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The success of pregnancy depends on precisely adjusted, local immune mechanisms. In early pregnancy, fetal trophoblast cells implant into the endometrium to build and anchor the placenta. Simultaneously, they mediate fetal tolerance and defense against infections. To cover these versatile requirements, local immune factors must be in balance. A too tolerogenic milieu can lead to an inadequate placentation; while a too inflammatory milieu can cause rejection of the semi-allogenic fetus. Bacterial infections can provoke these inflammatory pregnancy complications as well. Therefore, the pregnant uterus was long thought to be sterile. Descriptions of a placental microbiome opened a scientific discourse, which is unsolved due to contrary studies. The colonization of the non-pregnant endometrium is, however, confirmed. It is supposed to affect both, uterine pathologies and fertility. Precise data are lacking. Aim of this work was to assess if and under which circumstances a bacterial colonization would be tolerable.
One of the described species in placental and endometrial samples is Fusobacterium nucleatum. It is an opportunistic bacterium, which is known from the human oral cavity and associated with the development of colon carcinomas. F. nucleatum supports tumorigenesis by the induction of epithelial proliferation, survival, migration and invasion as well as angiogenesis and tumor tolerance. Since similar processes are required for implantation and placentation, F. nucleatum might support these as well. In this work, the effects of F. nucleatum on leukocyte-trophoblast-interactions, especially of macrophages and innate lymphoid cells type 3 (ILC3), were assessed.
The monocytic cells (THP-1) were differentiated into inflammatory M1 (IFN-γ) or tissue-repairing and tolerogenic M2a (IL-4) and M2c (TGF-β) macrophages. Inactivated F. nucleatum, LPS or E. coli was added. Only small concentrations of inactivated bacteria were used (bacteria:leukocyte ratio of 0.1 or 1), since it was not the aim to analyze infections. Conditioned medium of treated leukocytes was added to trophoblastic cells (HTR-8/SVneo). Migratory, invasive and tube formation behavior of trophoblastic cells was quantified.
Treated M1 macrophages impaired trophoblast function, whereas M2a macrophages induced trophoblast invasion. M2c macrophages supported trophoblast migration and tube formation if treated with the smaller, but not with the higher concentration of F. nucleatum. This treatment induced the accumulation of HIF-1α and the secretion of VEGF-A in M2c macrophages as well. Moreover, the higher concentration of F. nucleatum caused rather inflammatory responses (NF-κB activation and cytokine expression). The activation of the HIF-1α-VEGF-A axis under the influence of TGF-β might serve as a mild immune stimulation by low abundant commensal bacteria supporting placentation.
In contrast to macrophages, the function of ILC3s during pregnancy is still unknown. In general, ILC3s are located in mucosal tissue, such as the gut. They participate in tolerance mechanisms and form the local micromilieu by the secretion of cytokines and the presentation of antigens. In order to characterize local, uterine ILC3s, murine ILC3s were compared to peripheral, splenic ILC3s. Uterine ILC3s were more activated and produced higher levels of IL-17 compared to splenic ILC3s. However, uterine ILC3s barely expressed MHCII on their surface. A reduced antigen presentation potential was confirmed in human ILC3s differentiated from cord blood stem cells by the addition of TGF-β or hCG. The treatment with bacteria increased MHCII expression, but not to the initial level. The higher bacterial concentration induced IL-8 secretion and led to an increased trophoblast invasion. ILC3s were less sensitive to bacterial stimulation than macrophages.
Recent studies on the uterine or placental presence of bacteria during pregnancy are discrepant. The results of this project indicate that bacteria or bacterial residues might serve as a mild stimulus under certain circumstances to support implantation without negative effects. The current discussion must therefore not only be expanded by additional studies, but especially include differentiated local conditions. In this context, the sheer presence of bacteria or bacterial components must not be equated with an infection representing a known hazard.
Bei ersten Betrachtungen zum Zelltransport nahm man an, dass Stoffe passiv über die Zellmembran diffundieren. Nach weiteren Forschungen musste dies revidiert werden. Heute weiß man, dass dies fast nur über spezielle Proteine möglich ist. Diese Proteine sind Kanäle und Transporter welche aufgrund ihrer Funktion eine Schlüsselposition in der zellulären Homöostaste darstellen. Sie sorgen für die Aufnahme und den Ausstrom fast aller wichtigen Substanzen.
Im Jahr 2007 wurde die Entdeckung eines neue Zelltransporters, TETRAN (Tetracycline transporter-like protein), veröffentlicht. In ersten Untersuchungen zeigte sich ein bevorzugter Transport von NSAIDs über die Zellmembran. NSAIDs haben bei unterschiedlichen Personen abweichende Wirkungen bzw. Nebenwirkungen deren Gund bis heute noch nicht endgültig geklärt ist.
In dieser Arbeit konnten polymorphe TETRAN überexprimierende Zellen erzeugt werden und der Nachweis unterschiedlich starker Expression des Proteins in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Unter anderem zeigte sich eine gute Expression in Plazentagewebe. Welches auch wegen guter Verfügbarkeit zur Reihensequenzierung von 25 Proben genutzt wurde. Es zeigten sich 28 Synonyme und 85 Veränderungen im Gencode welche Einfluss auf die Primärsequenz des Proteins haben. Diese wurden alle in einer berechneten Grafik des Proteins zusammengefasst und dargestellt. In drei Situationen bildete sich anstatt des Wechsels einer Aminosäure ein Stopcodon. Dies trat jedoch nie homozygot auf. So das immer ein vollständiges Protein vorhanden war. In Anlehnung an vergleichbare Studien könnte dies mit ein Grund der differenten Wirkung von NSAIDs sein. Umfangreichere Beweise können in weiteren Studien noch folgen.
TGF-ß ist ein pleiotrophes Molekül das nicht nur im Immunsystem eine wesentliche Funktion in der Aufrechterhaltung immunologischer Toleranz besitzt, sondern auch Differenzierung und Expansion in vielen Geweben reguliert. Von TGF-ß sind drei Isoformen beschrieben, die alle an den gleichen Rezeptor binden. Dieser TGF-ß Rezeptor I kann für sich allein zwar TGF-ß binden, aber kein Signal in die Zelle übermitteln. Hierfür ist der TGF-ß Rezeptor II erforderlichlich. Die Arbeitsgruppe von Prof. Yeh beschäftigt sich intensiv mit der Entwicklung des fetalen humanen Ovars. Zum Zeitpunkt der von mir durchgeführten Untersuchungen war nicht bekannt ob und wenn ja in welchen Reifestadien TGF-ß an der Regulation der Entwicklung von fetalen Ovarien beteiligt ist. Ziel dieser Studie war es daher die Translation und Expression der TGF-ß Isoformen und der TGF-ß Rezeptoren I und II im fetalen humanen Ovar zu untersuchen. Die Transkription wurden mittels rtPCR untersucht und die Proteinexpression mittels Immunhistochemie nachgewiesen. Ich konnte zu allen untersuchten Zeitpunkten eine Expression der TGF-ß Isoformen und ihrer Rezeptoren nachweisen. Die Immunhistochemie zeigte darüber hinaus, dass die Verteilung in den Zelltypen (Oozyten und Granulosazellen) in Geweben des ersten und des zweiten Trimenons unterschiedlich reguliert ist. Im zweiten Trimenon zeigte sich, im Vergleich mit jüngeren Ovarien, eine insgesamt höhere Färbeintensität sowie eine Bevorzugung der Oozyten für alle hier untersuchten Proteine. Diese Ergebnisse stützen unsere ursprüngliche Hypothese, dass TGF-ß in der untersuchten Entwicklungsperiode auch im Ovar eine Bedeutung besitzt. In einem zweiten Teil der Untersuchungen wurde die Expression von TGF-ß und seiner Rezeptoren in der reifen humanen Placenta untersucht. Es war bekannt, dass TGF-ß exprimiert wird, ob auch die für die biologische Wirkung erforderlichen TGF-ß RI und RII vorhanden sind, war jedoch nicht bekannt. Hier konnte im Rahmen meiner Arbeit die Expression aller TGF-ß Isoformen als auch der Rezeptoren nachgewiesen werden. Spätere Arbeiten konnten die von uns gefundenen Ergebnisse im Wesentlichen bestätigen. Zusammenfassend zeigen die hier vorgelegten Daten, dass TGF-ß zu kritischen Zeitpunkten der fetalen Ovarentwicklung exprimiert wird. Ob sich hier Ansatzpunkte ergeben um Krankheitsbilder deren Ursprung in der fetalen Entwicklungsperiode vermutet werden, wie z. B. das Polycystische Ovar besser zu verstehen, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen.
Die Plazenta als funktionstüchtiges Organ ist für einen unkomplizierten Schwangerschaftsverlauf sowie die Geburt eines gesunden Kindes unabdingbar. Während der Organogenese ist die korrekte Differenzierung der einzelnen Trophoblast-Subpopulationen zu villösen oder extravillösen Zytotrophoblasten und Synzytiotrophoblasten sowie eine ungestörte Vaskulogenese und Angiogenese der Plazenta enorm wichtig. Eine entscheidende Rolle spielt hierbei das Gleichgewicht von Wachstumsfaktoren, Hormonen und Zytokinen. Störungen der Entwicklungsprozesse können weit reichende Folgen wie z.B. Präeklampsie, Schwangerschaftsdiabetes, intrauterine Wachstumsretardierung bis hin zum Abort haben. Das in dieser Arbeit untersuchte Protein CXCL12 gehört zur Familie der chemotaktischen Zytokine und wird deshalb den Chemokinen zugeordent. Seine Wirkung entfaltet CXCL12 über seinen spezifischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor CXCR4. Um die Rolle des CXCL12/CXCR4-Systems während der plazentaren Entwicklung besser zu verstehen, erfolgten im Rahmen dieser Arbeit mittels immunhistochemischer Methoden zunächst Expressions- und Kolokalisationsstudien von CXCL12 und CXCR4 mit spezifischen plazentaren Markern. Hierbei zeigte sich in der frühen Schwangerschaft während der Proliferationsphase eine starke CXCR4-Expression in allen Trophoblast-Subpopulationen, insbesondere in Zytotrophoblasten, welche im Verlauf der Plazentareifung abnimmt. CXCL12 hingegen ist während der gesamten Schwangerschaft in allen plazentaren Trophoblast-Subpopulationen sowie z. T. in Assoziation mit Blutgefäßen nachweisbar. Mittels Fusions-Assays und Proliferationsstudien in Explantat- und Zellkulturen wurde in dieser Arbeit die Rolle des CXCL12/CXCR4-Systems in der Plazenta ex vivo und in vitro weiterführend charakterisiert. Um den natürlichen Bedingungen während der Plazentaentwicklung möglichst genau zu entsprechen, erfolgten die Experimente bei unterschiedlichen Sauerstoffpatialdrücken (pO2). Es konnte ein eindeutiger pro-proliferativer Effekt von CXCL12 auf Trophoblasten nachgewiesen werden. Des Weiteren fördert CXCL12 die synzytiale Fusion, wobei die Fusion vom Zytotrophoblasten zum Synzytium erst durch Kontakt zum mütterlichen Blut und damit steigendem pO2 (etwa ab der 10. SSW) intensiv durch CXCL12 stimuliert wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen zudem auf einen möglichen Zusammenhang mit der Ätiologie der Präeklampsie hin. Durch eine mögliche CXCL12-vermittelte Dickenzunahme der Synzytiumschicht könnte die veränderte Plazentaschranke zu einer Mangelversorgung des Feten beitragen.
Ziel der Arbeit war es, ein Probenkollektiv zu etablieren und die Expression, Lokalisation und Funktion pharmakologisch und physiologisch relevanter Membrantransporter systematisch zu untersuchen. Dafür wurde aus 70 humanen Plazenten mRNA, Protein und genomische DNA isoliert. Im Anschluss konnte die mRNA-Expression der Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC1 (MRP1), ABCC2 (MRP2), ABCC3 (MRP3), (ABCC5), ABCG2 (BCRP), SLC10A6 (SOAT), SLC22A4 (OCTN1), SLC22A5 (OCTN2), SLC22A11 (OAT4) und SLCO2B1 (OATP2B1) bestimmt und hinsichtlich ihrer Assoziation mit dem Gestationsalter und dem Geschlecht analysiert werden. Dabei zeigte sich eine signifikante gestationsabhängige Expressionsabnahme für das P-gp, BCRP, OATP2B1 und OAT4, darüber hinaus war die Expression von MRP1 in Plazenten männlichen Feten im Vergleich zu weiblichen Feten deutlich erhöht. Da fast alle Organe, mit Ausnahme der Leber, Niere und Gehirn, auf eine Carnitinaufnahme aus dem Blut angewiesen sind, spielen Carnitintransporter wie das SLC22A4 (OCTN1) und SLC22A5 (OCTN2) eine entscheidende Rolle: In der Plazenta sind sie bei der Versorgung des Fetus mit L-Carnitin unabdingbar. Auf mRNA-Ebene konnte in diesem Zusammenhang zunächst keine gestationsabhängige Expressionsänderung gezeigt werden, obwohl der Fetus zum Ende der Schwangerschaft einen deutlich erhöhten Carnitinbedarf hat. Die daraufhin durchgeführte Bestimmung der korrespondierenden OCTN2-Proteinexpression, die interessanter Weise nicht mit den mRNA-Werten korrelierte, zeigte tatsächlich eine erhöhte Transporterexpression zum Ende der Schwangerschaft hin. Für das OCTN2 wurden weiterhin Untersuchungen zum Einfluss eines bekannten Promotorpolymorphismus, dem -207G>C, der in anderen Studien mit der OCTN2 Expression assoziiert werden konnte, durchgeführt. Hier zeigte sich, dass diese genetische Variante zwar die mRNA Expression des Transporters beeinflusst, sich dieser Effekt aber wiederum nicht auf die Proteinebene übersetzt, so dass anzunehmen ist, dass die plazentare OCTN2 Expression auch von nicht transkriptionellen Faktoren (z.B. miRNA) bestimmt wird. Mit Blick auf die anderen untersuchten Transporter zeigte sich in vielen Fällen eine Korrelation in der Expression bestimmter Efflux- und Aufnahmetransporter. Ein Beispiel für ein solches Transporterpaar war dabei das BCRP und OATP2B1,das in der Folge weiter untersucht wurde, wobei insbesondere ein mögliches funktionelles Zusammenspiel im Mittelpunkt stand. Aufbauend auf der apikalen Expression des BCRP und der basalen des OATP2B1, wurde ein, auf MDCKII-Zellen basiertes, in vitro Zellsystem verwendet, um die Bedeutung dieser Transporter für den transzellulären Transport von Substanzen wie E1S und DHEAS zu zeigen. In der Tat war ein gerichteter Transporter dieser Substanzen nur zu beobachten, wenn beide Transporter in den Zellen exprimiert wurden. Diese Ergebnisse sind bezüglich der Hormonsynthese durch die Plazenta von Bedeutung, da diese während der Schwangerschaft einen zentralen Syntheseort darstellt, aber einige Vorläufermoleküle nicht selber synthetisieren kann. Zusammengefasst bietet die vorliegende Arbeit ein umfassendes Bild über die Regulation wichtiger physiologischer und auch pharmakologischer Membrantransporter im letzten Drittel der Schwangerschaft. Darüber hinaus konnte für ausgewählte Transporter das Zusammenspiel (OATP2B1 und ABCG2) und die Regulation (OCTN2) näher charakterisiert werden.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden in der Plazenta über 30 membranständige Transportproteine identifiziert, die zum einen in der maternal zugewandten (apikalen) oder zum anderen in der fetal zugewandten (basalen) Membran der Synzytiotrophoblasten lokalisiert sein können. Trotz vieler Hinweise auf die Existenz plazentarer Transportproteine verfügen wir bis heute über kein umfassendes Wissen über ihre Funktion und Expression. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die Kenntnisse über plazentare Transportproteine zu vervollständigen und ein möglichst komplexes Wissen über ihre Expression und Funktion in der Plazenta zu gewinnen. Dazu wurden die Transportproteine ABCB1 (P-glycoprotein) und ABCC2 (multidrug resistance protein 2, MRP2) als Vertreter der Effluxtransporter einerseits und OCT3 (organic cation transporter 3) als Vertreter der Aufnahmetransporter anderseits zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zuerst wurden die Untersuchungen zur plazentaren Expression der Transportproteine ABCB1, ABCC2 und OCT3 durchgeführt und der Einfluss von intrauteriner Entwicklung, schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen und Genotyp auf die Expression geprüft. Anschließend wurde die Funktion von ABCB1, ABCC2 und OCT3 mittels Modellsubstraten und selektiver Hemmer untersucht. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mittels real-time RT-PCR (TaqMan®) und auf Protein-Ebene mittels quantitativer Western Blot-Analyse bestimmt. Die funktionellen Untersuchungen wurden an OCT3 überexprimierenden MDCKII-Zellen, plazentaren Membranvesikel, mittels der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta und des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta durchgeführt. Die plazentare ABCC2-Expression in der Spätschwangerschaft war deutlich höher als die Expression von ABCB1. In Untersuchungen zur intrauterinen Entwicklung wurde ein signifikanter gestationsaltersabhängiger Anstieg der OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene beobachtet. Die schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen Präeklampsie und Gestationshypertonie verminderten signifikant die OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene. In Untersuchungen zur Veränderungen der Expression in Abhängigkeit vom Genotyp waren die Polymorphismen C3435T und G2677T im ABCB1-Gen und C3972T und C24T im ABCC2-Gen mit einer veränderte Expression der Transporter verbunden. In den funktionellen Untersuchungen wurde zuerst der Einfluss von pharmakologisch relevanten Substanzen auf die Aufnahme des OCT3-Modellsubstrats 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP) in die MDCKII-OCT3-Zellen getest. Einen signifikanten Hemmeffekt auf die MPP-Aufnahme zeigten Imipramin, Fluoxetin, Ecstasy, Nikotin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und der bekannte OCT3-Inhibitor Disprocynium 24 (D24). Um die Funktion von OCT3 näher zu charakterisieren, wurde die MPP-Aufnahme in die apikalen und basalen Membranvesikel der menschlichen Plazenta untersucht. In den apikalen Vesikel zeigten Fluoxetin, Amphetamin und MPTP eine signifikante Hemmung des MPP-Transports. In den basalen Vesikel haben D24, Imipramin und Ecstasy die MPP-Aufnahme gehemmt. Im nächsten Schritt wurde die Funktion von Abcb1 und Abcc2 mit Hilfe der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta an Abcc2-defizienten- und Wildtyp-Ratten untersucht. Die Abwesenheit eines funktionsfähigen Abcc2-Transporters führte bei Abcc2-defizienten-Ratten zu einer erhöhten materno-fetalen Permeabilität des Modellsubstrats Talinolol, die durch Zugabe des Abcb1-Hemmers PSC833 weiter anstieg. Bei den Wildtyp-Ratten verursachte die Zugabe von PSC833 und dem Abcc2-Hemmer Probenecid einen Anstieg der materno-fetalen Permeabilität von Talinolol. Dies spricht für Beteiligung beider Transportproteine an der Plazentabarriere. Im dualen in vitro Perfusionsmodell der menschlichen Plazenta wurde ein unidirektionaler feto-maternaler Transfer des ABCB1- und ABCC2-Modellsubstrats Talinolol bewiesen. Dieser Transfer war durch den ABCC2-Inhibitor Probenecid und den unselektiven Inhibitor Verapamil modulierbar. Der ABCB1-Inhibitor PSC833 hatte dagegen keinen Einfluss auf die diaplazentare Permeabilität von Talinolol. Dies und die hohe ABCC2-Expression in der Terminplazenta spricht für eine größere Bedeutung von ABCC2 in der Spätschwangerschaft. Weitere Untersuchungen mittels des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta wurden zur Beschreibung der Funktion von OCT3 durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine höhere materno-fetale Permeabilität des OCT3-Modellsubstrats MPP festgestellt. Der selektive OCT3-Hemmer D24 verminderte die materno-fetale Permeabilität des Modellsubstrats MPP signifikant. Daraus folgern wir, dass OCT3 in den diaplazentaren Transfer von organischen Kationen in fetale Richtung involviert sein muss. Psychopharmaka wie Fluoxetin, Imipramin oder illegale Drogen wie Ecstasy können die Funktion von OCT3 beeinflussen und damit den diaplazentaren Transfer von kationischen Substanzen verändern.
Die Variabilität von Arzneimitteln wird nicht nur durch die Spezifität der Substanzen für die Zielstrukturen bestimmt, sondern auch durch die interindividuelIe Variabilität von eliminierenden Prozessen. Im Hinblick auf die demographische Entwicklung mit zunehmendem Alter Schwangerer scheint auch die Notwendigkeit einer therapeutischen Intervention der Schwangerschaft wahrscheinlicher. Effekte von maternal gegebenen Arzneimitteln auf das sich entwickelnden Kind sind die Hauptrisiken einer schwangerschafts-assoziierten Therapie. Die Plazenta bildet die Schnittstelle zwischen Mutter und Kind und ist sowohl an der Versorgung, als auch an der Protektion des Kindes beteiligt. Es konnte bereits in vorhergehenden Studien gezeigt werden, dass Transportproteine welche auch die Mitglieder der ABC (ATP-binding cassette) Transporter Familie einschließen, an der Schutzfunktion beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde die Expression Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der ABC-Transporter in der Plazenta untersucht. Näher betrachtet wurden P-Glykoprotein (ABCB1), Breast Cancer Restance Protein (ABCG2), Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2) und MRP5. Quantitative Real-Time Reaktion ergab tue Expression der Transport in allen untersuchten 60 Proben von Früh- und Termingeburten. Nachgewiesen werden konnte eine mit den Gestationsalter abnehmende Expression von MRP5, während die MRP2 und P-Glykoprotein mRNA mit dem Gestationsalter anstieg. Western Blot Analysen von Membranpräparation zeigte ähnliche Ergebnisse. Mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie konnte MRP5 hauptsächlich in der basalen Membran des Synzytiotrophoblasten und in der Umgebung voll fetalen Gefäßen nachgewiesen werden, während die anderen 'Transporter hauptsächlich in der apikalen Syzytiotrophohlasten- Mernbran lokalisiert waren. Darüber hinaus wurde die Veränderung der Expression der Transporter in isolierten Zytotrophoblasten untersucht. Diese Vorläuferzellen des Synzytiotrophoblasten differenzieren in vitro und bilden ein multinukleäres Synzytium. Es zeigte sich, dass mit zunehmender Differenzierung die Expression der Transporter mit der hCG-Sekretion - einem biochemischem Marker der Differenzierung- ansteigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression der hier untersuchten Transporter vorn Gestationsalter abhängig ist und sich mit der Differenzierung der Cytotrophoblasten verändert.