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Das Mammakarzinom ist die häufigste maligne Tumorerkrankung bei Frauen. In verschiedenen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass Heparin einen Einfluss auf das Überleben von Tumorpatienten hat. Heparin ist ein stark negativ geladenes Molekül, dadurch kann es Komplexe mit basischen Proteinen bilden. Neben seiner Wirkung auf die Blutgerinnung wurden bei Heparin antikanzerogene Effekte beobachtet, wobei diese nicht in Zusammenhang mit den antikoagulatorischen Eigenschaften zu stehen scheinen.
Zytokine, kleine lösliche Proteine, können Einfluss auf die Interaktion und Kommunikation von Zellen nehmen. Des Weiteren sind sie an der Immunantwort unseres Körpers beteiligt.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von unfraktioniertem Heparin auf die Proliferation, Zytokinsekretion, Invasion und Migration von humanen Mammakarzinomzelllinien untersucht. Es wurden die humanen Mammakarzinomzelllinien MDA-MB-231 und MCF-7 eingesetzt. Die Zellen wurden ohne bzw. mit unfraktioniertem Heparin in der Dosierung 5 µg/ml sowie mit den Stimulationsfaktoren HGF, EGF, SDF-1α und TGF-β in den Dosierungen 10 ng/ml und 100 ng/ml inkubiert. Im Anschluss erfolgte zunächst mittels Cell Titer Blue® eine Bestimmung der relativen Zellzahl, um Rückschlüsse auf die Spontanproliferation erhalten zu können. Des Weiteren wurden mittels ELISA die Zytokinsekretion von IL-8, IL-11, RANTES, MCP-1, IP-10 und MIG sowie mittels real-time RT-PCR die Zytokinexpression von IL-8 untersucht. Darüber hinaus wurden der Einfluss von Heparin auf das Invasionsverhalten ermittelt und, zur Echtzeit-Beobachtung der Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen, ein Wound-Healing-Assay (Scratch-Assay) durchgeführt.
Weder die eingesetzten Stimulationsfaktoren HGF, EGF, SDF-1α und TGF-β noch Heparin hatten einen signifikanten Einfluss auf die Spontanproliferation der MDA-MB-231-Zellen. Bei den MCF-7-Zellen konnte sowohl durch HGF als auch durch Heparin die Zellzahl im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe innerhalb von 48 Stunden gesteigert werden.
Heparin konnte die Zytokinsekretion sowohl auf Protein- als auch auf Genebene beeinflussen, dieser Effekt war zelllinien- sowie zytokinspezifisch. Bei den MDA-MB-231-Zellen konnte das eingesetzte Heparin die Zytokinsekretion von IL-8 signifikant und von IL-11 in der Tendenz herabregulieren. Für die MCF-7-Zellen konnte eine basale Sekretion von RANTES nachgewiesen werden, wobei diese nicht durch Heparin oder die Stimulationsfaktoren beeinflusst wurde.
Für IL-8 wurde diese Beobachtung zudem mittels real-time RT-PCR untersucht. Die größten Effekte konnten hier bei den MDA-MB-231-Zellen nach vier und acht Stunden festgestellt werden. Bei den MCF-7-Zellen zeigte sich dahingegen eine unzureichende IL-8-Expression auf Genebene.
Das eingesetzte Heparin hatte keinen wesentlichen Einfluss auf das Invasionsverhalten der MDA-MB-231-Zellen. Auch der Einsatz der Stimulationsfaktoren konnte das Invasionsverhalten der Zellen nicht verstärken. Bei den MCF-7-Zellen konnte innerhalb von 72 Stunden kein Invasionsverhalten beobachtet werden.
Im Wound-Healing-Assay konnten für die MDA-MB-231-Zellen keine signifikanten Ergebnisse erreicht werden, wobei Heparin ohne weitere Zusätze in der Tendenz den größten Effekt auf das Migrationsverhalten der Zellen hatte und dieses steigerte. Bei den MCF-7-Zellen konnte dahingegen kein Migrationsverhalten, sondern lediglich Zellproliferation beobachtet werden.
Heparin konnte sowohl die Spontanproliferation, die Zytokinsekretion sowie das Migrationsverhalten der verwendeten humanen Mammakarzinomzelllinien MDA-MB-231 und MCF-7 zelllinienspezifisch modulieren. Hiermit konnte gezeigt werden, dass Heparin in der Lage ist, das Tumormikromilieu humaner Mammakarzinomzelllinien zu beeinflussen. Heparin kann somit wiederum sowohl in das Tumorwachstum selbst als auch in den Metastasierungsprozess eingreifen.
Zum weiteren Verständnis, wie Heparin auch weitere Prozesse der Karzinogenese beeinflussen kann, müssten weitere, an diese Arbeit anknüpfende Untersuchungen erfolgen. Es konnte aber gezeigt werden, dass Heparin in der Lage ist, unabhängig von seinen antikoagulatorischen Eigenschaften, auf viele Schritte der Tumorentstehung, des Tumorwachstums und der Ausbreitung der Karzinomzellen Einfluss zu nehmen.
Tumorpatienten haben ein erhöhtes Risiko für thrombembolische Ereignisse und werden deshalb oft prophylaktisch mit Heparinen behandelt. Klinische Beobachtungen zeigen, dass Heparine bei Tumorpatienten positive Effekte haben, die über die klassische antikoagulatorische Wirkung hinaus gehen und möglicherweise einen davon unabhängigen Überlebensvorteil bieten. Die genauen Mechanismen sind nicht vollständig geklärt. Diskutiert werden günstige Einflüsse der Heparine auf die Tumorzellen selbst, auf das umgebende Tumormikromilieu oder auch auf die Metastasierung.
Diese Arbeit untersucht, ob Heparine allein oder in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Paclitaxel (PTX) einen direkten Einfluss auf das Überleben und das Wachstum humaner Endometriumkarzinomzellen (ECa-Zellen) in vitro haben. Des Weiteren wird überprüft, inwieweit diese Substanzen Auswirkungen auf den Zytokinhaushalt der ECa-Zellen haben.
Anhand von Vitalitäts- und Zytotoxizitätsmessungen zeigte sich, dass Heparine keine Veränderung der Wachstums- und Überlebensraten der untersuchten ECa-Zelllinien in vitro bewirken. Eine Modulation der antimitotischen Wirkung von PTX durch Heparine war nicht nachweisbar. Unter der Behandlung mit PTX kam es bei einigen der untersuchten Zelllinien zu einer signifikant stärkeren Expression und Sekretion der Zytokine RANTES, MCP-1 und IL-6, während der Einsatz von unfraktioniertem Heparin (UFH) keinen generalisierbaren Effekt auf den Zytokinhaushalt der ECa-Zellen erbrachte. Die Kombinationsbehandlung aus PTX und UFH zeigte lediglich bei RL95-2-Zellen eine synergistische Wirkung bei der Zunahme der RANTES-Sekretion.
Um eine genauere Bewertung dieser in vitro beobachteten Effekte zu ermöglichen, sollten weitere Untersuchungen zur Rolle von RANTES, MCP-1 und IL-6 im Tumormikromilieu des Endometriumkarzinom angestrebt werden. Auch wenn sich kein verallgemeinbarer Effekt von Heparinen auf den Zytokinhaushalt der untersuchten ECa-Zellen zeigte, sind einzelne modulatorische Einflüsse denkbar, weil die individuellen Merkmale von Tumorzellen und deren Umgebungscharakteristika eine Vielzahl von Interaktionsmöglichkeiten bieten.
Trotz zahlreicher Fortschritte in der Reproduktionsmedizin bleibt die ungewollte Kinderlosigkeit weiterhin ein nur teilweise verstandenes und behandelbares Problem. Unter habituellen Aborten, also drei oder mehr Fehlgeburten in Folge, leiden weltweit
etwa 1% aller Paare. In der Behandlung ungewollter Kinderlosigkeit auch unbekannter Ursache nehmen Heparine mittlerweile eine wichtige Rolle ein, auch wenn die Wirkungsweise zur Verbesserung des Schwangerschaftserfolgs oder der Verhinderung von Schwangerschaftskomplikationen nicht endgültig geklärt ist. Wichtige Aspekte sind dabei nicht nur die antikoagulativen Eigenschaften dieser Medikamente, sondern auch immunmodulatorische Effekte, welche in dieser Arbeit anknüpfend an andere Arbeiten unserer Arbeitsgruppe weiter untersucht wurden. Das Immunsystem spielt eine herausragende Rolle bei Entstehung und Erhalt von Schwangerschaft.
Es ist bekannt, dass sich während der Schwangerschaft das Gleichgewicht zwischen TH1- und TH2-Zytokinen in Richtung der TH2-Zytokine verschiebt, wodurch die für den Feten potenziell schädlichen Effekte durch die TH1-Immunantwort abgeschwächt werden. Bei Frauen mit ungewollter Kinderlosigkeit scheint das Verhältnis wiederum in Richtung der TH1-Zytokine verschoben zu sein. Eine Einflussnahme auf diese Zytokinverschiebung könnte also hilfreich sein.
In der hier vorgelegten Arbeit wurde ein in-vitro-Modell endometrialer Stromazellen
(ESC) in Zellkultur verwendet. Es wurde dabei mittels ELISA und PCR untersucht,
wie die beiden wichtigen Modulatoren der Chemokinproduktion TNF-alpha (ein proinflammatorisches TH1-Zytokin) und Thrombin (wichtiger Partner von Heparin beim Eingriff in die Gerinnungskaskade) die Chemokinproduktion von ESC auf RNA- und Proteinebene beeinflussen und wie unfraktioniertes Heparin (UFH), niedermolekulare Heparine (LMWH) und Heparin-ähnliche Moleküle diese wiederum verändern können.
Untersucht wurden dabei die Chemokine GRO-alpha, Ena-78, IL-8, MCP-1 und RANTES.
In dieser Arbeit wird gezeigt, dass UFH die von TNF-alpha hervorgerufene Steigerung der Produktion von IL-8 und RANTES dosisabhängig beeinflusst. Mithilfe des Einsatzes des NFkappaB-Inhibitors Parthenolid kann zudem dargestellt werden, dass der TNF-alpha- und vermutlich auch der Heparineffekt über den Signalweg des Transkriptionsfaktors NFkappaB vermittelt wird. Mittels der Heparin-ähnlichen Moleküle Dextransulfat, Danaparoid und ODSH versuchen wir anschließend darzustellen, welche Moleküleigenschaften Heparins für die Einflussnahme auf die von TNF-alpha verursachte Chemokinexpression und -sekretion von GRO-alpha, IL-8 und RANTES verantwortlich sind.
Im zweiten Teil der Arbeit wird zunächst gezeigt, dass Thrombin die Sekretion von
GRO-alpha, IL-8 und MCP-1 durch ESC erhöht, während es auf die RANTES Expression anders als TNF-alpha keinen Einfluss hat. UFH ist in der Lage diese gesteigerte Chemokinsekretion von IL-8 und MCP-1 zu verringern. Außerdem hemmen nicht nur UFH, sondern auch LMWHs die Thrombin-induzierte Hochregulation von IL-8 und MCP-1 auf mRNA- und Proteinebene. Thrombin scheint für seine Einflussnahme auf die Chemokinproduktion dabei den MAPK-Signalweg zu nutzen, wie mittels des MAPK-Inhibitors PD98059 dargestellt wird. Diese Arbeit zeigt somit wie Heparine ihre immunmodulatorischen Effekte auf die Chemokinproduktion endometrialer Stromazellen beim Vorliegen eines proinflammatorischen Milieus ausüben. Dadurch wird ein Beitrag geleistet, um die Wirkungsweise von Heparinen beim Einsatz ungewollter Kinderlosigkeit besser zu verstehen und es wird nochmals das Potential dieser Medikamente bei der Anwendung in diesem Bereich unterstrichen. Es sind allerdings weitere Untersuchungen am Tiermodell oder im Rahmen klinischer Studien notwendig, um diese am in-vitro-Modell gewonnenen Erkenntnisse auf ein in-vivo Modell zu übertragen und somit profunderes Wissen für die klinische Anwendung zu gewinnen.
Protamine is administered as protamine sulfate to reverse the anticoagulant effect of heparin following cardiopulmonary bypass surgery. Immunogenicity of protamine has been recognized for decades in several patient groups including vasectomized men, diabetic patients on protamine-containing insulin and patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery. Anti-protamine/heparin antibodies are a newly described class of heparin-dependent antibodies found in about 30% of patients exposed to protamine and heparin during cardiac surgery. A subset of seropositive patients especially who tested positive for platelet-activating anti-protamine/heparin immunoglobulin G (IgG) antibodies before surgery have prolonged postoperative thrombocytopenia with an increased risk for arterial occlusions. Studies presented in this thesis shed light on potential approaches that may prevent antibody-mediated platelet activation by anti-protamine/heparin antibodies. Two approaches are presented in this thesis, partially desulfated heparin (ODSH) and low molecular weight protamine (LMWP). Our studies demonstrated the ability of ODSH to inhibit anti-protamine/heparin antibody-mediated platelet destruction in the NOD/SCID mouse model by: i) reduction of antibody binding to preformed protamine/heparin complexes, as shown by enzyme immunoassay, ii) interfering with the binding of protamine/heparin complexes to platelets as shown by flow cytometry and fluorescence microscopy, and iii) inhibition of antibody-mediated platelet activation. Interestingly, ODSH was also able to block ongoing platelet destruction by displacing pre-bound complexes from the platelet surface. In addition, our data suggest the use of synthesized LMWP as a substitute for protamine in heparin reversal. The in vitro investigations showed that synthesized LMWP efficiently neutralizes heparin using the activated partial thromboplastin time. Anti-protamine/heparin antibodies have low binding properties to LMWP/heparin complexes as indicated in enzyme immunoassay. The ability of platelet-activating anti-protamine/heparin antibodies to induce platelet activation in the functional assay was significantly reduced in the presence of LMWP/heparin compared to protamine/heparin complexes. Owing to findings obtained in our studies, both approaches might be a promising future option to reduce anti-protamine/heparin antibody-mediated adverse effects.
Die Modulation TNFalpha-induzierter Chemokine in humanen endometrialen Stromazellen durch Heparine
(2015)
Die Gründe ungewollter Kinderlosigkeit können sehr vielschichtig sein und reichen im weiblichen Organismus von allgemeinen Risikofaktoren (z.B. Lebensalter) über anatomische Fehlbildungen, bis hin zu Autoimmunerkrankungen des Gerinnungssystems. Darüber hinaus können funktionelle Störungen im Hormonhaushalt oder im Immunsystem einen erfolgreichen Schwangerschaftsverlauf behindern. Trotz rasanter Fortschritte in der Kinderwunschbehandlung bleiben nach wie vor viele Paare kinderlos - ohne genau geklärte Ursache. Wie Forschungen belegen, liegt Schwangerschaftskomplikationen häufig ein Immunmilieu zugrunde, in welchem proinflammatorische Mediatoren überwiegen. Nachweislich bestehen erhöhte Werte von TNF -alpha, einem typischen Vermittler von Entzündungsreaktionen. An diesem Punkt stellen Heparine einen interessanten Therapieansatz dar, weil sie neben ihrer typischen, antikoagulatorischen Wirkung insbesondere auch antiinflammatorische Effekte vermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurde in einem in vitro-Modell mit kultivierten endometrialen Stromazellen (ESC) untersucht, inwiefern Heparine die Produktion proinflam-matorischer Zytokine beeinflussen. Für die Experimente wurden folgende Zytokine gewählt, welche nachweislich im Endometrium vorkommen und durch TNF -alpha in ihrer Produktion gesteigert werden: IL-8, RANTES, GRO- alpha, ENA-78, IL-15, MCP-1, SDF-1 -alpha. Die Ergebnisse zeigten, dass unfraktioniertes Heparin (UFH) und niedermolekulare Heparine (LMWH) die TNF -alpha-vermittelten Effekte der Zytokinproduktion modulieren. Dabei bestand häufig eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der Heparinwirkung und der Molekülgröße des jeweils verwendeten Heparins: Je größer das Molekül, desto stärker war der Effekt und umgekehrt. Ein alleiniger Effekt von Heparinen bei Fehlen von TNF -alpha zeigte sich nicht. Dies wurde zudem durch die Untersuchung verschiedener Signalwege (NF-kB, Erk, Akt) bestätigt. Im Einzelnen stellte sich der Einfluss von Heparinen, abhängig vom betrachteten Zytokin, sehr differenziert dar: In vier der sieben untersuchten Fälle wurde die durch TNF -alpha-induzierte Zytokinproduktion gesteigert (RANTES, ENA-78, IL-15, MCP-1). In einem Fall (IL-8) senkten Heparine die Expressionsraten und bei wiederum einem Zytokin (SDF-1 -alpha) hatten Heparine keinen Einfluss auf TNF- alpha-vermittelte Effekte. Insgesamt kann angenommen werden, dass Heparine das Potential haben, durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften die Zytokinproduktion im endometrialen Stroma moderat so zu verändern, dass günstigere immunologische Bedingungen für die Implantation sowie für Wachstum und Entwicklung des Embryos geschaffen werden. Eine derartige Immunmodulation stellt einen sinnvollen Therapieansatz in der Kinderwunschbehandlung dar.
Bis zu 5% der Patienten, welche unfraktioniertes Heparin erhalten, bilden eine immunogene Thrombozytopenie aus. Komplikationen dieser Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) können gliedmaßen- und lebensbedrohliche Thrombosen sein. Die HIT wird durch Antikörper ausgelöst, die an Komplexe aus dem körpereigenen Protein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin binden. Die Pathogenese der HIT ist weitestgehend aufgeklärt. Jedoch ist immer noch unklar, warum nicht alle Patienten mit anti-PF4/Heparin-Antikörpern eine klinische HIT entwickeln. Testverfahren, die zum Nachweis von anti-PF4/Heparin-Antikörpern aufgereinigte Thrombozyten verwenden sind sensitiver als solche, bei denen Vollblut oder Plättchen-reiches Plasma eingesetzt werden. Daraus ergab sich die Fragestellung, ob Faktoren im Plasma den Durchbruch einer HIT bei Anwesenheit von anti-PF4/Heparin Antikörpern inhibieren können. Ein wichtiger Mechanismus in der Pathogenese der HIT ist die Bindung von PF4 an die Thrombozytenoberfläche. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Plasmafaktoren die PF4-Bindung an Thrombozyten beeinflussen können. Da Blutfette und Zuckerstrukturen ausgeschlossen werden konnten, lag der Fokus auf Proteinen als mögliche Hemmfaktoren. Da nicht nur Plasma, sondern auch Serum die PF4-Bindung inhibieren konnte, kamen keine Gerinnungsfaktoren in Frage. Die gesuchten Faktoren waren auch nicht Hitze sensitiv, sodass es sich auch nicht um Komplementfaktoren handeln konnte. Bei einer Standardmethode zur Aufreinigung von IgG aus dem Serum fiel auf, dass das vom IgG befreite Serum keine hemmende Wirkung mehr auf die PF4-Bindung an Thrombozyten zeigte. Jedoch führte die Substitution mit IgG nicht zu dem erwarteten Hemmeffekt, so dass der gesuchte Faktor ebenfalls bei der Aufreinigung entfernt worden sein musste. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Charakterisierung des Hemmfaktors bildeten eine wichtige Grundlage, um in weiterführenden Versuchen in der gleichen Arbeitsgruppe Fibronektin als möglichen Kandidaten zu identifizieren.
Klinische Studien haben gezeigt, dass Heparin das Überleben von Karzinompatienten unabhängig von seiner antikoagulatorischen Wirkung verlängern konnte. Aufgrund seiner Eigenschaften wie die stark negative Ladung ist eine Interaktion mit vielen Molekülen möglich. Zytokine, zumeist positiv geladen, spielen eine wichtige Rolle im Tumormikromilieu. Sie können die Proliferation, die Invasion sowie das Überleben von Tumorzellen fördern. Die Tumorprogression wird bspw. durch die Zytokine IL-8, RANTES, MCP-1 und HGF verstärkt. Für diese Moleküle ist eine Bindung bzw. Interaktion mit Heparin beschrieben. Ebenfalls werden IL-8, RANTES und MCP-1 vermehrt von endometrialen Adenokarzinomzellen sezerniert, wohingegen HGF vorwiegend von Stromazellen freigesetzt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Heparin auf die Spontanproliferation, Zytokinsekretion und Invasion von humanen endometrialen Adenokarzinomzelllinien untersucht. Die fünf unterschiedlich differenzierten humanen endometrialen Adenokarzinomzelllinien AN3 CA, ECC-1, HEC-1-A, KLE sowie RL95-2 wurden mit verschiedenen Dosen unfraktioniertem Heparin inkubiert. Es erfolgte die Bestimmung der relativen Zellzahl mit Hilfe des Vitalitätsassays CellTiterBlue®, der Zytokinsekretion mittels ELISA sowie der Zytokinexpression mithilfe der real-time RT-PCR. Ebenfalls wurde der Einfluss von verschiedenen niedermolekularen Heparinen und Fondaparinux auf die Zytokinsekretion mittels ELISA untersucht. Des Weiteren wurde das Invasionsverhalten der Zelllinien gegenüber Heparin und Zytokinen im Invasionsassay ermittelt. Der Einfluss von TNF alpha, IL-6 und Heparin auf die HGF-mRNA in endometrialen Stromazellen wurde mittels real time RT- PCR bestimmt. Die Experimente wurden meist sowohl unter Normoxie (21 % Sauerstoff) als auch unter Hypoxie (1 % Sauerstoff) durchgeführt. Heparin hat einen geringen Einfluss auf die Spontanproliferation, der abhängig von der Zelllinie, Heparinkonzentration sowie Dauer der Inkubationszeit war. Ebenfalls beeinflusste es die Zytokinsekretion auf Protein- und Genebene zelllinien- sowie zytokinspezifisch. Bei RL95-2, HEC-1-A und AN3 CA kam es zu einer dosisabhängigen Hochregulation der RANTES Sekretion, wohingegen bei KLE eine Abnahme der MCP-1 und IL-8-Sekretion schon bei der geringsten Dosis nachweisbar war. Diese Effekte waren sowohl unter Normoxie als auch Hypoxie gleichermaßen nachweisbar. Die niedermolekularen Heparine sowie Fondaparinux beeinflussten ebenfalls die Zytokinsekretion. In Abhängigkeit von der jeweiligen Zelllinie, der verwendeten Dosis und der Sauerstoffkonzentration zeigte sich eine Hoch-, eine Herunterregulation oder gar keine Beeinflussung des entsprechenden Zytokins. HGF erhöhte die Invasivität von KLE sowie unter Hypoxie von HEC-1-A. Die Kombination von HGF und Heparin erhöhte die Anzahl der invadierten Zellen bei HEC-1-A und RL95-2 im Vergleich zu unbehandelten Zellen. TNF alpha und IL-6 konnten die HGF-Sekretion in endometrialen Stromazellen teilweise erhöhen, wohingegen Heparin alleine keinen Einfluss hatte. Dahingegen konnte Heparin den durch TNF alpha und IL-6 erhöhten HGF mRNA-Gehalt in endometrialen Stromazellen auf das Ausgangsniveau wieder absenken. Heparin konnte sowohl die Spontanproliferation, die Zytokinsekretion und die Invasivität endometrialer Adenokarzinomzelllinien zelllinienspezifisch modulieren. Ebenfalls konnte es den mRNA-Gehalt endometrialer Stromazellen regulieren. Dadurch kann Heparin das Tumormikromilieu beeinflussen und so in wichtige Prozesse der Karzinogenese wie Wachstum sowie Metastasierung eingreifen. Da dem umliegende Gewebe wie karzinomassoziierte Fibroblasten und Makrophagen eine wesentliche Rolle in der Tumorprogression zukommt, müssen weitere Untersuchungen in Kokulturexperimenten erfolgen, um die Bedeutung von Heparin auf das Tumormikromilieu besser zu verstehen. Diese Beobachtung zeigt die Fähigkeit Heparins neben seiner Rolle als Antikoagulanz in wichtige Prozesse der Tumorinitiation und –progression einzugreifen und macht somit seine Anwendung in weiteren Gebieten neben der Antikoagulation vorstellbar.
Zusammenfassung: Heparin ist ein häufig verwendetes Medikament, das zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen eingesetzt wird. Eine unerwünschte Nebenwirkung des Heparins ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT), die paradoxerweise mit potentiell lebensbedrohlichen arteriellen und venösen Gefäßverschlüssen assoziiert ist. Die Erkrankung wird durch die Bil-dung von Thrombozyten-aktivierenden Antikörpern der Klasse Immunglobulin G (IgG) aus-gelöst. Diese sind gegen Komplexe aus dem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin gerichtet. Die zugrunde liegende B-Zell-vermittelte Immunität entspricht nicht der klassischen Immunantwort und führt zu einer frühzeitigen und transienten Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern der Klassen IgM und IgG. In der vorliegenden Arbeit wurden die B-Zellen, die an der Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern beteiligt sind, identifiziert. Hierfür wurden die Mäuse systemisch mit PF4/Heparin-Komplexen immunisiert. Das Vorliegen einer Immunantwort wurde durch den Nachweis der Antikörperproduktion mittels eines neu entwickelten Fluid-Phase ELISA nach-gewiesen. Der Einsatz von rekombinanten Maus-PF4/Heparin-Komplexen zeigte, dass die beim Menschen für die HIT charakteristisch frühe und transiente Antikörperproduktion auch im Mausmodell auftritt. Diese Immunantwort war spezifisch für PF4/Heparin-Komplexe und konnte nicht durch andere unspezifische Reize wie ein Gewebetrauma oder dem Modellanti-gen Ovalbumin ausgelöst werden. Der Nachweis der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellpopulation(en) wurde durch die Etablierung des Zell-spezifischen Enzym-gekoppelten Immun-Spot Tests (ELISPOT) auf der Fluid-Phase Basis – Detektion der PF4/Heparin-Antikörper-Komplexe in der löslichen Phase – ermöglicht. Unterschiedliche Gewebe/Kompartimente (Milz, Knochen-mark, Peritonealhöhle) von naiven, nicht-immunisierten und PF4/Heparin-immunisierten Mäusen wurden mit diesem Assay auf das Vorliegen von PF4/Heparin-spezifischen B-Zellen untersucht. Während in nicht-immunisierten Mäusen ausschließlich B-Zellen nachgewiesen werden konnten, die anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM produzierten, wurden in immunisierten Mäusen sowohl kurzlebige PF4/Heparin-spezifische IgM (7%)- als auch IgG (25%)-sezernierende B-Zellen detektiert. Die spezifischen Zellen befanden sich in beiden Fällen in der Milz. Dieses Gewebe dient als Nische für follikuläre, Marginalzonen (Mz)- und B1-B-Zellen, wobei sie im Fall der Mz-B-Zellen die einzige Überlebensnische darstellt. Den Hauptanteil der Antikörper-produzierenden Milzzellen bilden die follikulären B-Zellen, deren Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist. Als Hauptquelle der anti-PF4/Heparin-Antikörper konnte diese Zellpopulation ausgeschlossen werden, da T-Zell-defiziente Mäuse nach der Behandlung mit PF4/Heparin weiterhin spezifische Antikörper produzierten. Normale Mäuse, denen vor der PF4/Heparin-Behandlung die Milz und somit die Mz-B-Zellen operativ entfernt wurden, konnten hingegen keine anti-PF4/Heparin-Antikörper mehr bilden. Dies zeigt, dass B1-Zellen allein nicht ausreichend sind, um die anti-PF4/Heparin-Antikörperproduktion zu induzieren, und dass Mz-B-Zellen für die Immunantwort notwendig sind. Der Mechanismus, der die Aktivierung der PF4/Heparin-spezifischen Mz-B-Zellen auslöst, ist bisher nicht im Detail bekannt. Jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die in vitro Stimulation von B-Zellen mit Mitogenen wie CpG und SAC antigenunabhängig zur Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern führt. Dies lässt vermuten, dass neben dem Kontakt mit dem Antigen auch andere immunstimulatorische Faktoren in die Induktion der Immunantwort gegen Maus-PF4/Heparin-Komplexe involviert sind.
Heparin is an anticoagulant drug. It is important in the treatment of deep vein thrombosis,pulmonary embolism and during surgeries. Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is a severe adverse reaction caused by the formation of ultralarge complexes of platelet factor 4 (PF4) with unfractionated heparin (UFH). It can lead to limb loss or fatal events like stroke, myocardial infarction or pulmonary embolism. HIT has an incidence of about 3% in patients receiving anticoagulative heparin treatment. PF4 is a tetrameric protein, released from the α-granules of platelets upon activation. PF4 is known to form antigenic complexes with UFH accompanied by structural changes of PF4. In this thesis, the size and size distribution of PF4 and PF4/heparin complexes were analyzed using asymmetrical flow field-flow-fractionation (AF4), photon correlation spectroscopy (PCS) and atomic force microscopy (AFM). PF4 tends to form auto-aggregates and to adsorb to different surfaces, including regenerated cellulose, polyethersulfone, quartz and glass. The aggregates are less pronounced in solutions at isotonic NaCl concentration. Arginine and Tween 20 were identified as possible ingredients to hinder the auto-aggregation of PF4. Also, it is shown by combining circular dichroism (CD) spectroscopy, atomic force microscopy (AFM) and isothermal titration calorimetry (ITC) with UFH and defined chain length (16-, 8-, 6-, 5-mer) heparins that structural changes (i.e., increase in β-sheets) alone are not sufficient to induce antigenicity. While UFH, 16-, 8-, and 6-mer heparins all induced an increase in the antiparallel β-sheet content to > 30% (as determined by CD spectroscopy), complex antigenicity as measured by anti-PF4/heparin antibody binding in an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) was only induced by UFH and 16-mer heparin. Fondaparinux (5-mer heparin), which forms in vitro non-antigenic complexes with PF4, did not induce structural changes of PF4. Interestingly, the structural changes induced by antigenic UFH and 16-mer heparin but not by non-antigenic shorter heparins were reversible at higher heparin concentrations. Furthermore, the complexes formed by PF4 with longer heparins were larger than those formed with shorter heparins as shown by atomic force microscopy (AFM). UFH, HO16 and HO08 are able to form ultralarge multimolecular complexes with PF4. ITC data indicated strong electrostatic interactions and energetically unfavorable conformational changes of PF4 with longer heparins, while for the short heparins, favorable conformational changes in the structure of PF4 are induced. This explains the reversibility of the structural changes seen for UFH and HO16 upon addition of an over-saturating amount of heparin. Finally, using differential scanning calorimetry (DSC) the thermal stability of PF4 and PF4/heparin complexes was assessed. Despite its tendency to form auto-aggregates, PF4 is a heat-stable protein. This stability is, length dependently, even increased in complex with heparins. This work shows important differences in the binding between PF4 and heparins of different chain length and might be relevant for the understanding of other biological functions of heparins (e.g., involvement in allergic and inflammatory reactions).
The central aim of this thesis was the investigation of protein/polyanion interaction using circular dichroism (CD) spectroscopy, enzyme immune assay (EIA), isothermal titration calorimetry (ITC) and flow cytometry (FC). A further aim was to understand why an endogenous protein becomes immuno-genic when forming a complex. The focus was on the protein platelet factor (PF4), which gained wide interest in the clinical field, due to its role in the life-threatening, immune-driven, adverse drug effect heparin-induced thrombocytopenia (HIT). PF4 is a small homotetrameric chemokine with several basic amino acids on its surface, forming a positively charged ring. The antibodies that are formed during HIT recognize an epitope exposed on PF4, when it is in a complex with heparin at a certain molar ratio at which, PF4 tetramers are aligned on the heparin and forced into close approximation. The main results and conclusions of the thesis are summarized below: 5.1 Evolutionary Conservation of PF4 (Paper I – PF4/Evolution) By carrying out an amino acid sequence survey we found that the positively charged amino acids contributing to the heparin binding site on the surface of PF4 and related proteins are highly conserved in all vertebrates, including fish species. PF4 interacts with the phospholipid lipid A, the innermost part of the lipopolysaccharide (LPS) of Gram negative bacteria. We showed that the shorter the sugar chain of the O antigen, outer and inner core of the LPS were the more PF4 was binding. The interaction of PF4 with lipid A is inhibited by heparin, suggesting that the amino acids known to contribute to heparin binding are also involved in binding to lipid A. 5.2 PF4 Interaction with Polyanions (PA) of varying Length and Degree of Sulfation (Paper II – PF4/PA) CD spectroscopy was found to be a powerful technique to monitor structural changes of PF4 caused by binding to various clinically relevant polyanions. Therefore PF4 was titrated with different PA to investigate the dependencies: i. impact of the PF4:PA molar ratio, ii. degree of polymerization of the PA and iii. degree of sulfation of the PA. In all cases, exposure of HIT-relevant epitope(s) was only observed for PA that also induced changes in secondary structure of PF4. A comparison of results of an immune ¬assay with CD spectroscopic data showed that the extent of complex anti¬genicity correlates well with the magnitude of changes in PF4 secondary structure, and that the structural changes of PF4 have to exceed a certain threshold to achieve PF4/PA complex antigenicity. These findings allowed us to calculate expectation intervals for complex antigenicity solely using CD spectroscopic data. To our knowledge, this was the first demonstration that the capability of drugs to induce antigenicity of PF4 can be assessed without the necessity of in vivo studies or the use of antibodies obtained from immunized patients specific for the antigens. The antigenicity of PF4 in complex is not restricted to negative charges originating from sulfate groups, PA with phosphate groups are also capable (binding to phospholipids). We investigated inorganic polyphosphates (polyP) with a chain length of 75 Pi and showed that the induced secondary structural changes are even higher compared to the changes induced by the different heparins and that the PF4/P75 complexes are antigenic as well. 5.3 PF4 Interaction with defined oligomeric Heparins (Paper III – PF4/defined Heparins) We tested highly purified, monodisperse heparins. In contrast to the clinically relevant but relatively undefined (high polydispersity index) glycosamino glycans reported in paper II (PF4/PA). The defined heparins induced higher secondary structural changes. Here we showed for the first time that strong conformational changes during PF4/PA complex formation are necessary but not sufficient for to the expression of the anti-PF4/heparin antibody binding site. Also, the size of the complexes is not the only prerequisite for anti-PF4/heparin antibody binding (tested by atomic force microscopy). By ITC we found that antigenicity is only induced if the PF4/PA complex has a high binding enthalpy and the complex formation leads to a negative change in entropy. 5.4 PF4/Polyphosphates (polyP) Complex Antigenicity and Interaction with Escherichia coli (E. coli, Paper IV – PF4/polyP) PolyP with chain lengths of 45 Pi and 75 Pi induced remarkable secondary structural changes in the PF4 molecule, thereby exposing the epitope recognized by anti-PF4/heparin antibodies. The induced conformational changes were similar to the changes induced by the defined heparins. Again a high binding enthalpy was observed but here in connection with a positive change in entropy. Further we showed that polyP (≥45 Pi) enhance PF4 binding to the surface of Gram negative E. coli at intermediate concentration and disrupt the binding at elevated polyP concentrations. The increased amounts of PF4 on the bacterial surface also improved the binding of anti-PF4/heparin antibodies and thereby the phagocytosis of the bacteria by poly¬morpho¬nuclear leucocytes. 5.5 Nucleic acid based Aptamers induce structural Changes in the PF4 Molecule (Paper V – PF4/Aptamer) Nucleic acids are another class of molecules containing phosphate groups. Especially after cell damage their extra¬cellular concentration can be locally quite high (>2 mg/ml). We found that certain aptamers form complexes with PF4 and thereby inducing anti-PF4/aptamer antibodies which cross-react with PF4/heparin complexes. Moreover by CD spectroscopy we showed that the protein C-aptamer caused similar secondary structural changes of PF4 like heparin, but already at much lower concentration. The maximally induced changes by the protein-C aptamer were even higher and persisted over a broader concentration range. 5.6 Protamine Interaction with Heparin (Paper VI – PS/Heparin) After the intensive investigation of the complex formation between PF4 and many different classes of PA we assessed another protein for structural changes upon complex formation with heparin. Protamine (PS) a protein in routinely used in post-cardiac surgery to reverse the anticoagulant effects of heparin was found to unfold but not to refold with increasing concentration of PA in solution. 5.7 Conclusion and Outlook When starting this thesis, it was believed that repetitive structures formed by PF4 on a heparin chain mold the epitope recognized by antibodies inducing HIT. These repetitive structures might exhibit similarities with viral capsids and are therefore recognized by the immune system of some patients. We found that induced by the close approximation PF4 changes its conformation, thereby exposing a neoepitope. The conserved positively charged amino acids of the heparin binding site and the involvement of these amino acids in the binding to lipid A confirm our hypothesis of PF4 as part of an ancient immune-mediated host defense mechanism. As possible consequence of the “primitive mechanism of defense” the highly variable O-antigens of LPS might have significantly contributed to an efficient escape mechanism by hiding the structures that made the bacteria vulnerable. In turn polyP might be an adaption of the host improve pathogen recognition by PF4 and further by antibodies inducing phagocytosis of the PF4-marked objects. Although shown only for PF4 and PS, our findings might be applicable to other proteins that also express epitopes upon changes in their secondary structure. Our physicochemical methods may further be applied: i. to drug development for the prediction of antigenicity induced by polyanionic drugs, ii. to guide the development of synthetic heparins and other polyanion based drugs, e.g. aptamers, that do not lead to HIT and iii. to provide relevant aspects for other biological functions of heparins.
Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine seltene, aber lebens-bedrohliche unerwünschte Wirkung einer Therapie mit Heparin. Ausgelöst wird sie durch die Bildung von Antikörpern, die gegen Komplexe aus dem positiv geladenem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und negativ geladenem Heparin gerichtet sind und Thrombozyten aktivieren können, welches sich klinisch in einer schweren prothrombotischen Diathese bei gleichzeitiger Thrombozytopenie äußert. Bemerkenswert ist, dass im Widerspruch zur klassischen Immunantwort bei der HIT auch von Heparin-naiven Patienten binnen weniger Tage anti-PF4/Heparin-Antikörper der Immunglobulinklasse G gebildet werden, welche eigentlich eine sekundäre Immunantwort repräsentieren. Darüber hinaus ist bekannt, dass PF4 auch mit verschiedenen polyanionischen Nichtheparinen Komplexe bildet, die von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Nukleinsäuren, die aufgrund ihres Reichtums an Phosphatgruppen ebenfalls stark negativ geladenen sind, mit PF4 Komplexe bilden, die von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt werden. Da eine Bildung antigener Komplexe mit PF4 für therapeutisch eingesetzte Nukleinsäuren von hoher praktischer Relevanz wäre, wurde außerdem die Interaktion von PF4 mit verschiedenen Aptameren untersucht. Dazu wurde die Interaktion zwischen PF4 und Nukleinsäuren in systematischen Bindungsstudien mit verschieden strukturierten Nukleinsäuren charakterisiert. Mittels Circulardichroismus-Spektroskopie wurde der Einfluss eines Modellaptamers auf die Sekundärstruktur von PF4 mit dem Einfluss von Heparin auf die PF4-Struktur verglichen. Die Kreuzreaktivität von anti-PF4/Heparin-Antikörpern gegen PF4/Nukleinsäure- bzw. PF4/Aptamer-Komplexe wurde mittels Immunassay und Thrombozytenfunktionstest untersucht. Schließlich wurde im Mausmodell die in-vivo-Immunogenität eines PF4/Aptamer-Komplexes überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass Nukleinsäuren längen- und strukturabhängig mit PF4 interagieren. Die Neigung zur Komplexbildung mit PF4 stieg mit der Länge der Nukleinsäure und dem Anteil doppelsträngiger Abschnitte. PF4/Nukleinsäure-Komplexe wurden von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt und konnten in Gegenwart dieser Antikörper eine Thrombozytenaktivierung vermitteln. Mit PF4/Aptamer-Komplexen immunisierte Mäuse produzierten anti-PF4/Aptamer-Antikörper, welche gegen PF4/Heparin-Komplexe kreuzreagierten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass insbesondere Aptamere mit hohem Anteil an doppelsträngigen Abschnitten mit PF4 Komplexe bilden können, die ein ähnliches Epitop exprimieren wie PF4/Heparin-Komplexe und damit ein potentielles Risiko für die Erzeugung HIT-ähnlicher prothrombotischer Komplikationen bergen. Nukleinsäuren könnten einen endogenden Interaktionspartner von PF4 darstellen und das höhere HIT-Risiko von Patienten nach großen orthopädischen Eingriffen oder schweren Infektionen erklären, welche mit höheren Plasmaspiegeln zellfreier Nukleinsäuren einhergehen. Darüber hinaus könnte die Interaktion von PF4 mit endogenen Nukleinsäuren eine Erklärung für die frühe Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörper der Immunglobulinklasse G liefern.
Plättchenfaktor 4 (PF4, CXCL4) ist ein 7.8 kDa stark positiv geladenes Protein, das zur Familie der CXC-Chemokine gehört. PF4 wird als Tetramer in den alpha-Granula von Thrombozyten gespeichert und bei deren Aktivierung freigesetzt. Seine biologische Funktion ist weitgehend unbekannt. Allerdings spielt PF4 eine wichtige Rolle bei der Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT), einer der häufigsten immunologisch bedingten Arzneimittelkomplikationen, die Blutzellen betreffen. PF4 und Heparin bilden Komplexe, die Neoepitope generieren und die Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern induzieren. Resultierende Immunkomplexe aktivieren Thrombozyten Fc-Rezeptor-vermittelt und führen zu einer paradoxen Thrombinbildung. Die Folgen können Thrombozytopenie und lebensbedrohliche Thrombosen sein. Die pathogenen Antikörper sind nicht spezifisch für Heparin und erkennen auch PF4 gebunden an andere Polyanionen. Die Immunantwort der HIT zeigt einige Besonderheiten. Bereits bei erstmaliger Heparinexposition treten anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgG bereits nach 4-6 Tagen auf. Dies kann keine primäre Immunantwort sein, da bei dieser IgG-Antikörper erst deutlich später gebildet werden. Damit muss eine Vorimmunisierung mit natürlich auftretenden PF4/Polyanion-Komplexen stattgefunden haben. Eine mögliche Quelle wären negativ geladene Strukturen, die auf bakteriellen Zelloberflächen vorkommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Bindung von PF4 an Zelloberflächen zu charakterisieren und insbesondere die Frage zu klären, ob PF4 auf der Bakterienoberfläche Komplexe bildet. Zunächst erfolgte die Etablierung einer durchflusszytometrischen Analysemethode zur Messung der PF4-Bindung an Thrombozyten in Abhängigkeit von antikoagulatorischen Polyanionen. Die PF4-Bindung war nicht von der antikoagulatorischen Wirksamkeit der Polyanionen abhängig, sondern von der negativen Ladungsdichte. Geringe Konzentrationen von Heparin haben die PF4-Bindung an Thrombozyten verstärkt, wohingegen hohe Konzentrationen die PF4-Bindung inhibierten. Auch mit PF4 exprimierenden HEK-Zellen konnte eine ladungsabhängige Bindung von PF4 nachgewiesen werden. Als nächstes wurde die Bindung von PF4 an Bakterien untersucht. PF4 hat auch hier, konzentrations- und ladungsabhängig, an Gram-positive und Gram-negative Bakterien gebunden. Mittels der Adsorptions-Elutions-Technik konnte dann gezeigt werden, dass es durch die Bindung von PF4 an Bakterien zur Ausbildung PF4/Heparin-ähnlicher Epitope kommt, welche von anti-PF4/Heparin-Antikörpern aus Patientenserum erkannt werden. Mit einem Phagozytoseassay wurde dann nachgewiesen, dass die durch PF4 vermittelte Bindung der anti-PF4/Heparin-Antikörper an Bakterien die Phagozytose durch polymorph nukleäre Zellen (PMN) fördert. Dass dieser Abwehrmechanismus tatsächlich in vivo bedeutsam ist, konnte in dem Maus-Sepsis-Modell Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) gezeigt werden. Die 6-8 Wochen jungen Mäuse entwickelten ab 3 Tagen nach der CASP-Operation anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM und ab 14 Tagen der Klasse IgG. Dieser Antikörperverlauf passt zur Immunreaktion nach erstmaligem Antigenkontakt und beweist, dass Bakterienkontakt im Rahmen der Sepsis eine primäre Immunisierung gegen PF4/Heparin induzieren kann. Jedoch ist die Sepsis, eine lebensbedrohliche Erkrankung, viel zu selten um das Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern in der Normalbevölkerung (18.8% anti-PF4/Heparin IgM, 6.1% anti-PF4/Heparin IgG) und bei 50% der Patienten nach kardiochirurgischem Eingriff erklären zu können. Eine häufiger auftretende, chronische, bakterielle Infektion ist die Parodontitis. Im Rahmen der SHIP-Studie (Study of Health in Pomerania) konnte dann gezeigt werden, dass der Parodontitis-Status mit dem Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern korreliert. Unterstützend konnte gezeigt werden, dass PF4 auch von parodontalpathogenen Bakterien gebunden wird und darüber die Bindung von anti-PF4/Heparin-Antikörpern ermöglicht wird. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine bislang unbekannte Funktion von PF4 in der anti-bakteriellen Wirtsabwehr. Gleichzeitig wurde die Frage geklärt, warum Patienten, die das erste Mal Heparin erhalten bereits an Tag 4-6 IgG-Antikörper gegen PF4/Heparin bilden. Somit konnte ein wichtiger Beitrag zur pathophysiologischen Erklärung einer der derzeit häufigsten immunvermittelten, unerwünschten Arzneimittelwirkungen geleistet werden. Hinsichtlich der biologischen Bedeutung von PF4 ist von besonderer Wichtigkeit, dass PF4 ladungsabhängig an viele verschiedene Bakterienspezies bindet. Damit sind Antikörper gegen PF4/Polyanion-Komplexe nicht spezifisch für eine Bakterienspezies, sondern können eine Form der Wirtsabwehr darstellen, bei der eine IgG-Spezifität eine Vielzahl von PF4-markierten Bakterien bindet. Es wäre denkbar, dass es sich hierbei um ein grundlegendes, evolutionär altes Abwehrprinzip handelt, dass möglicherweise auch bei anderen immunvermittelten Erkrankungen Relevanz hat.
Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparintherapie. Dabei erfolgt zwischen dem Protein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin eine Komplexbildung, welche wichtig für die krankheitsauslösende Bildung des Antigens ist. Von PF4 existiert eine beim Menschen vorkommende Variante, Plättchenfaktor 4 Variante 1 (PF4var1). Bei PF4 und PF4var1 handelt es sich um Proteine non-alleler Gene. Die Proteine unterscheiden sich an 3 Stellen ihrer Aminosäuresequenz. PF4var1 ist weniger positiv geladen, wodurch die Wechselwirkung mit Heparin beeinflusst wird. Die veränderte Sequenz beeinflusst die Eigenschaften der Proteine. So weist PF4var1 stärkere chemotaktische und anti-angiogenetische Eigenschaften auf als PF4. Auch bei den Signalpeptiden der beiden Proteine liegt eine Änderung vor. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst mit PF4 bzw. PF4var1 kodierendem Gen transformierte humane embryonale Nierenzellen in unterschiedlichen Nährmedien kultiviert. Die Zelllinien wurden hinsichtlich der Produktion, Expression und Sekretion der Proteine PF4 bzw. PF4var1 untersucht. Die angewendeten Untersuchungs¬methoden zur Expression (FACS) bzw. zur Sekretion (ELISA) ermöglichten den Nachweis der Proteine. Eine Differenzierung zwischen PF4 und PF4var1 ist hiermit nicht möglich. Allerdings zeigte die Sequenzierung der Aminosäurestrukturen und der DNA das spezifische Vorliegen von entweder PF4 oder PF4var1. Zur Herstellung von Antikörpern gegen PF4var1 werden große Mengen an PFvar1 benötigt. Da, auch nach Einsatz des Minifermenters, durch die humanen Zellen keine ausreichende Proteinproduktion möglich war, wurde E. coli mit der genetischen Information für PF4 transformiert. Gleiches wurde mit PF4var1 durchgeführt. Hierdurch ist eine Proteinproduktion in größerem Maßstab möglich. Zur Aufreinigung der Proteine mussten spezielle Pufferlösungen eingesetzt werden. Für PF4var1 wurden neu entwickelte Puffer eingesetzt. Derart aufgereinigte Proteine konnten in ESI-ToF-Experimenten erfolgreich unterschieden werden. Durch die hier vorgestellten methodischen Fortschritte dürfte es in nächster Zeit möglich sein neue Erkenntnisse des Zusammenspiels zwischen PF4var1 und HIT zu erlangen.
Retinale Gefäßverschlüsse sind nach der Diabetischen Retinopathie die zweithäufigste Gefäßerkrankung des Auges. Seit der Erstbeschreibung eines Zentralvenenverschlusses im Jahr 1855 durch Liebreich sind zahlreiche Therapien erprobt worden, von denen sich aber nur wenige in der klinischen Routine etablieren konnten. In dieser Arbeit werden niedermolekulare Heparine und unfraktioniertes Heparin bezüglich des Effektes auf die Visusentwicklung und auf das Auftreten neovaskulärer Komplikationen verglichen. Hierzu wurden retrospektiv die Krankenakten von 63 Patienten, die in den Jahren 2006 bis 2008 aufgrund eines retinalen Venenverschlusses stationär behandelt wurden, ausgewertet. Eine Rubeosis iridis (14,3% vs. 55,6%) und ein Sekundärglaukom (9,5% vs. 55,6%) traten bei Zentralvenenverschlüssen in der mit niedermolekularem Heparin behandelten Gruppe signifikant seltener auf. Somit konnte für diese Patientengruppe eine Überlegenheit der niedermolekularen Heparine gegenüber unfraktioniertem Heparin gezeigt werden. Die Visusentwicklung verlief hingegen in der mit unfraktioniertem Heparin behandelten Patientengruppe vorteilhafter, allerdings ohne statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Therapiegruppen hervorzubringen. Ob dies Ausdruck einer Überlegenheit des unfraktionierten Heparins ist, ließe sich mit einer Studie mit größerem Stichprobenumfang klären. Um aber eine Therapieempfehlung für eine der Substanzen aussprechen zu können sind randomisierte placebokontrollierte Studien notwendig. Damit hierbei auch eventuelle negative Effekte der Antikoagulation erfasst werden können, sollte in solchen Studien Wert auf die Quantifizierung von retinalen Hämorrhagien gelegt werden.
Untersuchung zur Assoziation von Antikörpern gegen PF4/Heparin-Komplexe mit Parodontalerkrankungen
(2010)
Ziel dieser Fall-Kontroll-Studie war es, zu evaluieren, ob eine Assoziation zwischen dem Vorliegen einer Parodontitis und dem Vorhandensein von PF4/Heparin-Komplex Antikörpern besteht. PF4 ist ein Chemokin, welches vermehrt durch Thrombozyten bei deren Aktivierung ausgeschüttet wird. PF4 kann Komplexe mit negativ geladenen Molekülen bilden. Die Prototypreaktion ist die Formation von PF4/Heparin-Komplexen. Mit Heparin behandelte Patienten können gegen diese Komplexe Antikörper bilden, die zur komplexen Aktivierung der Blutgerinnung mit erhöhtem Risiko zu thrombembolischen Ergeignissen führen können. Diese Antikörper konnten aber auch in nicht mit Heparin behandelten Patienten nachgewiesen werden. Daraus entwickelte sich die Hypothese, dass parodontale Infektionen/Entzündungen möglicherweise über die Aktivierung der Thrombozyten und vermehrte Freisetzung von PF4 die Formation von PF4-Komplexen und Antikörperbildung induzieren könnten. Das Serum von 937 Blutspendern mit einem Alter von 40 - 60 Jahren wurde auf PF4/Heparin-Komplex Antikörper der Klassen IgG, IgA und IgM (ELISA) untersucht. Zu den 99 positiv getesteten Blutspendern (40 Fallprobanden, mittleres Alter 47,9 Jahre) wurden 40 Kontrollprobanden (mittleres Alter 48,1 Jahre) nach Alter (±2 Jahre), Geschlecht, Rauch- und Bildungsstatus gematcht. Die klinischen Parameter waren Zahnzahl, Sondierungstiefe, Attachmentverlust und Bluten nach Sondieren. 50% der Probanden waren männlich, 35% Nichtraucher, 25% ehemalige Raucher und 40% Raucher. 80% (15%) der Probanden haben ein mittleres (hohes) Bildungsniveau. Die Probanden der Fallgruppe hatten einen schlechteren parodontalen Gesundheitszustand als die Kontrollgruppe. Das Risiko eines positiven PF4/Heparin-Komplex-Antikörper-Status’ war 2 bis 7-fach erhöht bei schweren mittleren Sondierungstiefen wie auch bei moderatem und schwerem mittleren Attachmentverlust. Die vorliegende Untersuchung zeigte, dass parodontal erkrankte Probanden ein höheres Risiko für das Auftreten von anti-PF4/Heparin Antikörpern aufwiesen als parodontal gesündere Probanden. Parodontitis könnte mit dem Auftreten von natürlichen anti-PF4/Heparin-Komplex Antikörpern assoziiert sein. Um einen möglichen kausalen Zusammenhang zu evaluieren, sind weitere Studien mit größerem Stichprobenumfang und longitudinalem Design erforderlich.
Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II ist eine antikörpervermittelte Immunreaktion. Nur ein Teil der HIT-Patienten entwickelt allerdings lebensbedrohliche Komplikationen wie Thrombosen. Faktor V Leiden, die Prothrombin G20210A-Mutation und der Methylentetrahydrofolatreduktase(MTHFR)-C677T-Polymorphismus gelten als genetische Risikofaktoren für die Entstehung von Thrombosen. In der vorliegenden Arbeit wird der Stellenwert der drei Mutationen als mögliche Risikofaktoren für die Entstehung HIT-assoziierter Thrombosen untersucht. In der Gruppe aller untersuchten HIT-Patienten ließ sich keine signifikant erhöhte Inzidenz der Faktor-V-Leiden-Mutation, des Prothrombin G20210A und des MTHFR-C677T-Polymorphismus im Vergleich zu Kontrollgruppen nachweisen. Auch bei den einzelnen Untergruppen der mit thrombembolischen Komplikationen symptomatischen HIT-Patienten zeigte sich kein Zusammenhang zwischen dem Vorliegen der Mutationen mit venösen oder arteriellen HIT-assoziierten Thrombosen. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, daß keine der drei untersuchten Mutationen ein herausragender Risikofaktor für die Manifestation thrombembolischer Komplikationen bei HIT-Patienten darstellt.