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Das Prostatakarzinom ist bei Männern in Deutschland die häufigste Krebserkrankungen und die dritthäufigste Krebstodesursache. Aufgrund der steigenden Inzidenz mit fortschreitendem Alter und der parallel dazu immer älter werdenden Bevölkerung ist diese Erkrankung von großer sozioökonomischer Bedeutung. Nach einer antiandrogenen Therapie im fortgeschrittenen Tumorstadium kommt es häufig zur erneuten Progression des Tumorwachstums. In diesem kastrationsresistenten Stadium kommt es zur hormonunabhängigen Aktivierung und Aufrechterhaltung von Signalwegen des Androgenrezeptors.
Ein in diesem Zusammenhang postulierter Mechanismus besteht in der direkten Wechselwirkung des Rezeptors mit dem Tumorprotein PC1 (prostate and colon gene-1), welches auch als Tumorprotein D52 bezeichnet. Es liegt in Prostatakarzinomzellen häufig überexprimiert vor und steht daher im Verdacht, maßgeblich zur Progression des Tumorwachstums beizutragen, insbesondere im kastrationsresistenten Stadium.
In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe von FRET-basierten Interaktionsstudien mögliche Wechselwirkungen von PC1 mit dem Androgenrezeptor untersucht werden. Da es bereits Hinweise für eine Interaktion von PC1 mit Prdx1 gab, wurde dieses Protein in die Analyse mit einbezogen. Die Untersuchungen wurden an den Prostatakarzinom-
zelllinien LNCaP und PC-3 unter verschiedenen Kulturbedingungen durchgeführt.
Die verwendeten Methoden umfassten die Klonierung von Expressionsvektoren, Transfektion von Plasmid-DNA in Säugerzellen, indirekte Immunfluoreszenz, Westernblot-Analysen, Durchflusszytometrie sowie konfokale Mikroskopie.
In dieser Arbeit konnte eine Kolokalisation zwischen PC1 und dem Androgenrezeptor sowie zwischen PC1 und Prdx1 im Zytoplasma von androgenabhängig wachsenden LNCaP-Zellen gezeigt werden. Auch in PC-3-Zellen, welche ähnlich wie kastrationsresistente Zellen androgenunabhängig wachsen, gelang es, eine Kolokalisation zwischen PC1 und dem Androgenrezeptor im Zytoplasma nachzuweisen. Bei Kultivierung dieser Zellen in hormonfreiem Medium waren PC1 und der Androgenrezeptor sogar im Zellkern von PC-3-Zellen kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf die besondere und zentrale Funktion des PC1 bei der Aufrechterhaltung des Tumorwachstums hin. Somit wäre das prostataspezifisch vorkommende PC1 eine durchaus interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Therapiestrategien beim fortgeschrittenen Prostatakarzinom.
Der Transport von Substanzen innerhalb eines Organismus stellt eine wesentliche Vorausset-zung zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen dar. Neben endogenen Stoffen unter-liegen auch die meisten exogenen Substanzen zahlreichen Transportvorgängen, darunter auch die meisten Arzneistoffe. Deren Pharmakokinetik wird oft entscheidend von ihrer Affini-tät zu bestimmten Transportproteinen beeinflusst. Von diesen präsentiert neben den ABC-Transportern die Familie der SLC-Transporter das größte Spektrum einzelner Vertreter. Auf-grund ihrer Beteiligung sowohl an physiologischen als auch pharmakokinetischen Prozessen erweisen sich darunter die OATPs als besonders interessant. Obwohl deren Bedeutung am Stofftransport durch umfassende Charakterisierung ihrer Expression und Funktion unbestrit-ten ist, erweist sich ihr zugrundeliegender Transportmechanismus noch immer als nicht voll-ständig verstanden. Jedoch bieten Untersuchungen an verwandten Transportern, wie der bak-teriellen Lactose-Permease, Erkenntnisse, die sich möglicherweise auch auf die OATPs über-tragen lassen. Für diese wurde ein Rocker-switch-Mechanismus vorausgesagt, bei dem die Bindung des Substrats zu einer Konformationsänderung führt. Hierdurch wird das Substrat entlang einer zentralen Pore durch das Transportprotein befördert. Eine Möglichkeit derartige Konformationsänderungen, die mit einer Verschiebung der Abstände innerhalb des Moleküls einhergehen, zu untersuchen, stellt der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) dar. Dieser beschreibt die strahlungslose Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren, deren Effizi-enz mit dem Abstand der Chromophore zu- bzw. abnimmt.
Erstes Ziel dieser Arbeit war es OATP2B1, als einen Vertreter der OATPs, so zu modifizieren, dass er für die Untersuchung mittels FRET zugänglich werden würde. Dies erfolgte durch die Herstellung von OATP2B1-Fusionsproteinen, bei denen der Transporter mit den FRET-geeig-neten Fluorophoren ECFP/EYFP bzw. ECFP/FlAsH ausgestattet wurde. Die Integration des ECFP erfolgte dabei jeweils am C-Terminus, während EYFP und FlAsH jeweils in die intrazellulären Schleifen des Proteins eingebracht wurden. Im Weiteren galt es, diese Fusionsproteine hin-sichtlich ihrer Funktion (Transport radioaktiv-markierter Substrate) und Lokalisation in der Zelle (Mikroskopie) zu charakterisieren. Hierbei wurde gezeigt, dass lediglich die Modifikation mit FlAsH in der dritten intrazellulären Schleife zu keiner Funktionsbeeinflussung führte und dieses Fusionsprotein auch als einziges eine membranäre Lokalisation aufwies. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der Messung der FRET-Effizienzen der Fusionsproteine mithilfe konfoka-ler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei konnte zunächst bei allen Fusionsproteinen ein FRET-Signal erfasst werden, das in Abhängigkeit der Position des FRET-Partners in der intrazellulä-ren Schleife eine unterschiedliche Effizienz aufwies. Die FRET-basierte Berechnung der Ab-stände innerhalb des Moleküls brachte Ergebnisse hervor, die vergleichbar mit denen waren, die anhand von Kristallstrukturanalysen verwandter Transporter erhoben wurden. Teilweise Übereinstimmungen ergaben sich daneben auch beim Vergleich der berechneten Abstände mit denen computergestützter Modelle. Die Ergebnisse zeigen damit das Potenzial dieser Me-thode, die Struktur des OATP2B1 aufzuklären. Außerdem stützen sie zum Teil die prognosti-zierte Strukturverwandtschaft der OATPs zu der strukturell besser charakterisierten Lactose-Permease. Letztes Ziel war es zu untersuchen, ob sich die gemessenen FRET-Effizienzen durch Zugabe des OATP2B1-Substrats E1S beeinflussen ließen. Es konnte für fast alle Fusionsproteine eine Beeinflussung festgestellt werden, wobei die FRET-Effizienzen in Abhängigkeit von der Position des FRET-Partners sowohl ab- als auch zunahmen. Daneben zeigte auch die Zugabe des OATP2B1-Inhibitors Rifampicin eine verschieden ausgeprägte Beeinflussung. Die Zugabe des Nicht-OATP2B1-Substrats 17β-Estradiol-3-glucuronid führte zu keiner Beeinflussung. Die Ergebnisse zeigen damit eine substanzspezifische Beeinflussung des Fusionsproteins. Die be-rechneten Änderungen des Abstandes waren vergleichbar mit den aus Kristallstrukturanaly-sen gewonnenen Abständen der Lactose-Permease. Es konnten hierdurch erste Hinweise ge-liefert werden, dass der dem OATP2B1 zugrundeliegende Transportmechanismus einem ähn-lichen Prinzip folgt, wie es für den Rocker-Switch beschrieben wurde. Die Bindung und der Transport des Substrats an das OATP2B1 führen zu einer Abstandsänderung innerhalb des Moleküls, die sich am ehesten über eine Konformationsänderung erklären ließe.
Diese Arbeit kann insgesamt erste Grundlagen zur weiteren Charakterisierung der Struktur und des Transportmechanismus der OATPs liefern. Sie zeigt, dass die Herstellung eines funk-tionsfähigen FRET-Fusionsproteins möglich ist und dass deren Untersuchung nachvollziehbare Ergebnisse liefern kann. Außerdem bietet sie einen Ansatz, FRET-basierte Screening-Verfah-ren für Transportersubstrate zu etablieren. Inwieweit diese praktisch umzusetzen sind, muss jedoch durch aufbauende Arbeiten geklärt werden.