LASP-1 (LIM und SH3 Protein 1) ist ein aktinbindendes Struktur- und Signalprotein. Es spielt eine Rolle bei der Migration, Proliferation und Differenzierung von Zellen. Im Mamma-, Ovarial- und Urothelkarzinom sowie im kolorektalen und hepatozellulĂ€ren Karzinom werden Ăberexpressionen beschrieben, die mit klinischen Parametern korrelieren. In dieser Arbeit wurde die Lokalisation des Proteins im benignen Prostatagewebe, in der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) und im Prostatakarzinom analysiert. Hierzu wurden Gewebeschnitte von Prostatakarzinomen von insgesamt 50 Patienten mittels Immunhistochemie und Prostatakarzinomzelllinien (DU-145, PC-3, LNCaP) mittels Immunfluoreszenz und Transfektion von LASP-GFP-Plasmiden untersucht. LASP-1 wurde im Zytoplasma und im Zellkern von Zellen nicht-neoplastischer DrĂŒsen und Zellen der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) exprimiert. Im Prostatakarzinom war eine heterogene LASP-1-Expression auffĂ€llig. In den Zellkernen des Prostatakarzinoms kam eine starke ImmunreaktivitĂ€t signifikant hĂ€ufiger vor als in denen nicht-neoplastischer Zellen. Die IntensitĂ€t der ImmunfĂ€rbung fĂŒr LASP-1 nahm mit fortschreitender Entartung der Gewebe zu, d. h. Zellen der Perineuralscheideninvasionen wiesen die stĂ€rkste AnfĂ€rbung auf. Des Weiteren war mit steigendem Gleason-Muster eine vermehrte Expression von LASP-1 in den Zellkernen der Tumorzellen zu finden. Je höher die T-Kategorie des Karzinoms war, desto mehr LASP-1 kam in den Zellkernen der Tumorzellen vor. Bei positivem Lymphknotenstatus zeigte sich vermehrt eine starke ImmunreaktivitĂ€t in den Zellkernen der Tumorzellen im PrimĂ€rtumor. In den Prostatakarzinomzelllinien DU-145, PC-3 und LNCaP wurde LASP-1 immunzytochemisch nachgewiesen und eine Kolokalisation mit Aktin in der Zellperipherie an Zell-Zell-Kontakten, Zell-Substrat-Kontakten und ZellmembranauslĂ€ufern bestĂ€tigt. AuĂerdem zeigte sich eine Kolokalisation von LASP-1 und Vinculin in FokaladhĂ€sionen und Zell-Zell-Kontakten. Die Transfektion der Zellen mit LASP-GFP-Plasmiden fĂŒhrte zu einer Hemmung der Zellmigration in den Prostatakarzinomzelllinien DU-145 und LNCaP, wĂ€hrend bei PC-3-Zellen die Migration nicht durch die Transfektion beeinflusst wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen folgern, dass LASP-1 eine Rolle fĂŒr die AdhĂ€renz und MotilitĂ€t von Prostatakarzinomzellen spielt und ein Zusammenhang zwischen der LASP-1-Expression und der MalignitĂ€t sowie klinischen Parametern des Prostatakarzinoms besteht.
Abirateron ist ein selektiver CYP17A1-Inhibitor und hemmt die Synthese von Steroiden wie Testosteron und Dihydrotestosteron. Molekulare Analysen an unserem PCa Zellkultur-Modell zeigten, dass Abirateron eine Hemmung der Androgen-Rezeptor(AR)-AktivitĂ€t bewirkte, die sowohl durch eine unterdrĂŒckte Expression des AR selbst als auch durch die Suppression AR-assoziierter Hitzeschock-Proteine (HSP) vermittelt wurde. Von besonderer Bedeutung waren die Analysen der AR-negativen Zelllinie PC-3 deren Proliferation unerwartet ebenso durch Abirateron gehemmt wurde. Diese Beobachtung lieĂ weitere, AR-unabhĂ€ngige Wirkmechanismen von Abirateron vermuten. So konnte gezeigt werden, dass Abirateron die Expression von Survivin unterdrĂŒckt, möglicherweise durch die Hemmung des Survivin-Bindungspartners HSP90, was eine AR-unabhĂ€ngige Reduktion der Zellzahl zur Folge hĂ€tte. Ein weiterer durch Abirateron regulierter Faktor ist die microRNA miR-1. Diese als Tumorsuppressor charakterisierte miR wurde in Gegenwart von Abirateron induziert und kann unabhĂ€ngig von der Steroid-Synthese-Hemmung das Wachstum der PCa-Zellen reduzieren. Die Analyse apoptotischer Mechanismen zeigte zudem die Induktion der pro-apoptotischen Faktoren p53, HSP60 und p21, was ebenfalls auf eine antiproliferative Abirateron-Wirkung unabhĂ€ngig von AR-Signalwegen hinweist. In der Gesamtheit zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Abirateron nicht nur ein Inhibitor der Androgensynthese ist, sondern auch auf davon unabhĂ€ngige Signal- und Effektorkaskaden wirken kann, welche zu einer Reduktion des Zellwachstums fĂŒhren. Abirateron ist ein Ă€uĂerst wirksames Mittel zur Therapie des CRPC. Diese EffektivitĂ€t liegt möglicherweise in den vielfĂ€ltigen Wirkmechanismen begrĂŒndet und könnte die Applikation von Abirateron auch in frĂŒhen PCa-Stadien sinnvoll erscheinen lassen.
Bei individueller Tumorprogression und Kastrationsresistenz des Prostatakarzinoms (PCa) sind der Wachstumsfaktor âTransforming growth factor-betaâ (TGF-beta), die TGF-beta-Rezeptoruntereinheiten 1 & 2 (TGF-betaïąR1 & TGF-betaR2) und die Homologe der Proteine SMA und MAD (Smad-Proteine) wesentliche molekulare Schalter. Ihrem Wirken werden sowohl pro- als auch antionkogene Eigenschaften zugeschrieben. Leitliniengerecht kommen beim kastrationsresistenten PCa u.a. das antiandrogene Therapeutikum Abirateron sowie die Zytostatika Cabazitaxel und Docetaxel zum Einsatz. Ein Versagen der Wirkstoffe in diesem Stadium reduziert die Ăberlebenswahrscheinlichkeit des Patienten drastisch. Einen möglichen Anhaltspunkt fĂŒr ein Versagen der Chemotherapie liefert die vorliegende Arbeit.Untersucht wurde, inwiefern eine Inkubation mit o.g. Wirkstoffen Einfluss auf TGF-beta und Smad-Signalkaskade, und somit auf Proliferation und Progression beim kastrationsresistenten Prostatakarzinom einnimmt.
Cabazitaxel zĂ€hlt zur Familie der Taxane und wird seit seiner Zulassung 2010 fĂŒr das fortgeschrittene CRPC als second-line Medikament eingesetzt. Es zeigte eine antiproliferative Wirkung nach der first-line Docetaxel-Behandlung. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Cabazitaxel auf zellulĂ€rer und molekularer Ebene in unterschiedlichen PCa-Zellen charakterisiert. HierfĂŒr wurden verschiedene PCa Zellstadien als Zellmodell eingesetzt. Zu Beginn wurde die IC50 fĂŒr die hormonrefraktĂ€ren PC3-, LNCaP- und 22Rv1 Zellen bestimmt. Eine antiproliferative Wirkung von Cabazitaxel konnte fĂŒr alle drei Zelllinien bestĂ€tigt werden. Die Untersuchung des proliferativ wirkenden Faktors AR, welcher fĂŒr die Progression des PCa verantwortlich gemacht wird, ergab eine Repression der AR-Protein Expression unter Cabazitaxel-Behandlung in AR-positiven LNCaP-Zellen. DarĂŒber hinaus wurde auch die PSA-mRNA in LNCaP-Zellen nach kurzer Induktion weniger exprimiert. Von Bedeutung war jedoch, dass auch in den AR-negativen PC3-Zellen eine Hemmung der Proliferation zu zeigen war. Somit wurden in weiteren Westernblot-Analysen die AR-assoziierten Proteine HSP27, HSP70, HSP90alpha und beta und Co-Chaperone HSP40 und HOP sowie der AR-Corepressor PHB hinsichtlich ihrer Expression in beiden Zelllinien untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass HSP27 auf mRNA- und Protein-Ebene in beiden Zelllinien reprimiert wurde. Ein zytoprotektiver Effekt des HSP27 beim Vergleich von PC3 und PC3-HSP27 Zellen lag nicht vor. Des Weiteren konnte keine signifikante Beeinflussung der Protein-Expression der bereits genannten HSPs sowie des pro-apoptotisch wirkenden HSP60 in beiden Zelllinien nach Cabazitaxel-Inkubation gezeigt werden. Die Auswirkung von Cabazitaxel auf den Apoptoseweg konnte mit einer signifikanten Induktion der p53 Expression gezeigt werden. PARP wurde unter Cabazitaxel-Behandlung nicht gespalten. Schlussendlich muss man sagen, dass die Behandlung mit Cabazitaxel ĂŒber die Repression des HSP27-Proteins einen zytostatischen Effekt bewirkt, was einen Unterschied zur Docetaxel-Behandlung von PCa-Zellen darstellt. Hierdurch kann eine Docetaxel induzierte und HSP27-vermittelte Resistenz ĂŒberwunden werden, was die Wirkung des second-line Medikaments auf molekularer Ebene erklĂ€ren kann.
Tumorbiologie und molekulare Mechanismen der Progression des Prostatakarzinoms (PCa) sind komplex und bisher nur unzureichend verstanden. Trotz einiger medikamentöser AnsĂ€tze zur Therapie des PCa mit teilweise neuartigen Wirkstoffen spielen primĂ€re und sekundĂ€re Therapie-Resistenzen bei der Behandlung eine groĂe Rolle. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des apoptotischen Faktors Hitzeschockprotein HSP60 in PCa-Zellen, um potentielle Signalkaskaden und EffektormolekĂŒle einer HSP60-abhĂ€ngigen PCa-Progression aufzudecken. Durch massenspektrometrische Analysen von potentiellen HSP60-Bindungspartnern wurden mit den Proteinen Peroxiredoxin-1 (Prx-1), Peroxiredoxin-2 (Prx-2), Hitzeschockprotein HSP70, Poly(ADP-ribose)-Polymerase (PARP) sowie Prohibitin (PHB) Kandidaten identifiziert, die bei Chemoresistenz wie auch bei proliferativen und apoptotischen Prozessen eine Rolle spielen können. Jedoch konnten durch Western Blot Analysen der Bindungs-Experimente nur Prx-1 und PHB als HSP60-Bindungspartner bestĂ€tigt werden. Die Modulation der HSP60-Expression mittels klonierter Ăberexpressions- und Knock-Down-Vektoren schlug aufgrund einer mutmaĂlichen starken und sehr raschen zellulĂ€ren Gegenregulation fehl. Dies kann als Hinweis darauf gedeutet werden, dass es sich bei HSP60 um einen essentiellen zellulĂ€ren Faktor mit einer sehr stringenten Expressions-Kontrolle handeln könnte. Analysen der HSP60-Expression nach Modulation der Syntheseraten von miR-1 zeigten eine deutliche Induktion des Hitzeschockproteins durch die MikroRNA. Die Frage, ob HSP60 in PCa-Zellen pro- oder anti-apoptotisch wirkt, konnte mangels effizienter Modulation der HSP60-Expression nicht ausfĂŒhrlicher untersucht werden. Da der positive HSP60-Regulatior miR-1 jedoch als Tumorsuppressor beschrieben wird und eine Protein-Protein-Interaktion von HSP60 mit den pro-apoptotischen Proteinen Prx-1 und PHB nachgewiesen werden konnte, kann man die begrĂŒndete Annahme formulieren, dass HSP60 in PCa-Zellen pro-apoptotische Funktionen ausfĂŒhrt.
Summary Prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer found in men from western countries and is the leading cancer death next to lung cancer and colorectal cancer. Proteomic studies on PCa identified a number of differentially expressed proteins and some of them were reported as potential markers, but clinical application of these markers is mostly missing. Most of the expression profiling studies have been carried out on radical prostatectomy specimens, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections, serum, urine and prostate fluids. To define the protein expression pattern of prostate biopsies, in the present study we investigated biopsy samples from benign prostate hyperplasia (BPH) and PCa patients by two-dimensional gel electrophoresis (BPH n=11 and PCa n=12) and mass spectrometry to identify potential biomarkers which might distinguish the two clinical situations. 2-DE results revealed 88 protein spots expressed differentially among hyperplasia and cancer groups with statistical significance. Interesting spots were analyzed by MALDI-TOF-MS-MS and 79 different proteins identified. The important proteins identified included, Prohibitin and NDRG1 tumor suppressor proteins, HSPs, cytoskeletal proteins, enzymes like DDAH1 and ALDH2. Prohibitin expression was investigated in detail at mRNA level and protein level using immunohistochemistry on prostatectomized specimens. We found that the level of mRNA for prohibitin correlates with the increased amount of protein indicating the involvement of changes at transcriptional level. Furthermore, immunohistochemistry revealed no staining in BPH, moderate staining in prostate intraepithelial neoplasia (PIN) and strong staining in PCa. From the list of differentially proteins compared to PCa, TPD52 is over expressed in prostate cancer and also mRNA estimation by real-time PCR confirmed over expression of TPD52 at transcriptional level in cancer. TPD52 is a protein over expressed in prostate and breast cancer due to gene amplification but its exact physiological function is not investigated in detail. In the present study, we explored the responsiveness of LNCaP cells after dysregulation of TPD52 expression. Transfection of LNCaP cells with specific shRNA giving efficient knockdown of TPD52 resulted in a significant cell death of the carcinoma LNCaP cells. As evidenced by the activation of caspases (caspase-3 and -9) and by the loss of mitochondrial membrane potential, cell death occurs due to apoptosis. The disruption of the mitochondrial membrane potential indicates that TPD52 acts upstream of the mitochondrial apoptotic reaction. To study the effect of TPD52 expression on cell proliferation, LNCaP cells were either transfected with EGFP-TPD52 or a specific shRNA. EGFP-TPD52 overexpressing cells showed an increased proliferation rate whereas TPD52-depleted cells showed a reverse effect. Additionally, we demonstrated that the exogenous expression of TPD52 promotes cell migration via åvù3 integrin in prostate cancer cells through the activation of protein kinase B (PKB/Akt) pathway. In an attempt to identify new interacting proteins for TPD52, GST pulldown assays provided evidence for the physical interaction between TPD52 and Prx1 in LNCaP cells. Further, immunoprecipitation results confirmed this interaction. Our results demonstrates that protein profiling and mRNA studies can be performed on prostate biopsies. Moreover, our study revealed a significant up-regulation of prohibitin in prostate cancer compared to BPH which may be a potential marker to distinguish PCa and BPH. From the results for functional characterization of TPD52, we conclude that TPD52 plays an important role in various molecular events particularly in morphological diversification and dissemination of PCa. It may be a promising target to investigate further in detail to develop new therapeutic strategies to treat PCa patients. Caspases represent a family of cysteine proteases that are regarded as central executioners of apoptotic cell death. Activation of caspase cascade is an essential prerequisite in the induction of apoptosis in cellular systems. So far, in many tumors caspases were shown to be downregulated while anti-apoptotic Bcl-2 is up-regulated. To get insight in their putative role in PCa progression we determined the expression of caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved (activated) caspases 3 and 6, caspase-9 and antiapoptotic protein Bcl-2 in benign prostate epithelium (BPE) and prostate carcinoma. In the current study 20 prostates were obtained from patients undergoing radical prostatectomy due to PCa. Paraffin embedded prostate whole mounts were cut at (4 ”m) and investigated immunohistochemically using anti-mouse monoclonal antibodies directed against caspases 1 and 9, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved caspases 3 and 6, and Bcl-2. In BPE all caspases were localized in the cytoplasm of glandular cells. Comparing BPE to PCa, no differences were found for caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6 as well as caspase-9. Immunostaining for cleaved caspases 3 and 6, however, revealed a statistically significant reduction in PCa compared to non-neoplastic tissue. Whereas in BPE Bcl-2 protein was detected in the basal compartment of epithelial gland cells no immunostaining was seen in PCa. As our results show a decreased amount of activated caspases may be due to the alterations of posttranslational cleavage rather than expression of caspases 3 and 6. This suggests that the modification in their activation pathway could play an important role during PCa progression.
Die zytostatische Behandlung mit Docetaxel ist die leitliniengerechte Therapie des fortgeschrittenen, kastrationsresistenten Prostatakarzinoms (PCa). Die Entwicklung von Resistenzen gegenĂŒber Docetaxel bedeutet auf Grund fehlender Therapiealternativen hĂ€ufig eine deutlich verschlechterte Prognose fĂŒr den Patienten. In dieser Arbeit wurde das Hitzeschockprotein 27 (HSP27) als bedeutsamer Faktor fĂŒr erhöhte Docetaxelresistenz in PCa-Zellen identifiziert. Eine hohe Expression von HSP27 korrelierte wĂ€hrend der Docetaxelbehandlung mit einer geringeren Docetaxel-SensitivitĂ€t der Tumorzellen. FĂŒr die Vermittlung dieser Zytoprotektion war die dephosphorylierte Form des Proteins verantwortlich, wĂ€hrend die Expression von phosphomimetischem HSP27 eine deutliche Reduktion des Zellwachstums zur Folge hatte. Die Inkubation mit Docetaxel resultierte in einer verstĂ€rkten Expression von HSP27 und einer raschen Phosphorylierung des Proteins. Auf die erhöhte HSP27-Phosphorylierung folgte anschlieĂend eine stete Abnahme des phosphorylierten HSP27-Anteils an der weiterhin steigenden HSP27-Gesamtproteinmenge. HSP27 wird stimulusabhĂ€ngig hauptsĂ€chlich von zwei Kinasen an drei fĂŒr die Funktion ausschlaggebenden Serin-Resten phosphoryliert. Die Modulation der HSP27-Phosphorylierung durch Inhibition und Aktivierung weder von Proteinkinase D1 (PKD1), noch von Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK) p38 allein fĂŒhrte zu signifikant verĂ€ndertem Tumorzellwachstum. Die simultane Aktivierung beider Kinasen jedoch resultierte in einer erheblich verringerten Zellzahl. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit demonstrieren, dass als Antwort auf Docetaxel-Exposition vermehrt HSP27 exprimiert wird, welches in seiner dephosphorylierten Form die Resistenz gegenĂŒber der zytostatischen Wirkung von Docetaxel erhöht. Somit könnte die Aktivierung der fĂŒr die HSP27-Phosphorylierung verantwortlichen Kinasen möglicherweise zur Sensibilisierung von Tumorzellen gegenĂŒber dem Zytostatikum Docetaxel fĂŒhren. Dies wĂŒrde eine zusĂ€tzliche Therapieoption fĂŒr die Behandlung des fortgeschrittenen, kastrationsresistenten PCa eröffnen.
