolen zum Golgi-Apparat und einer weiteren strukturellen Desintegration der chlamydialen Kompartimente. Der Vorgang ermöglicht es infizierten DCs, die durch cPLA2/Arachidonsäure beeinträchtigen Inklusionen von der vesikulären Versorgung abzukoppeln und durch weitere intrazelluläre Mechanismen zu eliminieren. Die durchgeführten Untersuchungen zum intrazellulären Abbaumechanismus weisen auf eine Aggresomen-vermittelte Xenophagie der bakteriellen Strukturen hin. Massenspektrometrische Analysen der Aggresomen aus DCs sowie die gefundene Beteiligung der mitophagosomalen Schlüsselkomponenten HDAC6, Parkin, Pink-1 sowie p62 und Ubiquitin belegen einen simultanen auto-/xenophagosomalen Abbau defekter Mitochondrien und desintegrierter Chlamydien. Eine vergleichbare intrazelluläre anti-chlamydiale Abwehr konnte ebenfalls in primären Maus- aber auch humanen DCs bestätigt werden.
Während des Infektionsverlaufs in DCs kommt es parallel zur Auto-/Xenophagie zu einer vermehrten Bildung von Multivesikularkörperchen (MVBs) und einer daran gekoppelten Formation exosomaler Membranvesikel (iDexosomen), die massiv zur Induktion der IFN-γ-Sekretion benachbarter NK-Zellen und so zur Aktivierung einer NK-Zellantwort während der Chlamydieninfektion beitragen. Weitere Untersuchungen zeigen, dass das TNF-α infizierter DCs in Kombination mit dem durch iDexosomen induzierten IFN-γ von NK-Zellen zu einer erhöhten Apoptoseinduktion nicht-infizierter aber auch Chlamydien-infizierter Epithelzellen führt. Dies deutet darauf hin, dass die chlamydiale Subversion der Apoptose infizierter Zellen zu einem gewissen Teil durch eine kombinatorische Wirkung von Exosomen, IFN-γ und TNF-α „ausgehebelt“ werden kann.
Abschließend wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und in welchem Maße die mit DCs kooperierenden NK-Zellen zelluläre Mechanismen besitzen, die eine zelluläre Chlamydieninfektion direkt bekämpfen. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass es bei infizierten NK-Zellen zu keinem Zeitpunkt zu einer erfolgreichen chlamydialen Etablierung und zu keiner zyklusvermittelten EB-RB-Differenzierung kommt. Interessanterweise zeigen die infizierten NK-Zellen eine funktionale Reifung, die durch eine erhöhte IFN-γ-Sekretion, CD146-Induktion, PKC-θ-Aktivierung und Granula-Ausschüttung charakterisiert ist und mit einer Freisetzung von nicht-infektiösen EBs einhergeht. Diese Ausschleusung von Chlamydien konnte hier sowohl für immortalisierte als auch primäre NK-Zellen der Maus gezeigt werden und lässt sich durch die pharmakologische Blockierung zellulärer Exozytoseprozesse inhibieren. Chlamydiale Strukturen innerhalb der NK-Zellen weisen in der Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie eine ausgeprägte Co-Lokalisierung mit sekretorischen Granula auf. Es scheint, dass das Granula-lokalisierte und ausgeschüttete Granzym B verantwortlich für den beobachteten Infektionsverlust, der durch NK-Zellen freigesetzten EBs, ist. Die chlamydiale Infektion und Ausschleusung von EBs hat keinen detektierbaren negativen Einfluss auf die Funktion der NK-Zellen. Sie können nach einer Erstinfektion den chlamydialen Infektions- und Ausschüttungsvorgang in einer weiteren Reaktion reproduzieren und besitzen eine zytotoxische Aktivität, die denen nicht-infizierter NK-Zellen entspricht oder sogar leicht erhöht ist. Die von NK-Zellen freigesetzten nicht-infektiösen Chlamydien zeigen eine nachweisbare Immunogenität, die laut IgG-Subklassen-Charakterisierung immunisierter Mäuse zu einer IgG2c-/IgG2b-dominierten Th1-Antwort führt. Die während der Immunisierung generierten anti-chlamydialen Antikörper besitzen zudem die Fähigkeit zur Infektionsneutralisierung bei der Verwendung epithelialer Wirtszellen als Modelsystem.
Im Résumé geben die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue und vertiefende Einblicke in die zellulären und molekularen Abwehrmechanismen Chlamydien-infizierter DCs und NK-Zellen sowie in deren funktionale wechselseitige Kooperation während der anti-chlamydialen Immunreaktion durch iDexosomen, TNF-α und IFN-γ.
The success of pregnancy depends on precisely adjusted, local immune mechanisms. In early pregnancy, fetal trophoblast cells implant into the endometrium to build and anchor the placenta. Simultaneously, they mediate fetal tolerance and defense against infections. To cover these versatile requirements, local immune factors must be in balance. A too tolerogenic milieu can lead to an inadequate placentation; while a too inflammatory milieu can cause rejection of the semi-allogenic fetus. Bacterial infections can provoke these inflammatory pregnancy complications as well. Therefore, the pregnant uterus was long thought to be sterile. Descriptions of a placental microbiome opened a scientific discourse, which is unsolved due to contrary studies. The colonization of the non-pregnant endometrium is, however, confirmed. It is supposed to affect both, uterine pathologies and fertility. Precise data are lacking. Aim of this work was to assess if and under which circumstances a bacterial colonization would be tolerable.
One of the described species in placental and endometrial samples is Fusobacterium nucleatum. It is an opportunistic bacterium, which is known from the human oral cavity and associated with the development of colon carcinomas. F. nucleatum supports tumorigenesis by the induction of epithelial proliferation, survival, migration and invasion as well as angiogenesis and tumor tolerance. Since similar processes are required for implantation and placentation, F. nucleatum might support these as well. In this work, the effects of F. nucleatum on leukocyte-trophoblast-interactions, especially of macrophages and innate lymphoid cells type 3 (ILC3), were assessed.
The monocytic cells (THP-1) were differentiated into inflammatory M1 (IFN-γ) or tissue-repairing and tolerogenic M2a (IL-4) and M2c (TGF-β) macrophages. Inactivated F. nucleatum, LPS or E. coli was added. Only small concentrations of inactivated bacteria were used (bacteria:leukocyte ratio of 0.1 or 1), since it was not the aim to analyze infections. Conditioned medium of treated leukocytes was added to trophoblastic cells (HTR-8/SVneo). Migratory, invasive and tube formation behavior of trophoblastic cells was quantified.
Treated M1 macrophages impaired trophoblast function, whereas M2a macrophages induced trophoblast invasion. M2c macrophages supported trophoblast migration and tube formation if treated with the smaller, but not with the higher concentration of F. nucleatum. This treatment induced the accumulation of HIF-1α and the secretion of VEGF-A in M2c macrophages as well. Moreover, the higher concentration of F. nucleatum caused rather inflammatory responses (NF-κB activation and cytokine expression). The activation of the HIF-1α-VEGF-A axis under the influence of TGF-β might serve as a mild immune stimulation by low abundant commensal bacteria supporting placentation.
In contrast to macrophages, the function of ILC3s during pregnancy is still unknown. In general, ILC3s are located in mucosal tissue, such as the gut. They participate in tolerance mechanisms and form the local micromilieu by the secretion of cytokines and the presentation of antigens. In order to characterize local, uterine ILC3s, murine ILC3s were compared to peripheral, splenic ILC3s. Uterine ILC3s were more activated and produced higher levels of IL-17 compared to splenic ILC3s. However, uterine ILC3s barely expressed MHCII on their surface. A reduced antigen presentation potential was confirmed in human ILC3s differentiated from cord blood stem cells by the addition of TGF-β or hCG. The treatment with bacteria increased MHCII expression, but not to the initial level. The higher bacterial concentration induced IL-8 secretion and led to an increased trophoblast invasion. ILC3s were less sensitive to bacterial stimulation than macrophages.
Recent studies on the uterine or placental presence of bacteria during pregnancy are discrepant. The results of this project indicate that bacteria or bacterial residues might serve as a mild stimulus under certain circumstances to support implantation without negative effects. The current discussion must therefore not only be expanded by additional studies, but especially include differentiated local conditions. In this context, the sheer presence of bacteria or bacterial components must not be equated with an infection representing a known hazard.
Epileptische Anfälle zählen weltweit zu den häufigsten neurologischen Symptomen. Obwohl bereits sehr viele Daten belegen, dass andere neurologische, akut die Hirnfunktion beein-trächtigende Erkrankungen, wie der Schlaganfall, zu einer systemisch peripheren Immunal-teration führen, existieren bisher wenige humane Daten über den Einfluss epileptischer An-fälle auf das erworbene und angeborene Immunsystem. Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob ein epileptischer Anfall ebenfalls zu Veränderungen der erworbenen und angeborenen Immunantwort führt.
Im Rahmen dieser explorativ prospektiven Kohortenstudie wurden Immunparameter im EDTA-Blut von 31 Patient*innen an Tag 0 und 1 nach einem gesicherten epileptischen An-fall (fokale Anfälle oder generalisiert tonisch-klonische Anfälle) analysiert. Als Kontroll-gruppe (n = 18) dienten mehrheitlich Patient*innen mit Kopfschmerzen ohne entzündliche Genese sowie Patient*innen vor einer Katarakt Operation. Die Analyse von Quantitäts-, Charakterisierungs- und Aktivierungszustand der Lymphozyten, Monozyten und Granulozy-ten erfolgte mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper (verwendete Marker: CD3, CD4, CD8, HLA-DR, CD32, CD14, CD16 und CD62-L). Zusätzlich wurden die Werte mit bereits publizierten Daten von Patient*innen nach einem Mediainfarkt, die nach demselben Protokoll untersucht wurden, verglichen. Die Auswertung der Facs-Rohdaten erfolgte mittels der Flow-Jo10-Software. Als statistische Tests dienten der Kruskal-Wallis-Test sowie der Dunns-Test als Post-Hoc-Test. (GraphPad Prism 6.0).
Parallel zum Schlaganfall traten nach einem epileptischen Anfall eine Reduktion der Lym-phozytenzahl, eine Monozytose, eine reduzierte monozytäre HLA-DR-Expressionsdichte sowie eine erhöhte Expressionsdichte des Rezeptors CD32 auf. Unterschiede in der Immun-antwort nach Schlaganfall und epileptischem Anfall bestanden in der zeitlichen Dauer der Veränderungen sowie der Zusammensetzung der Monozyten-Subpopulationen.
Diese Studie liefert Daten zu strukturellen und molekularen Veränderungen der unmittelba-ren Immunantwort nach einem epileptischen Anfall. Die erworbene und angeborene postik-tale Immunreaktion ist abhängig von der Art der Anfälle. Sie scheint aber unabhängig davon zu sein, ob ein erstmaliger Anfall oder eine bereits diagnostizierte Epilepsie vorliegt. Lym-phozyten, Monozyten und Granulozyten sind essentielle Elemente der humanen Immunab-wehr. Gezeigte Immunalterationen durch epileptische Anfälle könnten bei Patient*innen zu einer passager reduzierten Abwehrlage führen. Ausgehend von diesen grundlegenden Er-kenntnissen können in Folgestudien umfassendere Zellfunktionsanalysen durchgeführt wer-den, um die tatsächliche klinische Relevanz und Folgen dieser beobachteten Immunalterati-onen zu prüfen.
Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASPV) ist ein wirtschaftlich wichtiger und in Haus- und Wildschweinen Hämorrhagie mit hoher Sterblichkeitsrate verursachender viraler Erreger.
1921 erstmals in Kenia beschrieben, breitete sich die ASP seit 2007 auch über den
Kaukasus, ins Baltikum (2014), weiter in europäische und asiatische Länder und seit 2020 in Deutschland aus. Trotz der hohen genetischen Stabilität des Afrikanischen
Schweinepestvirus (ASPV) wurden Genomvarianten identifiziert, bei denen Unterschiede
in der Genexpression von Multigenfamilien (MGF) dominieren. Letztlich divergieren ASPV-Stämme in ihrer Virulenz und verursachen akut-letale bis chronische Verläufe im Schwein. Aufgrund der enormen Komplexität des Virus und seiner vielfältigen
Immunevasionsstrategien sind viele Mechanismen der Virus-Wirts-Interaktion, die zur
Immunpathogenese beitragen, nicht ausreichend verstanden und erschweren somit die
Impfstoffentwicklung. Dabei können virale Subversionsmechanismen der Wirtszelle die
antivirale Immunantwort modulieren und stehen deshalb im Fokus dieser Arbeit. Zur
Charakterisierung und mechanistischen Aufklärung dieser ASPV-spezifischen
Immunsubversionsmechanismen wurden primäre porzine Monozyten von Hausschweinen
mit hochvirulentem (Armenia) und natürlich-attenuiertem (Estonia) ASPV infiziert. Die
Resultate ergaben sowohl stammunabhängige als auch -abhängige Unterschiede in der
Regulation myeloider Oberflächenmarker infizierter Monozyten. Insbesondere
beobachteten wir eine stammunabhängige Suppression des Phagozytose-regulierenden
CD172a und eine stammabhängige Regulation von porzinem MHC I (SLA I). Weitere
Experimente zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen ergaben, dass zwar
beide Stämme die Oberflächenexpression von CD172 unterdrücken, jedoch nur Armenia-,
im Gegensatz zu Estonia-infizierten Monozyten, eine reduzierte Recyclingrate sowie eine Abspaltung (Shedding) von CD172a von der Zelloberfläche zeigten. Dies lässt vermuten, dass die Virus-vermittelte Suppression von CD172a der beiden ASPV-Stämme auf unterschiedlichen Subversionsmechanismen beruht. Reinfektionsexperimente und
molekularbiologische Untersuchungen belegten zudem, dass das abgespaltene
Oberflächen-CD172a der Armenia-infizierten Monozyten mit einer gesteigerten
Infektionsrate einhergeht, dies ist wahrscheinlich das Ergebnis (entweder direkt oder indirekt) einer Komplexbildung zwischen dem virulenten Armenia-Virus und löslichem
CD172a. Im Gegensatz dazu resultierte die Infektion von Monozyten mit Armenia, jedoch nicht mit Estonia, in einem deutlichen Oberflächenverlust von porzinem SLA I, welches für die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T-Zellen essentiell ist. Weitere Versuche zeigten einen Reifungsdefekt von SLA I, der mit dem Abbau funktioneller ER-Strukturen und der Induktion von ER-Stress in Armenia-infizierten Monozyten in Zusammenhang stand. Gleichzeitig wurde eine deutlich reduzierte Überlebensfähigkeit Armenia-infizierter Monozyten beobachtet, die mit einem Verlust mitochondrialer Funktionen und der Bildung von Aggresomen aus fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma einherging. Vertiefende Analysen dazu zeigten einen Caspase-3 aktivierten Zelltodmechanismus und ein infektionsbedingtes, progressives Abschalten der Proteintranslation in Armenia-infizierten Zellen. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen den beobachteten
Subversionsmechanismen und der Expression bestimmter viraler MGF-Gene zu finden,
wurden weitere ASPV-Stämme in die Untersuchungen zur CD172a- und SLA I-Oberflächenexpression einbezogen. Ähnlich wie Armenia zeigte sich auch für die Stämme
NHV und OURT88/3 eine deutliche Reduktion der SLA I-Oberflächenlevel, auch wenn diese
in vivo gering-virulent sind. Andererseits zeigte das hochvirulente Benin97/1-Isolat im Gegensatz zu Armenia keine SLA I-Subversion, sondern ähnlich wie nach Estonia-Infektion kaum veränderte SLA I-Level, was vermuten lässt, dass der SLA I Subversionsmechanismus nicht alleinig den Virulenzgrad der ASPV-Stämme bestimmt. Ein direkter Genomvergleich identifizierte verschiedene Mitglieder der MGF110- und MGF505-Gene als möglicherweise beteiligte virale Genkandidaten. Im Gegensatz hierzu ergaben sich keine detektierbaren Unterschiede bei den Analysen zur Oberflächensuppression von CD172a innerhalb der verwendeten Isolate, wie bereits bei Armenia und Estonia Infektion beobachtet. Interessanterweise beobachteten wir dabei das Vorhandensein von MGF110-14 als eine genomische Gemeinsamkeit, die für die generelle Oberflächenreduktion von CD172a, zusätzlich zu anderen Genen, die ein Shedding und die Armenia-spezifische Interaktion bestimmen könnten, verantwortlich sein könnte.
Insgesamt zeigen die Resultate dieser Arbeit erstmals, dass das virulente ASPV Armenia, anders als das attenuierte ASPV Estonia, einen ausgeprägten Funktions- und Vitalitätsverlust in seinen primären Zielzellen (z. B. Monozyten) bewirkt. Die gesteigerte Infektiosität, Induktion von zellulärem Stress und Beeinträchtigung der SLA I-vermittelten Antigenpräsentation werden in infizierten Schweinen eine entscheidende Rolle in der Virus-Verbreitung und der Immunevasion spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Befunde dieser Arbeit neue und vertiefte Einblicke in die zellulären Mechanismen der SLA I- und CD172a-Subversion im Zusammenhang mit der Immunevasion durch hoch-virulentes ASPV Armenia und attenuiertes ASPV Estonia gibt und zudem wichtig für das bessere Verständnis der ASP-Immunpathogenese sind.
Obwohl der Myokardinfarkt eine der häufigsten Todesursachen überhaupt ist, sind die zellulären und molekularbiologischen Pathogenesemechanismen und seine Therapiemöglichkeiten nicht ausreichend untersucht. Es ist bekannt, dass die Entzündungsreaktion für die Folgen eines Myokardinfarkts eine große Rolle spielt. In dieser Arbeit wurde ein Modell zur näheren Untersuchung grundlegender intrazellulärer und interzellulärer Mechanismen dieser Entzündungsreaktion entworfen. Es wurde ein in vitro Kokultursystem zwischen mononukleären Zellen (MNC) und Kardiomyozyten (H9c2 Zellen) etabliert. Damit konnten nicht nur bisher unbekannte Zellmechanismen aufgezeigt, sondern auch ein Modell zum Screening neuer therapeutischer Substanzen im Rahmen eines Myokardinfarkts entwickelt werden. So können beispielsweise neue Wirkstoffe für den Patienten sicherer gestaltet werden. Dieses Modell wurde durch die Simulation vieler bereits in vivo beschriebener Befunde im Rahmen eines Myokardinfarkts verifiziert. Dazu zählen die Verstärkung der Expression von ICAM‑1 auf Herzzellen sowie eine Erhöhung von ICAM‑1 und LFA‑1α auf MNC. Diese Befunde konnten mit dem entwickelten in vitro Kokultur‑Modell in Bezug auf Lymphozytensubpopulationen differenziert werden. Zusätzlich wurden Aussagen über LFA‑1α speziell auf B- und T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen, über MHC Klasse I und II auf T‑Lymphozyten sowie auf H9c2 Zellen und über den Aktivierungsgrad der T‑Lymphozytensubopulationen getroffen. Durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen kommt es zu Veränderungen von Oberflächenstrukturen auf beiden Zelltypen. Es kann von einem erhöhten Aktivierungszustand der MNC nach der Kokultur ausgegangen werden, da die Expressionsdichte von Aktivierungsmarkern (IL‑2 Rezeptoren, MHC Klasse II) auf MNC durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen erhöht war. Die verstärkte Expression von ICAM‑1, LFA‑1α, MHC Klasse I und MHC Klasse II auf H9c2 Zellen sowie die erhöhten prozentualen Anteile an CTL und T‑Helferzellen und die erhöhten Expressionen von LFA‑1α und ICAM‑1 auf MNC durch die Kokultur lassen auf eine Interaktion zwischen mononukleären Zellen und Kardiomyozyten schließen. Insbesondere die Ergebnisse aus den an den H9c2 Zellen adhärierten MNC verstärken diesen Aspekt. Es gibt verschiedene Interaktionsmöglichkeiten zwischen MNC und H9c2 Zellen. Einerseits ist die Rezeptorbindung zwischen LFA‑1α auf MNC oder H9c2 Zellen und ICAM‑1 auf Kardiomyozyten oder MNC wichtig, andererseits spielt die Rezeptorbindung über MHC Klasse I/CD8 beziehungsweise über MHC Klasse II/CD4 eine Rolle. Durch die Kokultur wurde die erhöhte Produktion und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und löslichen Mediatoren für TNF‑α, IL‑6 und NO gezeigt. Da H9c2 Zellen unter Kontrollbedingungen kein TNF‑α in das Kulturmedium freisetzten, wird deutlich, dass die gemessene erhöhte Menge an TNF‑α nach der Kokultur von MNC stammte. Andererseits konnte nicht geklärt werden, ob das erhöhte IL‑6 durch die MNC oder durch die H9c2 Zellen produziert wurde, da sowohl MNC als auch H9c2 Zellen in der Kultur unter Kontrollbedingungen geringe Mengen an IL‑6 freisetzten. Es muss davon ausgegangen werden, dass die erhöhte IL‑6 Konzentration aus der infolge der Kokultur vermehrten Produktion beider Zelltypen hervorgegangen ist. Aufgrund dessen, dass besonders IL‑6 für die Induktion der Expression von ICAM‑1 verantwortlich ist, scheint eine Signaltransduktion zwischen MNC und H9c2 Zellen von TNF‑α über IL‑6 und ICAM‑1 wahrscheinlich. H9c2 Zellen sowie MNC sezernieren unabhängig von der Kulturzeit eine geringe NO Menge, die durch die Kokultur gesteigert wurde. Durch eine längere Kokulturzeit wurde quantitativ nicht mehr NO sezerniert als bereits nach 24 Stunden, sodass geschlussfolgert werden kann, dass die NO Freisetzung besonders in der frühen Inflammationsphase eine Rolle spielt. Da IL‑6 erst verzögert nach 48 Stunden Kokultur verstärkt freigesetzt wird, TNF‑α aber bereits nach 24 Stunden ein Maximum im Kulturüberstand erreichte, wird die Induktion der NO Freisetzung eher auf TNF‑α oder andere proinflammatorische Zytokine, nicht aber auf IL‑6 zurückzuführen sein. Es ist nicht bekannt, ob NO durch IL‑6 induziert werden kann. Mit Hilfe durchflusszytometrischer und molekularbiologischer Auswertung konnte ein lokales RAS in den MNC nachgewiesen werden. In der mRNA Analyse wurden sowohl AT1AR als auch AT1BR detektiert. Ebenso wurde in den MNC der F344 Ratten mRNA für Angiotensinogen, AT2 Rezeptoren, ACE, Renin und Exon 1A Renin nachgewiesen. Renin, AOGEN und ACE von sMNC, die mit Hilfe einer quantitativen PCR untersucht wurden, werden durch die Kokultur von MNC und H9c2 Zellen signifikant vermindert. Der Anteil AT1R positiver Zellen verminderte sich durch die Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen und die AT2 Rezeptordichte auf sMNC und speziell auf T‑Lymphozyten erhöht sich. Jedoch spiegelt die Kokultur nicht in allen Parametern die Aktivierung des lokalen RAS innerhalb der nicht adhärierten MNC wieder. Die adhärierten MNC waren für die PCR Untersuchung nicht zugänglich. Es bleibt offen, inwieweit es zur Aktivierung des lokalen RAS in MNC durch die Kokultur kommt. Da sowohl sMNC als auch PBMC über alle RAS-Komponenten zur Generierung von ANG II verfügen, kann geschlussfolgert werden, dass sie ein lokales Renin‑Angiotensin‑System besitzen. Es können durch die Kokultur bedingte Veränderungen hinsichtlich der Oberflächenexpression einiger Strukturen durch den Einsatz von spezifischen Hemmstoffen des RAS vermindert oder aufgehoben werden. Dieser Effekt ist ein Indikator dafür, dass das lokale RAS in der Kokultur von MNC mit H9c2 Zellen eine wichtige Rolle spielt. Beispielsweise verminderte der AT1 Rezeptorblocker DUP753 signifikant den prozentualen Anteil an LFA‑1α und ICAM‑1 exprimierenden T‑Lymphozyten. Zusätzlich kam es zur Verminderung der Dichte von MHC Klasse II Oberflächenmolekülen auf T‑Lymphozyten und der IL‑2 Rezeptordichte auf CTL gegenüber den ohne Inhibitor kokultivierten Zellen. Diese Befunde lassen auf einen geringeren Aktivitätszustand der MNC und auf eine schwächere Interaktion zwischen MNC und H9c2 Zellen durch Behandlung mit einem AT1 Rezeptorblocker schließen. Dies ist ein Indiz dafür, dass das lokale RAS der MNC in der Kokultur von MNC und H9c2 Zellen aktiviert wird. Im Gegensatz dazu lässt sich die durch die Kokultur bei H9c2 Zellen induzierte Apoptose und Nekrose durch AT1R und AT2R Blockade nicht verhindern. Dieses Modell ist geeignet, zelluläre und molekulare Prozesse des Myokardinfarkts zu simulieren. Es könnte künftig ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelscreenings der Herzinfarkttherapie darstellen und als Grundlage für weitere Studien in der Behandlung des Myokardinfarktes dienen. Zur Optimierung dieses Modells sollte eine Methode etabliert werden, die es ermöglicht, die adhärierten MNC von den H9c2 Zellen zu trennen, um sie molekularbiologisch untersuchen zu können.
The order of bats (Chiroptera) account for ~20% of all mammalian species and attracted immense global attention due to their identification as important viral reservoir. Bats can harbour a plethora of high-impact zoonotic viruses, such as filoviruses, lyssaviruses, and coronaviruses without displaying clinical signs of disease themselves. Given this striking diversity of the bat virome, their ability of self-powered flight, and global distribution, understanding chiropteran immunity is essential to facilitate assessment of future spillover events and risks.
However, scarcity of bat-specific or cross-reactive tools and standardized model systems impede progress until today. Furthermore, the richness of species led to generation of isolated datasets, hampering data interpretation and identification of general immune mechanisms, applicable for various chiropteran suborders/families. The key to unlocking bat immunity are coordinated research approaches that comprehensively define immunity in several species. In this work, an in-depth study of innate and adaptive immune mechanisms in the fructivorous Egyptian Rousette bat (Rousettus aegyptiacus, ERB) is presented.
Detailed stability analyses identified EEF1A1 as superior reference gene to ACTB, and GAPDH, which rendered unstable upon temperature increase or presence of type-I-IFN. Since the body core temperatures of pteropid bats reach from 35°C to 41°C and it has been postulated that bats display constitutive expression of IFNs, a suitable reference gene has to be stable under these physiologically relevant conditions. To study cellular innate immunity in detail, cell lines from the nasal epithelium, the olfactory compartment and the cerebrum were generated. To include immune responses of epithelia cells, essential for immunity at sites of primary viral infection, primary epithelia cells from the nasal epithelium, trachea, lung and small intestine were generated. Cellular identities were determined by comprehensive analyses of transcripts and proteins expressed by each cell line. The capacity of each cell line to produce type-I- and III-IFNs was assessed at 37°C and 40°C upon stimulation with viral mimetics. This revealed cell type-dependent differences is the capability to express IFNs upon stimulation. Furthermore, the constitutive expression of type-I- and III-IFNs was significantly elevated in higher temperatures and quantified at mRNA copy levels. To characterize ERB innate immunity upon infection with high-impact zoonotic viruses, cells from the nasal epithelium, the olfactory system, and the brain were infected with several lyssaviruses. This revealed striking differences in susceptibility: cells from the nasal epithelium rendered least whereas cells from the olfactory epithelium rendered most susceptible to viral infection and replication. Additionally, due to a lack of IFN expression in infected cells, it could be shown that LBV possibly possesses advanced strategies to ensure successful replication in ERB cells. Since the current SARS-CoV-2 pandemic put bats even further in the focus of zoonotic research, primary epithelial cells and animals were infected with this virus to monitor ERB-specific immune transcripts in cells and tissues. These studies revealed a notably early IFNG expression in the respiratory tract of infected individuals.
To understand immunomaturation in bats, the immune cell landscape in periphery and various tissue in adult and juvenile ERB was analyzed by flow cytometry and scRNA-seq, revealing intriguing, age-dependent variations in the abundance of granulocytes and lymphocytes. Flow cytometry revealed a significantly higher number of granulocytes in adults, as well as higher numbers of B cells in juveniles. scRNA-seq allowed detailed identification of different leukocyte subsets, uncovering the presence of highly-abundant NKT-like cells and a unique PLAC8 expressing B cell population. A functional characterization of phagocytic cells and lymphocytes derived from adult and juvenile ERB revealed no significant differences in cellular functionality.
In conclusion, the presented work demonstrated suitability of all established ERB cell lines to study bat immunity in vitro, which led to striking findings regarding IFN expression at steady state, or upon stimulation or viral infection. In addition, established qRT-PCR protocols allowed definition of constitutive and temperature-dependent elevation of IFN expression magnitudes, as well as insights into expression of immune-related transcripts in SARS-CoV-2 infected ERB. Finally, based on optimized scRNA-seq technologies and flow cytometry, frequencies and absolute cell counts could be determined in ERB of different ages, revealing e.g. age-dependent variations in leukocyte profile compositions.
Multiple sclerosis (MS) and stroke share a number of mechanisms of neuronal damage. In both cases the balance between neurodestruction and neuroprotection appears modulated by the function of the adaptive immune system. MS is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), leading to permanent disability. It seems certain that an autoimmune response directed against the CNS is central to the pathogenesis of the disease. While these CNS-specific T cells are activated in MS patients, they are inactive and naive in healthy. Therefore it is believed that an activation of autoreactive T cells by cross-reactivity with pathogens occurs outside of the CNS. In consequence T cells express adhesion molecules and proteinases which enable them to cross the blood-brain barrier. In stroke, however, the blood-brain barrier is disturbed in its integrity caused by the decreased blood flow. Cells can freely migrate from the periphery into the brain. CNS autoreactive cells from the periphery can be activated within the CNS and thus contribute to further tissue damage. While the local autoimmune response remains temporary in stroked brains, it is chronically destroyed in MS. The differences between the underlying mechanisms are not understood. This thesis investigated T cell responses in Multiple Sclerosis in response to the therapeutics Mitoxantrone and IFN-b. The induction of a TH1 to TH2 cytokine response appears to be a shared mechanism of action between both therapeutic agents. Primarily the post stroke immune response was investigated. Patients developed a stroke induced immune suppression characterized by monocytic dysfunction and lymphocytopenia explaining the high frequency of post stroke infections. Moreover early post stroke predictors of subsequent infections, like the CD4+ T cell count, were identified. The T cell response of stroke patients appeared primed to proinflammation and unsuppressed after mitogen stimulation. A detailed understanding of post stroke immune alterations may offer new avenues of intervention to improve the clinical fate of stroke victims. In addition, such knowledge could also further our understanding of Multiple Sclerosis, because, while increasing the infection risk, the dampening of the immune system could have an important protective function, if it limits autoimmune brain damage triggered by the massive release of brain antigens during stroke. If these two pathways could be modulated separately it would create the opportunity to develop distinct therapeutic approaches that inhibit autoimmunity and strengthen antibacterial defenses. To further delineate these mechanisms it is crucial to investigate the role of the innate immune system as compared to the adaptive immune system in stroke induced immune suppression.
The study of host-pathogen interactions is central to a better understanding of the human microbiome, infections and the inner workings of immune cells. One focal point of this research is how the human immune system recognises both harmful and harmless antigens, integrates the resulting signals and forms a response, and how, conversely, microbes can manipulate this reaction.
In this thesis, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), a critical pathogen in chronic and nosocomial infections, was in the focus. The aim was to search for bacterial proteins that favour a type 2 immune response, as it is orchestrated by CD4+ type 2 T helper cells (Th2 cells). The humoral arm of a type 2 response is dominated by IgG4 and IgE. Such immune responses are typically directed against multicellular pathogens like helminths and other parasites. However, type 2 immune responses are suboptimal for the defence against extracellular bacteria like P. aeruginosa. Previous research suggests that some bacterial proteins may promote a switch to such an insufficient immune response as a mechanism of immune evasion.
To optimise the sensitivity of the search for type 2 response inducing proteins of P. aeruginosa, cystic fibrosis (CF) patients were studied, as many are exposed to the pathogen in their airways over prolonged time periods. As such, the humoral immune response of 9 CF patients to their own P. aeruginosa strain was examined. For this, the secretomes of 9 clinical P. aeruginosa isolates from CF patients and the P. aeruginosa reference strain PAO-1 were studied by 2D-immunoblotting for their ability to be bound by IgG4 and IgG1 from respective patient sera. IgG4 served as a proxy for IgE, as assays analysing IgE binding suffer from low sensitivity because of low serum concentrations of IgE. Antibody reactive P. aeruginosa proteins were then identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry and the results were compared with proteomics data from literature.
In total, 308 distinct protein spots were analysed. These belonged to 17 bacterial proteins, which comprise the entire known P. aeruginosa secretome. Of these spots, 232 were bound by IgG4, and 24 by IgG1 only. Notably proteases like serralysin and P. aeruginosa elastase presented with an IgG4 bias. This is concordant with previous research linking proteases to a type 2 immune response. Moreover, structural proteins like
agellins were also immunodominant. Flagellins are known as common targets of immune detection in bacteria. These proteins also demonstrated a clear IgG4 bias.
Thus, the search for secreted P. aeruginosa proteins that elicit an IgG4-dominated antibody response was successful. It remains to be shown whether these bacterial proteins are also recognized by IgE and Th2 cells, meaning whether they are truly driving a type 2 immune response in CF patients. It is also an open question whether the observed IgG4 bias in the antibody response to the exoproteome of P. aeruginosa is specific to CF or a general feature of the human immune response to the pathogen.
Viral diseases are a threat to bacteria and enormous animals alike. Vaccines are available against several viruses. However, for some viruses, like ASFV, we still lack vaccines, while for others, like IAV, they are not as effective as we need them to be. To a large extent, this is because we do not fully understand the mechanisms conferring antiviral immunity. To improve our understanding of antiviral immunity, we used a model species that is in many immunological aspects closer to humans than the widely used laboratory mice, pigs. In this thesis, pigs were investigated as a potential biomedical model species for viral respiratory infections in humans and as a natural host for viral infections. Both approaches provide valuable insights into aspects of porcine immunology that can either be used as the foundation for translational research or for the design of targeted therapeutics and vaccines for pigs.
Insights into fundamental characteristics of the porcine immune system form the basis for translational studies. Paper I pioneered a detailed characterization of porcine iNKT cells. To make pigs and porcine iNKT cells more available for scientific investigations, we established multicolor flow cytometry analysis platforms that allow for a more detailed investigation of these cells than previously possible. We found porcine iNKT cells circulating in peripheral blood to be a rare population among CD3+ lymphocytes that displays a pre-activated effector state and can be divided into at least three functional subsets. Upon antigenic activation, they proliferated rapidly, secreted pro-inflammatory cytokines, and exerted cytotoxicity. Moreover, we provided first evidence for a role of iNKT cells in porcine IAV and ASFV infections, which we investigated in more detail in paper IV. Central characteristics, i.e., phenotype and functional properties, exhibit a high degree of similarity between humans and pigs. Moreover, differences between human and murine iNKT cells are more pronounced than between humans and pigs.
Based on the results obtained in paper II, the established biomedical model could be used for further studies of infectious respiratory diseases. IAV infections pave the way for secondary co-infections with increased morbidity and lethality. These bactoviral co-infections are a threat to both pigs and humans. The shared susceptibility as well as homologies on the physiological and immunological level make pigs exceptionally suitable animal models for studies of these infections. Paper I and II can also be interpreted under translational aspects. Activation of iNKT cells in porcine vaccination studies showed promising results. Based on these and our findings, this might be a suitable approach for humans as well. Along with other studies, our results suggest that pigs might be a well-suited large animal model for research in infectious diseases. This is true especially for respiratory infections, such as seasonal IAV infections, for which pigs are natural hosts and contribute to viral spread and emergence as “mixing vessels”, which can result in pandemic strains like H1N1pdm09. We could show that porcine iNKT cells as well as the antiviral responses of cTC against H1N1pdm09 in pigs are comparable to human cells and processes. The increased implementation of pigs in basic and applied research might enable an improved translation of scientific knowledge to human and veterinary medicine.
In two further studies, papers III and IV, we investigated T-cell responses during a viral infection, ASF, for which pigs are the only natural hosts. Immune responses were similar after highly and moderately virulent ASFV infection in domestic pigs and wild boar, respectively. However, they differed between both species. Antiviral immunity in domestic pigs was predominantly exerted by αβ T cells, CD8α+ and DP αβ T cells, while the response in wild boar was dominated by γδ T cells, mainly CD8α+ effector cells. Since wild boar show a higher disease severity and lethality, even during infection with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, a shift to γδ T cells seems to be detrimental. In contrast, domestic pigs survive infections with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, which indicates that CD8α+ or DP αβ T cells confer protection at least in infections with non-highly virulent ASFV strains. Interestingly, in paper V we found higher and prolonged inflammation in domestic pigs, correlating with increased T-cell influx. However, histopathological analyses revealed no direct explanation for the differences in disease progression and lethality in domestic pigs and wild boar. These findings require further studies to elucidate the underlying mechanisms.
The lack of basic data about immunological differences between domestic pigs and wild boar hampers attempts to understand immunity against ASFV. We found differences between both suid subspecies already at steady state and even more prominent during ASFV infections in papers III-V. Most apparently, T-cell responses in wild boar were heavily biased towards γδ T cells, while immune responses in domestic pigs were based on αβ T cells. However, information about even basic characteristics, like the composition, phenotypes, and functional qualities of wild boar’s immune system, is missing. Therefore, essential baseline data must be obtained in order to adequately assess changes in future studies.
Analyses like these reveal major advantages of pigs as a biomedical model. On the one hand, similar to conventional model species, researchers can investigate every tissue at any desired time. Tissue from human patients is often scarce or not at all available, so models that can be investigated at specific times after infection are needed. On the other hand, results obtained in pigs are more comparable to humans than data from murine studies. Moreover, pigs are susceptible to similar pathogens as humans and experimental infections can be investigated without the need for major genetic manipulations. However, there are also limitations of the porcine model system. Analysis tools are not as advanced as they are for mice, especially in terms of availability of mAbs or genetically modified organisms. Still, given the major advantages that become more and more obvious, efforts should be made to make pigs more applicable for basic and translational research. In addition, findings derived from pigs can be used for the species itself. Pigs are a major livestock species and new treatments, or vaccines could also be used for them. Therefore, this research could eventually also improve animal welfare.
In summary, the presented thesis significantly enhanced our knowledge of porcine immune processes for cTC in general and iNKT cells in particular. Results were obtained both at steady state and in the context of IAV and ASFV infections, and thus, made pigs more available as a model for future research. The use of multicolor flow cytometry provided a broad overview of the ongoing immune reactions and enables further, more wide-ranging studies that can also address open questions in even more complex infection scenarios.
IL-21 gehört zur Gruppe der proinflammatorischen Zytokine und ermöglicht als lös-licher Botenstoff eine Interaktion zwischen verschiedenen Zellen innerhalb des Im-munsystems. Unlängst wurde die Rolle von IL-21 bei der Entstehung von Autoim-munerkrankungen beschrieben. Dabei kommt es zur Fehlregulation des Immunsys-tems, so dass infolge körpereigene Strukturen bekämpft werden. Während einer Schwangerschaft kommt es zu umfassenden Anpassungsvorgängen innerhalb des Immunsystems, wobei mögliche Fehlregulationen sowohl für die Mutter als auch für den Fötus verschiedene Komplikationen mit sich bringen kann. Inwieweit IL-21 in-nerhalb dieser Vorgänge und letzten Endes für den erfolgreichen Ausgang einer Schwangerschaft von Bedeutung ist, ist bislang unbekannt und ist Gegenstand der in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungsergebnisse.
Die Ergebnisse lassen erkennen, dass B-Zellen der verschiedenen Mausgruppen (NPM=nicht schwanger, GPOM=normale Schwangerschaften und PPOM=komplizierte Schwangerschaften) unterschiedlich sensibel auf IL-21 reagie-ren. Diese Beobachtung fußt auf unterschiedlicher Verteilung des IL-21R. Demnach exprimieren B-Zellen der GPOM-Gruppe niedrigere Level an IL-21R, deren Beein-flussung durch das Zytokin IL-21 als gering zu beurteilen ist und deshalb nachfol-gend relativ seltener in die Apoptose eintreten. Die größten Differenzen bezüglich der Rezeptorexpression konnten innerhalb der MZ B-Zellen beobachtet werden. MZ B-Zellen wird bereits in früheren Arbeiten eine wichtige Rolle für eine erfolgreiche Schwangerschaft zugeschrieben.
Mittels immunologischer Methoden wurde weiterhin die Produktion von IL-10 unter-sucht, die bei GPOM am höchsten war. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass in dieser Situation B-Zellen sich durch eine Herunterregulierung ihrer IL-21R dem Ein-fluss des Zytokins entziehen und nachfolgend für eine vermehrte Produktion von IL-10 zur Verfügung stehen. Auch IL-10 konnte bereits als ein für eine erfolgreiche Schwangerschaft förderlicher Faktor identifiziert werden.
Als mögliche Quelle von IL-21 und aufgrund der räumlichen Nähe zu den MZ B-Zellen wurden Tfh-Zellen mittels Durchflusszytometer analysiert. Hierbei wurde festgestellt, dass diese Zellen gehäuft in der PPOM-Gruppe vorkommen, wodurch auch diese T-Zell Subpopulation für den Ausgang einer Schwangerschaft mit ver-antwortlich sein kann. Alle Ergebnisse dieser Arbeit sprechen in der Zusammen-schau dafür, dass es zu einer Reduktion des IL-21/IL-21R-Systems kommen muss, um einen erfolgreichen Ausgang der Schwangerschaft zu gewährleisten. Aus die-sem Grund sollte auf der einen Seite das IL-21/IL-21R-System verstärkt in den Fo-kus künftiger Forschung rücken und auf der anderen Seite ist gleichzeitig eine Er-weiterung des für eine Schwangerschaft bestehenden Th1/Th2/Th17/Treg Para-digmas um Tfh-Zellen angezeigt.
Die immunologische Dysfunktion nach operativem Trauma und der Einfluss des N. vagus im Mausmodell
(2024)
Trotz aller medizinischen Fortschritte der letzten Jahrzehnte ist der Einfluss operativer Trauen auf die Immunhomöostase noch weitgehend unklar. Im Falle septischer Komplikationen sind postoperative Patienten meist mit einer noch höheren Mortalität assoziiert als septische Patienten ohne ein vorhergehendes operatives Trauma. Einen Grund dafür stellt die postoperative Immundysfunktion dar, welche von Länge und Ausmaß der Operation abhängt. Die pathophysiologischen Hintergründe sind noch unbekannt und erscheinen traumaspezifisch. Um diese einer näheren Betrachtung unterziehen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe das Tiermodell der Surgically induced Immune Dysfunction (SID) etabliert. Dafür wird zur Simulation eines abdominalchirurgischen Eingriffs der Dünndarm nach einer medianen Laparotomie dreimal antegrad ausgestrichen. Einen möglichen Baustein zum Verständnis dieser Immundysfunktion stellt die Entdeckung des cholinergen antiinflammatorischen Signalweges (CAIP) dar. Über diesen ist das Zentralnervensystem via den Nervus vagus in der Lage, immunmodulatorisch einzuwirken. Ziel der Arbeit war es, aufgrund dessen unter anderem den systemischen Einfluss des CAIP auf die postoperative Immundysfunktion zuuntersuchen. Dafür wurden einige Versuchstiere sechs Tage vor SID einer Vagotomie unterzogen. Die Analysen erfolgten nach sechs Stunden und drei Tagen.
Zusammenfassend konnte sechs Stunden nach SID eine Akut-Phase-Reaktion beobachtet werden, die durch eine Neutrophilie, Lymphopenie, erhöhte IL-6-Konzentrationen und komplett aktivierte T-Lymphozyten gekennzeichnet war. Gleichzeitig zeigten sich aber auch eine erhöhte IDO-Aktivität und eine reduzierte LPS-Stimulierbarkeit von Blut- und Milzzellen. Diese gedämpfte Immunreaktion auf den in-vitro second hit schlug bemerkenswerterweise nach drei Tagen in eine Hyperreagibilität und damit in einen hyperinflammatorischen Phänotyp um. Gleichzeitig reduzierte sich die Anzahl von Teff- und B-Lymphozyten, während zeitgleich eine relative Treg-Expansion mit gesteigerter CTLA-4-Expression nachweisbar war. Diese Steigerung immunsuppressiver Mechanismen und dergleichzeitige Verlust an Effektorzellen könnte im Falle eines nachfolgenden second hit zu der beobachteten gesteigerten Mortalität postoperativer Patienten beitragen. Wurde vor der SID eine Vagotomie durchgeführt, fiel die Inflammation sechs Stunden später noch intensiver aus: Die Neutrophilie war stärker ausgeprägt und die Konzentration von proinflammatorischen Zytokinen im Plasma war erhöht. Die reduzierte LPS-Stimulierbarkeit von Blut- und Immunzellen wurde im Wesentlichen aufgehoben. Nach drei Tagen verstärkte eine Vagotomie die bereits nach SID beobachtete Hyperreagibilität auf den LPS-Stimulus noch weiter.
Somit lassen diese Ergebnisse auf einen wichtigen immunsuppressiv wirkenden vagalen Einfluss auf die postoperative Immundysfunktion schließen und zeigen einen vielschichtigen zeitlichen Verlauf von Anti- und Hyperinflammation nach operativem Trauma auf. Eine nähere Erforschung dieses multiphasischen Verlaufs kann Implikationen für die klinische Praxis, insbesondere im Bezug auf Re-Operationen geben. Auch eröffnet es die spannende Frage, ob das Immunsystem auf einen postoperativen septischen Fokus in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand zur Operation unterschiedlich reagiert. Nicht zuletzt wird durch die Ergebnisse auch ein wichtiges Schlaglicht auf die Bedeutung von traumareduzierenden Operationsverfahren wie der minimal-invasiven laparoskopischen Chirurgie für das postoperative Outcome geworfen.
Pregnancy involves adaptations of the cellular composition in utero to establish a functioning fetal-maternal interface. Different subsets of leukocytes populate the endometrium and contribute to tolerance of the fetal allograft while protecting it from potentially threatening infections or rejection. ¬¬Innate lymphoid cells are recently discovered immune cells that, besides the gut, lung and skin, possess immunoregulatory functions in the female reproductive tract, especially during gestation. Although present at the fetal-maternal interface, the dynamics of ILC migration during pregnancy remains poorly investigated. The involvement of homing receptors in ILC migration to the uterus was the main subject of the present work.
First, the expression of homing receptors on ILCs from miscellaneous organs was assessed across the course of murine pregnancy in vivo by means of flow cytometry. Then, their migratory capacity towards pregnancy-relevant chemokines was investigated in vitro. The impact of pregnancy related hormones on the migration and homing of ILCs was then analysed in vitro via migration assays.
The results confirm altered proportions of ILCs in utero and the altered expression of homing receptors in ILCs in pregnancy. Different murine lymphoid organs showed augmented expression of chemokine receptors and decreased levels of homing integrin α4β7 in the first trimester, suggesting enhanced migration patterns of ILCs during early pregnancy. Subsequently, migration assays were used to demonstrate the role of different chemokine ligands in enhancing ILC migration.
Eventually, the alterations in homing receptor expression were correlated with female pregnancy hormones. Progesterone treatment caused similar effects on homing receptor expression in ILCs as observed during early gestation. These results represent the first study evaluating the effect of sex steroid hormones on ILC chemokine receptor distribution.
Taken together, our results indicate the involvement of pregnancy-relevant chemokines, including CCL4, CCL20 and CCL28, in the recruitment of ILCs to the uterus during pregnancy. The data highlight an endocrinological-immune crosstalk in the regulation of ILC homing to the female reproductive tract. Gestation alters chemokine receptor expression in order to regulate the access of immune cell subsets to the fetal-maternal interface. An adequate regulation is highly needed, as a lack or abundance of different subgroups could result in pregnancy complications, including fetal loss, pre-eclampsia or pre-term birth. Thus, the role of ILC chemotaxis to the pregnant uterus and its regulation are of interest in the understanding, prevention and treatment of the clinically relevant obstetric diseases.
Der Erreger des Q-Fiebers ist C. burnetii, ein zoonotisches intrazelluläres Bakterium. Die Gram-negativen Coxiellen kommen in zwei verschiedenen antigenen Lipopolysaccharid (LPS)-Formen vor: als virulente Ph I-LPS- und/oder avirulente Ph II-LPS-Bakterien. C. burnetii wird durch Kontakt mit infizierten Tieren sowie infektiösen Stäuben übertragen. Akute fiebrige Infektionen können beim Menschen im weiteren Verlauf eine Pneumonie oder Hepatitis auslösen. Zu einem geringen Prozentsatz entstehen chronische Infektionen mit persistierenden Coxiellen. Eine C. burnetii-Infektion bewirkt sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort. Neben Monozyten und Makrophagen dienen auch dendritische Zellen (DCs) den Coxiellen als geeignete Wirtszellen. DCs gehören zu den Immunzellen der first-line-of-defense des angeborenen Immunsystems und treten während einer Coxiellen-Infektion ebenso wie die mit ihnen kooperierenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) früh mit dem aufgenommenen bakteriellen Pathogen in Kontakt. Durch Antigenpräsentation infizierter DCs wird die für die anti-Coxiellen Abwehr maßgebliche T-Zell-Immunität initialisiert und die nachgeschaltete Immunantwort funktional ausgerichtet.
Trotz dieser zentralen Immunfunktion sind die zellulären Vorgänge von DCs während einer C. burnetii-Infektion, insbesondere mit Blick auf die zelluläre Selbstverteidigung gegenüber den vermutlich initial auftretenden Ph II-LPS-Varianten, nicht ausreichend verstanden. Zudem ist bisher nicht hinreichend geklärt, welchen Einfluss FN-γ, das von aktivierten NK-Zellen produziert wird, sowie die Sauerstoffumgebung auf die zelluläre Abwehr infizierter APCs nimmt.
Das Forschungsziel dieser Promotionsarbeit war es daher, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Coxiellen-Infektionen von DCs und NK-Zellen zu erhalten und hierbei insbesondere die IFN-γ-Wirkung auf die DC-Pathogen-Wechselwirkung sowohl unter norm- als auch hypoxischen Bedingungen zu untersuchen.
Die im ersten Teil der Promotionsarbeit durchgeführten zellbiologischen, immunologischen und proteinbiochemischen Analysen im murinen Zellsystem belegen eine pathogenausgelöste Subversion der funktionalen Aktivierung/Induktion der MHC I-Antigenpräsentation Coxiellen-infizierter DCs. Die infektionsbedingte Beeinträchtigung der MHC-Antigenpräsentation infizierter DCs lässt sich in direkter Weise auf einen autokrinen Suppressionseffekt des αVβ8-Integrin-aktivierten TGF-β und nicht auf die subversive Wirkung von Coxiellen-LPS als Virulenzfaktor zurückführen. Untersuchungen im Zusammenhang mit IFN-γ zeigen, dass dieses Zytokin in infizierten DCs eine Wiederherstellung der MHC I-Induktion und -Oberflächenexpression bewirkt, welche mit einer funktionalen Prozessierung und MHC-Präsentation pathogener Peptidantigene verbunden ist. Weitere Studien belegen zudem, dass IFN-γ-behandelte DCs in der Lage sind, die Etablierung/Vermehrung intrazellulärer Coxiellen negativ zu beeinflussen. Die durchgeführten siRNA- und CRISPR/Cas9-Experimente zeigen, dass die zelluläre Selbstverteidigung infizierter DCs maßgeblich durch das IFN-γ-induzierbare iNOS/NO-System vermittelt wird. Als reaktives Stickstoffradikal scheint Stickstoffmonoxid (NO) sowohl Komponenten der bakteriellen Elektronentransportkette als auch die autophagische Ausbildung und Integrität parasitophorer Vakuolen zu beeinträchtigen. Parallel hierzu schützen sich infizierte DCs über einen metabolischen Wechsel zur aeroben Glykolyse vor mitotoxischer NO-Wirkung und sichern so während der intrazellulären Coxiellen-Eliminierung ihr eigenes Überleben.
Weitere Untersuchungen dieser Arbeit belegen zudem, dass auch C. burnetii zu einer entsprechenden Gegenwehr fähig ist. Um der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs entgegenzuwirken, induzieren Coxiellen zur Minderung antibakterieller Radikal-Effekte ihre Cytochrom bd-, Katalase- und SOD-Expression. Infektionsstudien mit T4SS-defekten Coxiellen weisen ferner darauf hin, dass das bakterielle Sekretionssystem vermutlich eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs spielt, da sich Coxiellen ohne intaktes T4SS offensichtlich dem negativen NO-Einfluss entziehen und/oder keine entsprechenden Angriffsziele für NO bieten. Studien C. burnetii-infizierter Makrophagen bestätigen, dass das iNOS/NO-System eine essenzielle antibakterielle Selbstverteidigung von APCs darstellt. So zeigen auch Makrophagen eine deutliche Beeinträchtigung intrazellulärer Coxiellen-Vermehrung unter iNOS-vermittelter NO-Synthese. Die im weiteren Verlauf der Arbeit untersuchten norm- und hypoxischen Infektionsmodelle infizierter DCs lassen vermuten, dass hypoxische Kulturbedingungen die Coxiellen dazu veranlassen, ein sporenähnliches Stadium ohne produktive Vakuolenbildung auszubilden. Diese hypoxische Überlebensform intrazellulärer Coxiellen zeichnet sich durch IFN-γ-Resistenz, eine durch modifizierte Genexpression optimierte Sauerstoffverwertung und Radikalentgiftung sowie die Erhaltung ihrer Infektiosität aus. Dies deutet darauf hin, dass Hypoxie den intrazellulären Coxiellen weitere Möglichkeiten zur effizienten Immunevasion eröffnet, die einen unentdeckten Bakterienverbleib innerhalb infizierter Wirtszellen begünstigt und so vermutlich chronische C. burnetii-Infektionen fördert.
Für die Synthese und Freisetzung des APC-stimulierenden IFN-γ sind im Zuge angeborener Immunität vor allem die mit DCs kooperierenden NK-Zellen verantwortlich. Die im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit durchgeführten Studien zur Charakterisierung der Interaktion zwischen NK-Zellen und Coxiellen belegen, dass NK-Zellen von C. burnetii infiziert werden, sie jedoch die Etablierung und Replikation internalisierter Bakterien durch Ausschleusung in die extrazelluläre Umgebung unterbinden. Dieser Prozess geht mit einer funktionalen NK-Zell-Aktivierung einher, welche durch Phospho-Aktivierung der PKC ϴ sowie IFN-γ- und Granzym B-Ausschüttung charakterisiert ist. Verschiedene mikroskopische Analysen zeigen zudem, dass die intrazellulären bakteriellen Strukturen in unmittelbarem Kontakt mit den sekretorischen Granula stehen und die Coxiellen-Freisetzung über Degranulierung infizierter NK-Zellen erfolgt. Der Abtötung innerhalb der sekretorischen Granula infizierter NK-Zellen scheint sich C. burnetii durch seine Säure- und Protease-Resistenz zu entziehen. Freigesetzte Coxiellen erhalten nach Degranulierung größtenteils ihre Integrität und Fähigkeit zur Infektion benachbarter Wirtszellen. Obschon Coxiellen der Eliminierung durch die sekretorischen Granula entgehen und dies eine kritische Achillesferse der angeborenen Immunantwort darstellt, verbleibt über das gleichzeitig ausgeschüttete IFN-γ infizierter NK-Zellen ein positiver Effekt auf die antibakterielle APC-Aktivität.
In ihrer Gesamtbetrachtung tragen die erzielten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zu einem besseren und tieferen Verständnis der C. burnetii-Infektion von DCs und NK-Zellen bei und geben neue Einsichten in die zelluläre Selbstverteidigung sowie die IFN-γ-basierte Immunkooperation innerhalb der frühen Phase der anti-Coxiellen Abwehr. Im weiteren Infektionsverlauf können jedoch diese immunologischen Prozesse durch auftretende Hypoxie vermutlich eingeschränkt und die Eliminierung intrazellulärer Coxiellen erschwert sein.