Open Access

Abstract A N‐heterocyclic olefin (NHO), a terminal alkene selectively activates aromatic C−F bonds without the need of any additional catalyst. As a result, a straightforward methodology was developed for the formation of different fluoroaryl‐substituted alkenes in which the central carbon–carbon double bond is in a twisted geometry.

The widespread use of natural and synthetic estrogens or chemicals with estrogenic activities is causing an increasing accumulation of estrogenic compounds in the environment. Already at very low concentrations these estrogenics can severely affect the wildlife, particularly in an aquatic environment. For these reasons measuring devices for detecting estrogen contaminations are in great demand. The majority of the analytical methods and bioassays on the market so far, lack semi-online adaptability, and usually cannot be used for automatic and continuous determination. Therefore, we have embarked on the development of new systems, which are able to fulfil those demands. The EstraMonitor combines recombinant A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK yeast cells as the microbial component with an amperometric detection method to analyze estrogenic contaminations. A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK was constructed by Kaiser et al. (2010). These cells were engineered to co-express the human estrogen receptor (hERa) gene and the inducible phytase (phyK, derived from Klebsiella sp. ASR1) reporter gene under control of a promoter with estrogen response elements (EREs). In the presence of estrogenic substances, such as 17ß -estradiol (E2), the phyK gene is expressed and recombinant phytase is secreted into the media. The level of phytase is quantified by amperometric detection using substrate p-aminophenyl phosphate (p-APP). Phytase dephosphorylates p-aminophenyl phosphate (p-APP) into an intermediate product p-aminophenol (p-AP). p-AP is electroactive and oxidized at the electrode. This generates electrons and produces a current which is proportional to the level of phytase activity. Since phytase activity is directly correlated to the E2 concentration, the estrogenic activity can thus be calculated from the current measured. The microbial component of the EstraMonitor, the non-immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK, works well with the amperometric method in a quantitative manner. The optimal applied potential determined for amperometric measurements was 150 mV and provided a low background signal for the amperometric detection. The half maximal effective concentration (EC50) and limit of detection (LoD) values for E2 obtained from amperometric measurements with the EstraMonitor were 69.9 ng L-1 and 44.5 ng L-1, respectively. The measuring procedure of the EstraMonitor system including incubation of A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells with E2, subsequently incubation with electrochemical substrate (p-APP), and signal recordation is completed within only 4 h and 10 min. Out of this total time, amperometric detection including substrate incubation and signals recordation takes only 10 min out of total time. The use of immobilized cells for a microbial biosensor is an essential advantage of the EstraMonitor system because it allows easy-handiness next to long-term stability and reusability. Immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells revealed excellent properties which make them very suitable for semi-online, automatic and continuous monitoring. They were stable up to 30 days when stored at 4 °C. Furthermore, they could be reused up to 15 times. The EC50 and LoD values achieved for E2 using immobilized cells in combination with amperometric detection were 20.9 and 8.3 ng L-1, respectively. Furthermore, this application also removes the need to separate cells by centrifugation, to sterilize the samples as well as to cultivate repeatly. Additionally, both immobilized and non-immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells remain fully functional in a wide range of untreated wastewater samples and in environments containing up to 5% NaCl. To enhance the sensitivity and reduce the time for estrogenic determination, an alternative A. adeninivorans G1214/YRC103-hERa-phyK strain was developed. This strain can produce a detectable amount of phytase within 2 h after induction with E2. It offers an improved microbial component in terms of sensitivity and time-effectiveness. In addition, to reduce the cost for estrogenic detection an alternative substrate, ascorbic acid 2-phosphate (AA2P), was tested. AA2P, which is both cheap and widely available, performed better than p-APP. The EC50 and LoD values for E2 obtained with AA2P were 15.69 and 0.92 ng L-1 versus 20.09 and 8.3 ng L-1 when examined with p-APP, respectively. Taken together, the EstraMonitor is an automated system with respect to sample cycling, sample measuring and calibration supplemented with an alarm function. This system makes it possible to control estrogenic activity semi-online, automatically and continuously. These are advantages of the EstraMonitor compared to other estrogenic detection systems. It can thus be concluded that, the EstraMonitor is a powerful and feasible semi-online device for monitoring estrogenic activity especially adapted for the use in sewage treatment plants.

Abstract Halide assays are important for the study of enzymatic dehalogenation, a topic of great industrial and scientific importance. Here we describe the development of a very sensitive halide assay that can detect less than a picomole of bromide ions, making it very useful for quantifying enzymatic dehalogenation products. Halides are oxidised under mild conditions using the vanadium‐dependent chloroperoxidase from Curvularia inaequalis, forming hypohalous acids that are detected using aminophenyl fluorescein. The assay is up to three orders of magnitude more sensitive than currently available alternatives, with detection limits of 20 nM for bromide and 1 μM for chloride and iodide. We demonstrate that the assay can be used to determine specific activities of dehalogenases and validate this by comparison to a well‐established GC‐MS method. This new assay will facilitate the identification and characterisation of novel dehalogenases and may also be of interest to those studying other halide‐producing enzymes.

The focus of the first two articles was the engineering and application of enzymes for the conversion of the bio-based resources glycerol and its oxidation product glyceraldehyde for the production of the value added product glyceric acid. Article III focuses on the cloning, exploration and engineering of a polyol dehydrogenase, which later on was used as cofactor recycling system in order to produce ε-caprolactone from cyclohexanol as presented in arti-cle IV. The following paragraphs will give a short outline of each article. ARTICLE I: ASYMMETRIC SYNTHESIS OF D-GLYCERIC ACID BY AN ALDITOL OXIDASE AND DIRECTED EVOLUTION FOR ENHANCED OXIDATIVE ACTIVITY TOWARDS GLYCEROL. GERSTENBRUCH, S., WULF, H., MUßMANN, N., O’CONNELL, T., MAURER, K.-H. & BORNSCHEUER, U. T. (2012). Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1243-1252. The alditol oxidase of Streptomyces coelicolor A3(2) (AldO) was used to catalyze the oxida-tion of glycerol to glyceraldehyde and glyceric acid. The enantioselectivity for the FAD-de-pendent glycerol oxidation was elucidated and different strategies were used to enhance the substrate specificity towards glycerol. Directed evolution by error-prone PCR led to an AldO double mutant with 1.5-fold improved activity for glycerol. Further improvement of activity was achieved by combination of mutations, leading to a quadruple mutant with 2.4-fold higher specific activity towards glycerol compared to the wild-type enzyme. In small-scale biotransformation concentrations up to 2.0 g•l-1 D-glyceric acid could be reached using whole cells. Investi¬gation of the effects of the introduced mutations led to a further identification of es¬sential amino acids with respect to enzyme functionality and structural stability. ARTICLE II: KINETIC RESOLUTION OF GLYCERALDEHYDE USING AN ALDEHYDE DEHYDROGENASE FROM DEINOCOCCUS GEOTHERMALIS DSM 11300 COMBINED WITH ELECTROCHEMICAL COFACTOR RECYCLING. WULF, H., PERZBORN, M., SIEVERS, G., SCHOLZ, F. & BORNSCHEUER, U. T. (2012). J. Mol. Catal. B Enzym. 74, 144-150. Two aldehyde dehydrogenases (ALDH) from Escherichia coli BL21 and Deinococcus geother-malis were cloned, characterized and evaluated according to their applicability for a bio-catalysis setup with electrolytic cofactor recycling. Both ALDHs turned out to have a sim¬ilar substrate scope and favor short to medium chain aldehydes and both oxidize glyceralde¬hyde to D-glyceric acid. The ALDH variant of D. geothermalis shows higher specific activity towards glyceraldehyde and has an elevated optimum temperature compared to the BL21 enzyme. Due to the higher specific activity of the ALDH of D. geothermalis, this enzyme was used to conduct a kinetic resolution of glyceraldehyde with electrolytic NAD+ recycling at a glassy carbon foam electrode with ABTS as redox mediator yielding in 1.8 g•l-1 glyceric acid. ARTICLE III: PROTEIN ENGINEERING OF A THERMOSTABLE POLYOL DEHYDROGENASE. WULF, H.*, MALLIN, H.*, BORNSCHEUER U.T. (2012). Enzyme Microb. Technol. 51, 217-224 (*equally contributed). The new enzyme polyol dehydrogenase PDH-11300 from D. geothermalis was extensively characterized regarding its temperature optimum and thermostability. A peptide stretch responsible for substrate recognition from the PDH-11300 was substituted by this particular stretch of a homolog enzyme, the galactitol dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides (PDH-158), resulting in a chimeric enzyme (PDH-loop). The substrate scopes were deter-mined and basically the chimeric enzyme represented the average of both wild-type en-zymes. A rather unexpected finding was the notably increased T5060, by 7°C to 55.3°C, and an increased specific activity against cyclohexanol. Finally, the cofactor specificity was suc¬cess-fully altered from NADH to NADPH by an Asp55Asn mutation, which is located at the NAD+ binding cleft, without influencing the catalytic properties of the dehydrogenase. ARTICLE IV: A SELF-SUFFICIENT BAEYER-VILLIGER BIOCATALYSIS SYSTEM FOR THE SYNTHESIS OF Ɛ-CAPROLACTONE FROM CYCLOHEXANOL. MALLIN, H. *, WULF, H. *, BORNSCHEUER U.T. (2013). Enzyme Microb. Technol., online, DOI: 10.1016/j.enzmictec.2013.01.007 (*equally contributed). The application of the engineered PDH-loopN mutant [1] (Article III) for the production of ε-caprolactone from cyclohexanol was investigated in a co-immobilization approach with the cyclohexanone monooxygenase from Acinetobacter calcoaceticus. Biotransformation with solubilized enzymes led to an isolated yield of 55% pure ε-caprolactone with no residual cy-clohexanol to be detected. During the immobilization experiments a higher enzyme ratio in favor of the CHMO led to higher reaction velocities. Similarly, the addition of soluble fresh CHMO during reuse of co-immobilization batches significantly increased the activity identi-fying the CHMO as the bottleneck in this reaction setup.

Metabolomics is the scientific study of metabolites of an organism, cell, or tissue. Metabolomics makes use of different analytical approaches. In this thesis, an analytical platform consisting of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS, EI/quadrupol) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS, ESI/TOF) was used for metabolite analysis. Due to the high physicochemical diversity of metabolites, the usage of different analytics is profitable. Focusing on metabolome analysis of microorganisms, the development of viable protocols was prerequisite. To ensure metabolome samples of best possible quality, particularly the sampling procedure has to be optimized for each microorganism to be analyzed individually. In microbial metabolomics, the energy charge value is a commonly used parameter to assure high sample quality (Atkinson 1968). The pathogenic bacterium Staphylococcus aureus and the biotechnical relevant bacterium Bacillus subtilis were main target of research. The sampling protocol development “A protocol for the investigation of the intracellular Staphylococcus aureus metabolome” (Meyer et al. 2010) and “Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis”s (Meyer et al. 2013) confirmed the need for development and verification of viable protocols. It was observed, that minor differences in the sampling procedure can cause major differences in sample quality. Using the validated analytical platform and the optimized protocols, we were able to investigate the metabolome of S. aureus and B. subtilis under different conditions. Investigations of the pathogenic bacterium S. aureus are of major interest due to its increasing resistance to antibiotics. Methicillin (multi)-resistant S. aureus (MRSA) strains are responsible for several difficult-to-treat infections. The cell wall of bacteria is the target of an array of antibiotics, like the beta-lactam antibiotics. Our study “A metabolomic view of Staphylococcus aureus and Its Ser/Thr kinase and phosphatase deletion mutants: Involvement in cell wall biosynthesis” (Liebeke et al. 2010) revealed the influence of the serine-threonine kinase on cell wall biosynthesis of S. aureus. LC-MS based metabolome data uncovered prevalent wall teichoic acid precursors in the serine-threonine kinase deletion mutant (ΔpknB), and predominantly peptidoglycan precursors in the phosphatase deletion mutant (Δstp), compared to the S. aureus wild type strain 8325. This uncovered a so far undescribed importance of the serine-threonine kinase on the cell wall metabolism and provides new insights into its regulation. The nasopharynx and the human skin are often the ecological niche of S. aureus. Furthermore, S. aureus exists outside its host, for example on catheters. Depending on its niche, S. aureus is exposed to several stress factors and limitation conditions, such as carbon source limitation and starvation. To cope with the latter, a number of regulatory cellular processes take place. In “Life and death of proteins: a case study of glucose-starved Staphylococcus aureus” (Michalik et al. 2012) protein degradation during glucose starvation was monitored. An intriguing observation was that proteins involved in branch chain amino acid biosynthesis and purine nucleotide biosynthesis were distinctly down-regulated in the clpP mutant. This lead to the assumption of a stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Intracellular metabolome data revealed higher GTP concentrations in the clpP mutant. This may explain the higher CodY activity and thereby stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Since different S. aureus strains are known to colonize different niches, global carbon source (glucose, glucose 6-phosphate, glycerol, lactate, lactose and a mixture of all) and carbon source limitation dependent exo-metabolome analyses were performed using three different S. aureus strains (HG001: laboratory strain, EN493: human endocarditis isolate and RF122: bovine mastitis strain). The most apparent observation was that RF122 can utilize lactose best, while EN493 and HG001 are better at utilizing glucose-6-phosphate compared to the bovine RF122 strain. Bacillus subtilis is an extensively studied Gram-positive and non-pathogenic bacterium. In the functional genomics approach “System-wide temporal proteomics profiling in glucose-starved Bacillus subtilis” (Otto et al. 2010) growth phase dependent changes in the proteome, transcriptome and extracellular metabolome were monitored. By mass spectrometric analysis of five different cellular subfractions, ~ 52% of the predicted proteins could be identified. To confirm and complete the proteomic data transcriptome and extracellular metabolome analyses were performed. The extracellular metabolome data ensured that cells were glucose-starved and revealed growth phase dependent metabolic footprints. In “A time resolved metabolomics study: The influence of different carbon sources during growth and starvation of Bacillus subtilis” ((Meyer et al. 2013) submitted) four different compounded cultivation media were investigated as only glucose, glucose and malate, glucose and fumarate and glucose and citrate as carbon source. It could be shown, that B. subtilis is able to maintain an intracellular metabolite homeostasis independent of the available carbon source. On the other hand, in the exo-metabolome, carbon source as well as growth phase dependent differences were detected. Furthermore, in this study the influence of ATP and GTP on the activation of the alternative RNA polymerase sigma factor B (σB) was discussed. The concentration of ATP and GTP decreased for all conditions, as cells entered the stationary growth phase. While cell growth on solely glucose and during growth on glucose and additional malate, the ATP and GTP concentrations increased slightly when the consumption of the second carbon source was initiated. Only under these conditions, a considerable σB activity increase during the transition from exponential to stationary growth phase was observed. Furthermore, the developed sampling protocol for metabolome analysis of B. subtilis enabled us to be part of a “multi omics” system biological approach to study the physiological adjustment of B. subtilis to cope with osmotic stress under chemostat conditions.

In this thesis, all three BVMOs from Pseudomonas putida NCIMB10007, that were known to be responsible for the ability of this strain to degrade camphor since the 1950s were successfully made available as recombinant biocatalysts. While the genomic sequence of 2,5-DKCMO was available from the database, the genes encoding 3,6-DKCMO and OTEMO had to be identified using certain PCR-techniques first. All three enzymes were cloned into standard plasmids enabling convenient expression in E. coli facilitating the application of the enzymes in organic chemistry. Their synthetic potential was already reported during the 1990s, but at that time their efficient application was limited due to difficulties with respect to low production levels and insufficient purity and separation of enzyme fractions. These drawbacks are now overcome. Furthermore, biochemical characterization of the camphor-degrading BVMOs was performed including the substrate spectra of these enzymes. Thereby OTEMO turned out not only to have a broad substrate scope accepting mono- and bicyclic aliphatic and arylaliphatic ketones, but also to efficiently convert alpha/beta-unsaturated cycloalkanones due to the similarity of these compounds to OTEMOs natural substrate. Finally, the major limitation in the synthetic application of Type II BVMOs was addressed by searching a flavin-reductase suitable for coupling to these two-component oxygenases. Putative candidates from the respective P. putida strain were identified by the use of amino acid motifs conserved in other representatives of two-component systems. While these enzymes failed, flavin-reductase Fre from E. coli - that also contained the motifs - was shown to enhance the activity of the DKCMOs when applied as crude cell extract as well as pure enzyme. This finding represents a key step for future application of Type II BVMOs.

This thesis investigates the biocatalytic synthesis of amines and amino alcohols. The applicability and economic feasibility of biocatalysis for chiral amine synthesis is reviewed and the findings were compared to established chemical processes using relevant process parameters (TON, TOF and STY). This review clearly showcases the potential of biocatalysis for the synthesis of chiral amines and provides a valuable guide for synthetic chemists who want to benefit from these new opportunities. Next, biocatalysis is applied for the synthesis of an amino alcohol with two stereocentres: A novel route for the synthesis of all four stereoisomers of 4-amino-1-phenylpentane-2-ol is presented. Enzymes were applied to install both stereocentres successively, which allowed the selective synthesis with high yields and optical purities. A small scale preparative asymmetric transamination yielded one amino alcohol stereoisomer selectively. The approach presented in this thesis provides a valuable option for the synthesis of this compound class as it is highly selective, step efficient and circumvents the need for protecting groups as well as transition-metal catalysis. The substrate scope of an (S)-selective amine transaminase (ATA) was altered in order to expand the applicability for amino alcohol synthesis. Protein engineering was conducted to enlarge the small binding pocket. Small scale preparative synthesis of the 1,2-amino alcohol (R)-phenylglycinol exemplifies the applicability of the evolved variants for the asymmetric synthesis of this compound. The designed variants expand the collection of ATAs that are suitable for the synthesis of amino alcohols with bulkier substituents. To deepen the understanding of ATAs further, a class III TA family wide analysis (which includes (S)-selective ATAs) is presented. After comparing the active site architectures and performing literature research amino acids were identified that correlate with the reaction- and substrate specificity of the enzymes within this family. This information is compiled in a sequence-function matrix, which allows the prediction of the main activity of biochemically uncharacterised enzymes from their sequence. These insights provide a better understanding of the activity determining residues in (S)-ATAs and class III TAs in general.

Bei der Arzneimittelentwicklung liegt der Fokus nicht nur auf der Wirksamkeit und Sicherheit einer pharmakologisch aktiven Substanz, sondern auch auf einer möglichst einfachen, idealerweise oralen Applikation. Um die benötigten Wirkstoffkonzentrationen im Zielorgan zu erreichen, wird die einzunehmende Dosis eines Medikaments in Abhängigkeit der präsystemischen Elimination ermittelt. Inzwischen ist bekannt, dass nicht ausschließlich der hepatische, sondern auch der intestinale Stoffwechsel die orale Bioverfügbarkeit eines Medikaments wesentlich beeinflussen kann. Arzneistoffe, die während der Darmpassage einer starken Metabolisierung unterliegen, sind zudem prädestiniert für unerwünschte Interaktionen mit anderen Substanzen, welche die entsprechenden Stoffwechselenzyme hemmen oder induzieren. Für die Abschätzung pharmakokinetischer Parameter eines neuen Wirkstoffs sind daher Kenntnisse zur Expression sowie Funktion klinisch relevanter intestinaler Stoffwechselenzyme von Bedeutung. Bisher publizierte Daten basieren größtenteils auf der Genexpression, obwohl aufgrund posttranskriptionaler Prozesse nicht zwingend Aussagen zur resultierenden Proteinmenge getroffen werden können. Die verfügbaren Daten zum intestinalen Proteingehalt wurden mittels immunologischer Methoden erhoben, die erhebliche Limitationen in Bezug auf Spezifität, Reproduzierbarkeit und Robustheit aufweisen. Diese Aspekte finden bei den inzwischen etablierten LC-MS/MS-basierten Targeted-Proteomics-Methoden Berücksichtigung. Dazu werden die Proteine einer Messprobe enzymatisch gespalten, um entstehende proteospezifische Peptide zur Quantifizierung der Proteine von Interesse zu nutzen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung und Validierung einer entsprechenden Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 sowie UGT2B15 in biologischen Matrices, welche die aktuell gültigen Leitlinien in Bezug auf Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision und Stabilität erfüllt. Bereits bei der ersten Anwendung der Methode zur Quantifizierung der Enzyme in kommerziell erhältlichen und selbst isolierten Mikrosomen zeigte sich, welchen erheblichen Einfluss die Probenvorbereitung auf die ermittelten Proteingehalte hat. Diese Erkenntnis wurde im Rahmen eines internationalen Projektes bestätigt, bei dem humane Leberproben desselben Ursprungs in diversen Laboren mit den dort etablierten Methoden prozessiert worden sind. Bezogen auf die eingesetzte Gewebemenge ergaben sich bei der Messung der Mikrosomen 6 - 30-fach geringere Enzymgehalte als bei der Analyse des nicht-fraktionierten Gewebes, da die subzelluläre Aufspaltung einer Probe mit erheblichen Proteinverlusten einhergeht. Folglich wurden alle weiteren Untersuchungen zur absoluten Enzymquantifizierung unter Verwendung von filterbasierten Zentrifugaleinheiten (filter aided sample preparation; FASP) mit Gesamtgewebelysatproben durchgeführt. Sowohl die optimierte Probenaufarbeitung als auch die validierte Targeted-Proteomics-Methode fanden bei der Untersuchung der Darmsegmente von 9 Spendern Anwendung, wobei jeweils Gewebe aus dem Duodenum, oberen und unteren Jejunum, Ileum sowie Colon zur Verfügung stand. Von den 13 untersuchten Enzymen wurden in allen Dünndarmabschnitten nur CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, UGT1A1, UGT1A3 und UGT2B7 nachgewiesen, deren Gehalt im Jejunum am höchsten war. Im Colon wurde auf Proteinebene keines der Metabolisierungsenzyme detektiert. Die entsprechenden Genexpressionsdaten dieser 8 Enzyme korrelieren signifikant mit den ermittelten Proteinwerten. Korrespondierend zur fehlenden Nachweisbarkeit der übrigen 5 Enzyme auf Proteinebene waren die Gene CYP2B6, CYP2C8, CYP2E1 sowie UGT2B15 nur sehr geringfügig und CYP1A2 gar nicht exprimiert. Zur Charakterisierung der metabolischen Aktivität der intestinalen Enzyme wurde eine weitere LC-MS/MS-basierte Methode entwickelt und validiert. Als Modellsubstrate fungierten Diclofenac (CYP2C9), Omeprazol (CYP2C19), Dextromethorphan (CYP2D6), Midazolam (CYP3A), Ezetimib (UGT1A) und Naloxon (UGT2B7). Die begrenzte Verfügbarkeit des intestinalen Gewebes sowie dessen sehr geringer mikrosomaler Proteingehalt stellten besondere Anforderungen an die Sensitivität der Methode. Ihre Eignung zur Charakterisierung der intestinalen Metabolisierungsaktivität wurde bei der Anwendung auf ein jejunales Mikrosomen-Gemisch gezeigt. Die im Rahmen dieser Arbeit generierten Daten zur Expression klinisch bedeutsamer Metabolisierungsenzyme entlang des humanen Darms tragen zu einem besseren Verständnis des intestinalen First-Pass-Metabolismus bei. Diese Kenntnisse können sowohl bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe als auch für die Erstellung von Physiologie-basierten pharmakokinetischen Modellen (PBPK-Modellen) nützlich sein, um die orale Bioverfügbarkeit sowie das Interaktionspotential pharmakologisch aktiver Substanzen abzuschätzen.

Der Einsatz von Enzymen ist inzwischen für viele Bereiche der chemischen und pharmazeutischen Industrie beschrieben. Dabei ermöglichen die Enzyme als Biokatalysatoren in vielen Fällen Syntheserouten, die umweltverträglichere Wege zum gewünschten Produkt darstellen als die vergleichbaren etablierten chemischen Routen. Insbesondere ihre oft stereo-, regio- und chemoselektiven Umsätze eröffnen Zugang zu wichtigen pharmazeutisch relevanten Produkten und Zwischenprodukten. Nach wie vor gibt es aber in vielen Enzymklassen Bedarf nach neuen oder verbesserten Enzymen. Insbesondere bei den oxidativen Enzymen erfüllen die zur Zeit vorhandenen Biokatalysatoren oftmals nicht die Anforderungen hinsichtlich Aktivität, Stabilität oder Selektivität. Das Auffinden neuer Biokatalysatoren, die eine Transformation von chemokatalysierten zu enzymatischen Prozessen ermöglichen, stellt die Motivation für die vorliegende Arbeit dar. Um Zugang zu neuen Enzymen zu erlangen, bestehen die klassischen Wege in einer Anreicherungskultur aus einer Umweltprobe und der nachfolgenden Isolierung von Organismen mit der gewünschten Enzymaktivität, oder in der Suche in einer bereits angelegten Stammsammlung. Die meisten Mikroorganismen können jedoch unter Laborbedingungen nicht kultiviert werden. Der Metagenom-Ansatz öffnet den Zugang zu eben diesen Enzymen. Dazu wird der Kultivierungsschritt umgangen und die DNA der Umweltprobe direkt isoliert. Diese metagenomische DNA kann anschließend entweder über ein Aktivitäts-basiertes oder über ein Sequenz-basiertes Screening auf bestimmte Enzyme hin untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Aktivitäts-basierte Ansatz gewählt, da auf diese Weise völlig neue Enzyme gefunden werden können, die keine Homologie zu bereits beschriebenen aufweisen. Als Grundlage für das Screening wurden metagenomische Bibliotheken aus verschiedenen Umweltproben angelegt. Um die Zahl der zu durchmusternden Klone gering zu halten, wurde ein Großteil der DNA in Cosmide kloniert. Als mikrobieller Wirt für die rekombinante Expression der Proteine wurde Escherichia coli gewählt. Der Prozess des Screenings stellte den wesentlichen Teil der Arbeit dar. Dazu wurden verschiedene Enzymassays adaptiert, um die enzymatisch gebildeten Produkte zu detektieren. In vielen Fällen wurde dies durch die Bildung farbiger Produkte ermöglicht, die spektrophotometrisch detektiert werden konnten. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag dabei auf den oxidativen Enzymen, insbesondere den Monooxygenasen. Verschiedene Gruppen von Monooxygenasen wurden dabei betrachtet: Styrol-Monooxygenasen, P450-Monooxygenasen sowie Baeyer-Villiger-Monooxygenasen. Außerdem wurden die metagenomischen Bibliotheken auf Oxidasen durchmustert. Neben oxidativen Enzymen wurde nach Transaminasen, Esterasen, Proteasen und Phosphatasen gescreent. Zwei metagenomische Esterasen und drei Phosphatasen konnten auf diese Weise gefunden werden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die unterschiedlichen Wege, über den Aktivitäts-basierten Metagenom-Ansatz zu neuen oxidativen Enzymen zu gelangen, ausführlich diskutiert. Der Fokus lag dabei auf der Wahl der Biotope für das Anlegen der metagenomischen Bibiotheken, den DNA-Isolierungsmethoden sowie der Nachweisempfindlichkeit und Hochdurchsatz-Fähigkeit der verwendeten Assays. Des Weiteren wurde der Zusammenhang zwischen der erwarteten Größe der Gene und der durchmusterten Bibliothek diskutiert. Dabei wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass der Metagenom-Ansatz grundsätzlich ein großes Potential zur Identifizierung neuer Enzyme für die Biotechnologie birgt, aber Grenzen beim Auffinden großer, komplexer oder seltener Enzyme aufweist.

Because heavy metal ions prefer to bind sulfur, inspired by molybdopterin the main goal of this work was combining dithiolene binding moieties with optically active substituents with the aim to detect/capture metal ions, which could preferably bind to the dithiolene moiety of for instance MPT. Therefore a number of dithiolene based molecules mimicking the natural immediate coordination sphere composition of Mo and W dependent oxidoreductase enzymes were synthesized and characterized by NMR, MS, IR, X-ray crystallography, UV-Vis, EPR and electrochemical methods. In order to work at the lowest possible base concentration due to potentially base sensitive substituents and reaction partners, the procedure for the de-protection of the ligand precursors and the in situ complexation reaction was first optimized in course of the work and interim we explored the surprising fact that the ring opening reaction of the 1,3- dithiol-2-one system is fully reversible and can be controlled simply by adjusting the pH-value of the solution. Then, the coordination behavior of the de-protected ligands towards different metal ions, including biologically relevant ions like Cu+, Cu2+, Fe3+ was tested. As the optically active substituents necessarily possess interesting electronic properties, a second focus of this work was to utilize the developed ligand systems for MoCo and WCo models and to investigate their potential catalytic activity in the model oxotransfer reaction between DMSO and PPh3 in order to evaluate the substituent’s effect on the dithiolene binding moiety.

Within this thesis the protein engineering, immobilization and application of enzymes in organic synthesis were studied in order to enhance the productivity of diverse biotransformations. Article I is a review about Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) and provides a detailed overview of the most recent advantages in the application of that enzyme class in biocatalysis. Protein engineering of a former uncharacterized polyol-dehydrogenase (PDH) identified in the mesothermophilic bacterium Deinococcus geothermalis 11300 is described in Article II. Article III covers the combination of one PDH mutant with a BVMO in a closed-loop cascade reaction, thus enabling direct oxidation of cyclohexanol to ε-caprolactone with an internal cofactor recycling of NADP(H). Article IV and Article V report a process optimization for transamination reactions due to a newly developed immobilization protocol for five (S)- and (R)-selective aminotransferases (ATA) on chitosan support. Furthermore, the immobilized ATAs were applied in asymmetric amine synthesis. In Article VI, an ATA immobilized on chitosan, an encapsulated BVMO whole cell catalyst and a commercially available immobilized lipase were applied in a traditional fixed-bed (FBR) or stirred-tank reactor (STR), and were compared to a novel reactor design (SpinChem, SCR) for heterogeneous biocatalysis.

In this work, the discovery, expression and characterization of new eukaryotic Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) from yeasts has been shown. A rational design of one of these enzymes led to the identification of key residues to alter the sulfoxidation activity of this group of enzymes. Additionally, in another rational design approach, the cofactor specificity of the BVMO cyclohexanone monooxygenase from Acinetobacter calcoaceticus could be substantially altered to accept the much cheaper and therefore industrially more relevant cofactor NADH.

Die akute Pankreatitis ist durch eine vorzeitige intraazinäre Proteasen-Aktivierung gekennzeichnet, wobei diese im Verlauf der Erkrankung durch eine zunehmende Immunantwort mit in das Pankreas infiltrierenden Immunzellen ergänzt wird. Eine besondere Bedeutung hat die intrazelluläre Aktivierung der Serinprotease Trypsinogen, die in Abhängigkeit der lysosomalen Hydrolase Cathepsin B (CTSB) verläuft. Wir konnten zeigen, dass verschiedene lysosomale Proteine (Cathepsin D (CTSD), Cathepsin C (CTSC)) nach pathologischem Stimulus in das sekretorische Kompartiment (Zymogengranula) umverteilt werden. Cathepsin D ist in der Lage, das Schlüsselenzym Cathepsin B zu aktivieren, indem es das Pro-Enzym zu aktivem Enzym spaltet. Der Ort dieser proteolytischen Aktivierung sind die sekretorischen Vesikel. Eine pharmakologisch induzierte Permeabilisierung der Lysosomen mit nachfolgendem Ausbleiben der Umverteilung der Enzyme in das sekretorische Kompartiment zeigte, dass die vorzeitige Zymogen-Aktivierung in der Frühphase der Pankreatitis erhalten geblieben ist und unabhängig vom Lysosom verläuft. Eine CTSB-Abhängigkeit bleibt jedoch bestehen. Ein Fehlen von CTSD in den Azinuszellen führt zu einem nur transient milderen Verlauf der akuten Pankreatitis, wie anhand von CTSDf/f/p48Cre/+ Mäusen demonstiert werden konnte, die einen Pankreas-spezifischen CTSD Knockout besitzen. Ein anhaltend milderer Verlauf der Pankreatitis fand sich in CTSD-/- Mäusen, der auf eine verminderte Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine in Immunzellen zurückzuführen ist. Auch bei Defizienz von CTSC war der Schweregrad der akuten Pankreatitis milder, wie in CTSC-/- Mäusen experimentell demonstiert werden konnte. Ursächlich hierfür ist vor allem ein reduziertes Einwandern neutrophiler Granulozyten in das Pankreas und in die extrapankreatischen Organe (Lunge), die auf eine geringere Aktivität der Serinprotease Neutrophilen Elastase und verminderte Spaltung des Zell-Kontakt Moleküls E-Cadherin beruhen. Umgekehrt beeinflusste das Fehlen von CTSC in den Azinuszellen nicht die vorzeitige Proteasen-Aktivierung. Unsere Arbeit unterstreicht die Bedeutung lysosomaler Enzyme in der akuten Pankreatitis und zeigt, dass diese Enzyme maßgeblichen Einfluss auf die Funktion von Immunzellen haben, die den Verlauf der Erkrankung wesentlich mitbestimmen. Unsere Arbeit zeigt außerdem, dass der primäre Ort der intrazellulären und vorzeitigen Proteasen-Aktivierung alleinig im sekretorischen Kompartiment stattfindet und nicht von einer Fusion mit dem lysosomalen Kompartiment abhängig ist.

The focus of this thesis is the engineering and analysis of the enantioselectivity of esterases using 3-phenylbutyric acid (3-PBA) as model substrate. An ultra high throughput assay for identification of enantioselective esterases has been developed, based on the combination of in vivo selection and flow cytometry. The in vivo selection medium consists of a couple of pseudo-enantiomers of 3-PBA; one enantiomer is coupled to glycerol (GE), and hydrolysis of this substrate will enable cell survival. The other enantiomer is coupled to the toxin 2,3-dibromopropanol (BE), the hydrolysis of this substrate will cause cell death. Thus, cell survival is a function of the enantioselectivity of the enzyme expressed. The pseudo-enantiomeric substrates are structurally similar to allow selection for enantioselectivity instead of selection for enzyme substrate affinity. Next, esterase BS2 was chosen as negative control to establish the selection system since it hydrolyses both pseudo-enantiomers with low enantioselectivity (E~3 and 1, respectively). High enantioselective esterases towards 3-PBA: esterases PestE and CL1 (E > 100, both (R)-selective) were identified in a screening and used as positive controls. Further, the hyperthermophilic esterase PestE was crystallized. After elucidation of the enzyme structure, the high enantioselectivity of the enzyme towards 3-PBA could be explained by molecular modelling. The optimal concentration of the pseudo-enantiomeric substrates was set to be 5 mM for GE (higher concentrations were toxic) and 20 mM for BE (lower concentrations did not completely inhibit bacterial growth). The in vivo selection system was established together with the identification of a flow cytometric method to differentiate bacterial physiological status. The combination of Syto9 and PI was chosen as staining technique, because it allowed differentiation of the viable and the dead cell populations, and of these from the background. After viability detection by flow cytometry was established, esterases PestE and BS2 were cultivated in selection ((R)-GE and (S)-BE) and anti-selection medium ((S)-GE and (R)-BE). Clear differences in the culture viability depending on the enantioselectivity of the enzyme expressed appeared: cells expressing the (R)-enantioselective PestE could proliferate in selection medium, but could not proliferate in anti-selection medium. Cells expressing the non-selective BS2 did not grow in any media. Further, cultures containing mixtures of BS2/PestE or BS2/CL1 expressing cells were incubated in selection and anti-selection medium, and the viable clones were detected by flow cytometry analysis, sorted out and plated on agar. When the mixtures were incubated in selection medium, enrichment of the (R)-selective enzyme (PestE or CL1) over the non-selective enzyme (BS2) was observed. When the enzyme mixtures were incubated in anti-selection medium, very few colonies grew on agar, indicating that cell survival was a function of enzyme enantioselectivity. The successfully developed assay was used to identify variants with increased enantioselectivity in a mutant library of esterase PFEI (E ~ 3, (R)-selective) created by saturation mutagenesis. After library expression, 108 clones were in vivo selected and analyzed by flow cytometry. The viable cells were sorted out and plated on agar. The 28 resulting colonies were transferred to one microtiterplate and their activity and enantioselectivity (Eapp) was investigated using p-nitrophenyl derivatives. Four interesting mutants were identified: Table 1. Enantioselectivity of the in vivo selected mutants. Mutant Eapp[a]Etrue[b]Etrue[c]Etrue[d]Etrue[e] Mutations C4 80 4 4 3 1 V121I, F198G, V225A E7 >100 2 n.d. 3 n.d. V121S E8 2 25 16 50 >100 V121S, F198G, V225A F5 5 13 15 18 80 F121I, F198C [a] with separate (R)- or (S)-enantiomers of p-nitrophenyl-3-phenylbutanoate. [b] towards GE with cell lysate or [c] pure enzyme. [d] towards Et-3-PB with cell lysate or [e] pure enzyme. n.d. not determined. The mutants were purified and activity and enantioselectivity were determined in kinetic resolutions towards Et-3-PB and GE (Table 1). Mutants identified as highly enantioselective in the Eapp-assay (C4 and E7) were low selective in kinetic resolutions. On the contrary, mutants E8 and F5, which showed low enantioselectivity towards p-nitrophenyl-3-phenylbutanoate, hydrolyzed the 3-phenylbutyric esters with good to excellent enantioselectivities. This confirms that Eapp values can differ much from Etrue values as “you get what you screen for”, and supports that the here described method is very suitable for identification of enantioselective esterases. In this PhD thesis a novel strategy for identification of enantioselective esterases has been developed. This method allows a very high throughput (≥ 108 mutants/day) and opens the bottleneck of variant analysis, which exists in protein engineering technology.

Abstract Erucic (22:1, cisΔ13) and gondoic acids (20:1, cisΔ11) are building blocks obtained from renewable sources for the oleochemical industry. Different biocatalytic strategies for the enrichment of these compounds with high recovery yields were developed in our group. Geotrichum candidum lipases (GCL) strongly discriminate against fatty acids longer than 18 carbon atoms. Thus, GCL‐I and ‐II were investigated using hydrolysis or ethanolysis reactions with Crambe and Camelina oils. Hydrolysis was also studied using fatty acid ethyl esters (FAEE) derived from the corresponding oil. Both isoforms were highly selective; however, interesting differences were observed. Although it has been reported that GCL‐I displays a higher preference toward 18 cisΔ9, which is present in the studied oils at high levels, GCL‐II showed higher enrichment values during hydrolysis independent of the substrate used. Hence, enrichments of 87% (Crambe oil) and 82% (Crambe FAEE) for erucic acid and 50% (Camelina oil) and 45% (Camelina FAEE) for gondoic acid, with recovery values between 89% and 99%, were achieved. On the contrary, the best enzyme for ethanolysis was GCL‐I (82% and 41% for erucic and gondoic acid, respectively). In this case, although GCL‐II also displayed good enrichment and recovery levels (77% and 28%, respectively), they were lower compared to the former reactions. In both ethanolysis reactions, the FAEE fraction contained between 92% and 97% of 18 unsaturated fatty acids.

Die vorgestellte Arbeit zeigt die schrittweise Entwicklung eines Systems zweier kurzer Ribonukleinsäuren fähig zur Selbstligation. Den Ausgangspunkt der Arbeit bildete die Suche nach einem System des Musters A+B -> T, wobei die Moleküle A und B unter Katalyse des Moleküls T zu T* ligiert werden. Das Produkt T* ist sequenzidentisch zu T und kann seinerseits die Bildung weiterer T* Moleküle katalysieren. Als Grundlage für die Entwicklung des angestrebten Systems wurde das natürlich vorkommende Hairpinribozym gewählt. Das Hairpinribozym ist ein intensiv untersuchtes katalytisches Motiv, welches Ribonukleinsäuren spezifischer Sequenz spalten bzw. ligieren kann. Das effizienteste hier letztendlich erreichte System ist fähig zur Bildung des Ligationsprodukts unabhängig von der Präsenz des Ribozyms als vollständig kovalent verbundene Einheit, was plausibel mit Bildung aktiver Ribozyme durch Assoziation der Substrat A und Substrat B Moleküle erklärt werden kann. Das vorliegende System zeigt einen zusätzlichen Weg auf, wie sich rein auf Grundlage der Nukleinsäurechemie sehr kurze RNA Fragmente zu längeren organisieren können.

Das Forschungsgebiet des RNA-Engineerings beschäftigt sich u.a. mit der Entwicklung von Ribozymen mit neuen oder verbesserten Eigenschaften. Es umfasst nicht nur den Entwurf neuer Ribozyme mittels in-vitro-Selektion oder rationalem Design, sondern auch die Validierung der entworfenen Systeme mit Hilfe von Aktivitätstests oder strukturellen Untersuchungen. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Methoden des RNA-Engineerings verschiedene Hairpinribozymvarianten generiert werden, die eine ortsspezifische RNA-Sequenzveränderung innerhalb geeigneter RNA-Substrate erlauben. Dabei war sowohl die potenzielle Anwendung dieser Ribozyme in der molekularen Medizin als auch deren Rolle als RNA-Rekombinasen in einer möglichen RNA-Welt von Interesse. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag hierbei in der Entwicklung eines Reportersystems, welches den direkten Nachweis einer twinribozymvermittelten Reparaturreaktion in Zellen erlaubt. Das Reportersystem basiert auf der Reparatur einer Vierbasendeletion innerhalb der EGFP-mRNA. Durch rationales Design wurde ein Twinribozym generiert, das die Reparatur mit einer Reparaturproduktausbeute von 32 % katalysiert. Das erfolgreich entwickelte Reportersystem steht somit für Experimente unter Zellkulturbedingungen zur Verfügung und eröffnet außerdem den Weg, die Twinribozymstrategie in der Zelle zu adaptieren und zu optimieren, um sie später intrazellulär für gewünschte Ziel-RNAs anwenden zu können. Ausgehend von der den Twinribozymen eigenen Aktivität zur Katalyse eines RNA-Fragmentaustauschs wurde darüber hinaus im Kontext der RNA-Welt-Hypothese ein Hairpinribozym entwickelt, welches durch Rekombination zweier nicht-funktioneller RNA-Substrate ein funktionelles RNA-Molekül generiert. Hierbei führte die hairpinribozymvermittelte Spaltung zweier geeigneter Substrate, Rekombination der Spaltfragmente und Ligation der neuangeordneten Fragmente mit einer Rekombinationsproduktausbeute von 76% zur Generierung eines funktionsfähigen Hammerheadribozyms.

The definition of Green Chemistry was first formulated at the beginning of the 1990s – 30 years ago and states as follows: “design of chemical products and processes to reduce or eliminate the use and generation of hazardous substances” (Poliakoff et al. 2002). Biocatalysis is one of the examples of “green” chemistry as it is relying on natural or modified enzymes. Today, biocatalysis is a standard technology for the production of chemicals (Straathof et al. 2002). In this PhD thesis, the implications of biocatalysis using different class of enzymes are discussed: two cytochrome P450 monoxygenases, two kinases and one lyase are shown as tools for the production of bioactive compounds. The P450 enzymes have a central role in the oxidative metabolism of a wide variety of compounds including the synthesis of endogenous substrates such as steroids and fatty acids. Moreover, P450s catalyze the hydroxylation of non-activated carbon atoms in a regio- and stereospecific fashion avoiding use of protecting groups and several, time-consuming chemical steps. Here, the recombinant expression and biocatalytic characterization of bacterial CYP107D1 for the regio- and stereoselective hydroxylation of two steroid compounds is reported. Since the natural electron transfer partners of these P450s are unknown, PdX and PdR from P. putida were employed to supply CYP107D1 with the necessary electrons for catalysis. This three-component system was used in bioconversions of two bile acids: LCA and DCA. P450 CYP107D1 exhibits high regio- and stereoselectivity for the tested steroids, giving 6β-hydroxylated products. The properties of the CYP107D1 make this multifaceted P450 monooxygenase an attractive enzyme for the production of novel drug metabolites. Moreover, the crystal structure of the enzyme is known, which provides the basis for developing a protein-engineering strategy aimed at catalytic properties of the CYP107D1 The second enzyme described in the thesis is the self-sufficient cytochrome P450 monooxygenase from Fusarium graminarium (FG067). From the overall structure, it resembles the well investigated CYP102 from Bacillus megaterium (CYP BM3) and the P450 from Fusarium oxysporum (CYPfoxy). In this study, two different strategies to recombinantly produce the fungal P450 monooxygenase P450-FG067, namely (a) producing in E. coli and (b) producing in P. pastoris were investigated. The P450 FG_067 from Fusarium graminarium was successfully overexpressed in P. pastoris. The enzyme was functionally active, converted fatty acid substrates of carbon chain length C10-16 with regiospecificity of the hydroxylating position ω -1, ω - 2 and ω-3, with the highest affinity for capric acid. The hydroxylation at different positions of the fatty acid chain is needed for different chemical industries. For example, ω-HFAs can be used as starting materials for the synthesis of polymers, with high resistance to heat or chemicals (Xiao et al. 2018). Therefore, the application of recombinant enzyme such as self-sufficient P450 FG_067 for a commercial production of HFAs is in high industrial demand. In this thesis, two kinases were used for the producton of phosphorylated metabolites. Kinases catalyzing N-phosphorylation, which are of synthetic interest because of tedious chemical procedures in selective chemical N-phosphorylations. A highly active and stabile arginine kinase, obtained by cloning and expressing the argK gene from Limulus polyphemus in E. coli, was used in the one-step synthesis of Nω-phospho-L-arginine using the phosphoenolpyruvate/pyruvate kinase system for ATP regeneration. Applying arginine kinase in biocatalysis opens up new opportunities for the selective biocatalytic N-phosphorylation of interesting low-molecular-weight compounds and metabolites. Another kinase investigated in this thesis was shikimate kinase. The highly active and stable shikimate kinase AroL was achieved by synthesizing the codon-optimized aroL gene and expressing it in high yield in E. coli. Next, shikimate kinase was used in an one-step synthesis of shikimate-3-phosphate using the phosphoenolpyruvate/pyruvate kinase system for ATP regeneration. Development of the described biocatalytic preparation of shikimate-3-phosphate is a superior route incomparison to a tedious multi-step and low yield classical synthesis of this compound. The biocatalytic phosphorylation is of great interest for a commercial production of metabolites and metabolite-like structures. The last investigeted enzyme in this PhD thesis was argininosuccinate lyase from Saccharomyces cerevisiae. The argininosuccinate lyase was cloned and overexpressed in E. coli as a highly active and stable biocatalyst. A simple and straightforward biocatalytic asymmetric Michael addition reaction has been established for the synthesis of the key metabolite N-(([(4S)-4-amino-4-carboxybutyl]amino)imino methyl)-L-aspartic acid, commonly referred to as L-argininosuccinate. This one-step addition reaction was developed by running part of the urea cycle in reverse. The use of this argininosuccinate lyase and reaction monitoring by NMR enabled the development of a biocatalytic asymmetric Michael addition reaction as a novel green chemistry route with high molecular economy for the synthesis of this important metabolite at gram scale. Recent advances in the field of scientific research have helped to understand the structure and functional activities of enzymes, which has in turn led to an increase in their stability, activity and substrate specificity. Nowadays, biocatalysis provide more sustainable, efficient, and less polluting methods for the production of fine chemicals and advanced pharmaceutical intermediates. The biocatalysts used in this thesis are introduced as a technology for the efficient synthesis of biologically active compounds, which is greener, reduces pollution and costs compared to chemical synthesis. In summary, the pharmaceutical industry should use the advantage of the progress of biochemistry to obtain biocatalysts in the production of fine chemicals on an industrial scale, improving the quality of end products and saving costs.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten Aptamere selektiert und charakterisiert werden, die an PF4 binden. PF4 ist ein kleines Cytokin, das aufgrund seiner Beteiligung an der Heparin induzierten Thrombozytopenie von gesteigertem klinischen Interesse ist und dessen biologische Funktion noch weitgehend unklar ist. Aptamere können aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums einen Beitrag leisten unbekannte Funktionen von Proteinen aufzuklären bzw. pathogene Effekte von Proteinen zu verhindern.Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Selektionen durchgeführt. In einer ersten Selektion wurden die Bedingungen so angepasst, dass vor allem Sequenzen im Pool verblieben, die besonders große Komplexe mit PF4 bilden. Solch große Komplexe aus PF4 und Heparin stellen das Hauptantigen der HIT dar und durch strukturelle Untersuchungen könnten Vorhersagen getroffen werden, welche therapeutisch eingesetzten Aptamere potentiell immunogen wirken könnten. Nach Analyse der Sekundärstrukturen der erhaltenen Sequenzen durch Faltungsprogramme konnten neben stäbchenförmigen Sekundärstrukturen vor allem three- und four-way junctions als dominierende Sekundärstrukturmerkmale identifiziert werden. Auf Grundlage dieser Resultate wurde ein Modell entwickelt, wonach die Ausbildung großer Komplexe zwischen RNA und PF4 durch das Vorhandensein mehrerer Helices in einem Molekül RNA gefördert wird und dadurch große Netzwerke aus RNA und PF4 entstehen. Um einen Anhaltspunkt zu erhalten, welches der selektierten Aptamere eine erhöhte Neigung zur Komplexbildung aufweist, wurden die Bindungseigenschaften zunächst qualitativ im Gelshift-Assay bei erhöhten NaCl-Konzentrationen untersucht. Dabei kristallisierten sich fünf Aptamere heraus, die auch bei NaCl-Konzentrationen höher als die der finalen Selektionsrunde noch zur Bindung fähig waren.Diese Sequenzen wurden mittels Photonenkorrelationsspektroskopie untersucht um Aussagen zur Komplexgröße und Stabilität zu erhalten. Basierend auf den Ergebnissen der PCS erfolgte die Synthese zweier Derivate der vielversprechendsten Sequenz. Für alle drei Konstrukte konnte die Komplexbildung im Gelshift Assay nachgewiesen werden. In einer zweiten Selektion wurden die Bedingungen so gewählt, dass an deren Ende spezifisch bindende Aptamere erhalten wurden. Zunächst erfolgte ein Vergleich der Bindungseigenschaften der in dieser Selektion erhaltenen Aptamere mit denen der vorangegangenen Selektion. Dabei konnten deutlich Unterschiede mittels Gelshift-Analyse nachgewiesen werden. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wurde versucht einen eigenen Sensorchip aufzubauen unter Verwendung vonPolyethylenglykol. Auch dies führte nicht zum gewünschten Erfolg und führte dazu, dass versucht wurde die Dissoziationskonstanten durch Immobilisierung von PF4 zu bestimmen. Durch die Struktur von PF4, in der die Monomere nichtkovalent miteinander verbunden sind, gelang es wiederum nicht eine stabile Oberfläche zu generieren, wodurch sich die Verwendung des Biacors zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten als ungeeignet herausstellte. Aus diesem Grund wurde versucht die Dissoziationskonstanten durch CD-Spektroskopie zu ermitteln. Nach Auswertung der Spektren konnte festgestellt werden, dass durch die Bindung der RNA an PF4 eine Strukturänderung im Protein induziert wird, durch die der Anteil antiparalleler β-Faltblätter zunimmt und der Anteil α-helikaler Bereiche und β-Turns abnimmt. Gleichzeitig wurde deutlich, dass sowohl spezifische- als auch elektrostatische Interaktionen einen Beitrag zur Bindung der Aptamere an PF4 leisten, wobei bei hohen Konzentrationen der Beitrag der elektrostatischen Wechselwirkungen überwiegt. Durch diese Kombination aus spezifischen und elektrostatischen Wechselwirkungen ist eine genaue Bestimmung der Dissoziationskonstanten nicht möglich und für die Aptamere konnte nur ein erster Anhaltspunkt, bestimmt werden.

In 2010, the identification of 17 novel (R)-ATAs represented a breakthrough for the biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines, because only one (R)-ATA was described before. These novel ATAs were identified in a bioinformatic approach by studying the substrate acceptance of BCATs and DATAs to deduce the unknown substrate coordination of (R)-ATAs. Article I describes an alternative approach for the identification of (R)-ATA activity by reengineering the substrate- recognition site of α-AATs. While the engineering of the eBCAT led to the formation of an initial (R)-amine acceptance only, the (R)-ATA activity was successfully introduced in the DATA scaffold. These results demonstrate the transformation of an α-AAT in a moderately active (R)-ATA for the first time and highlight the evolutionary relationship between α-AATs and ATAs. Despite the availability of different ATAs nowadays, their substrate spectrum is limited due to the natural composition of their active sites. Several protein-engineering studies showed the widening of the substrate spectrum and the acceptance of bulky substrates by screening large mutant libraries to identify beneficial variants. In Article II, we developed an in silico engineering approach for amine transaminases to improve the conversion of bulky substrates and to reduce the number of variants to be tested in the laboratory. The resulting double-mutants of the (S)-ATA from C. violaceum displayed a >200-fold improved activity towards the bulky benchmark substrate. These variants expand the available biocatalytic toolbox for the synthesis of bulky amines, and the developed framework paves the way for rational protein-engineering protocols. By studying unconventional transaminase substrates, we explored the potential of the available in- house transaminase toolbox in Articles III, IV, V, and VI. In Article III, we showed the transamination of a β-keto ester, leading to the synthesis of β-phenylalanine. The described cascade in Article IV enables the synthesis of amino carbohydrates. In addition, Article V describes an enzymatic cascade for the synthesis of amino fatty acids, which was extended in Article VI to obtain fatty amines. The findings of this thesis clearly contribute to the understanding of the substrate scope and specificity of amine transaminases and expand the application of this versatile biocatalyst beyond classical ketone substrates.

Given the central metabolic role of the liver, hepatic metabolites and transcripts reflect the organismal physiological state. Biochemical-clinical plasma biomarkers, hepatic metabolites, transcripts, and single nucleotide polymorphism (SNP) genotypes of some 300 pigs were integrated by weighted correlation networks and genome-wide association analyses. Network-based approaches of transcriptomic and metabolomics data revealed linked of transcripts and metabolites of the pentose phosphate pathway (PPP). This finding was evidenced by using a NADP/NADPH assay and HDAC4 and G6PD transcript quantification with the latter coding for first limiting enzyme of this pathway and by RNAi knockdown experiments of HDAC4. Other transcripts including ARG2 and SLC22A7 showed link to amino acids and biomarkers. The amino acid metabolites were linked with transcripts of immune or acute phase response signaling, whereas the carbohydrate metabolites were highly enrich in cholesterol biosynthesis transcripts. Genome-wide association analyses revealed 180 metabolic quantitative trait loci (mQTL) (p < 10-4). Trans-4-hydroxy-L-proline (p = 6 × 10-9), being strongly correlated with plasma creatinine (CREA), showed strongest association with SNPs on chromosome 6 that had pleiotropic effects on PRODH2 expression as revealed by multivariate analysis. Consideration of shared marker association with biomarkers, metabolites, and transcripts revealed 144 SNPs associated with 44 metabolites and 69 transcripts that are correlated with each other, representing 176 mQTL and expression quantitative trait loci (eQTL). This is the first work to report genetic variants associated with liver metabolite and transcript levels as well as blood biochemical-clinical parameters in a healthy porcine model. The identified associations provide links between variation at the genome, transcriptome, and metabolome level molecules with clinically relevant phenotypes. This approach has the potential to detect novel biomarkers displaying individual variation and promoting predictive biology in medicine and animal breeding.

The hirudin‐like factor 1 (HLF1) of Hirudo medicinalis belongs to a new class of leech‐derived factors. In previous investigations, HLF1 did not exhibit anticoagulatory activities. Here, we describe the analysis of natural and synthetic variants of HLF1 and HLF‐Hyb, a yet uncharacterized member of the HLF family. Modifications within the N terminus of HLF1 have a strong impact on its activity. Some variants of HLF1 exhibit thrombin‐inhibiting activity comparable to hirudins, whereas others have reduced or no activity. The analyses of HLF‐Hyb variants revealed a strong impact of the central globular domain on activity. Our results indicate a comparable mode of action of hirudins and thrombin‐inhibiting HLF variants. Finally, we propose and discuss criteria for classifying hirudins and HLFs.

In this thesis, two novel assay systems had been developed, which allow a fast and easy screening for amine transaminase activity as well as the characterization of the amino donor and acceptor specificity of a given amine transaminase. The assays overcome some limitations of previously described assays but of course have some limitations themselves. The relatively low wavelength of 245 nm, at which the production of acetophenone is detected with the spectrophotometric assay, limits the amount of protein/crude extract that can be applied, which eventually results in a decreased sensitivity at higher enzyme loads due to an increased initial absorbance. Otherwise, this assay can be used very easily for the investigation of the amino acceptor specificity and both pH and temperature dependencies of amine transaminases. The conductometric assay is – by its very nature – limited to low-conducting buffers, a neutral pH and constant temperatures. In summary, the assays complement one another very well and the complete characterization of the most important enzyme properties can be accomplished quickly. Furthermore, we developed and applied a novel in silico search strategy for the identification of (R)-selective amine transaminases in sequence databases. Structural information of probably related proteins was used for rational protein design to predict key amino acid substitutions that indicate the desired activity. We subsequently searched protein databases for proteins already carrying these mutations instead of constructing the corresponding mutants in the laboratory. This methodology exploits the fact that naturally evolved proteins have undergone selection over millions of years, which has resulted in highly optimized catalysts. Using this in silico approach, we have discovered 17 (R)-selective amine transaminases. In theory, this strategy can be applied to other enzyme classes and fold types as well and for this reason constitutes a new concept for the identification of desired enzymes. Finally, we applied the seven most promising candidates of the identified proteins to asymmetric synthesis of various optical pure amines with (R)-configuration starting from the corresponding ketones. We used a lactate dehydrogenase/glucose dehydrogenase system for the necessary shift of the thermodynamic equilibrium. For all ketones at least one enzyme was found that allowed complete conversion to the corresponding chiral amine with excellent optical purities >99% ee. Bearing in mind that until last year there was only one (R)-selective amine transaminase commercially available and two microorganisms with the corresponding activity described, the identification of numerous enzymes is a breakthrough in asymmetric synthesis of chiral amines.

In dieser Arbeit wurden drei neue Imin-Reduktasen (IREDs) identifiziert und biochemisch charakterisiert. Bei einem dieser Enzyme war eine Kristallstruktur bereits gelöst, jedoch keine Funktionalität beschrieben. Beim Untersuchen des Substratspektrums wurde in dieser Arbeit erstmals festgestellt, dass neben zyklischen Iminen und Aminen auch azyklische Amine Substrate der IREDs sein können. Außerdem können IREDs Ketone oder Aldehyde als Substrate verwenden indem diese mit Ammoniak oder primären Aminen reduktiv aminiert werden. Es wurde die Kristallisation von den von uns neu entdeckten IREDs, sowie von 15 weiteren neuen IREDs untersucht. Für drei Enzyme konnten gut streuende Kristalle erhalten werden, wobei es zum ersten Mal für IREDs gelang, Kristalle bei der NADP+ Co-Kristallisation zu erhalten. Zwei dieser Enzyme tragen ungewöhnliche Reste im aktiven Zentrum (Glutamat und Asparagin). Bisher wurden meist Aspartat für (R)-selektive beziehungsweise Tyrosin für (S)-selektive IREDs beschrieben. Eine Ausnahme bildet die von uns charakterisierte IRED Ppu, welche ein Histidin einen Turn upstream (in der Sequenz weiter in Richtung C-Terminus) in der IRED trägt und im phylogenetischen Stammbaum eine dritte Gruppe von IREDs bildet. Neben der erstmalig berichteten Immobilisierung von IREDs, konnten wir mit Hilfe von rationalem Design eine Variante der Sgf3587 IRED erstellen, welche eine 3-fach erhöhte Akzeptanz von NADH zeigt. Da alle bisher beschriebenen IREDs NADPH stark präferieren, bildet die K40A-Variante der Sgf3587 IRED eine Alternative die den kostengünstigeren Cofaktor NADH verwenden kann. Eine andere von uns untersuchte Methode zur Kostenreduzierung ist die Verwendung eines Substrat-gekoppelten Ansatzes zur Cofaktor-Regenerierung. Hierbei wird ein zweites achirales sekundäres Amin eingesetzt, welches durch Oxidation des Substrats den Cofaktor reduziert, welcher dann für die Imin-Reduktion zur Verfügung steht. Die bisher beschriebenen Beispiele für die reduktive Aminerung zeigten eher geringe Umsätze. Sie wurden nur für drei Enzyme dargestellt. Mit Hilfe unseres Kooperationspartners konnten wir über 30 weitere Beispiele für Enzyme zeigen, welche die reduktive Aminierung durchführen können. Weiterhin konnten wir präparative Beispiele mit 1% (m/v) Substrat-Konzentration zeigen, wobei es gelang gute Umsätze und Reinheiten zu erlangen. Mit Hilfe der reduktiven Aminierung konnte außerdem die prinzipielle analytische Darstellung von Rasagilin, ein Alzheimer Medikament, gezeigt werden. Diese ist sehr vielversprechend und nach weiterer Optimierung wäre eine industrielle Anwendung möglich.

Triple helix-forming oligonucleotides (TFOs) are one of the most specific DNA duplex binding agents and offer new perspectives towards oligonucleotide-mediated gene regulation and manipulation. However, the poor thermodynamic stability of DNA triplexes under physiological conditions limits a successful application in the antigene strategy. Thus, the conjugation of TFOs with small triplex-specific binding ligands is a promising approach to stabilize the formed complexes and to enhance their overall binding affinity. The present study focused on the synthesis of novel TFO conjugates with triplex-binding indolo[3,2-b]quinoline derivatives (PIQ) and on their ability to form and stabilize intermolecular triplexes through their recognition of a duplex target. During the course of the work the thermodynamics of conjugate binding and structural aspects of drug-DNA interactions have been characterized by a variety of spectroscopic and calorimetric techniques.

Using validated analytical tools and optimized sampling procedures, it was possible to detect a vast number of metabolites from the extracellular space but also from the cytosol of B. subtilis. The results indicate that the complement of the analytical methods was suitable in the monitoring of the metabolome since it allowed a great coverage of physicochemical diverse metabolites. However, a wide number of unknown metabolites/features were also detected. Although broad databases exist that can help in the annotation of metabolites, further investigation is needed in their identification. In unpredictable changing conditions, bacterial cells possess appropriate adaptation strategies for a successful bacterial growth. These rely on sensing mechanisms that globally adjust gene expression via transcription and feedback regulations. The metabolic sensing mechanisms have emerged as key roles in the nutritional information and regulation of cell cycle processes. In this work, a new quality of information regarding the metabolism and adaptation to the absence of key signal mechanisms in B. subtilis was provided. Investigations of cells lacking Pyk uncovered alterations in the import of glucose and pyruvate from the nutritional media. These results gives insights to the pyruvate homeostasis mechanism but also brought new questions concerning the regulation of the CCR. Pyruvate wasn't susceptible to the glucose dependent CCR in Δpyk. The earlier in ux of pyruvate in these cells is in accordance to the newly discovered pyruvate transport mechanism. Also, it was speculated that the lower consumption of external glucose could be a consequence of the impairment of the PTS system in the mutant cells due to the accumulation of glycolytic metabolite FBP. In future studies, insights of the PTS system mechanism should be done in these conditions, that could comprise the determination of HPr phosphorylation and the HPrK activity. This study also arose new questions that should be address, that include the higher secretion of acetoin and 2,3-butanediol, and the lower accumulation of shikimate 3-phosphate by the mutant cells. In an untargeted metabolomic analysis, a vast number of altered features were suggested to be fatty acids metabolites, precursors of phospholipids and LTA. Complementary approaches should be done for the confirmation of these metabolites and the inspection of possible alterations in the membrane structure. In the study of LTA mutants, the accumulation of PG precursors provided a hint of altered cell wall assembly. Although by uorescence microscopy no clear changes were detected, the metabolic results emphasized the previous assumption of the affected hydrolytic activity occurring in the PG. For comprehensive knowledge of the cell wall it would be important to detect and identify more metabolites of the LTA anchor using optimized cromatographic method. These results could be complemented with other omics data sets studies which would help in the elucidation of these key regulatory systems mechanisms.

In the 1940s cytochrome P450 monooxygenases have been discovered and have been the focus of many studies ever since. Although they catalyze very interesting reactions that might find applications in the production of fine chemicals or pharmaceuticals, their low activity and stability often reduces their economic value. Both properties, the activity and the stability, are influenced by the uncoupling of the catalytic cycle. In this PhD thesis, an assay for the screening of activity and uncoupling of cytochrome P450 enzymes was successfully developed. After finding optimal conditions for the assay, concerning pH and enzyme concentration, the uncoupling of cytochrome P450 BM3 and five mutants (F87Y, R47L, Y51F, A82L and T268A) was investigated. With the results obtained, a comparison of data from literature was possible and revealed similarities. Additionally, through negative controls, the reliability of the assay could be further demonstrated. Although other methods have been described for the detection of hydrogen peroxide formation, the combination of NADPH consumption measurement and hydrogen peroxide formation in parallel was new and represents a very good basis for a pre-screening of large mutant libraries, followed by closer investigation of selected variants. For the investigation of the activity of the CYP11A1 system, consisting of CYP11A1 and Adx and AdR as redox partner system, the expression and purification for all three proteins was investigated first. For the protein CYP11A1 and Adx, good expression levels were achieved, whereas for AdR the protein concentration obtained was very low. The purification of all three proteins was partially accomplished but left room for improvement. Therefore, in the Master thesis of Christopher Grimm, the pH and temperature stability of all three proteins was further investigated in order to improve conditions used for ion exchange chromatography and to investigate possible conditions for in vitro biocatalysis. As unfortunately even with further investigation of the expression of AdR, no improvement was achieved, a whole-cell system was further investigated. Here, the product formation could be increased 8-fold in comparison to the published data, from 0.27% conversion to 2.2% conversion over 24 h by using a different detergent for substrate solubilization, which might have led to a better substrate supply to the enzyme. Due to the low activity and stability, a different P450 system, the CYP17A1 enzyme, was subsequently investigated, first by in vitro biocatalysis with the human CYP17A1 expressed in E. coli. Therefore, a suitable redox partner system needed to be found for efficient electron supply of the enzyme. In in vitro biocatalysis, in combination with the Pdx/PdR system of P. putida the CYP17A1 enzyme showed the highest conversion with 91% after 24 h. To investigate the activity of the enzyme further, all active site residues in 4 Å proximity to the bound substrate were exchanged with alanine. After expression of the variants, almost no correctly folded protein was obtained for the variants. Also, after investigating different buffers to possibly enhance the stability, no improvements were achieved. Therefore, a whole-cell approach with the bovine enzyme was chosen in order to investigate the activity of the alanine variants. Here the importance of positions N202, R239, G297, E305, and T306A, described in literature to be important for catalytic activity, was confirmed. Most importantly, three positions that alter the regioselectivity of the enzyme were identified. The reaction of the V483A mutant was therefore also further investigated by preparative biocatalysis. Afterwards the new product was separated by preparative HPLC and identified as 16α- hydroxyprogesterone as confirmed by NMR spectroscopy analysis. In the last part of the thesis, another screening approach for possible high-throughput screening was investigated. In contrast to the other screening approach, here the investigation of the substrate conversion and the hydrogen peroxide formation were optimized for application in droplets. After finding that DCFH-DA was not sensitive enough towards hydrogen peroxide, the AmplifluTM Red probe was used. As both fluorescent products were found to stay in the aqueous phase above pH 7.4, the conditions investigated for the AmplifluTM Red assay were applied and only NADPH to substrate ratio was investigated by using an uncoupling variant, an active variant from literature and the cytochrome P450 BM3 wild-type enzyme. After finding a good ratio, the five variants used for the investigation of the AmplifluTM Red assay were investigated in the same concentration later on found in the droplets (1 cell per 4 pL), and one variant showed improved product formation compared to wild-type. This finding clearly shows the applicability of the assay for high-throughput screening in droplets.

In this thesis several methods of protein engineering were applied to explore and increase enantioselectivity and thermostability of certain carboxylesterases and to better understand the relationship between sequence, structure and function. For example, we were able to confirm the observed conservation of motifs like GX/GGGX and GXSXG, which was reported earlier. Yet, even more details were revealed and some were designated in numbers. However, the numbers may vary when even more sequences will be available, but the trend should remain the same. The power of the ABHDB lies in the information available throughout the very diverse and quite large superfamily. Structural equal positions can be easily compared and analysed regarding mutations, correlated mutations, prevalence etc., and visualization is simplified through direct output with YASARA software. The ABHDB was the first structural alignment of such a large number of known enzymes of the alpha/beta-hydrolase fold superfamily. With methods of rational protein engineering we were able to show that there is little flexibility of the GGG(A)X motif for the eukaryotic enzyme PLE 1 and the natural motif appears to be a good solution for high activity and enantioselectivity of PLE 1 in the conversion of tertiary alcohol esters. In a focused directed evolution approach, we were able to identify variants of BsteE with moderate, but significantly increased enantioselectivity in the kinetic resolution of tetrahydrofuran-3-yl acetate, and hence, were able to proof that the concept of ‘small but smart’ libraries is an efficient way to find improved mutants, while the screening effort was reduced. Moreover, we were able to show that the domain exchange enhanced the thermostability of BsubE, while expression level and activity were maintained or increased, respectively. Despite the great achievements and possibilities at present, we are not yet in the position to directly modify the gene to alter the structure in a complete predictable fashion to improve functional properties as imagined by Ulmer (1983). Nevertheless, substantial changes can be targeted and as demonstrated in this work, several broadly applicable methods are at hand. Furthermore, bioinformatics tools play an essential role in planning of experiments, analysis and interpretation.

Der gesamte Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu ermöglichen. Hier werden Stoffe ohne Abtrennung oder Aufarbeitung über verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erfolgreich eine in vivo Enzymkaskade aus drei Oxidoreduktasen etabliert, untersucht und mit Fusionsproteinen verbessert werden. Zur Etablierung der in vivo Enzymkaskade aus Alkoholdehydrogenase, Enoatreduktase und Baeyer-Villiger-Monooxygenase im Rahmen eines DFG-Projekts (Bo1862/6-1) in Zusammenarbeit mit der Technischen Universität Wien wurde zunächst nach den geeigneten Enzyme gesucht. Mit einer Alkoholdehydrogenase aus Laktobacillus kefir und einer Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus ruber konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Im Rahmen der Suche nach geeigneten Enzymen für die Kaskade wurde von drei neuen Enoatreduktasen aus Pseudomonas putida ATCC 17453 das Substratspektrum untersucht. Die xenobiotische Reduktase A (XenA), die xenobiotische Reduktase B (XenB) und die N-Ethylmaleimid-Reduktase (NemA) akzeptierten sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde. Sehr gute Umsätze konnten mit Imiden und Carvonen nachgewiesen werden. Besonders die XenA und XenB zeigten mit über 99 % Enantiomerenüberschuss in der Bildung von Dihydrocarvonen exzellente Stereoselektivitäten. In der Enzymkaskade setzten dann die XenB oder das Old yellow enzyme (OYEI) die α,β-ungesättigen Ketone selektiv zu den chiralen Ketonen um. Diese wurde dann von der Cyclohexanon-monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter species in die gewünschten chirale Laktone umgesetzt. Nach erfolgreichen Klonierungen konnten alle vier Enzymkombinationen der Enzymkaskade löslich und aktiv in einem E. coli-Stamm kultiviert werden. Mit der Kombination verschiedener nicht-natürlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methyl-substituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Laktonen umgesetzt werden. Wir konnten durch Auswahlmöglichkeiten zwischen verschiedenen Alkoholdehydrogenasen und Enoat-reduktasen modular agieren und so zum Beispiel innerhalb von 20 Stunden die Reaktion von 4 Methyl-2-cyclohexenol zu 100 % in das optisch reine Lakton in E. coli katalysieren. Auch die für die Polymerindustrie interessanten Dihydrochalconlaktone konnten mit sehr guten Umsätzen und mit über 99 %ee hergestellt werden. Nach der erfolgreichen Etablierung der Enzymkaskade wurde die Umsatzgeschwindigkeit mit Hilfe von Fusionsproteinen noch einmal gesteigert. Dafür wurde die Auswirkung von verschiedenen Linkern und die Abfolge der Enzymdomänen im Fusionsprotein aus XenB-Domäne und CHMO-Domäne untersucht. Mit dem Fusionsproteine CHMO_G_XenB konnte nach einer Stabilisierung der CHMO-Domäne ein sehr guter Biokatalysator hergestellt werden. Anwendungen in der in vivo Enzymkaskade zeigten schnellere Umsätze für Cyclohexenol und Carveol. Ein aktives Fusionsprotein aus Alkoholdehydrogenase, XenB und CHMO konnte nicht etabliert werden, da beide Alkoholdehydrogenasen aus der Enzymkaskade bei der Fusionierung inaktiviert wurden. Auch wenn kein aktives Fusionsprotein aus drei verschiedenen Enzymdomänen hergestellt werden konnte, ist mit der erstmaligen Fusion einer Enoatreduktase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase die neue in vivo Enzymkaskade verbessert worden. Somit konnte in dieser Doktorarbeit die erfolgreiche Anwendung von einer modularen in vivo Enzymkaskaden für die Herstellung chiraler Laktone für die Polymerchemie gezeigt werden.

Interactions between bacteria and the human body are manifold and happen constantly. Most parts of the skin and gastrointestinal tract, the saliva, the oral mucosa, the conjunctiva and the vaginal mucosa are colonized with a multitude of bacterial species forming the human microbiota. Strikingly, the estimated amount of bacterial cells outnumbers the human body by 10 to 1. However, most of these bacteria colonize the human body without positive or negative effects and are regarded as commensals. Staphylococcus aureus a Gram positive bacterium is such a commensal bacterium of 25 % to 30 % of the world population. It is also an opportunistic pathogen and is able to cause infections in the lung, skin and heart and to induce sepsis. Its pathogenicity is mainly facilitated by the secretion of a broad spectrum of virulence factors which interact with the host. Some are distracting the immune system, others are targeting the host cell membrane or degrade macromolecular structures of the host in order to provide nutrients. Furthermore S. aureus is able to invade the host cell and to survive and replicate in the host cell cytosol or other compartments. The Gram negative proteobacterium Burkholderia pseudomallei is an environmental bacterium but still has the ability to enter the human body via body orifices or skin wounds. In a very efficient way it penetrates the host cell, replicates intracellular and the uses host structures to spread from cell to cell thereby causing the disease melioidosis often with fatal outcomes. Since the natural habitats of B. pseudomallei are wet soils, the change to the environment in the human body is drastic and requires a high degree of flexibility of the bacterium. Environmental stress conditions such as temperature, pH, nutrient limitation or presence of antibiotics induce a switch of colony morphology which is a special characteristic of this bacterium. Since it is assumed, that changes in colony morphology are connected to adaptive processes to the environmental changes, these morphology switches might also be important during infection. The host organism and the host cell on the other side try to kill and remove the bacterial threat by activating the immune system and cellular defence mechanisms. This includes generation of reactive oxygen and nitrogen species, production of antimicrobial peptides and cellular processes such as phagocytosis, autophagy, apoptosis and activation of the immune response. The actions and reactions on both, the pathogen side and the host side, are summarized as host-pathogen interactions. In the field of functional genomics, methods were developed to understand various levels of host-pathogen interactions. The holistic analysis of the mRNA (the transcriptome) or translated proteins (the proteome) were already very useful tools to describe important cellular processes on the host and the pathogen site. The level of metabolites with regard to host-pathogen interactions however, has been neglected so far. In this dissertation the metabolic composition in the intracellular and extracellular space of the host and the pathogen was analyzed. For this matter biochemical analytical tools were used such as 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy and chromatographic methods (GC and HPLC) coupled to mass spectrometry. The combination of these methods allows a broad coverage of physicochemical diverse metabolites. In accordance to the above mentioned biological levels like mRNA and proteins, the sum of all metabolites is referred as the metabolome. Consequently to transcriptomics and proteomics the analysis of the metabolome is referred as metabolomics. To gain insights into the infection relevant metabolome of the host-pathogen relationship between S. aureus and human lung cells several approaches were developed. First the distribution of the recently identified bacillithiol in different S. aureus strains was investigated with regard to its role during the infection. For that matter a HPLC-methodology was used with fluorescence based detection of labelled low molecular weight thiols (article I: Distribution and infection-related functions of bacillithiol in Staphylococcus aureus). After that the next aim was to reveal the effect of S. aureus on the host cell metabolism. To reduce the complexity of effects on the host cells an artificial model was chosen in a first approach. The lung cells were treated with the staphylococcal virulence factor alpha-hemolysin, a pore forming toxin and a holistic metabolomics approach was performed (article II: Staphylococcus aureus Alpha-Toxin Mediates General and Cell Type-Specific Changes in Metabolite Concentrations of Immortalized Human Airway Epithelial Cells). Using this approach, a protocol for cell culture metabolomics was established and first changes in the host cell metabolome that could be caused by S. aureus were described. However, this only describes specific changes caused by one single virulence factor and does not necessarily describes the reality during a S. aureus infection. Therefore in a next approach, an infection model using a human lung epithelial cell line and the S. aureus strain USA300 was established and used for metabolome analysis. Furthermore a combination of inhibitor treatment and metabolic labelling was used to clarify the metabolic activity in the host cell after exposure to S. aureus (article III: Metabolic features of a human airway epithelial cell line infected with Staphylococcus aureus revealed by a metabolomics approach). Finally this thesis deals with the host-pathogen interaction of B. pseudomallei and its host with a focus on the role of the switch in colony morphology in basic metabolism. Various morphotypes of two strains were generated by nutrient limitation and their uptake of nutrients was monitored. Furthermore the morphotypes were used in in vitro and in vivo infections and subsequently isolated out of the cell line and mice respectively. After isolation, the colony morphology was determined and again the nutrient uptake profile was monitored (article IV: Burkholderia pseudomallei morphotypes show a synchronized metabolic pattern after acute infection). The information provided by this thesis adds a new complexity to the knowledge about the host-pathogen interactions of S. aureus and B. pseudomallei and their hosts. It furthermore lays the groundwork for future studies, which will deal with these and other bacterial host-pathogen interactions in order to understand the interdependencies of infection and metabolism.

Aufgrund der extremen Instabilität des Molybdän Cofaktors (MoCo) ist eine genauere Untersuchung der aktiven Zentren der lebenswichtigen MoCo-abhängigen Enzyme allein durch biochemische Methoden fast unmöglich. Hierfür liefert eine chemische Modellierung des Cofaktors die einzige Möglichkeit einen tieferen Einblick in seine Struktur und Funktion. Die vorliegende Dissertation ermöglicht einen weitaus tieferen Einblick in Struktur-Funktionsbeziehung des Molybdän-Cofaktors hinsichtlich des zentralen Metalls und des Molybdopterin-Liganden. Zunächst wurde die Rolle des Molybdänzentrums in den Modellverbindungen detailliert analysiert. Hierfür wurde in den synthetisierten Modellen Molybdän mit Rhenium, ausgetauscht. Die erhaltenen Komplexe wurden zuerst umfangreichend durch verschiedene Methoden Kristallstrukturanalyse, IR-, Raman-, NMR-, 2D-NMR-Spektroskopie, temperaturabhängige Elektrochemie und quantenchemischen Berechnungen analysiert und auf Analogien und Unterschiede verglichen. Dabei wurde auf der Suche eines MoCo-Modells, das die richtige Balance zwischen katalytischer Aktivität und Stabilität besitzt, untersucht, ob Rhenium eine potenzielle Alternative zu Molybdän darstellen kann. Um einen tieferen Einblick in die Chemie des Pterin-Strukturabschnitts von MoCo zu erschaffen, beschäftigt sich diese Arbeit mit der Feinabstimmung von Chinoxalin- und Pterin-Dithiolen-Liganden sowie mit der Entwicklung deren Molybdän-Komplexen. Dazu konnten neuartige Chinoxalin- und Pterin-Dithiolen-Liganden synthetisiert werden, die als Modell-Liganden für die Erforschung der Biosynthese des MoCos fungieren können. Hierin wird die Synthese und die vollständige Charakterisierung eines neuartigen Oxo-Bis(pterin)dithiolen-Molybdän-Komplexes beschrieben. Durch 2D-NMR Spektroskopie konnte die Struktur des erhaltenen Komplexes in Lösung detailliert analysiert werden. Schließlich wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals durchgeführte Untersuchungen zur Bindung von chemisch synthetisierten MoCo-Modellen mit dem Apoenzym der Trimethylamin-N-Oxid-Reduktase unternommen. Dabei konnte die essenzielle Rolle des Pterin-Gerüstes für die richtige Platzierung des Cofaktors in der Bindungstasche des Apoenzyms etwas näher aufgeklärt werden. Zukünftig könnten noch strukturell genauere MoCo-Modelle den Weg für die Synthese einer semi-artifiziellen Sulfitoxidase, die als eine Behandlungsmöglichkeit der Molybdän-Cofaktor-Defizienz (MoCoD) und der isolierten Sulfitoxidase-Defizienz (iSOD) eingesetzt werden, eröffnen.

Abstract The bidirectional force transmission process of integrin through the cell membrane is still not well understood. Several possible mechanisms have been discussed in literature on the basis of experimental data, and in this study, we investigate these mechanisms by free and steered molecular dynamics simulations. For the first time, constant velocity pulling on the complete integrin molecule inside a dipalmitoyl‐phosphatidylcholine membrane is conducted. From the results, the most likely mechanism for inside‐out and outside‐in signaling is the switchblade model with further separation of the transmembrane helices.

The synthesis of pterin-dithiolene ligands was achieved by employing the radical nucleophilic substitution, i.e. the so-called “Minisci- Reaction”1. This protocol was used for the first time by Professor W. Pfleiderer on pterin substrates2 and proved a powerful method for the preparation of 6 acyl-pterins in course of this work. Subsequent construction of the dithiolene ring facilitates the synthesis of pterin-dithiolene ligands with completely unprotected pterin moieti. The molybdenum cofactor is probably one of the most relevant discoveries in the recent history of pterin chemistry and biochemistry. Many efforts have been made for the preparation of compounds able to mimic the features of the Moco ligand system called "Molybdopterin". In fact, the study of MPT models enables a deeper understanding of the “mechanism of function” of this cofactor and most importantly, lays the foundation for a potential treatment for the Moco related diseases MoCOD and iSOD.

Trotz einer sehr großen funktionellen Diversität, zeichnen sich die Enzyme innerhalb der α/β-Hydrolasefaltung-Superfamilie durch eine sehr hohe strukturelle Homologie aus, weshalb man annimmt, dass sich deren Vertreter über divergente Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Unter Zuhilfenahme von Methoden des Protein-Engineerings sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob es möglich ist, Enzyme innerhalb dieser Superfamilie ineinander umzuwandeln. Als Modelenzyme dienten eine Esterase aus Pseudomonas fluorescens (PFE) und eine Epoxidhydrolase aus Agrobacterium radiobacter (EchA). Nach der Etablierung geeigneter Analysemethoden für Esteraseaktivität und Epoxidhydrolaseaktivität wurden mittels verschiedener Sequenz- und Strukturalignments Aminosäuren identifiziert, die essentiell für den jeweiligen Reaktionsmechanismus sind. Diese wurden nachfolgend mittels positionsgerichteter Mutagenese in die jeweiligen Enzyme eingefügt und die entsprechenden Mutanten auf die jeweilige Aktivität hin untersucht. Leider zeigte weder die PFE Epoxidhydrolaseaktivität, noch die EchA Esteraseaktivität. Anschließend wurden über weitere Strukturvergleiche ganze Bereiche in Epoxidhydrolasen identifiziert, die möglicherweise von Wichtigkeit für die Funktionalität des Enzyms sind. Es wurden also ganze Bereiche der PFE durch solche der EchA ersetzt und auf diese Weise drei Chimär-Enzyme hergestellt. Diese Chimären wurden mittels Coexpression von Chaperonen hergestellt und anschließend aufgereinigt. Eines dieser Chimärenzyme zeigte eindeutig Epoxidhydrolaseaktivität. Es wird angenommen, dass der Eingangsbereich ins aktive Zentrum der PFE im Wildtyp-Enzym versperrt war und dieser durch den Austausch eines Loops geöffnet wurde. Weiterhin wurde ein Ansatz entwickelt, Esteraseaktivität in der EchA zu generieren. Dieser basiert auf einem strukturbasierten Sequenzalignment, das es erlaubt Aminosäuren zu identifizieren, die sich in Epoxidhydrolasen und Esterasen unterscheiden. Leider führte dieser Ansatz bisher noch nicht zum Erfolg, weshalb weitere Untersuchungen nötig sind. Im zweiten Teil der Arbeit ging es darum, Mutantenbibliotheken für die fokussierte, gerichtete Evolution möglichst klein, aber qualitativ hochwertig herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ebenfalls ein strukturbasiertes multiples Sequenzalignment herangezogen, das es erlaubt die Aminosäureverteilung an verschiedenen Positionen des Enzyms in einer riesigen Anzahl strukturell verwandter Enzyme zu bestimmen. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Aminosäuren an definierten Positionen sehr häufig sind und welche eher selten. Von solchen Resten, die sehr selten sind, wird angenommen, dass sie negative Auswirkungen auf die strukturelle Integrität des Proteins haben und deshalb von der Natur nicht berücksichtigt wurden. Diese Annahme wurde zur Herstellung von Proteinbibliotheken ausgenutzt. In einer fokussierten, gerichteten Evolution wurden einmal 3 und einmal 4 Aminosäuren der PFE simultan und zufällig durch Aminosäuren ersetzt, die sehr häufig in 2800 verwandten Sequenzen an diesen Positionen vorkommen. Die auf diese Weise generierten Bibliotheken wurden einmal auf eine verbesserte Thermostabilität (für die 3 Positionen) und einmal auf eine verbesserte Enantioselektivität untersucht (4 Positionen). Hierbei wurde zusätzlich die Auswirkung der Mutationen auf die Substratspezifität untersucht. Als Vergleichsbibliotheken wurden ebenfalls einmal alle 20 proteinogenen Aminosäuren eingefügt und einmal nur solche, die sehr selten im Alignment auftauchen. Das Ergebnis war in beiden Fällen eine sehr viel bessere Bibliothek, wenn nur solche Reste vertreten waren, die auch in der Natur bevorzugt vorkommen. Dies galt sowohl in Bezug auf die Anzahl aktiver Klone in jeder Bibliothek, als auch auf die Chance eine verbesserte Variante zu finden (stabiler bzw. selektiver). Die besten Mutanten der Bibliotheken hatten im Vergleich zum Wildtyp einen 8°C höheren Schmelzpunkt bzw. einen bis 18fach höheren E-Wert (bei 50facher katalytischer Effizienz). Weiterhin konnten die Substratspezifität um den Faktor 4.300 verändert werden.

The four stranded G-quadruplexes are important secondary structures of nucleic acids formed by guanosine-rich sequences. Besides the application as scaffold for technological applications, they are involved in many cellular processes such as gene regulation, replication, or maintenance of chromosomal ends. Characteristically, a large diversity of quadruplex structures is observed, whereas the correlation between sequence and structure is still not fully understood. In this thesis, the effects of modified nucleotides on G-quadruplexes were analyzed using NMR-spectroscopy to gain insight into driving forces determining the folding process. Contrary to DNA quadruplexes, the folding landscape of RNA structures is mostly restricted to parallel topologies. Therefore, ribose moieties were introduced into DNA sequences to isolate the effect of the additional hydroxy group. In this way, sequential CHO hydrogen bonds between the 2&prime;-OH and the H8 of the 3&prime;-neighbored anti conformer were identified and subsequently detected within RNA structures. In a second part, 2&prime;-fluoro-2&prime;-deoxyribose was incorporated at positions with guanosine in unfavored syn orientation. Instead of a changed global fold, the direction of the hydrogen bond network in the modified tetrad was reversed. This first example of tetrad inversion within a unimolecular quadruplex yielded a unique (3+1)-hybrid topology with only homopolar stacking interactions. Additionally, the effect was reproduced for another sequence and high-resolution structures were determined. Unfavored interactions between the 2&prime;-fluorine and the narrow groove of the quadruplex were identified as a reason for different sugar conformations and consequent structural rearrangements.

Komplexe mit σ2P=C-Liganden wurden viel weniger untersucht als solche von Phosphanliganden und bieten damit einen Freiraum für die Suche nach neuen katalytischen Anwendungen von P(III)-Liganden. Darüber hinaus eröffnen Additionsreaktionen an die P=C-Bindung neue Synthesestrategien für Phosphanliganden. Zur Nutzung von 1H-1,3-Benzazaphospholen als P=C-Liganden bzw. Synthesebausteine wurden vereinfachte Synthesen für N-methylierte Benzazaphosphole sowie ein Zugang für die erstmalige Darstellung N-asymmetrisch substituierte Benzazaphospholeentwickelt, Basisschritte dieser Synthesen sind die Alkyl- und katalytische Arylaminierung, die katalytische Arylphosphonylierung, die Reduktion der entstehenden Phosphonsäureester mit LiAlH4 und anschließende Cyclokondensation mit Dimethylformamiddimethylacetal. Eine disproportionierende Cyclokondensation mit überschüssigem Paraformaldehyd erlaubt gleichzeitige N-Methylierung. Über polaritätsgesteuerte Reaktionen 2-unsubstituierter Benzazaphosphole mit tBuLi können Substitutionsreaktionen in 2-Position bzw. Additionen an die P=C-Bindung erreicht und funktionelle Gruppen eingeführt werden. Die Umsetzungen N-asymmetrischer Benzazaphosphole mit tBuLi in THF oder Et2O ergaben Mischungen der Produkte der direkten 2-CH-Lithiierung (P=CLi) und von Additionsprodukten an die P=C-Bindung. Eine Umstellung auf selektive CH-Lithiierung in THF oder Et2O wurde durch Zugabe von KOtBu erreicht, während regiospezifische Additionen zu den tBuP-CHLi-Spezies in Hexan/Et2O erzielt werden konnten. Zum Studium der Koordinationseigenschaften wurde vorwiegend das gut zugängliche 1-Neopentyl-1,3-benzazaphosphol eingesetzt. Zur Stabilisierung durch Rückbindung wurden Cu(I)- und Ag(I)-Benzazaphosphol-Komplexe mit d10-Elektronenkonfiguration synthetisiert. Bei einem Einsatzmolverhältnis des Benzazaphosphols (L) zu MX 1:1 werden L2MX-Komplexe (X = Cl, Br) gebildet, bevorzugt mit µ-X-Brücken und zwei terminalen Liganden L. Für L2CuBr wurde auch eine isomere dimere Struktur mit terminalem Bromid und einem µ-gebundenen Benzazaphosphol gefunden. Die NMR-Spektren zeigten generell, typabhängig mehr oder weniger stark, Hochfeldkoordinationsverschiebung des 31P-Signals und damit Rückbindungen an. Die Labilität der Komplexe sorgte für breite Signale, insbesondere in den 31P-NMR-Spektren. Durch analoge spektrale Änderungen konnte auch für HgCl2 Komplexbildung mit Neopentylbenzazaphosphol nachgewiesen werden. Mit 2-(o-Diphenylphosphanyl-phenyl)benzazaphosphol konnten Mo(CO)4- und HgCl2-P,P´-Chelatkomplexe erhalten werden. Kristallstrukturanalysen zeigten, dass Mo(0) nur relativ schwach aus der Ringebene ausgelenkt koordiniert wird, Hg2+ jedoch nahezu senkrecht und nur noch schwach. Ein kationischer d8-Rh(I)(COD)-Komplex mit einem anderen P,P´-Phosphanylbenzazaphosphol-Liganden erwies sich als instabil und addierte Wasserspuren an die P=C-Bindung. Die aus (Neopentylbenzazaphosphol)W(CO)5 und AgSbF6 gebildeten labilen LW(CO)5/Ag+ SbF6−-Komplexe erwiesen sich als sehr effektive Katalysatoren für Ringöffnungspolymerisationen sowie auch Copolymerisationen von Tetrahydrofuran, Oxetan und Epoxiden. Die über die Additionsreaktionen von tBuLi und nachfolgende Umsetzung mit CO2 zugänglichen Dihydrobenzazaphosphol-2-carbonsäuren bilden mit Ni(COD)2 sehr aktive Katalysatoren für die Bildung wachsartiger linearer Ethylenpolymere mit Methyl- und Vinylendgruppen.

Purpose: The cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor p27Kip1 may be involved in regulating re-entry of residual hepatocytes into the cell cycle upon loss of liver tissue by partial hepatectomy (PH). As yet, changes in Kip1 expression during the initial period following PH are not well-characterized. We investigated immediate changes in Kip1 mRNA and protein levels as well as changes in Kip1 phosphorylation in liver tissue within the relevant time window between surgery and the onset of DNA synthesis at 10–12 h. Methods: We used real-time PCR, quantitative Western blotting, and immune histochemistry on tissue samples of adult rats obtained during or between 2 and 10 h after surgical removal of two thirds of the liver to analyze Kip1 mRNA or protein levels, respectively, or to quantify nuclear expression of Kip1. Results: Kip1 mRNA was down-regulated within 4 h after PH by 60% and remained unchanged thereafter up to 10 h. With a lag phase of 2–3 h, Kip1-protein was down-regulated to a level of 40% of the control. The level of Thr187-phosphorylated Kip1 started to increase at 4 h and reached a maximum level at 8–10 h after PH. Kip1 immunoreactivity was observed in 30% of the hepatocytes before PH. Within 6–8 h after PH, more than half of the hepatocytes lost nuclear Kip1 signals. Kip1-specific micro-RNAs (miRNA221, miRNA222) were not changed upon PH. Conclusions: A portion of hepatocytes in adult rats constitutively express Kip1 and down-regulate Kip1 immediately upon PH. This response involves transcriptional processes (loss of Kip1 mRNA) as well as accelerated degradation of existing protein (increase in pThr187-phosphorylation mediating polyubiquitinylation and proteasomal degradation of Kip1). Kip1 down-regulation occurs precisely within the intervall between surgery and onset of DNA synthesis which supports the hypothesis that it mediates activation of G0/0S-phase Cdk/cyclin-complexes and re-entry of hepatocytes into the cell cycle.

The aim of this thesis was to validate a method called OSCARR for One-pot, Simple Cassette Randomization and Recombination for focused directed evolution, which had been developed by Dr. Hidalgo. It is based upon the megaprimer PCR method using outer primers differing in TM and including asymmetric cycles before the addition of the forward primer to generate more mutated megaprimer. As mutation-carrying primers, spiked oligonucleotides are employed. These spiked oligonucleotides are designed using an algorithm and have strictly defined composition of nucleotides at each position. An OSCARR library of the Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) of approximately 8000 clones was generated and screened for altered chain-length selectivity. Two mutants with higher activity towards medium chain length p-nitrophenyl esters were identified, both carried the mutation F126I, which causes the substrate entrance tunnel to be widened, thus facilitating access of bulkier substrates to the active site. One mutant carried the additional mutation G120S which completes a catalytic tetrad which is observed mainly in proteases. F126I had a stronger influence on chain-length specificity, so the further amino acids which form the “bottleneck” to the active site were mutated to further widen the entrance, and mutants with improved activity were found. The bottleneck mutants which consist of single, double, triple and quadruple mutants which are mostly combinations of F126L, F144L, F159L and I225L were then assayed for altered enantioselectivity against chiral acids and secondary alcohols. For substrates 1-phenyl-1-propyl acetate (2), 1-phenyl-2-propyl acetate (3) and 1-phenyl ethyl acetate (4), mutants with increased enantioselectivity were found. I225L plays a crucial role, as it is vital for enantioselectivity against 3, but destroys selectivity against 2, both facts obvious from the comparison of the triple mutant without I225L (mutant T3) and the corresponding quadruple mutant including I225L (mutant Q). However, the single mutant I225L alone does not possess high selectivity against 3, so synergistic effects play an important role. The PFE I wild type already possesses a good enantioselectivity in the hydrolysis of 4, but all mutants which were analyzed in detail surpass the wild type. The program YASARA was then used to calculate docking solutions for both enantiomers of 2 and 3 into the wild type and the best mutant. The results revealed that the mutants’ widened bottleneck allows the phenyl moiety of the substrates to point towards the access tunnel, while only (R)-2 does so in the wild type. Residues 126 and 144 do not come very close to the substrate and are more likely to influence substrate diffusion. Another goal was to find a way to confer promiscuous amidase activity upon the PFE I. In the search for structural homologues, a close structural neighbour with amidase activity was found. The --lactamase from Aureobacterium sp. was named after its activity toward the Vince lactam 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one. Biocatalysis experiments with the PFE I and its mutants revealed an excellent enantioselectivity against the ( )-lactam. Specific activities were determined for purified proteins, and the activity of some mutants was within the same order of magnitude as lactamase’s activity.

In ersten Teil der Arbeit wurde versucht, in einer α/β-Hydrolase (Esterase) durch den Austausch einzelner Aminosäuren die Aktivität eines anderen Mitgliedes zu erzeugen (Haloalkan-Dehalogenase (HLD)). Als Modellenzym diente die Arylesterase PFE aus Pseudomonas fluorescens, welche wie die HLDs eine cap-Domäne aus &alhpa;-Helices aufweist. Bei den HLDs wurde sich an den Unterfamilien HLD-I und II orientiert, deren Mitglieder Unterschiede in ihren katalytischen Triaden und in einigen weiteren, an der Katalyse beteiligten Aminosäuren zeigen. Sie katalysieren jedoch die gleiche Reaktion und unterscheiden sich nicht in ihrem Mechanismus. Mit Hilfe von Sequenz- und Strukturalignments einiger HLDs und der PFE wurde nach konservierten Bereichen innerhalb der HLDs gesucht. Neben der katalytischen Triade mussten die für HLD-Aktivität essenziellen Halogen-stabilisierenden Reste in der PFE eingefügt werden. Sowohl in der katalytischen Triade als auch bei den Halogen-stabilisier enden Resten gibt es Unterschiede zwischen den Unterfamilien HLD-I und HLD-II, woraus sich zwei unterschiedliche Sätze von hotspots ergaben. Mit Hilfe der error-prone PCR wurden auf Basis einer einfachen Mutante 4.000 Varianten erstellt und analysiert. Ein weiterer Ansatz zur Generierung von HLD-Aktivität beruhte auf einer Sättigungsmutagenese der Halogen-stabilisierenden Reste. Insgesamt wurden in diesem Experiment 765 Varianten erstellt und untersucht. Keine der mittels rationalem Design und gerichteter Evolution entwickelten Mutanten zeigte Aktivität. Das Fehlen von HLD-Aktivität liegt vermutlich im variabelsten Teil der HLDs begründet: dem loop nach dem β6-Strang. Die Aminosäuren aus diesem loop sind an der Bildung der Tunnel zum aktiven Zentrum beteiligt und haben Einfluss auf die Positionierung der Reste in der α4-Helix, welche z.T. das aktive Zentrum dieser Enzyme bilden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens zum Abbau von 3-Chlor-1,2-Propandiol (3-MCPD) und seinen Estern, welche in Lebensmitteln bei deren Herstellung entsehen können. Das Verfahren basiert auf einer Enzymkaskade aus Lipase, Haloalkohol-Dehalogenase (HHD) und Epoxydhydrolase (EH). Die Lipase setzt zunächst den Ester um und somit das 3-MCPD frei, welches im nächsten Schritt von der HHD zu Glycidol umgesetzt wird. Das ebenfalls toxische Glycidol wird schließlich durch eine EH zum nicht-toxischen Glycerin hydrolisiert. Im konkreten Fall wurden die Lipase A aus Candida antarctica (CAL-A), die HHD HheA aus Arthrobacter sp. AD2 und die EH EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1 verwendet. Als Fettsäurekomponente für die Umsätze mit einem 3-MCPD-Ester wurde die Ölsäure gewählt. Im wässrigen System konnten innerhalb von 3,5 h 75% des 3-MCPD umgesetzt werden, wobei nach Beendigung der Reaktion das Zwischenprodukt Glycidol nicht mehr detektiert werden konnte. Im 2-Phasen-System mit dem 3-MCPD-Ölsäureester als Substrat war die Lipase CAL-A in der Lage, den Ester nahezu quantitativ aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen und die entsprechenden Mengen an 3-MCPD freizusetzen, welches dann in der wässrigen Phase durch die HHD und die EH umgesetzt wurde. Dabei konnte der Wassergehalt im System ohne Einbußen in der Effektivität bis auf 5% gesenkt werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine neue HLD (DppA) aus Plesiocystis pacifica SIR-1 identifiziert und charakterisiert. Sequenz- und Strukturanalysen erlaubten die Einordnung des Proteins in die HLD-Unterfamilie I. Nach Untersuchung der Substratspezifität von DppA wurde das Enzym der Spezifitätsgruppe SSG-I zugeordnet. Im Unterschied zu den anderen Mitgliedern dieser Gruppe setzte DppA allerdings keines der getesteten chlorierten Substrate um. Bei der Suche nach strukturellen Erklärungen für diese Tatsache fiel eine Lücke im Sequenzalignment von DppA und dessen nächsten Verwandten DhlA auf. DppA fehlt hier ein Bereich von 11 Aminosäuren. Der Bereich liegt in der cap-Domäne und es wurde postuliert, dass das betreffende Segment sich durch die Anpassung eines Vorfahren heutiger Dehalogenasen an das Substrat 1,2-Dichlorethan entwickelte. In einer darauffolgenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass DhlA nach Entfernen einer Kopie der Sequenzwiederholungen nicht mehr in der Lage war, sein natürliches Substrat 1,2-Dichlorethan umzusetzen, dafür aber immer noch Aktivität gegenüber 1,2-Dibromethan zeigte. Die Aminosäurereste der Wiederholungen in DhlA haben Einfluss auf die Positionierung sowohl von Tunneln als auch von Resten im aktiven Zentrum. Ein Alignment der Strukturen von DhlA und DppA zeigte, dass ein Teil der Sequenz die Postion des slot-Tunnels aus DppA blockiert. Dementsprechend befindet sich dieser Tunnel in DhlA auch an anderer Stelle. Dem Enzym fehlen die mit der Fähigkeit zur Umsetzung von 1,2-Dichlorethan in Verbindung gebrachten Sequenzwiederholungen und dementsprechend setzt es insbesondere dieses Substrat nicht um.

Alpha/Beta-Hydrolasefaltungsenzyme wie Esterasen, Dehalogenasen oder Epoxidhydrolasen sind Enzyme, die unter anderem zur Detoxifizierung von Umweltschadstoffen und der Synthese von Feinchemikalien eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden die Alpha/Beta-Hydrolasefaltungsenzyme untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Dehalogenaseaktivität in der Esterase PFE I und der Epoxidhydrolase EchA erzeugt. Dabei wurden die katalytischen Loops und die Cap-Domäne ausgetauscht, sowie ein rationales Design durchgeführt. Mit dem Computerprogramm 3DM wurde des Weiteren die Konsensussequenz von Haloalkandehalogenasen ermittelt und diese in die Esterase PFE I integriert. Zur Untersuchung der geringen promiskuitiven Aktivitäten wurden sensitive Aktivitätsassays mit isothermaler Titrationskalorimetrie entwickelt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zwei kontinuierlich gerichtete Evolutionen durchgeführt. Die benötigten in vivo Mutagenesemethoden und Selektionsassays wurden in dieser Arbeit etabliert. Im Anschluss wurden die Methoden eingesetzt um zum Ersten die Enantioselektivität von Esterasen zu verbessern und zum Zweiten eine Dehalogenaseaktivität in Esterasen und Epoxidhydrolasen zu generieren.

Molybdopterin spielt in der Natur eine wesentliche Rolle, da es gebunden an Molybdän den Molybdän-Cofaktor bildet, der einer Reihe verschiedener Enzyme als katalytisches Zentrum dient. Der Molybdän-Cofaktor kann zwar aus dem Protein freigesetzt werden, erweist sich dann aber als instabil. Trotz langjähriger Bemühungen konnten der Molybdän-Cofaktor und seine biologischen Vorstufen bisher nicht auf chemischem Wege synthetisiert werden. Daher konnten die bisher gewonnenen Kenntnisse über diese Verbindung nicht anhand von Untersuchungen an dem freien Cofaktor gewonnen werden. Um den Cofaktor in seiner Chemie zu verstehen, beschäftigt sich diese Arbeit mit der chemischen Synthese von Modellverbindungen, die die Aufgaben des natürlichen Cofaktors nachbilden können. Um den Einfluss der verschiedenen Struktureinheiten auf die Stabilität oder die katalytische Aktivität zu verstehen und so ein tieferes Verständnis über Molybdopterin und mögliche Struktur-/Funktionsbeziehungen des natürlichen Cofaktors zu entwickeln, werden einzelne Strukturabschnitte untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit war der Fokus das Verständnis der Chemie des Pyrazin-Pyran-Dithiolen-Strukturabschnittes und nach Möglichkeit die Entwicklung alternativer Modellverbindungen, die in der Lage sind Sauerstoff-Transport-Reaktionen zu katalysieren und/oder mit dem Apoenzym verbunden werden können. Im besten Falle kann so eine Modellverbindung als Behandlungsmöglichkeit der Molybdän-Cofaktor-Defizienz eingesetzt werden, bei Bindung mit dem Apoenzym für iSOD (isolierte Sulfitoxidase-Defizienz) oder bei Nichtbindung für MoCo-Defizienz Typ B. Für die Synthese der Pyrazin-Pyran-Dithiolen-Liganden sollten bereits literaturbekannte Syntheserouten insbesondere von Garner modifiziert und optimiert werden. Vergleichsweise sollten auch Ligandensysteme mit einer CH2-Gruppe anstelle der Sauerstofffunktion des Pyrans synthetisiert werden. Des Weiteren sollten neue Synthesewege zu strukturell und elektronisch ähnlichen Verbindungen entwickelt werden. Die so gewonnenen Ligandensysteme sollten anschließend mit vorzugsweise Molybdän, aber auch Wolfram komplexiert werden.

In this thesis, rates and extend as well as the ecological implications of electron exchange reactions that involve redox-active moieties in organic matter (OM) were explored. The research builds on earlier findings that confirmed that OM may act as terminal electron acceptor (TEA) for electrons released in microbial respiration. This property was associated with quinone moieties that are ubiquitously found in OM from terrestrial and aquatic environments and that may undergo reversible reduction to the respective hydroquinone. Earlier methodological advances allowed for a rapid, direct and precise quantification of the electron accepting and donating properties of quinones in dissolved OM (DOM) by mediated electrochemical analysis. In this work, the previously established mediated electrochemical analysis was adapted and used in the characterization of redox properties of particulate natural samples that contain redox active iron and organic matter ("geochemical phases"). For the first time, direct measurements confirmed that microorganisms transferred electrons (e) from microbial respiration to the organic and inorganic electron acceptors in the particulate phase. Particulate OM in the sediments was found to provide a capacity to accept or donate e of 650 µmol e/gC. An incubation experiment resolved the spatiotemporal dynamics of organic and inorganic TEA species (i.e., nitrate, sulfate, Fe- and Mn oxyhydroxides) in sediments upon changes in oxygen availability and hence redox conditions. Oxygen is consumed when the reduced species are oxidized and, by this means, re-generate their electron-accepting capacity. The use of mediated electrochemical analysis allowed for the quantification of the redox state of the geochemical phases during their reduction and re-oxidation. The electron fluxes initiated by the oxic re generation of the TEAs nitrate, sulfate, Fe(III), Mn(IV) and quinoid moieties in OM were therefore directly monitored instead of modeled from the species’ distribution profiles in interstitial waters. The cyclic reduction and re-oxidation of redox species exposed to oxygen fluctuations was suspected to be a critical component of many aquatic ecosystems. In stratified lakes, extended sediment volumes are exposed to oxygen only upon lake overturn. Lake oxygen budgets are therefore influenced by benthic redox processes. The combined field and laboratory study showed that lake overturn seasonally introduces a finite amount of oxygen to the hypolimnion and that about 50% of the subsequent sediment oxygen consumption is exclusively associated with the re-generation of TEA species. These species previously formed in the sediment when organic matter was microbially decomposed during anaerobia. While lake overturn can completely mix epi- and hypolimnetic waters, small-scaled dynamics in temperature and oxygen availability may confine discrete parts of the water column with oscillations in physicochemical conditions. In the studied lake, a transient thermocline cyclically introduces oxygen to hypoxic hyplimnetic waters close to the pelagic redox interface. In the lake, organic TEAs may represent an important component of the total pelagic electron acceptor capacity. Due to the rapid and reversible redox reactions of DOM, reduced organic TEAs are re-generated upon dislocation to oxic parts of the water column. Results show that diurnal fluctuations of oxycline depth shape a micro-environment selecting for microbial species that are released from TEA limitations by OM in oxidized state. Pelagic microbial communities subjected to the same amount of OM in different oxidation states differed by more than 50% after one day. This work substantiates earlier findings that suggested that OM may be an important TEA species in many aquatic and terrestrial ecosystems. OM reduction in microbial respiration was shown to directly affect critical system parameters as bacterial activity, oxygen budgets and aquatic biodiversity. Both the microbial reduction and subsequent abiotic oxidation of OM are sufficiently fast for relevant interaction with oxycline fluctuation on different timescales. Given that organic TEAs are cyclically regenerated, a significant share of ecosystem respiration could be linked to OM reduction. This thesis demonstrated the new and important role electron exchange reactions in OM-rich environments play and explored the mechanism of this previously neglected part of lake functioning. As of today, linking the chemistry of aquatic turnover processes with the microbiological and physical conditions at redox interfaces remains challenging. In conclusions, by providing several cases from aquatic environments, this thesis contributes to the mechanistic understanding of OM reduction in microbial respiration. The results prompt for further research regarding the competitive inhibition of other respiration pathways, including the reductive production of the potent greenhouse gas methane.

Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are at the heart of modern translation, catalyzing the accurate biosynthesis of aminoacyl-tRNAs. According to the RNA world hypothesis, the early translation system should have aminoacylation ribozymes for RNA aminoacylation. For this, an aaRS ribozyme system, consisting of the KK13 ribozyme and the C3a ribozyme was successfully designed, which can perform both amino acid activation and aminoacyl transfer reaction. Generation of such aminoacylation ribozyme system would fill up the gap between the RNA world and the modern biological world. In addition, two types of diversified aminoacylation ribozymes, symmetrical ribozymes and self-assembling ribozymes were successfully developed, which may have great meaning in the origin of life.

Humanity is constantly confronted with the emergence and reemergence of infectious diseases. Many of them produce large or devastating epidemics, like AIDS (HIV) and Ebola. Others have been long neglected, yet pose immediate threats to global public health as evidences the abrupt emergence of Zika virus in South America and its association with microcephaly in babies. The examples illustrate, that many of these diseases are provoked by RNA viruses. One of the first steps in understanding and eliminating those threats is the development of sensitive and rapid diagnostic methods. A general and relatively rapid method is the direct detection and examination of the agent’s genome. However, the nature of (re)emerging RNA viruses poses a series of very specific problems for the design of such methods. Therefore, a systematic approach was proposed for the design of DNA-hybridization-base methods to detect and characterize RNA viruses that will have both a high sensitivity and a specificity sufficiently broad to detect, per reaction, down to a single copy of any of the possible variants of the viral genome. Following this approach a series of assays were designed, developed or adapted and put into use for detection and characterization of important RNA viruses. One of those viruses is West Nile virus (WNV), which after its explosive introduction into USA become the most widespread flavivirus throughout the world and, consequently, many countries began an intensive monitoring. While existing assay detected predominantly the Lineage 1, in Europa Lineage 2 was expected. Two new RT-qPCR for the detection of both lineages were developed, and reportedly used by independent laboratories. Due to more than 50000 associated deaths per year, the Hepatitis E virus also received an increasing attention to elucidate novel routes of transmission. This virus (especially genotype 3) has the zoonotic potential of transmission from pigs and wild boar to humans. RT-qPCR and nested qPCR for detection and characterization of this virus as well as a methodology for subtyping were developed and the first detected case of subtype 3b in a German wild animal was documented. In addition a novel assay for flaviviruses conformed by a RT-qPCR coupled with a low density DNA microarray was developed, which enabled the identification of WNV in mosquitoes from Greece. A RT-qPCR suitable for surveillance and diagnostic of all known variants of Venezuelan equine encephalitis virus was developed too. A causative agent of hemorrhagic infections, the Ngari virus, was detected and characterized in animal samples from Mauritania. These achievements were supported by the development of software applications for selection and visualization of primers and probes from aligned DNA sequences and for modeling of DNA hybridizations using unaligned sequences. In conclusion a general methodology for rapid development of sensitive diagnostic methods based in DNA-hybridization technics (PCR, sequencing and microarray) was stablished and successful applications are reported.

Die Monooxygenase TetX wurde zuerst in Bacteroides sp. identifiziert, später auch in Sphingobacterium sp. Tetracycline werden von TetX zu 11a-Hydroxy-Tetracyclinen hydroxyliert, welche nicht-enzymatisch weiterdegradieren und keine zweiwertigen Kationen chelatieren können. Dies führt zur Resistenz von aeroben Bakterien gegen Tetracycline. Die Verbreitung von TetX könnte zu einem späteren Zeitpunkt zu klinischer Relevanz gelangen. Die Kristallstruktur von TetX wurde durch Multiple Anomale Dispersion an einem Selenomethionin-Derivat gelöst. Die native Kristallstruktur von TetX konnte mit den erhaltenen Phasen des TetX-SeMet Experiments gelöst werden. Die Kristallstrukturen von TetX im Komplex mit 7-Iodtetracyclin, 7-Chlortetracyclin, Minocyclin und Tigecyclin wurden gelöst, wobei der Minocyclin-Komplex mit 2.18 Å der am höchsten aufgelöste Komplex ist und so zu den detailliertesten Einblicken der Tetracyclin-Erkennung durch TetX verhilft. Durch Derivatisierung von TetX-Einkristallen mit Xenon, welches ähnliche hydrophobe Eigenschaften wie molekularer Sauerstoff besitzt, wurden zwei besonders hydrophobe Taschen in der Substrat-bindenden Domäne von TetX identifiziert, die dem Sauerstofftransport dienen können. Neben der enzymatischen Inaktivierung von Tetracyclinen durch TetX sind nicht-enzymatische Abbauprozesse von Tetracyclinen allgegenwärtig. Dazu gehört die Umwandlung von Tetracyclinen zu Iso-Tetracyclinen im neutralen bis alkalischen Milieu, was zu einem Bruch der C11-C11a-Bindung und somit zu einer veränderten Anordnung der neuen Ringe A, B, C* und D führt. Die Bindung von Iso-Tetracyclinen zum Tetracyclin-Repressor, der durch die [Mg-Tetracyclin]-Bindung induziert wird, von der Operator-DNA tetO dissoziiert und so die Expression von TetR und dem Effluxprotein TetA reguliert, wurde untersucht. Die Affinität von Iso-Chlortetracyclin für TetR(D) wurde durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz bestimmt. Die Kristallstrukturen von TetR(D) im Komplex mit Iso-Chlortetracyclin bzw. Iso-Cyanotetracyclin wurden durch Co-Kristallisationsexperimente gelöst.