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Beeinflussung der Wundheilung von respiratorischen Epithelzellen in vitro durch Roxithromycin
(2023)
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des Makrolid-Antibiotikums Roxithromycin auf die frühe Phase der postoperativen Wundheilung am Zellkulturmodell untersucht werden. Gründe für den Einsatz des Medikamentes sind abseits der bekannten bakterios-tatischen Wirkung insbesondere die in der Langzeitanwendung beschriebenen immunmodulatorischen Effekte. Es sollte untersucht werden, ob diese bereits in der Akutsituation zu einem Benefit in der Wundheilung im HNO-Bereich führen, da Wundhei-lung hier sekundär verläuft und Wundheilungsstörungen durch Fibrosierungen und Re- Stenosen nicht selten zu einer operativen Korrektur zwingen.
Gewählt wurden S9-Zellen als Modell für respiratorisches Epithel, welche einer standardi-sierten Wundsetzung durch Stanzung unterzogen wurden. Mittels AlamarBlue-Assay wurden zytotoxische Medikamentenkonzentrationen herausgearbeitet und im Folgenden durch Konzentrationsfindungsversuche über 120 Stunden mit kombinierter Wundsetzung bestätigt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe beschleunigt Roxithromycin in Konzentrationen von 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml eher die Wundheilung, während Konzentrationen von 80 µg/ml und 160 µg/ml zu einer signifikanten (p ≤ 0.01 bzw. p ≤ 0.05) Hemmung der Wundheilung führen. Die Effekte waren jeweils über die ganze Beobachtungsdauer und im Ausmaß zunehmend nachweisbar. Roxithromycin in einer Konzentration von 160 μg/ml konnte die Zellproliferation 96 und 120 h nach Wundsetzung so stark hemmen, dass die residuale Wundfläche sogar anstieg.
In einem Validierungsansatz konnte zudem herausgearbeitet werden, dass die Wundsetzung konsequenterweise von nur einer/m Experimentierenden erfolgen sollte, um ein re-produzierbares Ergebnis zu erhalten, während sich kein Unterschied in der Auswertung der Wundflächen durch verschiedene Personen zeigte.
Zum Verständnis der molekularbiologischen Effekte des Medikamentes auf Epithelzellen wurden unter Berücksichtigung der in der Literatur beschriebenen maximalen Serumkonzentration bei systemischer Anwendung von Roxithromycin (7,28 ± 1,85 mg/l), fehlenden Hinweisen auf einen zytotoxischen Effekt sowie tendenziell beschleunigter Wundheilung nachfolgend 2D–DIGE-Experimente gekoppelt mit massenspektrometrischen Proteinidentifikationen für die Roxithromycinkonzentration von 10 µg/ml durchgeführt. Es ergaben sich Hinweise auf eine Förderung des Zellwachstums durch Beeinflussung des Polyaminmetabolismus über Induktion der Spermidinsynthase und darüber hinaus Spermidin-abhängige Modifikation des Translationsfaktors EIF5A. Des Weiteren wurde eine Nrf2-assoziierte Antwort auf oxidativen Streß bereits bei niedriger Roxithromycin- Konzentration von 10 µg/ml als protektiver Faktor ermittelt. Durch quantitative LC-MS/MS-Analysen wurde dieser Effekt ebenso für Konzentrationen von 20 und 40 µg/ml Roxithromycin bestätigt. Der weitläufig dokumentierte konzentrationsabhängige zytotoxische Effekt des Medikamentes bei höheren Konzentrationen konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Während apoptoseauslösende Proteine in der Konzentration von 10 µg/ml nicht nachgewiesen werden konnten, gelang in höheren Roxithromycin-Konzentrationen eine Darstellung von regulierten Proteinen des intrinsischen und extrinsischen Apoptoseweges, bis hin zur bereits mikroskopisch erfassbaren Zelldepletion bei Konzentrationen von 80 und 160 µg/ml. Insbesondere bei der Konzentration von 20 µg/ml fanden sich Hinweie, dass eine Regulation über den ERK1/2-Pathway stattfindet, welcher umfangreiche Funktionen wie Zytokinfreisetzung, Zellmigration, Zellproliferation und auch Zelltod moderiert.
Die Behandlung mit Roxithromycin führt in niedriger Konzentration (10 µg/ml) tendenziell zu einer beschleunigten Wundheilung ohne Auftreten zytotoxischer Effekte. Grundlage könnte die Aktivierung von Translationsfaktoren (EIF5A) und Protektion vor den Schäden durch oxidativen Streß sein. Damit stellt diese Therapie eine Option in der frühen postoperativen Situation im HNO-Bereich dar, welche allerdings weiterer Untersuchung z. B. durch Testung an Fibroblasten bedarf. Attraktiver erscheint das Outcome bei einer Medikamentenkonzentration von 20 µg/ml, da die epitheliale Wundheilung signifikant schneller abläuft und somit zu einem schnelleren Wundverschluß führt. Die molekularbiologischen Hinweise auf Induktion der Apoptose werden bei dieser Konzentration offenbar noch durch protektive Mechanismen über Beeinflussung der Zellmigration, Neutralisierung von Schäden durch oxidativen Streß und Eingriff in den ERK-Pathway aufgefangen, was bei höheren Roxithromycinkonzentrationen nicht mehr gelingt und in einer Zelldepletion mündet. Daher bietet sich für die Konzentration von 20 µg/ml insbesondere die topische Applikation als Salbenstrang oder Nasenspray an, um die positiven Effekte zu nutzen und die Limitation durch vorheriges Erreichen der maximalen Serumkonzentration zu umgehen. Empfehlenswert ist die Untersuchung des Medikamentes in weiteren Zell-reihen und in vivo da Wundheilung ein multimodaler Prozeß ist. Eine topische Applikation von ggf. höheren lokalen Konzentrationen scheint hier keinen zusätzlichen Nutzen darzustellen.
Es wird allgemein angenommen, dass nicht nur das Vorhandensein des Diabetes mellitus, sondern auch die Qualität der Therapie zur Optimierung der diabetischen Stoffwechsellage einen Einfluss auf Wundheilungsprozesse hat.
An 40 spontan-diabetischen B(io)B(reeding)/O(ttawa)K(arlsburg) sowie 20 nicht-diabetischen BB/OK Ratten wurden systematische Trommelfellperforationen vorgenommen. Der Verlauf der Trommelfellwundheilung wurde zu definierten Zeitpunkten fotodokumentiert und histologische Untersuchungen der Wundheilungsprozesse erfolgten zum Versuchsende.
In der Gruppe der normoglykämischen Versuchstiere konnte eine mittlere Dauer bis zum Verschluss der Perforation von 9,8 Tagen festgestellt werden. Für die hinsichtlich des Diabetesstoffwechsels gut kompensierten Ratten zeigte sich eine mittlere Dauer bis zum Verschluss der Trommelfellperforationen von 11,1 Tagen (p = 0,03). Bei den Tieren mit schlecht kompensierter Stoffwechselsituation war eine mittlere Dauer von 11,2 Tagen bis zum vollständigen Verschluss der Trommelfellperforationen zu verzeichnen (p = 0,04). Die Wundheilung am Trommelfell diabetischer Ratten ist im Vergleich zu stoffwechselgesunden Ratten statistisch signifikant verzögert. Es konnten hingegen keine statistisch signifikanten Unterschiede beim Vergleich des Verschlusses der Trommelfellperforationen zwischen den gut und schlecht kompensierten Diabetes-Ratten nachgewiesen werden (p = 0,77). Die Qualität der Stoffwechselkontrolle hat somit keinen spezifischen Einfluss auf die Wundheilung, sondern alleinig das Vorliegen des Diabetes mellitus verzögert diese.
Für Menschen mit Diabetes mellitus und gleichzeitigen Trommelfellperforationen lassen diese Ergebnisse die Schlussfolgerung zu, dass unabhängig von der Blutzuckerkontrolle eine verzögerte Wundheilung, z. B. nach einer Tympanoplastik, resultieren kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal in der aktuellen Literatur das Proteom von einer humanen und einer bakteriellen Zellreihe nach Behandlung mit sogenanntem tissue-tolerable Plasma hypothesenfrei analysiert. Mit diesem neuartigen Ansatz konnten die vorliegenden aktuellen Literaturdaten größtenteils bestätigt und erheblich erweitert werden. So konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit TTP dosisabhängig zu einer signifikant vermehrten Proliferation der humanen respiratorischen S9-Zellen führt. Als therapeutisch vielversprechendste Dosis wurde dabei, wie auch schon in der Literatur vermutet, die 120s-Behandlung identifiziert, wobei auch kleinere Dosen eine vorteilhafte Tendenz aufzeigten. Nichtsdestotrotz sind weitere Studien dringend erforderlich, um insbesondere die Langzeit- und Nebenwirkungen von TTP aufzuzeigen. Dass die Behandlung auch Risiken bergen könnte, zeigen die auf Proteinebene erhaltenen Ergebnisse, wo mit steigenden TTP-Dosen auch die Veränderungen der Expression von Proteinen der Funktionskomplexe DNA-Schäden und Apoptosefaktoren zunehmen. Unklar ist bislang, wie sich der Verlauf über den 120h-Zeitraum hinaus darstellt und mit welcher Häufig- und Regelmäßigkeit die Behandlung in der Klinik erfolgen müsste, um einen nachhaltigen, therapeutisch relevanten Effekt zu erzielen. Zum Nachweis der Praxistauglichkeit der Plasmatherapie sind weitere Studien erforderlich, um eben diese Fragen zu beantworten und auszuschließen, dass die negativen Auswirkungen bedingt bspw. durch verstärkte Apoptoseinduktion eventuell zu einem späteren Zeitpunkt die positiven Effekte der TTP-Behandlung überlagern oder antagonisieren. Notwendig sind auch klinische Studien in der Hals-Nasen-Ohrenkunde, die das Wachstumsverhalten der Zellen im Allgemeinen, aber auch im Speziellen der respiratorischen Zellen in vivo zeigen. Die in vitro gefundenen Resultate geben maximal einen kleinen Fingerzeig auf das, was in einem komplexen, wechselwirkenden Organismus zu erwarten ist. Bislang sind in diesem Bereich noch keine größeren Studien erfolgt.
Gezeigt werden konnte in der Arbeit auch, dass die Staphylokokken deutlich anfälliger für TTP sind als die humanen Zellen. Hier konnte das in vitro Wachstum eingeschränkt werden, was den Ergebnissen der aktuellen Literatur entspricht. Allerdings gilt hier ebenfalls, das in vitro erzielte Ergebnisse nicht ohne Weiteres auf die Klinik übertragen werden können. Auch wenn es bereits einige klinische Studien zur antimikrobiellen Wirkung von Plasma gibt, steht die Forschung noch am An-fang. Gezeigt werden muss im Verlauf noch, dass TTP auch im Biosystem Mensch die in-vitro gezeigten Effekte auslöst. Bekannt ist außerdem wie oben beschrieben, dass Staphylokokkus aureus ohnehin zu den sensibleren Keimen gehört. Eine Analyse des Verhaltens von möglicherweise resistenteren Bakterien ist nötig. Auch zu klären bleibt, wie sich Pilze unter der Behandlung verhalten und ob nicht nach Ausschalten der bakteriellen Flora möglicherweise ein Selektionsvorteil entsteht, der zu vermehrten Pilzwundinfektionen führt.
Die Ergebnisse der Arbeit konnten die Entstehung von oxidativen Stress als wichtigsten Mediator der TTP-Wirkung aufzeigen. Diese Erkenntnis deckt sich mit der aktuellen Studienlage und konnte aufgrund der umfassenden Proteomanalyse beider Zellreihen gewonnen werden. Nichtsdestotrotz müssen weitere genaue Auswertungen erfolgen. Aufgrund der sehr großen Datenmenge erfolgte im Verlauf der Analyse eine ausgiebige Ordnungs- und Filterarbeit. Trotz großer Sorgfalt ist es kaum möglich gewesen, alle Informationen zu berücksichtigen und in einer übersichtlichen Form zu erhalten. Daher sind die in der Arbeit dargestellten Ergebnissen lediglich ein kleiner Ausschnitt der offensichtlichsten Erkenntnisse. Es ist außerdem zu bedenken, dass aufgrund der technischen Limitation lediglich 1220 Proteine identifiziert werden konnten, bei aktuell 30.057 bekannten menschli-chen Proteinen [99]. Betrachtet wurden letztlich also lediglich 4% des Proteoms. Weitere globale Analysen sind im Verlauf sinnvoll und nötig, um die gewonnenen Resultate zu stärken oder zu hinterfragen .
Insgesamt präsentiert sich TTP als ambitionierte Therapiealternative, die große Möglichkeiten in der Medizin der Zukunft verspricht. Insbesondere in der HNO birgt es vielversprechende Möglichkeiten bei bislang problematischen Erkrankungen. Die Forschung ist allerdings gefordert, weitere umfassende Studien durchzuführen um die Sicherheit und Praktikabilität zu gewährleisten.
Die EPOS-Leitlinien empfehlen bei chronischer Sinusitis mit poyposis nasi die präoperative Gabe von Doxycyclin. Ein einheitlicher Standard für die postoperative Therapie fehlt. Es wurde daher der Frage nachgegangen, wie Doxycyclin und Kamillosan sich in einem in-vitro Wundmodell auf die Wundheilung auswirken. Drei Wundmodelle wurden verglichen und anschließend eine in-vitro Medikamententestung durchgeführt. Es handelt sich hierbei um die erste in-vitro Studie zur Wundheilung unter Einfluss von Doxycyclin und Kamillosan bei Epithelzellen und Fibroblasten. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige wachstumshemmende Wirkung auf Epithelzellen und Fibroblasten durch Kamillosan und ein wachstumsfördernder Trend auf Fibroblasten durch Doxycyclin. Das Wachstum von Epithelzellen blieb unter Einfluss von Dxycyclin unbeeinflusst.
In dieser Arbeit gilt es die „Beeinflussung der Trommelfellwundheilung der Ratte durch Blockade des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors“ (nach akuter traumatischer Trommelfellperforation) genauer zu betrachten. Die Arbeitshypothese dieser Ausarbeitung lautet, ob Erlotinib (ein kleinmolekularer Tyrosinkinase-Inhibitor), systemisch in unterschiedlich hohen Dosierungen appliziert, in der Lage ist, eine chronische Trommelfellperforation zu generieren. Erlotinib ist ein sehr potenter und spezifischer Inhibitor des EGFR, wobei langfristiges oder repetitives Einwirken jedoch eine Grundvoraussetzung für die Wirkungsentfaltung ist. Eine chronische Trommelfellperforation ließ sich in dieser Versuchsreihe nicht erwirken. Es kam zu einer Verzögerung des Wundheilungsprozesses bei Verabreichung von Erlotinib, ohne dass der Wundheilungsprozess jedoch vollständig gestoppt werden konnte. Die hervorgerufene Verzögerung ist jedoch mit hohen Nebenwirkungen behaftet (Diarrhoe, Gewichtsverlust sowie vorzeitiger Exitus). Die Arbeitshypothese ist damit als nicht erfüllt anzusehen. Im Rahmen dieser Versuchsreihe wurde hingegen erneut die Tatsache bestätigt, dass der Tyrosinkinase-Inhibitor an sich keine histologischen Veränderungen an EGF-haltigen Geweben bewirkt. Veränderungen histologischer Art fanden erst während des Wundheilungsprozesses nach akuter traumatischer Trommelfellperforation statt. Die Studie wirft neue Fragen bezüglich der Verträglichkeit von Erlotinib im Rahmen systemischer Applikation auf. In früheren Studien bestand an der guten Verträglichkeit dieses Medikamentes nahezu kein Zweifel. Eine nähere Erforschung diesbezüglich und eventuell die Entwicklung geeigneter Freisetzungssysteme, durch welche eine lokale Therapieform ermöglicht würde, gelten daher als entscheidende, noch zu lösende Problemstellung bei der Anwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren.