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Microbial infections can be either caused by a single species or complex multi-species consortia. One of the most prominent opportunistic human pathogens leading to mono- or mixed-species infections is the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Understanding the molecular basis of its adaptation to infection-related stresses is an essential prerequisite for the prevention and treatment of P. aeruginosa infections. We therefore employed state-of-the-art proteomics approaches to elucidate the molecular adaptation mechanisms of P. aeruginosa to infection-related conditions. Moreover, structure, function and interaction of complex microbial consortia containing P. aeruginosa and causing catheter-associated urinary tract infections were investigated by metaproteomics analyses. Our investigations revealed that the adaptation of P. aeruginosa during infection is either based on gene expression changes caused by environmental signal integration or by gene mutations leading to a selective advantage in a particular host environment. In study I, investigating the proteome response of P. aeruginosa biofilms to the clinical relevant antibiotic ciprofloxacin, global changes in the protein profile were observed. Ciprofloxacin induced the expression of proteins involved in the Lex-induced SOS-response, drug efflux pumps and gene products of the ciprofloxacin-responsive prophage cluster and repressed the expression of porins and DNA-binding proteins. In study II the transcriptome and proteome of two clonal P. aeruginosa lineages during long-term colonization of cystic fibrosis (CF) patient’s lungs were analyzed. Point mutations in global regulator genes, i.e. retS, gacS, and gacA, were identified by genomic sequencing. Inactivation of RetS, found two years after the initial colonization, induced the expression of genes involved in chronic infections and coding for the type 6-secretion system (T6SS). Additional mutations in the GacS/GacA two-component regulatory system (TCS) were found to repress the expression of T6SS proteins and to induce the expression of proteins belonging to the type 3-secretion system (T3SS). In study III we elucidated the niche-specific adaptation of P. aeruginosa isolates from different infection sites by investigating their protein expression patterns and glucose metabolic fluxes. We could show that isolates from the urinary tract express a higher amount of proteins involved in the acquisition of micronutrients (i.e. iron) and carbohydrates compared to isolates from the CF lung. In study IV 16S rDNA sequencing and metaproteomics were employed to demonstrate that the investigated CAUTI-related biofilms consisted of two to five different species with one or two species dominating the mixed community. Following this line of research, we investigated in study V structure and function of a biofilm of a long-term catheterized patient, which was predominantly composed of P. aeruginosa and Morganella morganii, but also contained a minor proportion of the obligate anaerobe Bacteroides sp.. The comparison of in vivo and in vitro protein expression profiles of P. aeruginosa and M. morganii indicated that iron and carbohydrates are the major growth-limiting factors in the bladder. These results indicate different nutritional strategies of the two pathogens in the bladder environment. A comparison of urinary protein profiles of healthy persons and catheterized patients suggested that the human innate immune system is induced by CAUTIs. Moreover, numerous proteins involved in nutritional immunity, e.g. iron-, calcium- and magnesium-binding proteins, were found to be more abundant in the urine of catheterized patients. A follow-up (meta)proteomics study (study VI) aiming at the elucidation of interspecies interactions during multi-species infections indicated that the urease-positive uropathogen Proteus mirabilis induces the precipitation of metal ions by urine alkalization and thereby limits the availability of these important micronutrients for other co-infecting bacteria. This limitation seems to be sensed by the P. aeruginosa PhoP-PhoQ two-component system (TCS) leading to an increased resistance to antimicrobial peptides and biofilm-forming capacity of the pathogen. Also during co-cultivation of P. aeruginosa with Staphylococcus aureus a slight increase in the expression of the PhoP-PhoQ TCS and the alkaline protease could be observed (study VII). In study VIII a combined metagenomics and metaproteomics approach was employed to investigate structure and function of the lichen Lobaria pulmonaria, a complex consortium consisting of a fungus, an algal partner, cyanobacteria, and a highly diverse bacterial microbiome. The results presented in this work contribute to a better understanding of the manifold and complex bacterial adaptation mechanisms to infection-related and environmental stress and thereby foster the development of novel treatment and prevention strategies.
A physiological proteomic approach to address infection-related issues of Gram-positive bacteria
(2012)
Trotz der vielen wissenschaftlichen Fortschritten sind Infektionskrankheiten auch heute noch die Haupttodesursache weltweit. Sie haben nicht nur heute, sondern werden auch in der Zukunft eine große epidemiologische Bedeutung haben. Die komplexe Infektionsthematik sollte unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden: der Prävention und der Behandlung. Zur Prävention von Infektionen zählen neben der Dekontamination und Sterilisation auch die Impfungen sowie die Hygiene- und Gesundheitsaufklärung. Bei der Behandlung von Infektionen kann auf Antibiotika zurückgegriffen werden, wenn das humane Immunsystem die Infektionen nicht auf natürliche Weise bekämpfen kann. Zwischen 1969 und 2000 wurde kein neues Antibiotikum den bereits vorhandenen Antibiotikaklassen hinzugefügt. Parallel zu dieser schwindenden Antibiotikaforschung, verbreiten sich nosokomiale Infektionen und community-acquired (vor allem Methicillin-resistente) Infektionen rapide. Von besonderer Bedeutung ist die Grundlagenforschung an infektionsassoziierten Mikroorganismen, wie dem humanen Erreger Staphylococcus aureus. Im Zusammenhang mit Infektionen spielen Virulenzfaktoren eine entscheidende Rolle. Sie sind entweder an der Zelloberfläche platziert oder werden aktiv ins Medium sekretiert. Um das pathogene Potential von S. aureus besser zu verstehen und aufzuklären ist ein Verständnis über die Proteintransportwege essentiell. Momentan sind die Transportwege von Escherichia coli (Gram-negative) und Bacillus subtilis (Gram-positive) am besten charakterisiert. Viele Transportwegekomponenten wurden mittels Transkriptions und Proteomeanalysen auch in S. aureus konserviert gefunden und ermöglichten dadurch einen ersten Einblick in die Sekretionsmaschinerie. Das Verständnis, warum und wie Virulenzfaktoren Infektionen auslösen birgt ein großes Potential in der Suche nach verbesserter Infektionskontrolle und Behandlung. Kontaminierte medizinische Arbeitsmittel, wie zum Beispiel Katheter oder Endoskope können auch eine auslösende Quelle von Infektionen sein. Diese medizinischen Arbeitsmittel oder Geräte bestehen immer häufiger aus bio-kompatiblen Polymeren (z.B. Polyethylen (PE) oder Polyethylenterephthalat (PET). Diese thermosensitive Polymere können keinen hohen Temperaturen ausgesetzt werden, ohne dass sie beschädigt werden. Damit sind herkömmliche Sterilisationsverfahren (z.B. Autoklavieren) nicht anwendbar. Alternative chemische Verfahren (z.B. Ethylenoxid-Sterilisation) sind mit Nebenwirkungen und Risiken verbunden, die im medizinischen Bereich nicht akzeptabel sind. Alternative Dekontaminationsverfahren für diese thermosensitive Materialen sind also gefragt. Hierbei rückt das Niedertemperaturplasma (NTP) nicht nur bei den Physikern sondern auch bei den Biologen und Medizinern immer weiter in den Fokus der Forschung. NTP, welches unter atmosphärischen Druck erzeugt wird, ist aus einer Vielzahl von antimikrobiell aktiven Agentien und chemischen Produkten (z.B. atomarer Sauerstoff (O), Ozon (O3), Hydroxyl (OH), reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS)) zusammengesetzt und stellt damit ein wirksames Mittel für die mikrobielle Dekontamination dar. Seit einiger Zeit wird NTP auch erfolgreich bei der Wundbehandlung angewendet. Erste Studien zeigen ein großes Potential von NTP-Wundbehandlungen in Hinblick auf verbesserte Wundheilung. Die Anwendung von Plasma in der Medizin könnte ganz neue Perspektiven eröffnet- das ist zumindest die Vision. Auf der praktischen Seite gibt es allerdings noch eine Vielzahl von offenen Fragen: (i) welche Art von Plasma ist für welchen Zweck am besten geeignet; (ii) was sind die Vorteile von Plasma im Vergleich zu gängigen medizinischen Behandlungen; (iii) ist Plasma ein ökonomische Alternative im Vergleich zu gängigen Anwandelungen und Standards? Bevor Plasma sicher und routinemäßig in Krankenhäusern zu Einsatz kommen kann ist es zusätzlich von größter Wichtigkeit den Einfluss von Plasma auf Zellen zu klären. Erst wenn die Plasma-Zell-Interaktion (pro- und eukaryotische Zellen) grundsätzlich untersucht und verstanden ist kann eine sichere, erfolgreiche und vor allem akzeptierte Implementierung in den Krankenhausalltag stattfinden.
Abbau von Phenylalkanen und weiteren alkylsubstituierten Aromaten durch Hefen und filamentöse Pilze
(2009)
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Abbau von Phenylalkanen durch eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Pilze, zu untersuchen. Im Focus der Dissertation lagen dabei Untersuchungen mit der Hefe Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Des Weiteren erfolgten Analysen mit Candida maltosa SBUG Y 700, Trichosporon mucoides SBUG Y 801 und neun filamentösen Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix und Umbelopsis. Als Substrate wurden Phenylalkane mit fünf bis zehn und zwölf Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette eingesetzt. Zur Charakterisierung der Abbau- und Transformationsleistungen der Hefen, insbesondere von T. asahii, erfolgten darüber hinaus Biotransformationsexperimente mit Phenylalkan-Derivaten und aromatischen Säuren. Candida maltosa 1. Mit der Hefe C. maltosa, die zur Assimilation von n Alkanen befähigt ist, konnte ein Wachstum mit Phenylalkanen (0,5 % [v/v]), deren Alkylseitenkette mindestens 8 Kohlenstoff-Atome aufwiesen, ermittelt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ungeradzahligen Phenylalkanen (Phenylheptan und Phenylnonan) konnte eine kontinuierliche extrazelluläre Akkumulation von Benzoesäure nachgewiesen werden. Phenylalkane mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette (Phenylhexan, Phenyloctan, Phenyldecan und Phenyldodecan) werden via Phenylbuttersäure und 4 Phenyl 3-butensäure zu Phenylessigsäure abgebaut, die ebenso wie Benzoesäure extrazellulär angereichert wird. 3. C. maltosa ist nicht zur weiteren Oxidation von Benzoesäure und Phenylessigsäure befähigt und akkumuliert daher diese Säuren während des Phenylalkan-Abbaus als dead-end-Produkte. Trichosporon asahii 1. In Wachstumsexperimenten mit T. asahii konnte gezeigt werden, dass die Hefe n Alkane (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) und Phenylalkane mit mindestens sieben Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette assimilieren kann. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ruhenden Zellen und Phenylheptan konnten anhand von HPLC-, GC-MS- und z. T. NMR-Analysen neun Produkte identifiziert werden: 7 Phenylheptansäure, 7-(2 Hydroxyphenyl)-heptansäure, 3 (2 Hydroxyphenyl) propionsäure, Benzoesäure, 3,4 Dihydroxybenzoesäure, Cumarin, 4 Hydroxycumarin, 4,6 Dihydroxycumarin und 4,8 Dihydroxy-cumarin. 3. Die Bildung der Metaboliten 2 Hydroxyphenylheptansäure und 2 Hydroxyphenylpropionsäure sowie der Cumarine konnte erstmals durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für den mikrobiellen Abbau von Phenylalkanen beschrieben werden. Die hydroxylierten Cumarine 4 Hydroxy-, 4,6 Dihydroxy- und 4,8 Dihydroxycumarin wurden bis Versuchende kontinuierlich im Inkubationsmedium akkumuliert, während die übrigen sechs Produkte nur zwischenzeitlich durch die Hefe ausgeschieden wurden. Die Inkubation von T. asahii mit Phenyloctan führte dagegen nur zum Nachweis der hydroxylierten Cumarine. In Biotransformationsexperimenten mit Phenylnonan, Phenyldecan und Phenyldodecan konnte als einziger Metabolit 4 Hydroxy-cumarin detektiert werden. Die für andere Hefen typischen Abbauprodukte wie Benzoesäure und Phenylessigsäure wurden durch diese Aromaten verwertende Hefe nicht akkumuliert. 4. Die Bildung von 4 Hydroxycumarin konnte auch in Biotransformationsexperimenten mit Phenylheptansäure, 2 Hydroxyphenyl-propionsäure, trans 2 Hydroxyzimtsäure sowie Cumarin nachgewiesen werden. Während die Transformation der zwei ortho-hydroxylierten Säuren in Ausbeuten von über 70 % 4 Hydroxycumarin innerhalb von 24 h resultierte, wurden nur 9,4 % der Phenylheptansäure und ca. 13 % des Cumarins in 4 Hydroxycumarin transformiert. 6. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung der Cumarine wurde die Bildung von Cumarinen aus den Präkursor-Stoffen 2,4 Dihydroxyphenylpropionsäure und 7 Hydroxycumarin durch T. asahii geprüft. Dabei konnte 4,7 Dihydroxycumarin während der Inkubation mit 2,4 Dihydroxyphenyl-propionsäure und 7 Hydroxycumarin nachgewiesen werden und zusätzlich 6,7 Dihydroxycumarin mit 7 Hydroxycumarin als Substrat. Eine 20-fache Steigerung der 6,7 Dihydroxycumarin-Konzentration wurde mit Zellen einer Phenol-Kultur im Vergleich zu Zellen, die mit Hefeextrakt kultiviert wurden, erreicht, was auf die Beteiligung einer induzierbaren Phenolhydroxylase hindeutet. 7. Unter Verwendung des Cytochrom P450-Inhibitors 1 Aminobenzotriazol konnte eine Beteiligung von Cytochrom-P450-Enzymen an der ortho-Hydroxylierung des Benzenrings von Phenylalkanen bzw. alkylsubstituierten aromatischen Säuren ermittelt werden. Diese Reaktion ist neben der Einführung einer Doppel-bindung in der Alkylseitenkette eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von Cumarinen. 8. Während der Inkubation von T. asahii mit dem Phenylheptan-Derivat Heptanophenon wurden primär Metaboliten detektiert, die am C1-Atom der Alkylseitenkette eine Hydroxy-Gruppe aufweisen und/oder subterminal am C4-, C5- und C6-Atom oxidiert sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte für Hefen erstmals eine subterminale Oxidation von gesättigten Alkylketten nachgewiesen werden. Trichosporon mucoides 1. In den Untersuchungen mit T. mucoides konnte gezeigt werden, dass die Hefe nicht zur Assimilation von n Alkanen (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) befähigt ist. Die Kultivierung mit Phenylnonan und Phenyldecan führte zwar nur zu einer geringen, dennoch signifikanten Zunahme der Biomasse. 2. Obwohl T. mucoides keine n Alkane verwerten kann, wurden in Biotransformationsexperimenten mit Phenylalkanen Metaboliten detektiert, die nicht nur aus terminalen und ß Oxidationsreaktionen an der Alkylseitenkette hervorgegangen sind, sondern auch subterminalen und am Ring stattfindenden Reaktionen zugeschrieben werden konnten. Das Metabolitenspektrum, das in den Untersuchungen mit Phenylalkanen und aromatischen Säuren ermittelt wurde, glich im Allgemeinen dem von T. asahii. Filamentöse Pilze 1. Mit Ausnahme von Penicillium chrysogenum zeigten alle Stämme der getesteten filamentösen Pilze die Fähigkeit zum Wachstum mit Phenyldodecan. Eine besonders starke Zunahme der Biomasse war dabei mit Sporothrix nivea SBUG M 35 und Umbelopsis isabellina SBUG M 1145 zu verzeichnen. Phenylalkane mit kürzeren Alkylseitenketten konnten von den meisten der untersuchten Pilze kaum bzw. nicht als Wachstumssubstrate genutzt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit C. elegans, M. hiemalis und U. isabellina konnten 5 neuartige Metaboliten identifiziert werden: Zimtaldehyd, Zimtalkohol, Phenylpropanol und Benzylalkohol (deren Bildung wird auf reduktive Reaktionen der entsprechenden Carbonsäuren zurückgeführt) sowie ein Glycinamid der Zimtsäure, das eine Art Konjugat darstellt. 4. Während der Inkubation der filamentösen Pilze Sp. nivea SBUG-M 25 und SBUG M 242 sowie C. elegans und U. isabellina mit Phenylheptan wurde – analog zu Versuchen mit T. asahii - auch 4 Hydroxycumarin als Metabolit nachgewiesen.
The toluene-degrading and solvent-tolerant strain Pseudomonas putida DOT-T1E was investigated with respect to its suitability and economic efficiency as biocatalyst in aqueous-organic two-phase systems with aliphatic solvents as organic phase (Rojas et al. 2004, chapter 4 and 5) and to its adaptive responses to the solvent decanol. The adaptive changes on the level of cell morphology (chapter 2), membrane fatty acids and permeability (chapter 3), as well as energetics and surface properties (chapter 5) of P. putida DOT-T1E have been investigated in order to ascertain information about the strain's suitability for two-phase biotransformation systems (chapter 4). The morphological adaptation to the presence of solvents was observable in changes of the cell size of P. putida DOT-T1E. Those changes were dependent on the cellular activity and occurred only after addition of non-lethal solvent concentrations. The cells reacted to the presence of organic solvents by decreasing the ratio between surface and volume of the cells and therefore reducing their relative surfaces (chapter 2). The cell surface and especially the cytoplasmic membrane are the major targets for toxic effects of membrane-active compounds like solvents. The mechanism of the cis-trans isomerisation of unsaturated fatty acids counteracts the fluidizing effect of solvents by increase the ordering of the membrane and therefore its rigidity. By comparing the responses of the cells to a series of stress factors (like solvents), a direct correlation between the activation of this mechanism and the well investigated K+-uptake pumps was observed (chapter 3). Huertas et al. (1998) reported that this strain tolerated concentrations of heptane, propylbenzene, octanol, and toluene of at least 10 % (vol/vol). 1-decanol is, in comparison to toluene, less hazardous and volatile, and it possesses good extraction properties for the desired fine chemical products. In further investigations of possible biotechnological processes, it was discovered that decanol is also a more suitable solvent as organic phase (chapter 4). Although the cells of P. putida DOT-T1E needed additional energy for their adaptation to the presence of the solvent decanol, they were able to maintain or activate their electron transport phosphorylation allowing homeostasis of ATP level and energy charge in the presence of the solvent, at the price of a reduced growth yield. On the other hand, significantly enhanced cell hydrophobicities converging with more negative cell surface charges were observed in cells grown in the presence of 1-decanol (chapter 5). It is however important to note that all the cell’s properties observed are closely linked to each other since they are all part of the adaptive response of the cells. It can be concluded that the easy adaptability and good growth properties of Pseudomonas putida DOT-T1E in the presence of the organic solvent 1-decanol make this system an excellent candidate for two-phase fermentation processes. Moreover, the absence of differences in the energetics of the bacteria during exposure to 1-decanol as compared to bacteria that grew in the absence of 1-decanol, support that this organism can be used for the industrial production of fine chemicals in an economically sound manner.
Technological advances in light microscopy have always gone hand in hand with unprecedented biological insight. For microbiology, light microscopy even played a founding role in the conception of the entire discipline. The ability to observe pathogens that would otherwise evade human observation makes it a critical necessity and an indispensable tool to infectious disease research. Thus, the aim of this thesis was to optimize, extend, and functionally apply advanced light microscopy techniques to elucidate spatio-temporal and spatio-morphological components of bacterial and viral infection in vitro and in vivo.
Pathogens are in a constant arms race with the host’s immune system. By finding ways to circumvent host-mediated immune responses, they try to evade elimination and facilitate their own propagation. The first study (publication I) demonstrated that the obligate intracellular pathogen Coxiella burnetii is not just able to infect natural killer (NK) cells, but is actually capable of surviving the harsh degradative conditions in the cytotoxic lymphocyte’s granules. Using live-cell imaging of reporter-expressing Coxiella burnetii, the transient NK cell passage was closely monitored to provide detailed spatio-temporal information on this dynamic process in support of a range of static analyses. Bacterial release from NK cells was pinpointed to a time frame between 24 to 48 hours post-infection and the duration of release to about 15 minutes.
The second approach (publications II-V) aimed at shedding light on the greater spatio-morphological context of virus infection. Thus far, most studies investigating the distribution or tropism of viruses in vivo have used conventional immunohistochemistry in thin sections. Omitting the native spatial context of the infection site in vivo inherently bears the risk of incomplete description. While the microscopic tools and sample preparation protocols needed for volumetric 3D immunofluorescence imaging have recently been made available, they had not gained a foothold in virus research yet. An integral part of this thesis was concerned with the assessment and optimization of available tissue optical clearing protocols to develop an immunofluorescence-compatible 3D imaging pipeline for the investigation of virus infection inside its intact spatio-morphological environment (publication II). This formed the basis for all subsequent volumetric analyses of virus infection in vivo presented here. Consequently, this thesis provided a valuable proof of concept and blueprints for future virus research on the mesoscopic scale of host-pathogen interactions in vivo (publications II-V), using rabies virus (RABV; publications II-IV) and the newly-emerged severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2; publication V) as infection models for the nervous system and the respiratory tract, respectively.
Applying and further improving this volumetric 3D imaging workflow enabled unprecedented insights into the comprehensive in vivo cell tropism of RABV in the central (CNS) (publication III) and peripheral nervous system (PNS) (publication IV). Accordingly, differential infection of CNS-resident astrocytes by pathogenic and lab-attenuated RABV was demonstrated (publication III). While either virus variant showed equal capacity to infect neurons, as demonstrated by quantitative image analysis, only pathogenic field RABVs were able to establish non-abortive infection of astrocytes via the natural intramuscular inoculation route. A combined 3D LSFM-CLSM workflow further identified peripheral Schwann cells as a relevant target cell population of pathogenic RABV in the PNS (publication IV). This suggested that non-abortive infection of central and peripheral neuroglia by pathogenic RABV impairs their immunomodulatory function and thus represents a key step in RABV pathogenesis, which may contribute significantly to the establishment of lethal rabies disease.
Finally, utilizing the full volumetric acquisition power of LSFM, a further refined version of the established 3D imaging pipeline facilitated a detailed mesoscopic investigation of the distribution of SARS-CoV-2 in the respiratory tract of the ferret animal model (publication V). Particularly for this newly-emerged pathogen of global concern, in-depth knowledge of host-pathogen interactions is critical. By preserving the complete spatio-morphological context of virus infection in the ferret respiratory tract, this thesis provided the first specific 3D reconstruction of SARS-CoV-2 infection and the first report of 3D visualization of respiratory virus infection in nasal turbinates altogether. 3D object segmentation of SARS-CoV-2 infection in large tissue volumes identified and emphasized a distinct oligofocal infection pattern in the upper respiratory tract (URT) of ferrets. Furthermore, it corroborated a preferential replication of SARS-CoV-2 in the ferret URT, as only debris-associated virus antigen was detected in the lower respiratory tract of ferrets, thus providing crucial information on the spatial distribution of SARS-CoV-2.
African swine fever virus (ASFV) is one of the most threatening animal viruses which has dramatically expanded its distribution range within the last years. ASFV was first described and is endemic in sub-Saharan Africa where it is transmitted in a sylvatic cycle between indigenous suids and Ornithodoros soft ticks. Therefore, ASFV is the only known DNA-arbovirus and, in addition to that, the only member of the genus Asfivirus within the family Asfarviridae. Being highly infectious to domestic pigs and wild boar, the virus was introduced into Georgia in 2007 and has subsequently spread throughout eastern Europe reaching the European Union in 2014. Despite almost 100 years of intensive research and the occurrence of African swine fever (ASF) on four continents including Europe, many aspects of its epidemiology, vector dynamics and virus evolution are unknown. In our study, first evidence is presented on endogenous ASFV-like (EASFL)- elements which are integrated into the genome of ASFV natural vectors, O. moubata soft ticks. Through a series of experiments including next-generation sequencing, infection experiments, phylogenetic and BEAST analyses as well as PCR-screening, evidence is provided that these elements belong to an ancestral ASFV strain that might have existed 50,000 to 30,000 years BCE. Further results suggest that the EASFL-elements are involved in protecting ticks against ASFV infection and might belong to a generalised tick defence mechanism. In order to evaluate factors influencing ASFV epidemiology in eastern Europe, experiments were conducted on possible indigenous vector species and circulating virus isolates. In the absence of the natural tick vector, blow fly larvae were considered as possible mechanical vectors involved in ASFV transmission and persistence. Results are presented that even after feeding on highly infectious wild boar tissue, fly larvae and pupae showed no contamination with infectious virus. On the contrary, the maggots appeared to have inactivated the virus in the organ tissue through their salivary secretions. Further experiments conducted on an ASFV-strain isolated from northeastern Estonia resulted in the first report of an ASFV-strain with attenuated phenotype isolated in Eastern Europe. Results from NGS-analyses provided evidence for a major genome reorganisation in that strain that included a large deletion and a duplication of multiple ASFV genes.
Taken together, this study provides novel insights into the epidemiology of ASF and evolution of ASFV one of the major threats to animal health worldwide and therefore does not only contribute significantly to basic research but possibly also to specific knowledge necessary for future disease management.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
Zur Aufklärung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgeführt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum größten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die Komplexität des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine Affinitätsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren ließ. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe Trennschärfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der Affinitäten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erhöhung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bezüglich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellulären mRNA führt, als überraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellulären-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes Nukleäres Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den stärker negativ geladenen Varianten beobachtet, die möglicherweise auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgeführt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten Veränderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen Vorgängen sein dürften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang verändert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ΔUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anfälligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der Probenkomplexität. Ein Vergleich zur Affinitätsfestphasenextraktion zeigte, dass ein Großteil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie Spleißfaktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten Veränderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besaßen pUL29 und pUL39 eine erhöhte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zusätzlich eine Größenvariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gestütztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.
Während des Replikationszyklus der Herpesviren vermittelt ein heterodimerer Proteinkomplex, welcher als nuclear egress complex (NEC) bezeichnet wird, den Transport neu synthetisierter Nukleokapside vom Zellkern ins Zytoplasma. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen des viralen Kernaustritts weiter aufzuklären und funktionelle Domänen in den NEC-Komponenten, welche beim Pseudorabies Virus als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden, zu ermitteln. Bereits durchgeführte Analysen konnten zeigen, dass die Transmembrandomäne des pUL34, die für die Verankerung des NEC an der Kernmembran verantwortlich ist, bei HSV-1 und PrV durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden kann, ohne dass dabei die Proteinfunktion während des viralen Kernaustritts inhibiert wird. Beim PrV pUL34 kann sogar eine Substitution der 50 C-terminalen Aminosäuren toleriert werden, wohingegen die Substitution 100 C-terminaler Aminosäuren zum Funktionsverlust des Proteins führt. Zur Identifikation möglicher funktioneller Domänen im C-Terminus des PrV pUL34 wurde das Protein in der vorliegenden Arbeit zwischen 50 und 100 C-terminalen Aminosäuren schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von 85 C-terminale Aminosäuren keine Beeinträchtigung der Proteinfunktion verursachte, wohingegen die weitere Deletion und Substitution von 90 Aminosäuren den viralen Kernaustritt blockierte. Somit konnte ein funktionell wichtiger Bereich des Proteins auf die Aminosäuren 172 bis 176 eingegrenzt werden. In dieser Region befindet sich die Sequenz 173RQR175, die einem RXR-Motiv entspricht, das als Signalsequenz für den Transport von Membranproteinen an die innere Kernmembran beschrieben wurde. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Analyse konnte jedoch zeigen, dass es sich hierbei um ein Arginin basierendes ER-Lokalisierungssignal handelt, welches die Anreicherung von Proteinen im endoplasmatische Retikulum (ER) und der damit verbundenen Kernmembran vermittelt. Neben der konservierten C-terminalen Hälfte des PrV pUL34 wurde in dieser Arbeit auch der N-Terminus analysiert. Bereits durchgeführte Studien beim PrV pUL34 ergaben dabei, dass die ersten 161 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 und damit für die NEC-Bildung verantwortlich sind. In der vorliegenden Arbeit konnte die pUL31-Interaktionsdomäne auf den Bereich von Aminosäure 5 bis 161 eingegrenzt werden. Zur Analyse wichtiger Aminosäuren oder Motive innerhalb der Interaktionsdomäne beim PrV pUL34 wurden in der vorliegenden Arbeit gezielt konservierte Aminosäuren zu Alanin ausgetauscht und die Auswirkungen auf die Bildung des NEC und der Funktion während einer Infektion analysiert. Dabei konnten zwei konservierte Motive identifiziert werden, die für die NEC-Bildung wichtig sind. Zum Einen wurde ein Motiv bestehend aus einer Glutaminsäure (E) und einem Tyrosin (Y) (EY-Motiv) detektiert, welches bereits in anderen pUL34-Homologen als essentiell für die Bildung eines funktionellen NEC beschrieben wurde. Für ein zweites Motiv bestehend aus einem Asparagin (N), einem Threonin (T) und einem Glycin (G) (NTG-Motiv) zeigte sich, dass N und G für die Funktion des NEC wichtig sind. Zusätzlich zu diesen beiden Motiven konnte ein konserviertes Asparagin an Position 103 identifiziert werden, welches zwar nicht für die Bildung des NEC benötigt wird, aber für die Funktion während des Kernaustritts essentiell ist. In dieser Arbeit wurde auch die zweite Komponente des NEC, das pUL31, untersucht. Dabei konnte die Funktion eines vorhergesagten Kernlokalisierungssignals (nuclear localization signal, NLS) im N-Terminus des Proteins bestätigt werden. Außerdem wurde ein Kernexportsignal (nuclear export signal, NES) identifiziert, welches eine wichtige Rolle bei der Knospung der Nukleokapside an der inneren Kernmembran während des Kernaustritts spielt. Hierfür wurden in dieser Studie die entsprechenden Bereiche im N- bzw. C-Terminus von pUL31 deletiert, was die Bildung eines funktionellen NEC und somit den Transport der Kapside aus dem Kern verhinderte. Ausgehend von vorherigen Untersuchungen am PrV pUL31, kann dabei spekuliert werden, dass der Bereich des NLS im N-Terminus neben der Lokalisierung im Zellkern möglicherweise auch für eine Funktion bei der Oligomerisierung von NECs bzw. pUL31-Molekülen wichtig ist. Der Bereich im C-Terminus, welcher das NES beinhaltet, scheint hingegen für die Komplexbildung mit pUL34 relevant zu sein. Zusammenfassend führten die hier durchgeführten Analysen in den beiden NEC-Komponenten pUL31 und pUL34 zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen des herpesviralen Kernaustritts. Da es bisher noch nicht gelungen ist eine Kristallstruktur des NEC zu ermitteln, sind Mutagenesestudien eine wichtige Methode funktionelle Domänen zu identifizieren. Die Aufklärung der NEC-Struktur kann in Kombination mit den bereits durchgeführten Mutagenesestudien das Verständnis der Funktion dieses Komplexes weiter komplettieren.
Mit der Entwicklung von sanften Ionisierungsverfahren wie der MALDI ist es seit Ende der 1980er Jahre möglich, Proteine und Peptide effizient in die Gasphase zu überführen, zu ionisieren und einer massenspektrometrischen Untersuchung zuzuführen. Dennoch bleibt die massenspektrometrische Proteomanalyse aufgrund seiner hohen Komplexität und hohen Konzentrationsunterschiede von bis zu 10 Zehnerpotenzen eine Herausforderung. Wegen ihrer leichten Zugänglichkeit werden Körperflüssigkeiten wie Plasma und Serum in der Medizin routinemäßig für diagnostische Zwecke eingesetzt. Die Entwicklung von Biomarkern aus Plasma und Serum wird allerdings durch die extrem unterschiedlichen physiologischen Konzentrationen verschiedener Plasmaproteine sehr erschwert. Die Zusammensetzung des menschlichen Plasmas ist in zahlreichen Studien intensiv analysiert worden, wohingegen für das Rind bis auf einige 2D-elektrophoretische Kartierungen nur wenige Studien vorliegen. Das im Vergleich zu Humanproben geringere Interesse an Proben z.B. bovinen Ursprungs zeigt sich auch am Mangel spezifischer Reagenzien zu deren Analyse und führt zu einer vergleichsweise schlechten Dokumentation der Zusammensetzung boviner Plasmen. Für eine detaillierte Analyse des bovinen Plasmaproteoms wurde daher ein dreistufiger Arbeitsablauf entwickelt. In einem ersten Schritt sollte die Proteinkonzentration im Ausgangsmaterial angeglichen werden. Dazu wurden zwei Methoden miteinander verglichen. Die bei humanen Proben angewandte Standardmethode der Extraktion von Albumin mit CB-modifizierten Matrizen ergab keine zufriedenstellende Bindungsspezifizität für BSA und ist daher für das Rind und andere getestete Nutztiere nicht anwendbar. Im Gegensatz dazu führte die Egalisierung mittels CPLL zu der gewünschten Angleichung der Proteinkonzentration und zu einer deutlichen Erhöhung der Ausbeuten an identifizierten Proteinen in der MS-Analyse. Der zweite Schritt des Arbeitsablaufes dient der Reduktion der Probenkomplexität durch Fraktionierung der Proben mit den folgenden drei Verfahren: (i) die SDS-PAGE mit anschließendem In-Gel-Verdau („geLC-MS“), (ii) die gelfreie präparative isoelektrische Fokussierung („offgeLC-MS“) der Plasmaproteine oder (iii) die Fraktionierung der proteolytischen Peptide durch präparative gelfreie Fokussierung. Die dabei erhaltenen Fraktionen wurden im dritten Schritt durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS analysiert. Alle drei Fraktionierungsstrategien führten nochmals zu einer verbesserten Ausbeute an Proteinidentifizierungen, wobei sich die gelfreie Peptidfokussierung als leistungsfähigstes Verfahren erwies. Die drei Fraktionierungsmethoden sind teilweise komplementär, da von den insgesamt 296 identifizierten Proteinen lediglich 96 in allen drei Ansätzen mittels MS nachweisbar waren. Nach einer weiteren Shotgun-Analyse mit einer anderen Protease wurde aus allen verfügbaren Daten schließlich ein Gesamtkatalog von 480 bovinen Plasmaproteinen erstellt. Während der Plasmaproteomstudie wurde auf Basis einer Zufallsbeobachtung eine alternative Methode zur Abreicherung von abundanten Serumproteinen entwickelt. Die Verdünnung oder Dialyse von Serumproben führte bei leicht sauren pH-Werten reproduzierbar zur Bildung eines Niederschlags, in dem die Konzentrationen der einzelnen Proteine ähnlich ausgeglichen schienen wie nach einer Extraktion mit CPLL. Das Präzipitat wurde mittels qualitativer und quantitativer MS näher charakterisiert. Im Vergleich mit einem parallel analysierten CPLL-behandeltem Serum wurde eine ähnlich effiziente Entfernung von BSA aufgezeigt. Die Proteinzusammensetzung beider Präparate erwies sich jedoch nach Analyse mittels 1D und 2D Gelelektrophorese und nLC-MALDI-TOF/TOF MS als signifikant unterschiedlich. Bezüglich der Abreicherung von abundanten und der Anreicherung von weniger abundanten Proteinen wiesen beide Verfahren unterschiedliche Profile auf, die nach Einführung einer Isotopenmarkierung mittels quantitativer MS charakterisiert wurden. Beide Verfahren waren exzellent reproduzierbar. Für eine eingehende Analyse des Präzipitats wurden nach erfolgtem tryptischen Verdau die Peptide durch präparative gelfreie Fokussierung fraktioniert und die Fraktionen sowohl durch nLC-MALDI-TOF/TOF MS als auch mit einem Orbitrap Massenspektrometer analysiert. Auf diese Weise konnten im Präzipitat insgesamt 306 Proteine identifiziert werden. Die GO-Analyse zeigte, dass darin typische Plasmaproteine angereichert sind. Die Methode eignet sich damit hervorragend als Ergänzung zum CPLL-Verfahren. Virusbedingte Erkrankungen von Wildtieren und Nutztieren werden zunehmend auch unter dem Aspekt der Übertragbarkeit auf den Menschen betrachtet. Zu solchen Erregern mit zoonotischem Potential gehören auch die zur Gattung Henipavirus zählenden Arten Hendravirus (HeV) und Nipahvirus (NiV). Das Matrixprotein dieser Viren ist für den vollständigen Zusammenbau des Viruspartikels und den Budding-Prozess bei der Virusfreisetzung verantwortlich und unterliegt einer nukleo-zytoplasmatische Passage. Welche Interaktionen zwischen Virus und Wirt während dieses Prozesses genau ablaufen und welche zellulären Faktoren dabei eine Rolle spielen, ist bisher nicht bekannt. Um solche Faktoren zu identifizieren wurden daher Proteinkomplexe charakterisiert, die durch Affinitätsreinigung mit Strep-markiertem HeV M isoliert wurden. Dabei wurde die Interaktion von ANP32B mit HeV M mit Hilfe der MALDI-TOF/TOF MS nachgewiesen und durch weitere Analysen bestätigt. So gelang in reziproken Co-Immunpräzipitationen die Fällung des jeweils anderen Bindungspartners und in fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen wurde gezeigt, dass M nur bei Anwesenheit des ANP32B im Zellkern akkumuliert. Dies wurde für HeV M und NiV M sowohl in transfizierten als auch in virusinfizierten Zellen nachgewiesen. Die Unterdrückung der ANP32B Expression in infizierten Zellen hatte keinen Einfluss auf den Budding-Prozess, so dass die Hypothese, die nukleo-zytoplasmatische Passage des M-Proteins sei essentiell für die Virusfreisetzung, nicht bestätigt werden konnte.
Das 3084 Aminosäuren umfassende innere Tegumentprotein pUL36 des zu den Herpesviren zählenden Pseudorabies Virus (PrV) stellt ein multifunktionelles Protein dar, das für die sekundäre Umhüllung der Nukleokapside im Zytoplasma essentiell ist. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei der frühen Phase der Replikation, d.h. dem Transport der Nukleokapside zum Zellkern und der Andockung an die Kernpore als Voraussetzung für die Freisetzung der viralen DNA in den Zellkern. Um die Rolle von PrV pUL36 während des viralen Replikationszyklus weiter aufzuklären, wurden funktionelle Regionen identifiziert und bekannte Motive und Regionen mittels gezielter Deletion bzw. Mutagenese untersucht. Zunächst wurden eine konservierte Deubiquitinylierungs (DUB)-Domäne und potentielle Leucin-Zipper-Motive im N-Terminus des Proteins, sowie eine Alanin- und Prolin-reiche Region im C-Terminus mittels gezielter Deletionen untersucht. Zusätzlich wurden durch ungerichtete Transposon-vermittelte Mutagenese Insertionsmutanten hergestellt. Die Funktionalität dieser Mutanten wurde durch Komplementierung einer UL36-negativen PrV Mutante untersucht. Mutierte Proteine, in denen essentielle Regionen betroffen waren, konnten den Replikationsdefekt der Virusmutante nicht kompensieren, während für Mutanten, die den Defekt komplementieren konnten, stabile Virusrekombinanten isoliert wurden. Die phänotypische Charakterisierung der Mutanten erfolgte mittels Plaquegrößenvergleich, Ein-Schritt-Wachstumskinetik und Ultrastrukturanalyse. Zusätzlich wurden einige Mutanten hinsichtlich des Replikationsverhaltens in vivo in einem Mausmodell untersucht. Um die Funktion von PrV pUL36 aufzuklären, ist es notwendig die intrazelluläre Lokalisierung von pUL36 zu kennen. Dazu wurden Immunfluoreszenz- und Ultrastrukturanalysen mit vier gegen unterschiedliche Bereiche des pUL36 gerichteten Antiseren durchgeführt. Auch die potentiellen Kernlokalisierungssignale (NLS) wurden hinsichtlich ihrer Funktion untersucht und die N-terminalen NLS-Motive 1/2 deletiert. Trotz der Funktionalität der essentiellen N-terminalen NLS-Motive 1/2 (Abb. 11) wurde pUL36 während der Virusreplikation niemals im Zellkern nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Tegumentierung ausschließlich im Zytoplasma abläuft. Die NLS vermitteln also bei der Infektion keinen Kerntransport des pUL36. Die Bedeutung der NLS könnte aber mit dem Transport der Kapside entlang der Mikrotubuli zum Zellkern und dem Andocken an die Kernporen zusammenhängen. Im Gegensatz dazu spielen die Leucin-Zipper (Abb. 11) offenbar bei der sekundären Umhüllung eine Rolle. Sie sind möglicherweise an der Verbindung des inneren und äußeren Teguments beteiligt. Im N-Terminus von pUL36 konnte zwischen der Interaktionsdomäne mit dem Komplexpartner pUL37 und den Leucin-Zippern eine weitere wichtige Region (Abb. 11) identifiziert werden. Diese Region ist auch in die sekundäre Umhüllung im Zytoplasma involviert und könnte für den Transport der teilweise tegumentierten Nukleokapside zum Trans-Golgi-Netzwerk verantwortlich sein, wobei pUL36, nicht aber die pUL36-pUL37-Interaktion hierbei eine Rolle spielt. Die gleichzeitige Deletion der DUB-Domäne und der Alanin- und Prolin-reichen Region (Abb. 11) führte zu einem Defekt bei der sekundären Umhüllung, wohingegen die Alanin- und Prolin-reiche Region allein für die Replikation von PrV kaum eine Rolle spielt. Allerdings konnte die Deletion nicht ohne Funktionsverlust weiter vergrößert werden, so dass die angrenzenden Bereiche für die Funktion von pUL36 essentiell sein könnten. Die zentrale Region von Aminosäure 1540 bis 1987 (Abb. 11) grenzt an diese Alanin- und Prolin-reiche Region an und ist für die Funktion von pUL36 essentiell, was durch den Funktionsverlust nach Insertionsmutagenese (mit einer Ausnahme) in diesem Bereich demonstriert wurde. Demnach könnte diese Region eine Rolle während der frühen Phase der Infektion, wie z.B. beim Transport der Kapside zum Zellkern und/oder beim Andocken der Kapside an die Kernpore und der Freilassung der DNA in den Zellkern spielen. Der essentielle C-Terminus von pUL36 (Abb. 11) kann wahrscheinlich auf die Aminosäuren 3022 bis 3066 eingegrenzt werden, so dass nicht nur die letzten 6, sondern womöglich die endständigen 18 Aminosäuren für die Funktion von pUL36 nicht gebraucht werden.
Ebolaviruses are dependent on host cell proteins for almost all steps in their viral life cycle. While some cellular factors with crucial roles in the ebolavirus life cycle have been identified, many of them remain to be identified or fully characterised. This thesis focuses on the characterisation and identification of host cell interactions of the highly pathogenic Ebola virus (EBOV), probing host-virus interaction at various stages of the viral life cycle. Beginning with viral budding, the function of a recently proposed late domain motif within the EBOV matrix protein VP40 was examined using an EBOV transcription and replication-competent virus-like particle (trVLP) system. Although this motif has been suggested to interact with the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT), we could show that this late domain motif does not contribute to EBOV budding.
While many host cell proteins have been identified so far that are important for viral budding, only a few proteins are known that are necessary for EBOV RNA synthesis. Thus, to identify host proteins that are involved in viral replication and transcription, we performed a genome-wide siRNA screen in the context of an EBOV minigenome assay. Using this approach, we identified several proteins that appear to be important for viral RNA synthesis or protein expression. Two of the most prominent hits in our screen were CAD (Carbamoyl-phosphate synthetase 2, aspartate transcarbamylase and dihydroorotase) and NXF1 (nuclear RNA export factor 1). CAD catalyses the first three steps in the de novo pyrimidine biosynthesis, while NXF1 is the main nuclear export protein for cellular mRNAs. In subsequent characterisation studies, using a range of life cycle modelling systems as well as molecular analyses, we could demonstrate that the canonical function of CAD during the pyrimidine biosynthesis is necessary for EBOV replication and transcription. In contrast to this, for NXF1 we discovered a so-far unknown function: Again, by applying different life cycle modelling alongside with molecular assays, we provided evidence that the EBOV nucleoprotein recruits NXF1 into inclusion bodies, the site of EBOV RNA synthesis, where it binds viral mRNAs to export them from these structures. Importantly, for both CAD and NXF1 we were able to recapitulate key data in the context of live EBOV infection, confirming their roles in the viral life cycle.
Both of these identified host factors are promising targets for antiviral therapies and indeed de novo pyrimidine synthesis is emerging as a possible antiviral target for a number of viruses. Similarly, as we could show NXF1 to be important in the life cycle of the highly pathogenic Junín virus, this raises the possibility that disruption of this interaction may result in broad-spectrum antiviral activity. Moreover, for an increasing number of negative-sense RNA viruses inclusion bodies as site of viral RNA synthesis are described to have a liquid organelle character. Therefore, our findings on NXF1 also provide an intriguing model to explain how negative-sense RNA viruses in general overcome this obstacle and export viral mRNAs from inclusion bodies.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
The here presented dissertation investigated the molecular mechanisms, by which the food industry model bacteria Pseudomonas fluorescens and Listeria monocytogenes, grown either as planktonic cultures, were inhibited by plasma treated water (PTW) produced by a microwave-induced plasma source (MidiPLexc). As a starting point, optimal operating parameters were determined with 5 standard liters per minutes(slm)compressed air during the treatment of 10 ml deionized water within a treatment time of up to 15 min (pre-treatment time). Treatment times of 1, 3 and 5 min were selected (post-treatment time). In addition to physical parameters, i.e. temperature measurements at different spots at the plasma source during the production of the PTW, the chemical composition of PTW was determined by pH measurements, chronoamperometry (determination of the H2O2 concentration), ion chromatography (determination of the NO2-, NO3- and ONOO- concentrations) and mass spectrometry (qualitative determination of the molecules). In addition, concentration changes of reactive species over a period of 3 h indicated a decrease of the NO2- concentration as well as an increase of the NO3- and ONOO- concentration in the PTW. Microbiological assays, i.e. quantification of colony-forming units (CFU), fluorescence and XTT assays, revealed a significant reduction of the proliferation ability of the cells, membrane damages and metabolic activity have been demonstrated for planktonic cultures as well as mono- and multispecies biofilms. PTW effects on biofilm structures were investigated using microscopic methods such as fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy (CLSM), atomic force microscopy (AFM), and scanning electron microscopy (SEM), as well as physical methods such as contact angle measurements. Significant changes in the biofilm structure have been shown, which indicate an ablation of the biofilm mass from top to bottom by approximately 2/3 of the biofilm mass and a destruction of the extracellular matrix (ECM) by the reactive species within the PTW. Subsequently, fresh-cut lettuce has been treated with PTW produced by up-scaled plasma sources. Apart from qualitative parameters of the lettuce after PTW treatment such as texture and color, the concentration of PTW reactive species have been determined. These experiments showed that the composition of the reactive species were slightly different from that of the laboratory-scaled plasma source MidiPLexc. Notably, the PTW treatment did not cause significant changes in texture and color of the fresh-cut lettuce. Finally, a synergistic effect of PTW treatment followed by plasma-processed air (PPA) drying was demonstrated application-specific.
The respiratory epithelium acts as both, a barrier of the respiratory tract to Nipah virus (NiV) entry and at the same time as a significant determinant of virus shedding. Both, for humans and pigs, replication in the respiratory tract epithelia is considered a major factor in transmission to other hosts. To understand why the virus constitutes a high-risk pathogen for livestock and humans, knowledge about
viral replication and host responses in relevant cells and tissues is crucial. Most in vitro studies, however, have been performed in conventional cell lines or non-differentiated lung cells. Only a few examples exist where Henipavirus infections have been investigated in fully-differentiated lung
epithelial cell models.
Thus, one aim of this thesis was to investigate infection, replication, spread and host protein dynamics of NiV in primary bronchial epithelial cells (BEC) cultivated at the air-liquid-interphase (ALI). By
immunofluorescence imaging, the NiV infection dynamics in BEC-ALI cultures were monitored over a 12 day time course, in order to provide detailed information about the infection process in the
respiratory epithelium of pigs and ferrets. Compared to undifferentiated primary BEC, the specific infectivity of NiV in BEC-ALI cultures was low. Infections remained focal and complete infection of the
cultures was not observed, even at 12 dpi. Analysis of viral titers and viral mRNA indicated a limited
virion release from the infected ALI-cultures while most of the newly synthesized NiV-RNA remained
cell associated. Immunofluorescence analysis of cross sections from infected ALI-cultures revealed
large infected areas that exhibited a strong cytopathic effect (CPE). Disruption of the epithelium
resulted in apical release of virus antigen-positive cell detritus while ciliated areas and basal cells were
less affected. From these data it was concluded, that NiV transmission could be supported by
exhalation of cell debris associated NiV and thus may contribute to rapid spread of infection in swine
populations.
A second aim was to explore the dynamics of host responses to NiV infection in differentiated BEC-ALI
culture and to assess whether this differs to conventional cell line data available from literature. Even
though strong CPE appeared in later phases of NiV infection, at least the porcine PBEC-ALI cultures
remained robust enough to allow protein sampling over 12 days infection course. Subsequent MS-based proteomics enabled unprecedent insight in complex cell culture response upon NiV infection.
Previous reports indicated a lack of efficient interferon type I induction in non-differentiated pig or
human BEC which were considered a prerequisite for efficient replication in the respiratory epithelium
and virusspread. In contrast to non-differentiated pig BEC (PBEC), in PBEC-ALI cultures multiple factors
involved in interferon responses were upregulated upon NiV infection. Thereby it was demonstrated
that NiV infection induced a robust innate immune response upon infection with elevated components of antigen processing and presentation resulting in the conversion from the constitutive proteasome to the immunoproteasome. In contrast to previous reports about NiV-infected non-differentiated
PBEC or endothelial cells, incomplete immunoproteasome formation and limitations in interferon
response could be excluded. Thus, a model is proposed in which NiV infection and spread in differentiated PBECs is slowed by potent innate immune responses to the virus infection. Overall, the
findings highlight the important role of the respiratory epithelium not only as a physical barrier to virus
infections but also indicate itsrole as a primary site of adaptive immune induction through NiV induced
antigen processing and MHC I presentation.
Finally, to allow functional studies of Henipaviruses at the BSL-2 biosafety level a recombinant CedPV
was generated and rescued. An imaging based screening and quantitative analysis pipeline was established to investigate the role of cellular factors and to screen for potential virus and host gene
directed inhibitory factors. Accordingly, different host and viral genes were targeted with a siRNA-pool
either targeting virus or selected cellular mRNAs followed by the infection with the CedPV and the
quantification of infected cells. With proof of concept of the siRNA screening pipeline, the recombinant
CedPV clone was used as a backbone to insert variousfluorescence reporter genesin order to optimize
the analysis workflow by allowing direct virus quantification in live, unstained samples. Consequently,
this thesis provides a valuable proof for future approaches related to the function of virus proteins,
influence of host-factors and virusreplication and Henipavirus-inhibitorscreens at low biosafety levels.
Orthohantaviruses are rodent-borne pathogens distributed all over the world, which do not cause visible disease in their reservoir host. Puumala orthohantavirus (PUUV) causes most human hantavirus disease cases in Europe and is transmitted by the bank vole (Clethrionomys glareolus). Hantaviruses have a tri-segmented genome consisting of the large (L) segment, coding for the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), the medium (M) segment, encoding the glycoproteins, and the small (S) segment. The S-segment contains two major overlapping open reading frames (ORF) coding for the nucleocapsid (N) protein and a non-structural (NSs) protein, a putative type I interferon (IFN-I) antagonist. To date, pathogenesis and reservoir host adaptation of hantaviruses are poorly understood due to missing adequate cell culture and animal models.
In contrast to previous studies, in this work, data from spring and summer 2019 indicated a high vole abundance, a high PUUV prevalence in voles and high human incidence for some endemic regions in Germany, but elsewhere values were low to moderate. Regional and local human health institutions need to be aware about the heterogeneous distribution of human PUUV infection risk.
For a better understanding of virus-host associations, two novel cell lines from bank voles and common voles each were generated and their susceptibility and replication capacities for a variety of zoonotic and non-zoonotic viruses were analyzed. The PUUV strain Vranica/Hällnäs showed efficient replication in a new bank vole kidney cell line, but not in four other cell lines of bank and common voles. Vice versa, Tula orthohantavirus (TULV) replicated in the kidney cell line of common voles, but was hampered in its replication in other cell lines. Several viruses, such as Cowpox virus, Vaccinia virus, Rift Valley fever virus, and Encephalomyocarditis virus 1 replicated in all four cell lines. West Nile virus, Usutu virus, Sindbis virus and Tick-borne encephalitis virus replicated only in a part of the cell lines. These results indicate a tissue or species specific tropism for many of the tested viruses and the potential value of vole cell lines to address such questions in detail.
Using one of these new cell lines, the first German PUUV strains were isolated from bank voles caught in the highly endemic region around Osnabrück. Complete genomes were determined by target-enrichment-mediated high-throughput sequencing from original lung tissue, after isolation and after additional passaging in VeroE6 cells and a bank vole-derived kidney cell line. Different single amino acid substitutions were observed in the RdRP of the two stable PUUV isolates. The PUUV strain isolated on VeroE6 cells showed a lower titer when propagated on bank vole cells compared to VeroE6 cells. Additionally, glycoprotein precursor (GPC)-derived virus-like particles of a German PUUV strain from the same region allowed the generation of monoclonal antibodies that reacted with the isolated PUUV strains.
To investigate the role of PUUV and other vole-borne hantavirus NSs proteins, the evolution of the NSs and N encoding sequences was investigated by a field study in bank voles and the NSs sequences were characterized in vitro for their inhibitory effect on the human interferon-β promoter. Analysis of blood and lung samples of 851 bank voles trapped during 2010-2014 in Baden-Wuerttemberg and North Rhine-Westphalia resulted in detection of 27.8% PUUV-specific antibody positive bank voles, whereas in 22.3% PUUV-specific RNA was detected. In the hantavirus outbreak years 2010 and 2012 PUUV prevalence in bank voles was higher compared to 2011, 2013 and 2014. Sequences of the S segment of all positive bank voles showed amino acid and nucleotide sequence types of the NSs-ORF with temporal and/or local variation, whereas the N-ORF was highly conserved. One sequence type persisted over the whole observation period in both regions. The NSs coding sequence was highly divergent among regional bank vole populations in the outbreak year 2012.
Transfection experiments resulted in the detection of different products of the NSs-ORF of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses, due to translation initiation at different methionine codons along the coding sequence. Using luciferase reporter assays, the NSs proteins of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses showed inhibition of IFN-I induction of up to 70%, whereas Sin Nombre and Andes orthohantavirus NSs proteins showed a reduced effect compared to the other NSs proteins. The first 20 amino acids of the N-terminal region of PUUV NSs were found to be crucial for IFN-I promoter inhibition.
In conclusion, the newly established cell lines, antibodies, reporter assays and PUUV isolates are highly valuable tools for future hantavirus research. The activity of PUUV NSs protein in human cells contributes to our understanding of virus-host interactions and highlights the importance of corresponding future reservoir host studies. Hantavirus surveillance studies showed the necessity for timely information of the potential human PUUV infection risk to public health institutions in endemic areas to initiate appropriate actions.
In recent years, negative impact of pharmaceutical products on natural environment became an issue of high public interest. Pharmaceutical residues are detected in various ecosystems worldwide. Due to increasing production and consumption of medicines this problem is intensified. Therefore, an efficient way to restrain release into the world’s water system is required.
This work presents an enzymatic approach for the degradation of pharmaceuticals in wastewater treatment plants, using laccase and cytochrome P450 — two enzymes of high biotechnological and industrial potential. Laccase genes from fungi Trametes versicolor and Pycnoporus cinnabarinus were isolated and overexpressed in the non-conventional yeast Arxula adeninivorans. This organism served also as cytochrome P450 gene donor.
Recombinant laccase Tvlcc5 was purified by immobilized-metal ion affinity chromatography and biochemically characterized using 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) as substrate for enzyme activity assays. The optimal temperature and pH were found to be 50 °C and 4.5–5.5, respectively. The half-life of Tvlcc5 at 60 °C was around 20 min. It was demonstrated that the presence of copper ions is essential for the synthesis of active protein. Moreover, negative impact of chloride anions on laccase activity was shown.
Cultivation conditions for the Tvlcc5 producing strain A. adeninivorans G1212/YRC102-TEF1-TVLCC5-6H were optimized. It was found that maintaining the pH at a constant level between pH 6.0 and 7.0 is essential for the production of active enzyme. Optimal cell growth and laccase accumulation were reached at 20 °C and in medium supplemented with 0.5 mM CuSO4. Performed fed-batch cultivation resulted in a laccase activity of 4986.3 U L-1.
Factors influencing the synthesis of Tvlcc5 leading to increased production of this protein were investigated. It was found that using three non-native signal peptides (cutinase 2 from A. adeninivorans (ACut2), α-mating factor from S. cerevisiae (MFα), and acid phosphatase from P. pastoris (PHO1) signal peptides) enhances the secretion of active enzyme by 20–80%. Besides that, additional overexpression of copper transporters positively affects laccase production.
Finally, it was proven that recombinant Tvlcc5 is a promising agent for the degradation of certain pharmaceuticals. After 24 h of incubation, the concentration of diclofenac and sulfamethoxazole decreased to 46.8% and 51.1%, respectively. Furthermore, it was shown that the addition of the redox mediator ABTS significantly shortens the degradation time of these substances.
Das Nipahvirus (NiV) ist ein Paramyxovirus, welches im Menschen eine tödliche Enzephalitis mit einer hohen Letalität von bis zu 100% und im Schwein vorwiegend eine schwerwiegende Atemwegserkrankung mit hoher Morbidität hervorruft. Es gibt bis heute keine zugelassene antivirale Therapie oder Vakzine. Da neben den neutralisierenden Antikörpern zunehmend auch die Bedeutung einer zellulären Immunabwehr gegenüber einer Henipavirus Infektion diskutiert wird, rücken vor allem Vakzinen in den Fokus, die in der Lage sind, beides zu induzieren. Virus-ähnliche Partikel (VLPs) stellen als nicht-replizierende Systeme eine sehr sichere Vakzine und durch ihren Virion-ähnlichen Aufbau mit repetitiven Strukturen sehr potente Immunogene dar.
In dieser Arbeit wurde die Immunogenität von Henipa VLPs (bestehend aus NiV G, NiV F und Hendravirus (HeV) M) bezüglich der Aktivierung des adaptiven Immunsystems zunächst im Kleintiermodell Maus und anschließend in einer Großtierstudie im natürlichen Wirt Schwein untersucht, um Rückschlüsse auf das Potenzial von Henipa VLPs als Vakzine ziehen zu können.
Durch die Immunisierung mit Henipa VLPs wurde sowohl in C57BL/6 als auch in BALB/c Mäusen eine humorale Immunantwort mit anti-Henipavirus-spezifischen Antikörpern als auch mit NiV neutralisierenden Antikörpern induziert. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Henipa VLPs in einem Mausstamm mit einer genetisch bedingten verstärkten Ausprägung einer Th1 Immunantwort (C57BL/6 Mäusen) in der Lage waren, eine zelluläre adaptive Immunantwort zu stimulieren. So konnte eine direkte Antigen-spezifische Proliferation und IFN-γ Expression in den CD8+ T-Zellen sowie die Th1 Zytokine IFN-γ, TNF-α und IL-2 in den Milzzellüberständen Henipa VLP-immunisierter C57BL/6 Mäuse nach homologer Restimulation nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass alle drei inkorporierten Proteine CD8+ T-Zell Epitope aufweisen. Die Kombination der drei Proteine in den Henipa VLPs führte zu einer stärkeren Reaktivierung der CD8+ T-Zellen. Im Rahmen der Immunisierung mit Henipa VLPs bildeten sich Gedächtnis CD8+ T-Zellen aus, die auch bei dreimaliger Applikation des Antigens und einer zusätzlichen Restimulation nicht in den funktionseingeschränkten Zustand der Erschöpfung oder Seneszenz übergingen.
Aufgrund der vielseitigen Immunogenität der Henipa VLPs im Mausmodell, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur Induktion des adaptiven Immunsystems im natürlichen Wirt Schwein untersucht. Auch in Schweinen induzierten die Henipa VLPs eine Gedächtnis B-Zellantwort mit anti-Henipavirus-spezifischen Antikörpern und NiV neutralisierenden Antikörpern. Hinzu kam die Stimulation einer MHC-abhängigen als auch der schnelleren, MHC-unabhängigen zellulären Immunantwort. Hierbei waren es vor allem die MHC-unabhängigen γδT-Zellen, die auf eine Henipa VLP Restimulation hin proliferierten und antivirale Zytokine wie IFN γ und TNF α exprimierten. Von den MHC-abhängigen T-Zellen waren es die CD4+ T-Zellen, die die eben genannten löslichen Mediatoren exprimierten. Die CD8α+CD8β+ T-Zellen (klassische CTL) blieben hingegen nahezu unbeeinflusst. Die sowohl in CD8α+ γδT-Zellen als auch in CD8α+CD4+ T-Zellen nachgewiesene Multifunktionalität in Form einer IFN-γ und TNF-α Koexpression deutet auf die Generierung einer zellulären Gedächtnis T-Zellantwort in Schweinen durch die Mehrfachimmunisierung mit Henipa VLPs hin.
In dieser Arbeit konnte das vielversprechende Potenzial von Henipa VLPs als Vakzine durch die Induktion sowohl einer humoralen als auch einer zellulären Immunantwort in Mäusen und zum ersten Mal auch in Schweinen herausgestellt werden. In zukünftigen Infektionsversuchen unter BSL-4 Bedingungen muss geklärt werden, inwieweit diese Henipa VLPs in der Lage sind, einen Schutz und eine sterile Immunität gegenüber einer Henipavirus Infektion zu vermitteln.
Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt die Nutzung globaler Transkriptom- und Proteomanalysen zur Untersuchung der Anpassung des Bodenbakteriums Bacillus subtilis an einige in seinem natürlichen Habitat vorherrschende Bedingungen. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass mit Hilfe globaler Transkriptom- und Proteomanalysen auch für bereits intensiv untersuchte Fragestellungen neue und zum Teil unerwartete Aspekte zu entdecken sind. Im Falle der seit ca. 30 Jahren untersuchten Sporulation in B. subtilis konnte eine Reihe von neuen differenziell exprimierten Genen identifiziert werden. Ferner wurden diese Gene den vier an der Sporulation beteiligten Sigmafaktoren zugeordnet. Einige der besonders interessanten Gene wurden einer Detailanalyse unterzogen. Die Analyse der seit Anfang der 90er Jahre auf molekularer Ebene intensiv untersuchten Anpassung von B. subtilis an hohe Osmolaritat führte zur Ausweitung bereits erhaltener Befunde und zur Entdeckung neuer Facetten dieser Adaptationsstrategie. Vergleichbares gilt für die Untersuchung der Anpassung von B. subtilis an schwankende Temperaturen. Die Verwendung globaler Analysen zur Untersuchung der Kälteschockantwort und der Adaptation wachsender Zellen an Kälte und Hitze haben auch hier neue interessante Befunde geliefert. Anhand der hier vorgestellten Ergebnisse wird das Potential globaler Analysen verdeutlicht. Sie ermöglichen Einblicke in das Zusammenspiel der einzelnen Anpassungsmechanismen und liefern entscheidende Hinweise zur Entschlüsselung zellularer Regulationsnetzwerke.
Kunststoffe durchdringen nahezu jeden Bereich unseres alltäglichen Lebens. Zur Herstellung bestimmter Plastikmaterialien (Epoxidharze und Polycarbonate) werden Bisphenole als Grundbaustein benötigt, deren Grundstruktur sich aus zwei Phenolringen zusammensetzt, die über eine substituierte Kohlstoffbrücke miteinander verbunden sind. Die einzelnen Bisphenole unterscheiden sich jeweils durch verschiedene Substituenten an der Kohlenstoffbrücke oder an den aromatischen Ringsystemen. Dabei gehen die großmaßstäbliche Produktion der Bisphenole sowie unser permanenter Kontakt mit bisphenolhaltigen Materialien mit einer verstärkten Nachweisbarkeit dieser Chemikalien in Umweltproben bzw. in menschlichen Geweben und Körperflüssigkeiten einher. Gleichzeitig stehen Bisphenole im Verdacht, aufgrund ihrer Toxizität und hormonähnlichen Wirkung eine Vielzahl von Erkrankungen zu begünstigen. Vor allem die Interaktion mit dem Östrogenrezeptor alpha ist gut verstanden. Daher wurde in dieser Arbeit die bakterielle Transformation von acht verschiedenen Bisphenolen (Bisphenol A, AP, B, C, E, F, PH und Z) durch die Umweltisolate Cupriavidus basilensis SBUG 290 und Bacillus amyloliquefaciens SBUG 1837 untersucht und näher charakterisiert. Beide Bakterienstämme waren in der Lage, alle eingesetzten Bisphenole zu transformieren. Dabei war die Transformation auf die Phenolringe oder daran befindliche Substituenten beschränkt. Ein mikrobieller Angriff an der ringverbindenden Kohlenstoffbrücke wurde nicht nachgewiesen. Während B. amyloliquefaciens die Schadstoffe ungeachtet ihrer Struktur jeweils phosphorylierte, transformierte C. basilensis die Bisphenole in Abhängigkeit von ihrer Struktur zu hydroxylierten Derivaten, Ringspaltungsprodukten, Produkten mit Acetamidstruktur oder zu Dimeren. Neben der Strukturaufklärung der mikrobiell gebildeten Produkte wurden die einzelnen Transformationswege für beide Bakterienstämme näher charakterisiert. Hierfür wurden u.a. die Produkte als Transformationssubstrate eingesetzt, der Einfluss der Kultivierung und Inkubationsmedien auf die Biotransformation untersucht sowie Proteomanalysen durchgeführt. Die Bildung von hydrophileren Transformationsprodukten durch die Bakterienstämme führte zur Detoxifizierung und Reduktion der östrogenen Aktivität der hydrophoben Bisphenole.
Das Bovine Virale Diarrhoe Virus (BVDV) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae. BVDV verursacht eine gefährliche Durchfallerkrankung bei Rindern,
besonders Kälbern, die Bovine Virusdiarrhoe (Mucosal Disease). BVDV gehört zu den einzelsträngigen RNA-Viren und ist eng verwandt mit dem Erreger der Klassischen Schweinepest sowie der Border Disease der Schafe. Wie andere Pestiviren, ist BVDV ein behülltes Virus, auf dessen Hülle drei Strukturproteine (Erns, E1 und E2) zu finden sind. In dieser Arbeit wurden die Glykoproteine E1 und E2 genauer charakterisiert, um Hinweise auf den Mechanismus der Knospung (Budding) von Pestiviren zu erhalten. Dazu ist die subzelluläre Lokalisation, die Topologie sowie der Retentionsmechanismus für E1 und E2 genauer untersucht worden. Die subzelluläre Lokalisation der Hüllproteine wurde mit Hilfe von Kolokalisationsanalysen mit spezifischen Kompartimentmarkerproteinen bestimmt. Sowohl als Einzelexpression als auch nach Expression als E1-E2-Vorläuferprotein zeigte sich eine Anreicherung der beiden Proteine vorwiegend im ER. Die Lokalisationsanalyse E2s in mit verschiedenen BVDV-Stämmen infizierten Zellen zeigte ein sehr ähnliches Bild wie die Einzelexpression. Die, die intrazelluläre Retention vermittelnden, Regionen wurden zunächst mit CD72-Fusionsproteinen eingegrenzt und zeigten, dass die Transmembrandomänen der Proteine für die Retention entscheidend waren.
Anhand verschiedenster Mutanten, welche Substitutionen, Insertionen und Deletionen im Bereich des C-Terminus von CD72-E1 bzw. E2 (ohne CD72-Fusionspartner) beinhalteten,
konnten einzelne Aminosäuren identifiziert werden, die essentiell für die Retention sind oder diese zumindest beeinflussen. Für E2 konnte das Arginin an Position 355 als wichtig für die Retention bestätigt und weiterführend untersucht werden. Mit Mutationen des Glutamins an Position 370 konnte außerdem der modulierende Effekt des cytoplasmatischen Rests auf die Retention E2s gezeigt werden. Die Retention von E1 ist unabhängig von der Länge der TMD und wird durch mehrere polare Aminosäuren (K174, R177, Q182) beeinflusst. Die Topologieuntersuchungen
für E1 und E2 nach Einzelexpression mit Tag-markierter Proteinvarienten zeigte, dass die reifen Proteine eine einspännige Transmembrandomäne mit dem N-Terminus auf der luminalen und dem C-Terminus auf der cytosolischen Seite des ERs besitzen.
Die Serin/Threonin Proteinkinase pUS3 ist innerhalb der Alphaherpesvirinae konserviert. Für pUS3-Homologe der Subfamilie wurden bereits zahlreiche Funktionen bei der Beeinflussung des Zellstoffwechsels und der Virusreplikation gezeigt, dennoch ist pUS3 für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell. PrV exprimiert zwei unterschiedlich lange Isoformen dieses Proteins in unterschiedlicher Menge, so dass das kürzere pUS3S im Vergleich zu pUS3L die abundante Isoform darstellt. Während die carboxyterminalen Sequenzen beider Isoformen identisch sind, weist der Amino-Terminus der langen Form 54 zusätzliche Aminosäuren auf. Innerhalb der Wirtszelle liegt pUS3S vor allem im Nukleus vor, wohingegen pUS3L vorwiegend im Zytoplasma, der Plasmamembran und den Mitochondrien lokalisiert ist. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der möglichen unterschiedlichen Funktionen der beiden pUS3-Isoformen und der Bedeutung des Expressionsniveaus dieser Isoformen während der Virusmorphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Analyse von Virusmutanten, bei denen die Expression von pUS3S bzw. pUS3L auf unterschiedliche Weise manipuliert wurde oder bei denen eine Inaktivierung der enzymatischen Aktivität erfolgte. Diese wurden auf empfänglichen Zelllinien dreier Tierarten phänotypisch charakterisiert und auf Unterschiede hinsichtlich ihres Replikationsverhaltens untersucht. Ein weiterer Teil dieser Arbeit umfasste Untersuchungen zur Identifizierung potentieller Substrate der Proteinkinase pUS3 mittels 32P-Radioimmunpräzipitation und Proteomanalytik, die eine weitere Analyse der Strukturkomponenten von PrV-Partikeln sowie die Prüfung einer Methode zur Präparation nukleärer Proteine einschloss.
Bisphenol A (BPA) ist ein Umweltschadstoff, der für die Produktion von Polykarbonatplastik und Epoxydharzen verwendet wird. Aufgrund seiner weltweiten Verbreitung, seiner Persistenz in der Umwelt und vor allen Dingen wegen seiner endokrinen Wirkung, stellt diese Verbindung eine große Gefahr für die Tier- und Pflanzenwelt sowie für den Menschen dar. Deshalb wurde aus einem bepflanzten Festbettreaktor, welcher mit BPA behandelt wurde, der Bakterienstamm RW4 isoliert, der fähig ist Bisphenol A als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen. Das Gram-negative Bakterium wurde mittels 16S rRNA-Analyse als Cupriavidus basilensis identifiziert und mittel der BIOLOG-Methode charakterisiert. Der Bakterienstamm kann ein sehr großes Spektrum an aliphatischen Stoffen wie Aceton, Ethanol, 1-Oktanol und aromatischen Verbindungen wie Phenol, Mono- und Dihydroxybenzoesäuren für das Wachstum nutzen. C. basilensis RW4 baut Bisphenol A nur sehr langsam ab. Es ist jedoch möglich den BPA-Abbau sowohl in Schüttelkulturen und als auch in kontinuierlich laufenden Sandsäulen durch Zugabe von Phenol als Co-Substrat und Wachstumsstimulanz deutlich zu steigern. Die erfassten Abbauintermediate wie 4-Hydroxyacetophenon und 2-(4-Propanol)-phenol wiesen darauf hin, dass C. basilensis RW4 einen ähnlichen Abbauweg nutzt wie Sphingomonas sp. TTNP3 von Kolvenbach et al. (2007) nutzt. In weiteren Untersuchungen, wurde die toxische Wirkung von Bisphenol A auf den Standardmikroorganismus Pseudomonas putida P8 in Schüttelkulturen und in kontinuierlich laufenden Sandsäulen analysiert. Es zeigte sich, dass BPA das Wachstum von P. putida P8 hemmt und Modifikationen in der Zusammensetzung der Phospholipide in der Membran hervorruft. P. putida P8 reagierte unmittelbar auf das Einwirken von BPA auf der Membranebene durch Veränderung des Verhältnisses der trans-ungesättigten Fettsäuren zu den cis-ungesättigten Fettsäuren, was schon in früheren Untersuchungen für andere organische Lösungsmittel beschrieben wurde. Dementsprechend wurde eine Korrelation zwischen der BPA-Konzentration und dem Anstieg des trans-cis-Verhältnisses ermittelt. Weil diese Anpassungsreaktion eine kurzfristige Antwort auf den einwirkenden Stressor ist, konnte der Anstieg des trans-cis-Verhältnisses nur kurz nach BPA-Zugabe erfasst werden. Somit kann das trans-cis-Verhältnis nur als temporärer Biomarker für die Toxizität von BPA in Schüttelkulturen genutzt werden, jedoch nicht in langfristig laufenden Sandsäulen.
Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit ergaben sich aus zwei Arbeitsschwerpunkten - dem Nachweis einer neuartigen prokaryotischen Phenoloxidase bei dem Bakterienisolat Azotobacter chroococcum SBUG 1484 und der Durchführung Phenoloxidase-katalysierter Biotransformationsreaktionen zur Derivatisierung von ortho- bzw. para-dihydroxylierten Verbindungen. Der zunächst unbekannte, eine neue Phenoloxidase bildende, Bakterienstamm sollte mittels morphologischer und physiologischer Tests sowie 16S-rDNA-Analysen einer Art zugeordnet werden. Da die Expression der Phenoloxidase nur unter bestimmten Bedingungen auftrat sollten die in Abhängigkeit von verschiedenen Kultivierungsparametern zahlreich auftretenden Zelldifferenzierungsprozesse des Stammes untersucht und eine standardisierte Kultivierungsmethode zur Erzielung hoher Phenoloxidase-Aktivitäten entwickelt werden. Die Untersuchung wesentlicher Eigenschaften der neubeschriebenen Phenoloxidase war für eine Zuordnung in die Gruppe der Multikupfer-Oxidasen und eine Prüfung der Eignung des Enzyms für biotechnologische Anwendungen eine unbedingte Voraussetzung. In Phenoloxidase-katalysierten Reaktionen sollte die Aminierung von einfach alkylsubstituierten Brenzkatechinen und Hydrochinonen sowie mehrfach-substituierten ein- bzw. zweikernigen dihydroxylierten Aromaten mit aliphatischen sowie alicyclischen Amindonoren untersucht werden. Im Mittelpunkt der Betrachtungen standen dabei die Aufklärung von Reaktionsmechanismen bei homo- und heteromolekularen Kopplungsreaktionen sowie die Prüfung des Einflusses verschiedener Reaktionsparameter (u.a. Hydroxylierungspositionen der Enzymsubstrate, Substituenten, Eduktkonzentrationen, Katalysatoren, pH-Werte der Reaktionssysteme, Lösungsmittel) auf die Nebenreaktionen und Ausbeuten der anvisierten Zielverbindungen (sekundäre Amine). Eine strukturchemische Analyse der Syntheseprodukte war dazu unerlässlich.
Die Synthese und der Abbau von mikrobieller Biomasse sind fundamentale biologische Prozesse auf unserer Erde. Im Gegensatz zu zellulären Syntheseleistungen wurde der Eliminierung von mikrobieller Biomasse allerdings bisher weniger Aufmerksamkeit geschenkt. Die Auflösung von Bakterienzellen wird als Bakteriolyse bezeichnet. Innerhalb von natürlichen Bakteriengemeinschaften wird die Bakteriolyse eingeleitet durch verschiedene mikrobielle Prozesse und wird schließlich durch die Degradation komplexer bakterieller Zellwandbausteine bedingt. Sie ist ein fundamentaler Vorgang zur Energie- und Nährstoffversorgung, sowohl im Rahmen der Saprotrophie, also dem Abbau von toten Bakterienzellen, als auch der Bakterivorie, der Prädation an lebenden Bakterien. Der Prozess der Bakteriolyse ist bei beiden Ernährungstypen abhängig von extrazellulären Enzymen und bioaktiven Metaboliten, die den enzymatischen Angriff ermöglichen oder verstärken und letztlich zur Zerstörung des Zellmaterials beitragen. Bakteriolytische Substanzen und Metaboliten besitzen eine hohe Anwendungsrelevanz, beispielsweise für die Zurückdrängung von Bakterien in vielen verschiedenen Bereichen des Lebens und werden in Anbetracht der weltweit steigenden Verbreitung von Krankheits- und Schaderregern sowie von Antibiotikaresistenzen dringend benötigt. Um Zugang zu neuen antimikrobiellen Substanzklassen zu erhalten, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit 35 stark bakteriolytische Bakterienisolate aus Brackwasser gewonnen und charakterisiert, darunter 31 von verschiedenen Probenahmeorten der Ostsee und 4 aus dem brackwasserhaltigen Bereich des Balchaschsees in Kasachstan. Alle bakteriolytischen Isolate wurden morphologisch und physiologisch charakterisiert. Eine Auswahl bakteriolytischer Stämme wurde zusätzlich taxonomisch identifiziert. Von den bakteriolytischen Umweltisolaten aus der Ostsee konnten zehn Stämme eindeutig den vier Bacillus-Arten B. pumilus, B. subtilis, B. megaterium und B. licheniformis zugeordnet werden (Brack et al. 2013). Unter den Isolaten aus dem Balchaschsee wurden drei Stämme als Pseudomonas veronii und ein Stamm als Paenibacillus apiarius identifiziert. Die Isolate aus dem Balchaschsee zeichneten sich durch eine starke Lyseaktivität gegenüber lebenden Zellen von Pseudomonas putida, Escherichia coli, Micrococcus luteus und Arthrobacter citreus aus und waren zum Teil in der Lage, auch autoklavierte Zellen dieser Arten zu degradieren. Für das Isolat Paenibacillus apiarius SBUG 1947 wurde nach Analyse von Wachstumskurven und elektronenmikroskopischen Aufnahmen eine besonders deutliche Lyseaktivität gegenüber lebenden Zellen von A. citreus in Flüssigkultur nachgewiesen (Brack et al. 2014c). In einem umfangreichen systematischen Screening über die bakteriellen Isolate aus der Ostsee zeigten ausgewählte Bacillus-Stämme aller vier identifizierten Arten lytische Aktivitäten gegenüber lebenden Zellen von grampositiven und gramnegativen Bakterien der Arten Arthrobacter citreus, Micrococcus luteus und Pseudomonas putida sowie zum Teil gegenüber Hefen wie Trichosporon mucoides. Diese und weitere Mikroorganismen wie Aeromonas sp., Bacillus subtilis, Chromobacterium violaceum, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa und Serratia marcescens wurden in Form von autoklavierten und pasteurisierten Zellen ebenfalls durch die Bacillus-Stämme lysiert (Brack et al. 2013). Das stark bakteriolytische Isolat B. pumilus SBUG 1800 zeigte zudem in Flüssigkultur eine deutliche Bakteriolyseaktivität gegen pasteurisierte und lebende Zellen von A. citreus, wobei selbst ein geringes Inokulum von B. pumilus zu einer raschen Abtötung sowie Auflösung der Wirtszellen führte, wie in Wachstumsversuchen und mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Aufnahmen gezeigt werden konnte. Die stärkste Lyseaktivität gegenüber lebensfähigen A. citreus-Zellen konnte nach 3,5 bis 4,5 Stunden der Inkubation in Co-Kultur mit verdünnter Nährbouillon beobachtet werden. Um den Bakteriolyseprozess genauer zu charakterisieren, wurden im Folgenden Veränderungen im extrazellulären Metabolom und Proteom unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht. So wiesen die zellfreien Kulturüberstände von B. pumilus SBUG 1800, coinkubiert mit pasteurisierten Zellen von A. citreus, nachweislich eine starke bakteriolytische Aktivität auf, was auf die Anwesenheit von extrazellulären Lysefaktoren hindeutete. Diese lytischen Faktoren sollten mit Hilfe von analytischen Messmethoden nachgewiesen und biochemisch charakterisiert werden. Mittels gekoppelter Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) wurden im Kulturüberstand von B. pumilus SBUG 1800, inkubiert in Gegenwart von pasteurisierten Zellen von A. citreus, verschiedene 2,5 Diketopiperazine detektiert. Hierdurch gelang der erste wissenschaftliche Nachweis der Sekretion der Diketopiperazine Cyclo(-Ala-Pro), Cyclo(-Gly-Pro), Cyclo(-Val-Pro), Cyclo( Ile-Pro), Cyclo(-Leu-Pro), Cyclo(-Pro-Pro), Cyclo (-HyP-Pro), Cyclo (-Pro-Met) und Cyclo(-Phe-Pro) durch das Umweltisolat B. pumilus SBUG 1800 aus der Ostsee sowie auch durch den Laborstamm B. pumilus SBUG 1921 (auch B. pumilus Jo2). Beide Stämme reagierten nach 4 h der Inkubation in einem Mineralsalzmedium mit einer erhöhten Produktion der Diketopiperazine Cyclo(-Gly-Pro), Cyclo(-Ala-Pro) und Cyclo(-Val-Pro) auf das Vorhandensein pasteurisierter A. citreus-Zellen. Auch in zehnfach verdünnter Nährbouillon wurden diese Diketopiperazine produziert. Die detektierten antimikrobiellen Diketopiperazine wiesen gegenüber verschiedenen Teststämmen eine Hemmwirkung auf, die bereits bei sehr geringen Konzentrationen von 1 µg ml-1 einsetzte. Für die Diketopiperazine konnte jedoch keine bakteriolytische Funktion nachgewiesen werden, weder gegenüber lebenden noch gegenüber abgetöteten Bakterienzellen (Brack et al. 2014a). Sie wirken daher als Stoffwechsel inaktivierende Vorstufe für einen nachfolgend einsetzenden bakteriolytischen Prozess. Um den unbekannten Lysefaktor aus dem zellfreien Überstand von B. pumilus SBUG 1800 zu identifizieren, wurde unter anderem die Lipopeptid-Fraktion der Zellen gewonnen und mittels LC-MS analysiert. Dabei wurden neun verschiedene Pumilacidine, darunter zwei bislang unbeschriebene Lipopeptide mit den Molekülmassen 1007 und 1021, detektiert. Da die Lipopeptidextrakte lebende Wirtzellen lysierten, können die Pumilacidine als eine erste Gruppe von wirksamen Lysefaktoren im untersuchten Prädator-Wirt-System angesehen werden. Die Konzentration der Pumilacidine ist ähnlich der Diketopiperazin-Konzentration nach vier Stunden der Inkubation in verdünnter Nährbouillon höher in Anwesenheit von pasteurisierten oder lebenden Zellen von A. citreus als im Kontrollmedium ohne Wirtszellen. Neben den antimikrobiellen Diketopiperazinen und den bakteriolytischen Pumilacidinen konnte mittels Gelelektrophorese die bakteriolytische Wirksamkeit einer großen Bandbreite von extrazellulären Enzymen aus B. pumilus SBUG 1800 nachgewiesen werden. Zwei der bakteriolytisch wirksamen Enzyme konnten mit Hilfe massenspektrometrischer Methoden als die Zellwandhydrolasen N-Acetylmuramoyl-L-Alaninamidase und β N Acetylglukosaminidase identifiziert werden (Brack et al. 2014b). Im Kontext der aktuellen Fachliteratur deuten die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass Bacillus-Arten sich als Intragilden-Prädatoren in das marine mikrobielle Nahrungsnetz einordnen lassen. Bei Nahrungsmangel, vergleichbar mit dem Wachstum in der vielfach verwendeten, zehnfach verdünnten Nährbouillon, greift B. pumilus benachbarte Mikroorganismen an, um diese als Nährstoff- und Energiequellen für das eigene Überleben zu nutzen durch die damit verbundene Lyse von Nahrungskonkurrenten den Prozess der eigenen Sporulation zu retardieren. Der Vorgang der Bakteriolyse im untersuchten Prädator-Wirt-System läuft dabei nach dem dargelegten Kenntnisstand folgendermaßen ab. In der Co-Kultur wird das Wachstum der Wirtsbakterienart A. citreus durch neun verschiedene Diketopiperazine mit antibakterieller Wirksamkeit inhibiert. Die Gesamtkonzentration der Diketopiperazine liegt bei über 80 µg ml-1. Gleichzeitig verursachen die ausgeschiedenen Pumilacidine A bis I als Hauptfaktoren der Bakteriolyse die initiale Zellpermeabilisierung, und den Zelltod der Wirtsbakterien, wahrscheinlich bedingt durch eine Desintegration von Membranstrukturen, woraufhin der austretende Zellinhalt im Medium verfügbar wird. Für die Degradation der freiwerdenden makromolekularen Nährstoffe sekretiert B. pumilus ein breites Spektrum von verschiedenen hydrolytischen extrazellulären Enzymen, welche die komplexen Zellbestandteile zu metabolisierbaren Oligomeren und Monomeren zersetzen (Brack et al. 2014b). Auf der Grundlage der neuen Erkenntnisse über den Hergang der Bakteriolyse im ausgewählten Prädator-Wirt-System können neue, anwendungsrelevante Ansätze für die Zurückdrängung von schädlichen Mikroorganismen abgeleitet werden. Neben der detailliert untersuchten Art Bacillus pumilus stehen weitere lytische Bakterien zur Verfügung, deren Wirkstoffe und lytische Enzyme, ein großes Potential zur Zerstörung von mikrobiellen Zellen und
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.
Der Erreger des Q-Fiebers ist C. burnetii, ein zoonotisches intrazelluläres Bakterium. Die Gram-negativen Coxiellen kommen in zwei verschiedenen antigenen Lipopolysaccharid (LPS)-Formen vor: als virulente Ph I-LPS- und/oder avirulente Ph II-LPS-Bakterien. C. burnetii wird durch Kontakt mit infizierten Tieren sowie infektiösen Stäuben übertragen. Akute fiebrige Infektionen können beim Menschen im weiteren Verlauf eine Pneumonie oder Hepatitis auslösen. Zu einem geringen Prozentsatz entstehen chronische Infektionen mit persistierenden Coxiellen. Eine C. burnetii-Infektion bewirkt sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort. Neben Monozyten und Makrophagen dienen auch dendritische Zellen (DCs) den Coxiellen als geeignete Wirtszellen. DCs gehören zu den Immunzellen der first-line-of-defense des angeborenen Immunsystems und treten während einer Coxiellen-Infektion ebenso wie die mit ihnen kooperierenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) früh mit dem aufgenommenen bakteriellen Pathogen in Kontakt. Durch Antigenpräsentation infizierter DCs wird die für die anti-Coxiellen Abwehr maßgebliche T-Zell-Immunität initialisiert und die nachgeschaltete Immunantwort funktional ausgerichtet.
Trotz dieser zentralen Immunfunktion sind die zellulären Vorgänge von DCs während einer C. burnetii-Infektion, insbesondere mit Blick auf die zelluläre Selbstverteidigung gegenüber den vermutlich initial auftretenden Ph II-LPS-Varianten, nicht ausreichend verstanden. Zudem ist bisher nicht hinreichend geklärt, welchen Einfluss FN-γ, das von aktivierten NK-Zellen produziert wird, sowie die Sauerstoffumgebung auf die zelluläre Abwehr infizierter APCs nimmt.
Das Forschungsziel dieser Promotionsarbeit war es daher, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Coxiellen-Infektionen von DCs und NK-Zellen zu erhalten und hierbei insbesondere die IFN-γ-Wirkung auf die DC-Pathogen-Wechselwirkung sowohl unter norm- als auch hypoxischen Bedingungen zu untersuchen.
Die im ersten Teil der Promotionsarbeit durchgeführten zellbiologischen, immunologischen und proteinbiochemischen Analysen im murinen Zellsystem belegen eine pathogenausgelöste Subversion der funktionalen Aktivierung/Induktion der MHC I-Antigenpräsentation Coxiellen-infizierter DCs. Die infektionsbedingte Beeinträchtigung der MHC-Antigenpräsentation infizierter DCs lässt sich in direkter Weise auf einen autokrinen Suppressionseffekt des αVβ8-Integrin-aktivierten TGF-β und nicht auf die subversive Wirkung von Coxiellen-LPS als Virulenzfaktor zurückführen. Untersuchungen im Zusammenhang mit IFN-γ zeigen, dass dieses Zytokin in infizierten DCs eine Wiederherstellung der MHC I-Induktion und -Oberflächenexpression bewirkt, welche mit einer funktionalen Prozessierung und MHC-Präsentation pathogener Peptidantigene verbunden ist. Weitere Studien belegen zudem, dass IFN-γ-behandelte DCs in der Lage sind, die Etablierung/Vermehrung intrazellulärer Coxiellen negativ zu beeinflussen. Die durchgeführten siRNA- und CRISPR/Cas9-Experimente zeigen, dass die zelluläre Selbstverteidigung infizierter DCs maßgeblich durch das IFN-γ-induzierbare iNOS/NO-System vermittelt wird. Als reaktives Stickstoffradikal scheint Stickstoffmonoxid (NO) sowohl Komponenten der bakteriellen Elektronentransportkette als auch die autophagische Ausbildung und Integrität parasitophorer Vakuolen zu beeinträchtigen. Parallel hierzu schützen sich infizierte DCs über einen metabolischen Wechsel zur aeroben Glykolyse vor mitotoxischer NO-Wirkung und sichern so während der intrazellulären Coxiellen-Eliminierung ihr eigenes Überleben.
Weitere Untersuchungen dieser Arbeit belegen zudem, dass auch C. burnetii zu einer entsprechenden Gegenwehr fähig ist. Um der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs entgegenzuwirken, induzieren Coxiellen zur Minderung antibakterieller Radikal-Effekte ihre Cytochrom bd-, Katalase- und SOD-Expression. Infektionsstudien mit T4SS-defekten Coxiellen weisen ferner darauf hin, dass das bakterielle Sekretionssystem vermutlich eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs spielt, da sich Coxiellen ohne intaktes T4SS offensichtlich dem negativen NO-Einfluss entziehen und/oder keine entsprechenden Angriffsziele für NO bieten. Studien C. burnetii-infizierter Makrophagen bestätigen, dass das iNOS/NO-System eine essenzielle antibakterielle Selbstverteidigung von APCs darstellt. So zeigen auch Makrophagen eine deutliche Beeinträchtigung intrazellulärer Coxiellen-Vermehrung unter iNOS-vermittelter NO-Synthese. Die im weiteren Verlauf der Arbeit untersuchten norm- und hypoxischen Infektionsmodelle infizierter DCs lassen vermuten, dass hypoxische Kulturbedingungen die Coxiellen dazu veranlassen, ein sporenähnliches Stadium ohne produktive Vakuolenbildung auszubilden. Diese hypoxische Überlebensform intrazellulärer Coxiellen zeichnet sich durch IFN-γ-Resistenz, eine durch modifizierte Genexpression optimierte Sauerstoffverwertung und Radikalentgiftung sowie die Erhaltung ihrer Infektiosität aus. Dies deutet darauf hin, dass Hypoxie den intrazellulären Coxiellen weitere Möglichkeiten zur effizienten Immunevasion eröffnet, die einen unentdeckten Bakterienverbleib innerhalb infizierter Wirtszellen begünstigt und so vermutlich chronische C. burnetii-Infektionen fördert.
Für die Synthese und Freisetzung des APC-stimulierenden IFN-γ sind im Zuge angeborener Immunität vor allem die mit DCs kooperierenden NK-Zellen verantwortlich. Die im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit durchgeführten Studien zur Charakterisierung der Interaktion zwischen NK-Zellen und Coxiellen belegen, dass NK-Zellen von C. burnetii infiziert werden, sie jedoch die Etablierung und Replikation internalisierter Bakterien durch Ausschleusung in die extrazelluläre Umgebung unterbinden. Dieser Prozess geht mit einer funktionalen NK-Zell-Aktivierung einher, welche durch Phospho-Aktivierung der PKC ϴ sowie IFN-γ- und Granzym B-Ausschüttung charakterisiert ist. Verschiedene mikroskopische Analysen zeigen zudem, dass die intrazellulären bakteriellen Strukturen in unmittelbarem Kontakt mit den sekretorischen Granula stehen und die Coxiellen-Freisetzung über Degranulierung infizierter NK-Zellen erfolgt. Der Abtötung innerhalb der sekretorischen Granula infizierter NK-Zellen scheint sich C. burnetii durch seine Säure- und Protease-Resistenz zu entziehen. Freigesetzte Coxiellen erhalten nach Degranulierung größtenteils ihre Integrität und Fähigkeit zur Infektion benachbarter Wirtszellen. Obschon Coxiellen der Eliminierung durch die sekretorischen Granula entgehen und dies eine kritische Achillesferse der angeborenen Immunantwort darstellt, verbleibt über das gleichzeitig ausgeschüttete IFN-γ infizierter NK-Zellen ein positiver Effekt auf die antibakterielle APC-Aktivität.
In ihrer Gesamtbetrachtung tragen die erzielten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zu einem besseren und tieferen Verständnis der C. burnetii-Infektion von DCs und NK-Zellen bei und geben neue Einsichten in die zelluläre Selbstverteidigung sowie die IFN-γ-basierte Immunkooperation innerhalb der frühen Phase der anti-Coxiellen Abwehr. Im weiteren Infektionsverlauf können jedoch diese immunologischen Prozesse durch auftretende Hypoxie vermutlich eingeschränkt und die Eliminierung intrazellulärer Coxiellen erschwert sein.
The aim of this work was to characterize the distribution of TULV in European common vole populations, to clarify the host association of TULV and to investigate correlations between host population dynamics and changes in TULV prevalence. Furthermore, the potential of common voles as reservoir for other rodent-borne pathogens was examined in comparison to other rodent species.
Molecular and serological analysis of rodents captured at 87 locations in Germany, France, Luxembourg, and Austria revealed TULV infections at 53.6 % of all trapping locations. The seroprevalence in common voles was low with a mean of 8.5 % (range: 0 – 19 %). TULV RNA was more often detected (mean: 15.3 %, range 0 - 37.5 %). Field voles (Microtus agrestis) and water voles (Arvicola amphibius) were less often tested positive for TULV: mean seroprevalence was 7 % for field voles and 6.7 % for water voles. RNA could be detected in 5.4 % of all tested field voles and 3.2 % of water voles and with exception of a single field vole only when TULV-RNA-positive common voles were trapped at the same location. Those results indicate that TULV infections of field and water voles are spillover infections from sympatric TULV-infected common voles. Phylogenetic analysis revealed distinct genetic differences between TULV sequences of regions of greater geographical distance which were associated with different evolutionary common vole lineages. Furthermore, we could detect genetic differences between TULV strains from trapping sites close to each other (ca. 10 km).
In a capture-mark-recapture study 1042 common voles captured in live traps in Germany were sampled as well as 225 captured in snap traps. When analyzing the seroprevalence of fluctuating common vole populations over several years and seasons we found a negative correlation between prevalence and population density in the current season but a delayed density-dependent positive correlation between the current population density and seroprevalence in the next season. However, this trend varied geographically between the four trapping locations. Usually, population density as well as seroprevalence peaked at the end of the reproductive period in autumn with the exception of Weissach (2010-2012), Jeeser (2010) and Gotha (2012) where population peaks in summer were observed.
In a pilot study in Austria common voles were captured as well as three other rodent species. They were investigated not only for presence of different viruses (TULV, Dobrava- Belgrade orthohantavirus (DOBV), Puumala orthohantavirus (PUUV), Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus (LCMV), Cowpox virus (CPXV)) but also pathogenic bacteria and endoparasites (Leptospira spp., Toxoplasma gondii, Borrelia afzelii, Coxiella burnetii, Rickettsia spp. und Bartonella spp.). Of all four captured species, common voles were most often infected with at least one pathogen (66.7 %), followed by wood mice (Apodemus sylvaticus) (57.7 %), bank voles (Myodes glareolus) (35 %) and yellow-necked field mice (Apodemus flavicollis) (34.5 %). Common voles were also exceptionally susceptible to multiple infections: 66.7 % of them were infected with two or three different pathogens, compared to 6.9 % of yellow-necked field mice and 2.5 % of bank voles. No multiple infections could be detected in wood mice.
The broad geographic distribution of TULV in its reservoir host is in contrast to the rare reports of human infection but might be explained with a low pathogenicity for humans or with the low prevalence in host populations. In addition, the rare detection of human TULV infections could be a result of the used diagnostic methods. Since the reservoir population is known for its dramatic changes in population density and recurring superabundances which facilitates frequent contact to humans, TULV should more often be considered as cause for human disease in future analysis. In
addition, several other zoonotic pathogens could be detected in common voles which could influence TULV infections in the reservoir host but also TULV transmission to humans and therefore deserve more attention in future research.
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
The thyroid gland is of crucial importance in human metabolism. Its main secretion products, L-thyroxine (T4) and 3,3’,5-triiodo-L-thyronine (T3), are essential for proper development of multiple tissues and organs as well as for their functioning in the adult organism. The secretion of thyroid hormones (TH) is stimulated by thyrotropin (TSH) released from the pituitary gland. This tight connection between both hormones is of crucial importance for the clinical diagnosis of thyroid dysfunction. During the last two decades the concept of TH action developed to increased complexity. However, most of the recent advances in the field of TH research are based either on cell culture, tissue or animal models or stem from studies investigating specific hypotheses in humans. Thus, experimental approaches for the comprehensive, hypothesis-free characterization of metabolic effects of classical and non-classical TH in human are urgently needed. This holds true in particular for the TH derivative 3,5-diiodothyronine (3,5-T2). It was described to alleviate the typical detrimental metabolic consequences of a high-fat diet and even reversed hepatic steatosis. To replicate these experimental findings from rodents in humans, comprehensive data from the population-based Study of Health in Pomerania (SHIP) was analyzed in the present work. Based on a euthyroid, diabetes-free SHIP-subsample (N=761), non-linear associations between the serum concentrations of 3,5-T2 and glucose as well as TSH were detected. In contrast, no significant 3,5-T2 associations with several anthropometric markers or blood lipid parameters were observed, partially questioning the transferability of the beneficial metabolic 3,5-T2 effects reported for pharmacological intervention studies on rodents to humans. Recent advances in technological development now allow for the use of high-throughput spectrometric platforms to characterize the small molecule content (metabolome) of blood and urine samples. The detected metabolome constituents can be associated with any relevant parameters of interest, thereby extending the scope of classical association studies. Therefore, in the second part of the present thesis, the metabolic fingerprints of FT4, TSH as well as the ratio log(TSH)/FT4 as markers of thyroid function were profiled. Strong differences between the metabolic fingerprints of FT4 and TSH were observed, partially alleviated by the log(TSH)/FT4 ratio. These findings not only emphasize the high diagnostic value of the combined evaluation of TSH and FT4 in the assessment of thyroid function but additionally argue for a holistic approach in the diagnosis of thyroid function. More moderate endogenous effects of 3,5-T2 were evaluated by comparing its urinary metabolic fingerprint with that of the classical TH. A number of associations became apparent, indicating a function of endogenous 3,5-T2 in intermediary metabolism. Besides partially confirming associations with respect to the presented findings in animal studies, the strongest 3,5-T2-association was observed with trigonelline, a metabolite described earlier to exhibit similar beneficial effects as 3,5-T2 on glucose metabolism when used as a pharmacological agent in animal studies. An association towards hippurate indicated a partial overlap with the metabolic profile of TSH and hence consolidated results from the first two projects in the sense of a thyromimetic role of 3,5-T2 in the feedback regulation of TH. The diagnosis of thyroid disorders based on the classical markers TSH and FT4 suffers from restricted sensitivity in the subclinical range as both parameters have broad reference ranges in the general population. Therefore, in an approach to detect novel peripheral biomarkers of thyroid function, sixteen healthy young men were challenged with 250 µg of levothyroxine (L-T4) over a period of eight weeks in the fourth project presented here as part of this thesis. Monitoring of the volunteers over a period of sixteen weeks allowed delineation of the metabolic shifts first towards thyrotoxicosis and later in the context of the restoration of euthyroidism. The use of mass spectrometry for the comprehensive characterization of the metabolite as well as the protein content of samples taken at the different time points revealed profound molecular alterations, despite the lack of any clinical symptoms in the volunteers. Molecular signatures of thyrotoxicosis indicated increased energy expenditure, pronounced defense against systemic oxidative stress, a general drop in apolipoproteins, as well as increased abundances of proteins related to the coagulation cascade and the complement system. Good and robust classification of the thyroid state independent of TSH and FT4 was achieved using random forest analysis with a subset of fifteen metabolites and proteins, indicating new options in the individualized diagnosis of thyroid disorders.
Coding constraints imposed by the very small genome sizes of negative-strand RNA viruses (NSVs) have led to the development of numerous strategies that increase viral protein diversity, enabling the virus to both establish a productive viral replication cycle and effectively control the host antiviral response. Arenaviruses are no exception to this, and previous findings have demonstrated that the nucleoprotein (NP) of the highly pathogenic Junín virus (JUNV) exists as three additional N-terminally truncated isoforms of 53 kD (NP53kD), 47 kD (NP47kD), and 40 kD (NP40kD). The two smaller isoforms (i.e. NP47kD and NP40kD) have been characterized as products of caspase cleavage, which appears to serve a decoy function to inhibit apoptosis induction. However, whether they have additional functions in the viral replication cycle remains unknown. Further, the origin and function of NP53kD has not yet been described.
In order to first identify the mechanism responsible for production of the NP53kD variant, a possible role of additional caspase cleavage sites was first excluded using a site mutagenesis approach. Subsequently, alanine mutagenesis was then used to identify a region responsible for NP53kD production. As a result, three methionine residues were identified within the characterized sequence segment of NP, linking the production of NP53kD to an alternative in-frame translation initiation. Further site-directed mutagenesis of the previously identified putative in-frame methionine codons (i.e. M78, M80 and M100) finally led to the identification of translation initiation at M80 as being predominantly responsible for the production of NP53kD. Once the identity of all three NP isoforms was known, it was then of further interest to more deeply characterize their functional roles. Consistent with the N-terminal domain containing RNA binding and homotrimerization motifs that are relevant for the viral RNA synthesis process, it could be demonstrated that all three truncated NP isoforms lost the ability to support viral RNA synthesis in a minigenome assay. However, they also did not interfere with viral RNA synthesis by full-length NP, nor did they affect the ability of the matrix protein Z to inhibit viral RNA synthesis. Moreover, it was observed that loss of the oligomerization motifs in the N-terminus also affected the subcellular localization of all three NP isoforms, which were no longer localized in discrete perinuclear inclusion bodies, but rather showed a diffuse distribution throughout the cytoplasm, with the smallest isoform NP40kD also being able to enter the nucleus. Surprisingly, the 3'-5' exonuclease function of NP, which is associated with the C-terminal domain and plays a role in inhibiting interferon induction by digestion of double-stranded RNAs, was found to be retained only by the NP40kD isoform, despite that all three isoforms retained the associated domain. Finally, previous studies using transfected NP and chemical induction of apoptosis have suggested that cleavage of NP at the caspase motifs responsible for generating NP47kD and NP40kD plays a role in controlling activation of the apoptosis pathway. Therefore, to further characterize the connection between the generation of NP isoforms and the regulation of apoptosis in a viral context, recombinant JUNVs deficient in the respective isoforms were generated. Unlike infections with wild-type JUNV, mutations of the caspase cleavage sites resulted in the induction of caspases activation. Surprisingly, however, this was also the case for mutation of the alternate start codon responsible for NP53kD generation.
Taken together, the data from this study suggest a model whereby JUNV generates a pool of smaller NP isoforms with a predominantly cytoplasmic distribution. As a result of this altered localization, NP53kD appears to be able to serve as the substrate for further generation of NP47kD and NP40kD by caspase cleavage. Not only does this cleavage inhibit apoptosis induction during JUNV infection, it also results in a cytoplasmic isoform of NP that retains strong 3'-5' exonuclease activity (i.e. NP40kD) and thus may play an important role in preventing viral double-stranded RNA accumulation in the cytoplasm, where it can lead to activation of IFN signaling. Overall, such results emphasize the relevance of alternative protein isoforms in virus biology, and particularly in regulation of the host response to infection.
Degradation of branched chain aliphatic and aromatic petroleum hydrocarbons by microorganisms
(2008)
The overall aim of the work was to investigate the ability of several Gram-positive bacteria including Mycocbacterium neoaurum SBUG 109, Nocardia cyriacigeorgica SBUG 1472 and Rhodococcus ruber SBUG 82 and the yeast Trichosporon mucoides SBUG-Y 801 to degrade and transform branched chain hydrocarbons which occur in petroleum and its fraction products such as gasoline or gas oil and which are known as important and recalcitrant environmental pollutants. Pristane, iso-pentylbenzene and sec-octylbenzene were used in this work as model compounds. These compounds represent significant groups of petroleum constituents (branched chain alkanes and aromatic hydrocarbons). Three bacteria and the yeast T. mucoides SBUG-Y 801 were selected in a screen of 16 hydrocarbon-utilizing strains in the SBUG collection and from 21 isolated hydrocarbon-utilizing strains from oil-contaminated habitats of Saudi Arabian Desert and of Vietnam. The bacteria were identified in cooperation with DSZM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) as M. neoaurum SBUG 109, N. cyriacigeorgica SBUG 1472, R. ruber SBUG 82. These bacterial and yeast strains were shown to possess high potential for degrading and transforming pristane, iso-pentylbenzene and sec-octylbenzene. The intermediates produced by these bacteria during incubation with pristane were analyzed by GC and GC/MS. The products 4-methyl pentanoic acid; methyl butanedioic acid; 2-methyl pentadioic acid; methyl propanedioic acid; 4-methyl heptanedioic acid and 2,6,10,14–tetramethyl-pentadecan–3–one were detected in M. neoaurum cultures. In R. ruber, methyl butanedioic acid; 2-methyl pentadioic acid; 4,8-dimethylnonanoic acid, 4-methyl heptanedioic acid; 2,6,10–trimethylundecanoic acid; 3,7-dimethyl decanedioic acid and 2,6,10,14–tetramethyl–pentadecan–3-one were identified. In N. cyriacigeorgica, 2-methylpentanedioic acid; 4,8-dimethylnonanedioic acid; 2,6-dimethylheptanedioic acid and pristanic acid were found. The detection of 11 intermediates during pristane degradation by the three Gram-positive bacteria provided sufficient information to elucidate in detail three degradative pathways of pristane involving mono-, di- and sub-terminal oxidations. The sub-terminal oxidation by M. neoaurum and R. ruber was demonstrated for the first time. This occurence of a sub-terminal oxidation in these strains was strengthened by further results of aromatic compounds transformation (see below). During this pathway, ketone mono-oxygenation reactions seem to be involved. Because of this it will be of interest to look more closely at the catalytic processes involved and their possible extension to the bio-degradation of other branched chain hydrocarbons. Since in the present study 59 %, 51 % and 84 % of pristane were degraded in 3 weeks by M. neoaurum, R. ruber and N. cyriacigeorgica, this illustrated that the degradation rates of this isoprenoid alkane were high. The bacteria we studied were not only effective degraders of multiple branched chain alkane but also useful transformers of aromatic hydrocarbons. The intermediates produced were analyzed by comparing the retention times and UV/Vis spectra of the HPLC elution profile as well as the retention times and mass spectra of the GC/MS with those of available standards. Using iso-pentylbenzene as a substrate, 8 metabolites were generated by M. neoaurum transformation including product A (phenylacetic acid), B (acetophenone), D (iso-valerophenone), E (succinic acid), F (benzoic acid), G [(2-hydroxy-phenyl)-acetic acid] and H (2-methyl-4-phenyl-butyric acid). We additionally identified an alkyl hydroxylated iso-pentylbenzene derivative as 2-methyl-4-phenyl-butan-2-ol or 2-methyl-4-phenyl-butan-1-ol. Two metabolites (C and D) were detected by N. cyriacigeorgica transformation and three metabolites (A, D and F) were identified by R. ruber transformation which led to the complete biotransformation of this substance. iso-Pentylbenzene transformation by M. neoaurum was initiated by attack on the alkyl side chain followed by ring cleavage. The appearance of iso-valeorophenone confirmed the occurrence of a sub-terminal oxidation mechanism in M. neoaurum and R. ruber. In addition to products A, C, D and G, the identification X-(3–methyl–butyl)-phenol (X means that position of the hydroxy group on the aromatic ring system, such as 2, 3 or 4 remained unclear) in T. mucoides cultivation demonstrated for the first time the capacity of alkyl side chain attack by this organism which was hitherto known only for its ability of ring cleavage. The detection of 15 degradation products of sec-octylbenzene (including 2-phenylpropionic acid, 3-phenylbutyric acid, ß-methylcinnamic acid, 5-phenylhexanoic acid, acetophenone, 2-hydroxy-acetophenone, 2,3-dihydroxy-benzoic acid, succinic acid, 7-phenyloctan-2-one, benzoic acid, phenylacetic acid, 7-phenyl-octan-2-ol, hydroxy-phenylacetic acid and 2-hydroxybenzoic acid), in the studied bacteria pointed to an effective sec-octylbenzene degradation pathway in which dehydrogenation of 3-phenylbutyric acid to form ß-methylcinnamic acid is a newly described option. The identification of 2-phenylpropionic acid and 3-phenylbutyric acid in sec-octylbenzene transformation experiments by T. mucoides confirmed the possibility of alkyl side chain attack by this yeast. Summarizing the results, we describe for the first time in detail the biotransformation of sec-octylbenzene by M. neoaurum, N. cyriacigeorgica, R. ruber and T. mucoides. Our results suggest that these microorganisms may be useful as potential strains for hydrocarbon degradation and it may be of interest to investigate their suitability to solve specific environmental pollutant problems associated with branched chain aliphatic and alkyl-branched compounds which contribute to the persistence of hydrocarbon fractions in the environment.
The following work is describing the development of two innovative biosensors for the detection of biologically relevant molecules in the field of ecology and medical diagnostics. Biosensors have the particularity to possess a biological partner which recognizes the target molecule and a physical detection method responsible for the transformation of this biological interaction into measurable information. In the present case, both biosensors are designed following the same strategy and use a recombinant produced human receptor as biological partner and the surface plasmon resonance (SPR) technique to transform the biological interaction in quantitative information. The progesterone biosensor is aimed to detect and quantify substances with affinity to the human progesterone receptor. The recent discoveries that some chemicals present in low quantities in the ecosystem called endocrine disrupting chemicals (EDCs) have a negative impact on the aquatic life fitness raised concerns about the effects of these same molecules to the human health. In order to assess the effects of these EDCs, the use of classical analytical detection methods like high performance liquid chromatography (HPLC) or gas chromatography (GC) is not sufficient as these techniques only quantify a defined molecule without giving information about its biological activity. By integrating a recombinant human progesterone receptor, the progesterone biosensor can determine the biological activity of an unknown molecule or of a mixture of molecules in a real sample. In this work, two different yeasts – one methylotrophic (Hansenula polymorpha) and one non-methylotrophic (Arxula adeninivorans) - were selected as host for the recombinant protein production and their performances were compared. Different purification strategies were assayed and the binding activity of the purified progesterone receptor was then confirmed by enzyme like receptor assay (ELRA) and SPR. This led to the design of a first version of the biosensor with the immobilization of a progesterone-BSA ligand to the surface of a SPR chip and the use of a progesterone receptor mixed with the target molecule as sample. This competitive assay format was successfully utilized with a commercial progesterone-BSA ligand as target molecule and the next step will be the adaptation of this biosensor for real samples measurements. The HER-2 biosensor was developed as an answer for one of the most critical issue in the field of breast cancer diagnostics. In approximately 30 % of cancer cases, the transmembrane protein HER-2 can be found in large amount at the surface of the carcinoma cells and these cases are known to be particularly aggressive. Based on the amount of HER-2 protein at the surface of the cells, the pathologists established a scale with four levels to adapt the treatment to each patient. Although effective therapies have been developed to treat the HER-2 positive breast cancer, one of the major challenges remains the classification of breast sample in this scale as the only accepted determination methods are immunohistochemistry (IHC) and fluorescent in situ hybridization (FISH) which are only qualitative. In this work, a biosensor has been designed to quantify the amount of the HER-2 protein in a crude cell extract from a breast cancer tissue sample. To achieve this, the strategy is to utilize an antibody specifically targeted against the HER-2 protein and bound to a SPR chip. As the development of this biosensor necessitated the use of large amount of purified HER-2 protein, it was decided to produce recombinant full-length HER-2 in two different yeasts and to purify it by chromatography. This recombinant protein production required particular attention due to the membrane localization of HER-2. The structural integrity of the recombinant protein was confirmed by Western Blot and ELISA and different antibodies were bound to SPR chips in order to detect the HER-2 protein. After finding the conditions giving an optimal SPR signal, a protocol was developed to extract native HER-2 from breast tissue sample and the biosensor was assayed with this crude cell extract.
The genus Capripoxvirus of the family Poxviridae consists of the species lumpy skin disease virus, sheeppox virus and goatpox virus that affect cattle, sheep and goats, respectively. Whereas lumpy skin disease virus (LSDV) is transmitted mainly mechanically via blood-feeding insects and possibly hard ticks, the major transmission routes of sheeppox virus (SPPV) and goatpox virus (GTPV) are via direct contact and aerosols. Affected animals develop fever and display clinical signs such as ocular and nasal discharge, lymphadenopathy and characteristic lesions of the skin. Severe clinical course, especially in combination with respiratory signs, can result in the death of the affected animals. In endemic regions, mortality of capripox virus-induced diseases is low (1-10%). However, mortalities of up to 75% have been reported for LSDV and up to 100% for SPPV and GTPV in exotic breeds and high-producing dairy or beef animals. The loss of quality of the leather, reduced weight gain and milk yield as well as complete loss of affected animals have severe impact on national and global economies. Therefore, capripox virus-induced diseases have significant impact on both the affected individual animal as well as on the existence of small-scale farmers and large agricultural enterprises. However, until now, only live attenuated vaccines are commercially available. These attenuated vaccines are not authorized in the European Union and their administration would comprise the disease-free status of the respective country. Thus, reliable diagnostic tools for the detection and characterization of capripox viruses as well as safe and efficient control measures are of high importance.
The objectives of the present thesis were the development, validation and comparison of diagnostic tools, the establishment of challenge infection models and the performance of pathogenesis studies for all three capripox virus species, and the development and testing of different inactivated prototype vaccine candidates against LSDV.
First, new real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays for robust detection and differentiation of LSDV field strains, LSDV vaccine strains, SPPV and GTPV were developed and extensively validated. In the following, two single assays were combined to duplex assays, one for the differentiation between LSDV field strains and LSDV vaccine strains, and the second for discrimination of SPPV and GTPV. Finally, a diagnostic workflow based on these new duplex assays in combination with already published methods was established. This workflow enables time-saving, robust and reliable detection, species-specific identification and genetic and phylogenetic characterization of all three capripox virus species. In addition, already existing serological examination methods (serum neutralization assay and commercial enzyme-linked immunosorbent assay) were compared regarding their sensitivity and specificity. Furthermore, pathogenesis studies with different capripox virus isolates were performed in the respective target species, and the suitability of selected virus isolates as challenge viruses for future vaccine studies was analyzed. Pathogenesis studies with isolates GTPV-“V/103” and LSDV-“Macedonia2016” revealed that both are proper candidates for challenge models. Finally, three different SPPV isolates (SPPV-“V/104”, SPPV-“India/2013/Surankote” and SPPV-“Egypt/2018”) were tested in sheep regarding their virulence to find a suitable challenge model for SPPV, and SPPV-“India/2013/Surankote” was chosen for future vaccine studies.
Once appropriate challenge models were established, different inactivated prototype vaccines against LSDV were developed, and vaccine safety as well as vaccine efficacy were tested in cattle. Eventually, a Polygen-adjuvanted inactivated LSDV-vaccine candidate was selected that is able to fully prevent cattle from any LSDV-related clinical signs after severe challenge infection. Furthermore, molecular and serological data indicate that this inactivated prototype vaccine is even able to induce a kind of “sterile immunity” against LSDV in those cattle. It has to be mentioned that a commercially available vaccine similar to this prototype vaccine would be a great advance for the control of LSDV.
In the future, additional studies addressing diagnostics and optimized control of capripox viruses should be performed. Firstly, probe-based real-time qPCR assays for the differentiation of SPPV and GTPV vaccine strains from their respective virulent field strains should be developed and included into the diagnostic workflow. Secondly, further tests of the inactivated prototype vaccine, e.g. determination of the minimum protective dose and the possibility of cross-protection in sheep and goats against SPPV and GTPV, respectively, should be performed.
Die McsB Argininkinase spielt in grampositiven Bakterien wie Bazillen, Staphylokokken und Listerien durch die Phosphorylierung von Guanidinogruppen eine gesonderte Rolle innerhalb der Familie der Kinasen. Insbesondere während der bakteriellen Stressadaptation scheint diese Art der posttranslationalen Proteinmodifikation von großer Bedeutung zu sein. Um die Funktionsweise der McsB Kinasefunktion in Verbindung mit dessen McsA Modulatorprotein besser verstehen zu können, wurden konservierte Arginine gegen Lysin substituiert. Auf diese Weise konnten entscheidende intramolekulare Positionen identifiziert werden, die für die Ausbildung der Autokinase- bzw. Phospho-Transferase Aktivität von Bedeutung sind. Diese konnten darüber hinaus in Einklang mit der McsB Struktur (Suskiewicz et al., 2019) gebracht werden.
Eines der Zielproteine für die McsB vermittelte Argininphosphorylierung (Arg-P) ist dabei der CtsR Regulator, welcher die Genexpression der Clp-Maschinerie in Bacillus subtilis reprimiert. Mit Hilfe globaler Transkriptomanalysen war es möglich, neben den bereits etablierten Zielgenen auch eine Art fine-tuning Regulation des MhqR Regulons aufzuzeigen.
Zwei weitere Proteine, die durch McsB vermittelte Arg-Ps beeinflusst werden, sind der Modulator der generellen Stressantwort, MgsR, und die intrinsisch inaktive Glutamat-Dehydrogenase GudB. Insbesondere GudB fällt durch die Identifikation von 15 Phospho-sites auf, wohingegen lediglich zwei Arg-P Bindungsstellen für MgsR nachgewiesen werden konnten (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2016). Dennoch ist die GudB Stabilität nur geringfügig durch die McsB Kinasefunktion beeinflusst, wohingegen die MgsR Degradation entscheidend durch Arg-Ps beeinflusst scheint. Durch die Substitution der Arginine von MgsR gegen Glutamat wurde eine Art Phospho-Mimikry integriert. So konnten die Auswirkungen auf Regulatoraktivität und Stabilität von MgsR durch mögliche Arg-Ps im Detail untersucht werden.
In diesem Zusammenhang wurden durch detaillierte Untersuchungen der MgsR Degradation zusätzliche Informationen zur Funktionsweise von McsB als Adapterprotein gesammelt. Dieses legten die Vermutung nahe, dass McsB nicht nur als ClpC-Adapterprotein fungiert, sondern darüber hinaus auch die ClpX-abhängige Proteindegradation unterstützt.
Pneumokokken haben verschiedene Virulenzfaktoren, die nicht nur den Kolonisierungsprozess unterstützen, sondern auch das Vordringen des Pathogens in tiefere Gewebsschichten ermöglichen oder einen Schutz vor den Komponenten des Immunsystems vermitteln. Diese Virulenzfaktoren stehen im Mittelpunkt der Untersuchungen für die aktuelle Impfstoffentwicklung. Die genomische Analyse verschiedener Streptococcus pneumoniae Stämme identifizierte den Pneumococcal adherence and virulence factor B (PavB) als LPXTG-verankertes Oberflächenprotein. PavB enthält repetitive SSURE-Sequenzen (Streptococcal Surface Repeats), die mit humanem Fibronektin interagieren. Das Molekulargewicht des hochkonservierten Proteins wird von der Anzahl der SSURE-Domänen bestimmt und variiert zwischen den unterschiedlichen Pneumokokkenstämmen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PavB ein Adhäsin auf der Oberfläche von Pneumokokken darstellt und am Kolonisierungsprozess der Pneumokokken unter in vivo Bedingungen beteiligt ist. Mäuse, die intranasal mit pavB-Deletions-Mutanten infiziert wurden, überlebten signifikant länger als die mit den Wildtypbakterien infizierten Tiere. Der PavB-defiziente Stamm zeigte im Vergleich zum parentalen Wildtyp eine verringerte Kolonisierung des Nasopharynx sowie eine verzögerte Ausbreitung in die Lunge. Dies konnte in Echtzeit unter Verwendung von biolumineszierenden Pneumokokken gezeigt werden. In Koinfektionsexperimenten mit gleichen Infektionsdosen von Wildtyp-Pneumokokken und isogenen pavB-Mutanten war die Mutante in ihrer Fähigkeit, sich in den Organen der oberen und unteren Atemwege auszubreiten, eingeschränkt. Im Gegensatz dazu war die Pathogenese einer Meningitis nach intrazerebraler Injektion der Pneumokokken, sowie die Erkennung und Phagozytose durch phagozytierende Zellen des angeborenen Immunsystems, unabhängig von der Produktion des PavB Proteins. Die Immunogenität des Oberflächenproteins unter relevanten Bedingungen wurde durch den Nachweis von PavB-spezifischen Antikörpern in Patientenseren gezeigt. Auf eine Rolle des Oberflächenproteins PavB während der bakteriellen Adhäsion an eukaryotische Zellen deuteten die Infektionsexperimente mit humanen Epithelzelllinien. Es wurden verschiede His6-getaggte PavB-Derivate (SSURE2, SSURE2+3, SSURE1-5) für die weitere funktionelle Charakterisierung von PavB gereinigt und in Bindungsstudien eingesetzt. Die Funktion von PavB als Adhäsin konnte in Kompetitionsexperimenten unter Verwendung eines PavB-Derivats als Inhibitor bestätigt werden. Ebenso konnte die direkte Bindung des Proteins an eukaryotische Zellen nachgewiesen werden, wobei der eukaryotische Rezeptor noch nicht identifiziert wurde. In Protein-Protein-Interaktionsstudien wurden zusätzlich zu Fibronektin weitere humane Proteine des Plasmas und der extrazellulären Matrix (EZM), die im Laufe einer Infektion mit Pneumokokken einen Vorteil für das bakterielle Überleben im Wirt vermitteln könnten, als Bindungspartner für die drei gereinigten SSURE-Proteine identifiziert. Als neues Fibronektin-Bindungsprotein (FnBP) von S. pneumoniae diente PavB desweiteren für die Bestimmung der Bindungsregion von FnBPs von Pneumokokken im Fibronektinmolekül. Die Verwendung rekombinanter Fibronektinfragmente (His6-FnIII-Fragmente) ermöglichte den Nachweis der Beteiligung der Typ III-Domänen des C-terminalen Bereichs von Plasmafibronektin an der Interaktion zwischen PavB-Derivaten und Fibronektin. Die Bedeutung von Plasmafibronektin (pFn) für die Pathogenese einer Pneumonie wurde in einem induzierbaren knockout-Mausmodell für Plasmafibronektin untersucht. Nach intranasaler Infektion der Mäuse mit S. pneumoniae hatte der Verlust des Plasmaproteins unter den verwendeten Bedingungen keine signifikante Auswirkung auf die Entstehung einer Lungenentzündung oder die Überlebensaussicht der pFn-knockout-Mäuse. Unter in vitro Bedingungen bewirkte die Bindung von pFn an phagozytierende Zellen eine erhöhte Bindung der Pneumokokken an die Phagozyten. Dagegen beeinflusste die Rekrutierung von pFn an die Pneumokokkenoberfläche nicht die Phagozytose. Bisher konnte nicht eindeutig geklärt werden, welche Funktion Fibronektin während der Infektion mit Pneumokokken ausübt. Neben seinen multifunktionellen Bindungseigenschaften stellt das hochkonservierte Protein PavB einen interessanten Bestandteil für ein neues, Protein-basiertes Pneumokokkenvakzin dar.
The present study deals with the spread and population genetics of the invasive Asian bush
mosquito Ae. japonicus in Europe and Germany. Since the first detection of Ae. japonicus
in Europe in 2000, the species spread rapidly through Europe, either actively by flying or
passively by human activities. In 2017, four confirmed populations of Ae. japonicus existed
in Europe. The largest population covered western Germany, parts of France, Switzerland,
Liechtenstein, Austria and Italy. The most northern population around Hanover, Germany,
did not spread since 2013. A very small population existed in Belgium and the second largest
population covered parts of Austria, Italy, Slovenia, Croatia and Hungary. By 2019, Ae.
japonicus had established in 15 European countries.
Most of the monitoring programmes in Europe dealing with the distribution and spread of
Ae. japoncus investigate cemeteries for juvenile stages. However, activities are not
harmonised, e.g. regarding numbers of investigated collection sites and declaration of
negative sites, making data comparison between different studies difficult. Therefore,
suggestions for a standardised Ae. japonicus monitoring method have been developed and
provided.
In the present study, 445 individuals of Ae. japonicus originating from five different
European countries were investigated for population genetic analyses by sequencing parts
of the nad4 gene and genotyping seven polymorphic microsatellite loci. In total, 16 different
nad4 haplotypes were identified with haplotype H1 being the most common and widespread
one through all populations.
Within Germany, Ae. japonicus has been spreading immensely over the last decade. Even
though the present results (2017) demonstrate incipient genetic admixture of populations as
compared to previous studies (2012-2015), no complete genetic mixture has taken place yet.
The populations of Ae. japonicus still fall into two genetic clusters, but the genetic diversity
on individual level had increased considerably (from three nad4 haplotypes in 2012 to 12
according to the present thesis). Both additional introductions and mutation are possible
reasons, but determining the origin of the German populations is not possible anymore.
In the years following the invasion of Germany, Ae. japonicus spread to southeastern
Europe. In 2013, it established in Croatia, in 2017 in Bosnia and Herzegovina and in 2018
in Serbia. In the current study, immature stages of Ae. japonicus were found at 19 sites in
Croatia, two sites in Bosnia and Herzegovina and one site in Serbia. The population genetic
analyses indicate at least two independent introductions in that area. Aedes japonicus collected west of Orahovica (Croatia) seemed to be genetically similar to samples previously
investigated from Southeast Germany/Austria and Austria/Slovenia. By contrast, samples
from east of Orahovica, together with those from Serbia and Bosnia and Herzegovina, were
characterised by another genetic make-up, but their origin could not be determined.
In 2021, individuals of Ae. japonicus were detected at two collection sites in the Czech
Republic for the first time: Prachatice close to the Czech-German border and Mikulov on
the Czech-Austrian border. Population genetics and comparison of genetic data showed a
close relationship of the Prachatice samples to a German population, while for Ae. japonicus
from Mikulov close relatives could not be identified.
In the future, the global spread and establishment of invasive mosquitoes through
international trade and travel will increase. Potential vectors, like the Asian bush mosquito
Ae. japonicus, can become a problem in Europe and Germany, especially in the course of
global warming which supports pathogen transmission. Monitoring the known populations
and identifying introduction and migration routes are therefore essential for vector
managing.
Im Rahmen dieser Dissertation konnten zahlreiche unterschiedliche Substanzklassen mit Hilfe der Laccase verknüpft werden. Die dabei synthetisierten Verbindungen können nicht nur als Feinchemikalien in der organischen Synthese sondern auch für die Herstellung von antimikrobiellen und antikanzerogenen Medikamenten oder funktionellen Biomaterialien genutzt werden. Potential der Laccase zur Herstellung von Wirkstoffen: Die Synthese von antimikrobiellen Wirkstoffen durch die laccasekatalysierte Derivatisierung konzentrierte sich vor allem auf verschiedene Azole und Morpholine. Die isolierten Derivate wurden hinsichtlich ihrer biologischen Wirkung untersucht. Azole und Morpholine sind Bestandteil verschiedener antifungaler Medikamente und Fungizide. Eine Derivatisierung dieser Substanzklassen könnte neue Verbindungen mit neuen Eigenschaften, wie z.B. einem erweiterten Wirkungsspektrum, führen. Synthese der potentiellen Wirkstoffe 1. Für die laccasevermittelte Derivatisierung der Azole und Morpholine wurden para-dihydroxylierte aromatische Verbindungen als Ausgangsstoffe eingesetzt. Im Verlauf der Reaktion erfolgte eine laccasekatalysierte Oxidation der jeweiligen para-dihydroxylierten aromatischen Verbindung zum Chinon, welches dann einer Aminierung durch eine intermolekulare Michael-Addition (1,4-Addition) unterlag und in der Bildung von C N verknüpften monoaminierten Produkten resultierte. Bei einer erneuten laccasevermittelten Oxidation des gebildeten monoaminierten Produktes und anschließender Aminierung entstanden diaminierte Produkte. Die gebildeten Hybridmoleküle bestanden folglich aus einem Molekül der para-dihydroxylierten aromatischen Verbindungen in chinoider Form und einem (monoaminiertes Produkt; Dimer) bzw. zwei (diaminiertes Produkt; Trimer) Molekül/en des Morpholins bzw. Azols. 2. Darüber hinaus wurde die laccasekatalysierte Synthese von neuartigen Zyklisierungsprodukten nachgewiesen, deren Bildung weder mittels Laccase noch mit chemischen Syntheseverfahren bislang beschrieben wurde. Die wichtigsten Gruppen dieser neuen Zyklisierungsprodukte sind Cycloheptene und Cyclooctene. Testung der potentiellen Wirkstoffe hinsichtlich ihrer biologischen Wirkung 3. Zur Prüfung der antimikrobiellen Aktivität gegenüber Candida maltosa und bei ausgewählten Verbindungen gegenüber Candida albicans wurde die Methode des EUCAST discussion document E.Dis 7.1 über die MHK-Bestimmung in Mikrotiterplatten modifiziert. Ein Vergleich der hemmenden Wirkung von ausgewählten Produkten und der für deren Synthese genutzten Ausgangsstoffe gegenüber dem Testorganismus Candida maltosa mit Candida albicans ergab eine weitestgehende Übereinstimmung der MHK-Werte und ermöglicht in hohem Maße die Übertragung der ermittelten MHK-Werte mit Candida maltosa auf die medizinisch relevante Hefe Candida albicans. Zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität wurde ein Agardiffusionstest eingesetzt und die Testung der zytotoxischen Aktivität erfolgte gegenüber einer humanen Blasenkrebszelllinie. 4. Die neu synthetisierten Verbindungen wiesen sowohl eine antibakterielle und antifungale Aktivität als auch eine zytotoxische Wirkung auf. Die Dimere zeigten z.B. eine antibakterielle und antifungale Wirkung während die Trimere keine oder nur vereinzelt eine antimikrobielle Wirkung aufwiesen. Die getesteten Zyklisierungsprodukte zeigten meist nur geringe hemmende Wirkung auf Candida maltosa. Potential der Laccase zur Herstellung von Biomaterialien: Als Vorbild für die Herstellung von Biomaterialien diente der von marinen Muscheln zur Anheftung an den Untergrund gebildete Klebstoff, der durch Polymerisationsreaktionen von Peptiden entsteht. Derartige Polymere könnten zur Herstellung von bioresorbierbaren Klebstoffen, z.B. für die Gesichtschirurgie zur Klebung von Knochensplittern, genutzt werden. 1. Die Derivatisierung von Aminosäuren und Peptiden mit para- und ortho-dihydroxylierten aromatischen Substanzen führte zur Bildung sowohl von di- und trimeren als auch polymeren Reaktionsprodukten. Die Laccase ermöglichte die Derivatisierung von geschützten aber auch ungeschützen Aminosäuren und Peptiden in einer sogenannten "one pot" Reaktion. 2. Ein Vergleich der Reaktionen mit Laccase und dem chemischen Katalysator Natriumiodat ergab für die Reaktionen der Aminosäuren L-Phenylalanin und L-Tryptophan mit 2,5-Dihydroxyacetophenon einen klaren Vorteil der Laccase. Die Ergebnisse der einzelnen Reaktionen belegen, dass eine effektive Derivatisierung von verschiedenen Substanzklassen mit Hilfe der Laccase als einem biologischen Katalysator möglich ist. Die relativ einfach durchführbare und effiziente laccasevermittelte Reaktion kann dabei auch für die Herstellung von neuartigen Verbindungen mit biologischer Wirkung genutzt werden. Die weitere Charakterisierung der Wirkstoffe wird zeigen, ob und inwieweit diese Verbindungen konkurrenzfähig gegenüber Standardverbindungen sind, die in der Human- und Veterinärmedizin aber auch der Landwirtschaft eingesetzt werden.
Encephalitides induced by lyssa-, borna- and astroviruses: molecular detection and characterization
(2017)
Encephalitis is a severe inflammatory disease of the brain which often has a fatal outcome or can lead to subsequent damages. In around two-thirds of all human encephalitis cases, the causative agent is, despite improved diagnostics, unknown today. Aim of this work was the development, improvement and validation of diagnostic methods, improvement of sampling strategies and the development of optimized systems for characterization of three viruses causing viral encephalitis. The main burden of RABV lies in developing countries, were standard diagnostic tools are often not realizable. Therefore, simple and rapid diagnostic tests for the use under resource limited settings, so called point-of-care tests (POCT), are favorable. Commercially available lateral flow device (LFD) based immunodiagnostic tests were analyzed and failed in terms of sensitivity compared to the standard FAT and RT-qPCR (Paper I). Therefore, molecular RABV alternative targeting genome tests were developed and combined with rapid nucleic acid extraction methods. The new HighSpeed RT-qPCR and RPA assays together with magnetic bead based automated or manual extraction methods delivered a specificity between 100% and 97.2% and a limit of detection of 10 or 1,000 genome copies per reaction, respectively and seem suitable as novel POCT (Paper II). Recently, a novel zoonotic VSBV-1, responsible for fatal encephalitis of three squirrel breeders, was detected. For further investigations of this new virus, methods for an in-vivo sampling approach of squirrels were established. They were useful to identify animals harboring this dangerous virus, and new sequence data could be obtained from the VSBV-1 positive animals. Until now, 3.5% of all investigated squirrels were VSBV-1 RNA positive and two subfamilies (Sciurinae and Callosciurinae) are affected. The pathogen occurs not only in Germany, but also squirrel holdings and zoological gardens in the Netherlands and Croatia were tested positive, indicating a serious human health threat of this virus (Paper III and IV). With the help of a metagenomic approach, astroviruses were detected to be associated to encephalitis in cattle and sheep. These viruses were detected in a cow in Germany (Paper V), and in brain samples from two sheep in the United Kingdom (Paper VI). In both cases, the sequences generated by high-throughput-sequencing (HTS) were confirmed by specific RT-qPCRs, which could be used for subsequent screening approaches. Together, methods for the detection of three different encephalitis viruses were developed, validated and applied for different sample material.
Viele als endokrine Disruptoren (EDCs) bezeichnete Schadstoffe gelangen in die Umwelt und können Veränderungen in der Entwicklung und der Funktion des Hormonsystems von Menschen und Tieren hervorrufen. Sie liegen häufig in niedrigen, physiologisch wirksamen Konzentrationen, sowie als Substanzgemische in komplexen Umweltproben vor. Zum Nachweis dieser Umweltchemikalien bedarf es der Entwicklung neuer, effizienter, benutzerfreundlicher und hoch sensitiver Detektionsmethoden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung von zwei neuen bioanalytischen Testsystemen, welche das biologische Potential von EDCs zuverlässig bestimmen. Das erste System, der neue Arxula adeninivorans yeast androgen screen (A-YAS) Assay, ermöglicht die Detektion von (anti-)androgenen Aktivitäten von EDCs als Reinsubstanzen sowie von Umweltproben. Dieser in vitro Bioassay basiert auf transgenen A. adeninivorans-Zellen, welche konstitutiv das Gen des humanen Androgenrezeptors (hAR) exprimieren. Das induzierbare Gen des Reporterproteins Phytase K (phyK, aus Klebsiella sp. ASR1 stammend) steht unter Kontrolle des aus A. adeninivorans stammenden Glucoamylase(GAA)-Promotors, welcher durch die Insertion von hormone responsive elements (HREs) modifiziert wurde. Bei Anwesenheit von (anti-)androgen wirkenden Substanzen bindet ein Dimer des hAR-Liganden-Komplexes an die HRE-Sequenzen und reguliert die Reportergenexpression. Das gebildete Reporterprotein Phytase K wird in das Medium sezerniert und ermöglicht die photometrische Bestimmung der Absorption als Maß der rekombinanten Enzymaktivität, welche mit der Konzentration der (anti-)androgen wirkenden Substanzen korreliert. Die Xplor®2-Transformations-/Expressionsplattform wurde verwendet, um mitotisch stabile und resistenzmarkerfreie Hefetransformanden zu generieren und geeignete Vertreter als Biokomponenten des Assays zu selektieren. Der A-YAS Assay ist benutzerfreundlich, schnell (Inkubationszeiten zwischen 5 h und 24 h) und als Hochdurchsatzmethode im 96-iger Mikrotiterplattenformat anwendbar. Für die Referenzsubstanz 5α-Dihydrotestosteron wurden ein Wert für die mittlere effektive Konzentration (EC50) von 277,1 ng/l sowie Nachweis- und Bestimmungsgrenzen von 56,5 ng/l bzw. 76,5 ng/l bestimmt. Damit ist der A-YAS Assay der derzeit sensitivste Hefezell-basierte Assay zur Detektion von androgenen Aktivitäten. Darüber hinaus wurden die androgenen und anti-androgenen Aktivitäten verschiedener weiterer EDCs (natürlich vorkommende Androgene und Östrogene, Pharmazeutika, Biozide) ermittelt. Der A-YAS Assay stellt ein robustes Testsystem dar und kann zur Bestimmung der androgenen Äquivalentwerte (AEQs) von komplexen Umweltproben wie Urinen eingesetzt werden. Die durch den Bioassay ermittelten AEQs mehrerer Rinderurinproben korrelierten gut mit den AEQs, welche durch GC-MS Analyse der gleichen Proben bestimmt wurden. Das zweite in dieser Arbeit entwickelte Testsystem ist ein zellfreies Verfahren, welches der rezeptorselektiven Anreicherung und Detektion von östrogen und androgen wirkenden Substanzen dient. Dazu wurden sowohl die vollständigen als auch die für die Ligandenbindungsdomäne (LBD) codierenden Gensequenzen vom humanen Östrogenrezeptor α (hERα) und von hAR mit der codierenden DNA-Sequenz für einen Polyhistidin-Tag (His-Tag) fusioniert. Durch die Wahl geeigneter Expressionssysteme erfolgte die Synthese rekombinanter, N- bzw. C-terminal mit einem His-Tag fusionierte Rezeptorproteine in vier unterschiedlichen Wirtsorganismen, dem Bakterium Escherichia coli BL21(DE3), den Hefen A. adeninivorans und Hansenula polymorpha sowie der Pflanze Nicotiana benthamiana. Zur maximalen Akkumulation von rekombinantem Protein wurden die Kultivierungsparameter der einzelnen Organismen optimiert. Eine Reinigung der nach Zellaufschluss extrahierten Proteine erfolgte durch die Metall-affine Interaktion von His-Tag-Fusionsproteinen mit Ni(II)-Nitrilotriacetat(Ni-NTA)-Gruppen in der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Die in E. coli BL21(DE3)/pET-23a(+)-LBD-hERα synthetisierte, C-terminal mit einem His-Tag fusionierte LBD von hERα (LBD-hERα-6Hp) konnte nach IMAC-Reinigung mit hoher Reinheit (>90 %) und in einer Konzentration von bis zu 4 mg/ml erhalten werden. Die Anwendung unterschiedlicher Ligandenbindungsassays wies die Funktionsfähigkeit des rekombinanten Proteins nach. Durch Immobilisierung auf einer Chipoberfläche und Integration in einer Durchflusszelle wurde LBD-hERα-6Hp zum einen in einem Anreicherungsverfahren eingesetzt, welches Analyte von bisher unbestimmbaren in detektierbare Konzentrationen überführt. Die spezifische Bindung von 17β-Estradiol (17β-E2) wurde anhand der im östrogen-sensitiven nAES-P Assay (Kaiser et al., 2010) bestimmten Wiederfindungsraten von 17β-E2 bestimmt, welche sich nach Inkubation in der Durchflusszelle verringerten. Durch Integration einer optischen Messmethode (Lumineszenz) wurde ein kompetitives Detektionsverfahren entwickelt. Durch den Einsatz von LBD-hERα-6Hp wurde die spezifische Bindung von 17β-E2 gezeigt. Das Detektionsverfahren kann zur sensitiven Bestimmung der hormonellen Aktivitäten von EDCs als Reinsubstanzen sowie in Umweltproben eingesetzt werden. Darüber hinaus könnte das Anreicherungsverfahren als Vorstufe von kostenaufwändigen Nachweisverfahren wie der GC-MS Analyse verwendet werden.
Das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus kann verschiedene, zum Teil lebensbedrohliche Erkrankungen wie Hautinfektionen (Furunkel, Karbunkel), Lungen-entzündung, Osteomyelitis (Knochenmarksentzündung), Endokarditis (Entzündung der Herzinnenhaut) und Sepsis auslösen. Dabei gehört S. aureus zu den häufigsten Erregern von Krankenhausinfektionen, sogenannten Nosokomialinfektionen. Deren Behandlung mittels Antibiotika stellt aufgrund von multiplen Antibiotikaresistenzen von S. aureus eine immer größere Heraus¬forderung dar, da dieser fähig ist, sich rapide an verändernde Umweltbedingungen anzu¬passen. Die Interaktion des pathogenen Bakteriums mit seiner Umwelt und seinem Wirt ist insbesondere durch den Proteinbestand, der auf der Zelloberfläche exponiert ist, bestimmt. S. aureus exprimiert ein Arsenal an Zellober-flächen-gebundenen Virulenzfaktoren, die zur Kolonisierung und Infektion von humanem Gewebe führen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung von Massen¬spektrometrie-basierten Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung der Zellober¬flächen¬-assoziierten Proteine von S. aureus. Dabei ist es gelungen, durch die Gel-freien und GeLC-MS/MS-basierten Methoden Biotinylierung und Trypsin-Behandlung 77% aller be-kannten Oberflächenproteine und zwei Drittel aller nach außen ragenden Membran-veran-kerten Lipoproteine von S. aureus zugänglich zu machen. Bei der Biotinylierung handelt es sich um eine Methode, bei der die Oberflächenproteine von intakten Zellen mit einem membranimpermeablen Reagenz markiert und anschließend über Affinitäts¬chroma-tographie aufgereinigt werden. Dagegen erfolgt bei der Trypsin-Behandlung die proteo-lytische Abspaltung der Oberflächen-exponierten Protein¬domänen. Erstmalig ist durch Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen, dem sogenannten 14N/15N-metabolischen Labeling, auch eine relative Quantifizierung der Oberflächenproteine von S. aureus möglich. Bei der Analyse des Oberflächenproteoms von wachsenden und nicht-wachsenden S. aureus Zellen konnten mittels Biotinylierung 146 Oberflächenproteine identifiziert werden. Durch relative Quantifizierung wurde gezeigt, dass Zelloberflächen-assoziierte Adhäsine von S. aureus, wie der Fibrinogen-bindende clumping Faktor B, vorzugsweise während des Wachstums exprimiert werden, während nicht-wachsende Zellen erhöhte Mengen an clumping Faktor A aufweisen. Desweiteren war die Menge an immunodominanten Antigen B auf der Zelloberfläche in der stationären Phase mehr als 10-fach erhöht. Bei dieser Arbeit wurde erstmalig das Gesamt¬proteom des Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus COL, bestehend aus cytosolischem, extra¬zellulärem, Membran- und Oberflächenproteom, um¬fassend identifiziert und quantifiziert (Becher et al., 2009). Um die Pathogenität von S. aureus näher zu erforschen, wurde das Oberflächenproteom des Wildtyps mit dem einer sigB-Mutante verglichen. Der alternative Sigma-Faktor SigmaB kontrolliert ein großes Regulon bestehend aus etwa 300 Genen, von denen viele in die Virulenz von S. aureus involviert sind. Durch Kombination von 14N/15N-metabolischen Labeling, Biotinylierung und GeLC-MS/MS konnten 98 Oberflächen-proteine quantifiziert werden. Von den 49 Proteinen, die in der sigB-Mutante verändert vorlagen, waren 21 schon als SigmaB-abhängig oder durch SigmaB beeinflusst bekannt. In dieser Arbeit konnten weitere 28 Oberflächenproteine erstmalig als SigmaB-abhängig beschrieben werden. Die Gruppe der Zelloberflächen-assoziierten Proteine und Virulenz-faktoren, die durch SigmaB beeinflusst werden, wurde so erweitert (Hempel et al., 2010). Durch Trypsin-Behandlung wurden insgesamt 63 Oberflächen¬proteine beim Vergleich vier verschiedener S. aureus Stämme identifiziert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Oberflächenproteom verschiedener S. aureus Stämme extrem variabel ist. Weniger als 10% der identifizierten Oberflächenproteine aller vier Stämme stimmten überein (Dreisbach et al., 2010). Eine optimale Analyse der Oberflächen¬proteine von S. aureus wird durch eine Kombination von Biotinylierung und Trypsin-Behandlung erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass Sortase-Substrate insbesondere durch Trypsin zugänglich sind, während Lipoproteine optimal durch Biotinylierung analysiert werden können. Das Protokoll zur Trypsin-Behandlung wurde modifiziert, stark vereinfacht und ist auch zur Quantifizierung von Oberflächen¬proteinen geeignet. Durch Kombi¬nation beider Methoden mit 14N/15N-metabolischen Labeling konnten 221 Oberflächen¬proteine identifiziert und 158 quantifiziert werden. Hierbei wurde S. aureus unter Eisenmangel-bedingungen untersucht. In den Körperflüssigkeiten von Säugetieren herrschen Eisenmangelbedingungen, und diese fungieren als wichtiges Wirtssignal für die Bakterien um Virulenzproteine zu exprimieren. Unter diesen infektionsrelevanten in vitro Bedingungen wurden insbesondere Zelloberflächenproteine wie die eisenabhängigen Häm-bindenden Proteine IsdA, IsdB, IsdC und IsdD, sowie lipidver¬ankerte Eisen-bindende Proteine stark induziert gefunden (Hempel et al., unpublished).
Massenspektrometrie hat sich zur Methode der Wahl für die globale relative und absolute Proteinquantifizierung entwickelt. Da das vorhandene Methodenspektrum in der Anzahl der zu analysierenden Proben limitiert ist und bei der Vermeidung von Vorfraktionierungstechniken keine globale Analyse erlaubt, war es das Ziel dieser Dissertation das Methodenspektrum anhand von anschaulichen Beispielen zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien zu erweitern. Dazu erstreckt sich diese Arbeit von der Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten der Isotopen markierten relativen Quantifizierungsmethode, über die Entwicklung eines globalen markierungsfreien relativen Quantifizierungsansatzes bis zur globalen absoluten Quantifizierung und weiter im speziellen der Stöchiometrie-Aufklärung eines Proteinkomplexes. Die Kombination aus 14N/15N metabolischer Markierung mit der GeLC-MS Technik erlaubt eine robuste relative Quantifizierung auf globaler Ebene. Durch die Verwendung eines internen 15N-markierten Referenzextraktes wurde eine bisher nicht erreichte zeitliche Auflösung von zehn Zeitpunkten bei der Untersuchung eines Nährstoffwechsels zwischen den bevorzugten Kohlenstoffquellen, Glukose und Malat, des Gram positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erreicht. Dieses Experiment zeigte klar, dass die Anpassung an Malat als zweite Kohlenstoffquelle sehr schnell passiert. Im Gegensatz dazu findet die Anpassung an Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle mit einer zeitlichen Verschiebung von ca. 45 Min. statt. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Anpassung an Malat hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene geschieht und die Anpassung an Glukose auf transkriptioneller Ebene stattfindet. Die geringe Reproduzierbarkeit von Vorfraktionierungstechniken beschränkt ihre Anwendung während einer markierungsfreien Quantifizierung. Die eingeschränkte Kombinationsmöglichkeit mit Vorfraktionierungstechniken führt zu einer geringeren Anzahl an identifizierten und quantifizierten Proteinen, was durch den Einsatz von Ausschlusslisten mit optimierten Messparametern in wiederholten Messungen mit einer eindimensionalen Chromatographie ausgeglichen wurde. Im Vergleich zu einer einfachen Wiederholung der Messung konnte die Anzahl an identifizierten Peptiden um 32 % gesteigert werden. Der Ausschlusslistenansatz konnte anschließend erfolgreich für eine markierungsfreie globale Proteinquantifizierung der Stickstoffmonoxid (NO) Stressantwort des humanpathogenen Stapylococcus aureus eingesetzt werden. Die Ergebnisse wurden mittels paralleler Quantifizierung mit 14N/15N metabolischen Markierung verifiziert. Mit dem Ansatz wurden fast 50 % des gesamten Proteoms identifiziert und 70 % davon konnten mit einem zu dem Markierungsexperiment vergleichbaren Ergebnis quantifiziert werden. Die Proteomsignatur der NO-Stressantwort zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu der von Antibiotika, die wie NO zu DNA-Strangbrüchen führen. Auch bei der absoluten Proteinquantifizierung kann nicht ohne Weiteres eine Vorfraktionierung eingesetzt werden. Durch die Verwendung einer „multiplexed LC-MS“ (LC-MSE) Methode wurde fast die Hälfte aller zytosolischen Proteine von B. subtilis mit einer hohen durchschnittlichen Sequenzabdeckung von 40 % identifiziert. Die Hi3-Methode ermögliche zusätzlich die absolute Quantifizierung fast aller identifizierten Proteine, die über fast vier Größenordnungen nachgewiesen werden konnten. Die Zuverlässigkeit des Ansatzes wurde für sechs Proteine mit der gut etablierten AQUA-Technik bestätigt. Mit der Hi3-Methode wurden zum einen absolute Proteomsignaturen für unterschiedliche Nährstoffsituationen erstellt, was auch Einblicke in die Regulation der Expression von Aminosäure-Biosynthese und –abbau-Enzyme ermöglichte. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Konzentration von ribosomalen und weiteren Wachstumsraten-abhängig benötigten Proteinen sich bei niedrigen Wachstumsraten nicht unterscheidet und erst ab einer Wachstumsrate von 0,8 Std.-1 linear ansteigt. Die vergleichsweise hohe Standardabweichung der Hi3-Methode (~30 %) erschwert ihre Anwendung bei der Bestimmung von nicht gradzahligen Protein-Komplex-Stöchiometrien. Deswegen wurde zur Analyse des RNA-Polymerase-Komplexes von B. subtilis der AQUA-Ansatz gewählt, der sich durch eine sehr geringe Standardabweichung auszeichnet (< 10 %). Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, welches auf einer mTRAQ-Markierung der Referenzpeptide und des verdauten Komplexes beruhte. Es war so möglich die bekannte Stöchiometrie des Kernkomplexes RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 zu bestätigen und zusätzlich die zwei ω-Unterheiten und die σ-Faktoren σA und σB absolut zu bestimmen. Die Menge an σB im Komplex nahm nach Glukose-Hunger und Ethanol-Stress auf bis zu 5 % zu und es konnte gezeigt werden, dass sich die Menge einer ω-Unterheit (YloH) sich im gleichen Maße im Komplex ändert, wie die Menge an σA.
Zooanthroponosen, d.h. von Tieren auf den Menschen übertragene Erkrankungen, spielen in der Humanmedizin eine wichtige Rolle. Um die Gefährdung der Bevölkerung durch Zecken- und Nagetier-assoziierte Infektionskrankheiten einschätzen zu können, ist es von entscheidender Bedeutung, das räumliche und zeitliche Auftreten der Erreger in deren Reservoirwirten zu kennen. Puumala-Virus (PUUV), Leptospira spp. und Rickettsia spp. stellen wichtige, aber teilweise „vernachlässigte“ Zoonoseerreger in Deutschland dar.
Ziel der Studie war die Validierung eines für Rötelmäuse in Finnland entwickelten PUUV-Schnelltests für die Anwendung in Deutschland und die Aufklärung der Wirtsassoziation von Leptospiren und Rickettsien in Rötelmäusen und anderen Kleinsäugern in Deutschland. Dazu wurde die Prävalenz von Leptospiren und Rickettsien in wildlebenden Kleinsäugern von Wald- und Grünlandhabitaten und in mit Menschen assoziierten Wanderratten unter Berücksichtigung der Wirtsspezifität, Saisonalität und mehrjährigen Oszillation sowie der möglichen Einflüsse von Habitat- und demographischen Faktoren ermittelt.
Für den serologischen Nachweis des PUUV in Rötelmäusen wurde ein Schnelltest validiert, der auf der Basis eines rekombinanten Antigens eines finnischen PUUV-Stammes (Sotkamo, SOT) entwickelt worden ist. Die vergleichende Validierung des Schnelltests erfolgte anhand von Rötelmausseren aus Baden-Württemberg und Nordrhein-Westfalen, zwei PUUV-Endemiegebieten in Deutschland, und wurde unter Verwendung von in-house ELISAs auf der Basis rekombinanter Antigene eines deutschen, eines schwedischen und des SOT-PUUV-Stammes durchgeführt. Im Ergebnis der Untersuchungen wurden sowohl mit dem Schnelltest als auch mittels der ELISAs 10% der Rötelmausproben PUUV-seropositiv. Die Validierung des Schnelltests für Rötelmausseren aus Deutschland ergab eine Testeffektivität von 93%-95%.
Durch Anwendung der lipl32-Gen spezifischen PCR wurde in Nierenproben von 17,2% der Ratten und 13,3% der anderen Nagetiere und Spitzmäuse DNA pathogener Leptospiren nachgewiesen. Durch die secY-Gen spezifische PCR wurden drei Genomospezies, Leptospira kirschneri, Leptospira interrogans und Leptospira borgpetersenii detektiert. Das anschließende multi locus sequencing typing (MLST) führte zur Identifizierung von einem Sequenztyp (ST) in Ratten, L. interrogans, ST 17, während in anderen Nagetieren und Spitzmäusen sieben verschiedene Sequenztypen, L. kirschneri, ST 110, 117, 136 und 230; L. borgpetersenii, ST 146 und 197; L. interrogans, ST 24 nachgewiesen werden konnten. Darüber hinaus scheint L. interrogans ST 24 spezifisch für das Habitat Wald, da ausschließlich mit diesem Habitat assoziierte Nagetiere mit diesem Erreger infiziert sind. Feld- und Erdmäuse besitzen eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit einer Infektion mit L. kirschneri ST 110 (Prävalenz von 30%). Auf einer Fangfläche in Baden-Württemberg wurde im Sommer und Herbst 2014 ein neuer L. kirschneri-Sequenztyp (ST 230) entdeckt.
Ohrhaut-DNA-Proben wurde mittels einer Citrat-Synthase (gltA) Gen-spezifischen real-time PCR auf Rickettsien-DNA getestet. Die Prävalenz in Ratten lag bei 1,1%, während eine durchschnittliche Prävalenz von 8.0% in anderen Kleinsäugern nachgewiesen wurde. Die anschließend durchgeführten ompA4- und ompB-PCRs führten zur Identifizierung von Rickettsia helvetica, Rickettsia felis und Rickettsia raoultii. Rickettsien-positive Ratten (R. helvetica) stammten ausschließlich aus zoologischen Gärten. Die dominante Rickettsienart in anderen Nagetieren und Spitzmäusen stellt Rickettsia helvetica dar. Auch hier zeigt das Habitat Wald die höchsten Prävalenzen für Rickettsien-DNA. Mäuse der Gattung Apodemus besitzen eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit einer Infektion mit Rickettsien (Prävalenz von 14,2%).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen die große geographische Verbreitung von Leptospiren und Rickettsien in Kleinsäugern in Deutschland und den Einfluss von demographischen Faktoren auf die Prävalenz für diese Erreger. Die erfolgreiche Validierung des Schnelltests für Rötelmausseren aus Deutschland erlaubt dessen zukünftige Anwendung für die zeitnahe Ermittlung von PUUV-Seroprävalenzen in Rötelmauspopulationen und deren Nutzung in Frühwarnsystemen für die Bevölkerung und entsprechende Risikogruppen. Zukünftige Untersuchungen müssen sich insbesondere den Zusammenhängen zwischen dem Nachweis der Erreger in potentiellen Reservoiren und dem Auftreten humaner Infektionen und Erkrankungen und den damit im Zusammenhang stehenden abiotischen und biotischen Faktoren widmen.
The introduction of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) enabled the separation and visualization of a substantial fraction of an organism’s entire proteome, and when mass spectrometry entered protein science, these proteins became even amenable to identification on a grand scale. Nevertheless, important classes of proteins elude a separation on classical 2 D gels, as the ones showing extremes in isoelectric point or molecular weight, and foremost very hydrophobic proteins naturally embedded in lipid membranes. This thesis aimed at the establishment and adaptation of alternatives to 2-D PAGE. New techniques allowing for an identification and quantification of critical protein classes were designed and adopted to physiological questions in the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. In a comprehensive study on cytoplasmic proteins of S. aureus COL the number of proteins identified by a 2-D gel based approach could be extended by 650 proteins employing gel free technologies. Application of these complementary methods resulted in the establishment of a comprehensive reference map of the cytosolic proteome in growing and non-growing S. aureus cells which can serve as basis for further physiological investigations. Gel free separation of complex protein digests was likewise used in a quantitative study on heat stress in B. subtilis. By implementation of the iTRAQ® technology four different physiological states could be relatively quantified in one experiment. A parallel generation of 2-D gel based data enabled the depiction of strengths and weaknesses of protein quantitation by both, spot intensities on 2-D gels and iTRAQ® signal intensities in MS/MS spectra. Furthermore, new insights into heat sensitivity of pivotal enzymes involved in amino acid biosynthesis could be delivered. The institution of gel free approaches and advancements in 2-D PAGE provide the tools to penetrate into yet unamenable scopes of proteomes. A review on proteome coverage in B. subtilis gives an overview on the strategies which have been explored for most comprehensive protein identification in various sub-proteomes. Although more than one third of B. subtilis’ open reading frames could be demonstrated on protein level, one has to be aware of the fact that it still is a long way to achieve complete coverage of its proteome. Integral membrane proteins make up about one quarter of the entirety of proteins in a cell. Despite their large portion they are clearly understudied due to the intricacy of identification. Their low abundance and non-accessibility of membrane-spanning domains represent major experimental difficulties. The establishment of a protocol efficiently depleting cytosolic proteins by membrane shaving and targeting trans-membrane peptides by novel digestion strategies essentially facilitated identification of highly hydrophobic integral membrane proteins. This protocol was not only successfully applied to the membrane proteome of growing S. aureus cells, but was shown to be applicable in B. subtilis as well. Both studies displayed the novel membrane shaving approach to be highly complementary to a previously established separation of membrane proteins via 1 D PAGE. A combination of the two techniques resulted in identification of about half of the theoretical membrane proteome in both bacteria, and hence layed the foundation for advanced and quantitative analyses. In this regard, 14N/15N metabolically labeled membrane samples of growing and non-growing cells of S. aureus COL were relatively quantified revealing a significant difference in amount for more than one third of the proteins. A corresponding experimental setup was used to compare the membrane proteomes of S. aureus SA113 and its mutant deficient in the lysylphosphatidylglycerol synthetase MprF. Interesting quantitative differences were obtained for proteins most likely involved in the regulation of cellular surface net charge as well as for virulence-associated proteins.
Ziel der Arbeiten war es, ein Hefe basiertes Testsystem zu entwickeln, mit dem in komplexen Proben (Urin, Milch, Ab-, Brack-, See-, Mineralwasser, Lebensmittel, Kosmetika und pharmazeutische Formulierungen) mit möglichst geringem Aufwand/Probevolumen/Kosten estrogene Aktivitäten be-stimmbar sind. Der entwickelte neue Arxula adeninivorans Estrogen-Screen (nAES-Assay) ermöglicht die Detektion estrogen-wirksamer Substanzen als Summenparameter. Der In vitro-Assay basiert auf transgenen A. adeninivorans-Zellen mit zwei Expressionsmodulen (Rezeptorgenmodul mit TEF1-Promotor – hERa-Gen – PHO5-Terminator, Reportergenmodul mit Arxula eigenen GAA-Promotor – phyK/ATAN1-Gen – PHO5-Terminator). Durch die Insertion zweier "Estrogen-Response-Elemente" (EREs) in die GAA-Promotorregion wurde diese zum Estrogen induzierbaren Promotor GAA2xERE–107 modifiziert. Als Reporter wurden zwei nicht-konventionelle Gene benutzt, die Klebsiella sp. ASR1 abgeleitete PhytaseK (phyK-Gen) und die Tannase (ATAN1-Gen) aus Arxula. Um die Genmodule in das Arxula Genom zu integrieren wurde die Transformations-/Expressionsplattform Xplor® 2 mit den Selektionsmarkermodulen ALEU2-/delALEU2-Promotor – ATRP1-Gen verwendet. Vorteil dieser Plattform ist, dass keine dominanten Resistenzmarker (HPH1(r)) in die Hefe übertragen werden und sich mitotisch stabile Hefetransformanten selektieren lassen. Xplor® 2 ermöglicht zudem die komplette Eliminierung aller E. coli-Plasmidbestandteile einschließlich Resistenzgene (Kan(r), Amp(r)). Die im Rahmen der Arbeit selektierten Transformanten wurden bezüglich ihrer Robustheit und Anwendbarkeit als biologische Komponente für den nAES-Assay geprüft. Anhand der auf PhytaseK und Tannase als Reporter basierenden zwei Varianten des nAES-Assays (nAES-P, nAES-T), wurde eine "Standard Operation Procedure – SOP" erstellt, was die Nutzbarkeit des Assays vereinfacht. Die Testplattform umfasst 96-well Arbeitsstandard, lyophilisierten Hefezellen und der validierten Testprozedur mit passender, von der quo data GmbH Dresden entwickelen Auswertesoftware Bioval®. Die Verwendung von A. adeninivorans G1212 [aleu2 atrp1::ALEU2] mit unikal integrierter Kassette in Verbindung mit dem Selektionsprotokoll ermöglichte eine ~2-fache Verbesserung der Messparameter des nAES im Vergleich zum konventionellen A-YES. Die zwei nAES Assay genutzten Reportervarianten wurden hinsichtlich Temperatur-, pH-Optimum und Anwendbarkeit in verschiedenen Proben charakterisiert. So eignet sich nAES-P besser für die Messung von Brack- und Seewasserproben, während der nAES-T die höhere Robustheit gegenüber NaCl aufweist. nAES-T und nAES-P erreichen bei der Bestimmung von estrogenwirksamen Substanzen in Urin und Abwasserproben mit 6–25 h Assaydauer, Nachweis-, Bestimmungsgrenze und EC50-Wert für 17b-Estradiol von 2,8; 5,9; 33,2 ng/l (nAES-P) bzw. 3,1; 6,7; 39,4 ng/l (nAES-T) ähnliche Charakteristika. Dem gegenüber sind die Substratspezifität und der dynamische Messbereich innerhalb der beiden Varianten annähernd gleich. Daraus ergibt sich, dass sich der nAES-Assay basierend auf der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans besonders für die Analyse von komplexen Umweltproben und im regulatorischen Sektor (Abwasserkontrolle, Steroidanalytik, REACh) eignet. In ersten Versuchen mit Realproben, wie Abwasser zeigten sich durchschnittliche estrogene Belastungen des Abwassers von < 6 ng/l. In Direkteinleitern ohne jegliche Behandlung konnten 17b-Estradiol estrogenequivalente-Aktivitäten (nAES-EEQ) von 8–70 ng/l detektiert werden. Die zusätzliche Messung von 47 Rinderurinen mit dem nAES-Assay auf estrogen-wirksame Substanzen ergab eine gute Korrelation zur parallel durchgeführten chemischen Analysen (ana-EEQ) mit GC/MS. Dies unterstreicht den praktischen Nutzen der nAES-EEQ Ergebnisse. In Kälberurin wurde ein durchschnittlicher nAES-EEQ von 800 ng/l und in Rinderurinen (älter als 24 Wochen) von 13000 ng/l bestimmt. Auch Testserien mit Mineralwasser und Eluaten aus dazugehörigen Verpackungsbestandteilen dokumentierten mit nAES-EEQs von < 6 ng/l die Praxistauglichkeit des nAES Assays. Damit hat sich dieser Assay als ein relativ schneller Assay zu Messung estrogener Aktivitäten in komplexen Probenmatrices (inklusive inhibitorischer Bestandteile), wie Urin und Abwasser, ohne aufwendige Aufkonzentrierungen und Vorbehandlungsschritte erwiesen. Die Vorteile zu vergleichbaren Assays und zelllinienbasierten Testsystemen sind seine leichte Handhabung und das Vorhandensein einer bereits erprobten/validierten Testprozedur.
The virosphere comprises all known and unknown viruses in our ecosystems. Advanced sequencing technologies in combination with metagenomic analysis have become a key tool for exploring this global diversity of viruses. However, discovery of novel viruses and comparative analyses are often based on small sequence fragments or lack biological context, which restricts a proper classification. In this study advanced genomic methods were used that included comprehensive knowledge of viral genomes along with supporting biological metadata in order to identify and classify viruses at different levels of genetic relationships. In a first example, the genetic background of vaccine-induced rabies cases was revealed by analyzing and comparing the genetic diversity of viral populations. Furthermore, the fundament for a taxonomic reclassification of orthopoxviruses was established on basis of a wide scale genomic analysis. In addition, novel neurotropic mamastroviruses from sheep and cattle were classified as members of a single species that provided evidence of interspecies transmission. Finally, two putative novel species of alphaherpesviruses and orthopoxviruses were identified. These examples are based on field cases that provide substantial corresponding clinical metadata and information of host-pathogen interactions. The analyses, therefore, puts taxonomic classification into biological and epidemiological context, rather than addressing generic phylogenetic relationships. Furthermore, the presented work demonstrates that a universal approach for virus classification is neither feasible nor reasonable as analyses must be adjusted the nature of the addressed virus. All results with impact on the current taxonomic classification will be or are already reported to the International Committee on Taxonomy of Viruses. In conclusion, this thesis contributed to the classification concepts of viruses and expanded the knowledge of virosphere diversity.
Die Maul- und Klauenseuche (MKS) ist eine hochinfektiöse Erkrankung bei Paarhufern, die hohe wirtschaftliche Schäden verursacht. Auslöser der Erkrankung ist das MKS-Virus (MKSV), ein Mitglied der Familie Picornaviridae. In der vorliegenden Arbeit sollten die aus dem MKSV-Genom abgeleiteten offenen Leserahmen (ORFs) P1-2A, P1-2A3C und 3C in das Genom von Bovines Herpesvirus 1 (BHV-1) und BacMam Viren integriert werden, um der Fragestellung nachzugehen, inwieweit diese beiden Viren sich als virale Vektoren zur heterologen Expression von MKSV-Proteinen eignen und damit eine weitere Möglichkeit der Entwicklung von Markervakzinen gegen MKS gegeben ist. Die Integration des ORF für eine aktive MKSV Protease 3C in das Genom von BHV-1 erwies sich dabei als problematisch. Im Gegensatz dazu konnten in BacMam Viren alle MKSV Proteine erfolgreich exprimiert und prozessiert werden. Die Ergebnisse eines durchgeführten Tierversuches zeigten, dass die intramuskuläre Immunisierung von C57BL/6 Mäuse mit den rekombinanten Viren BacMam/P1-2A und BacMam/P1-2A3C zur Induktion einer humoralen Immunantwort führt. So konnten im ELISA 14 Tage nach der ersten Immunisierung MKSV-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Im Proliferationstest wurden isolierte Milzzellen von immunisierten Tieren mit gereinigten MKSV-Strukturproteinen restimuliert. Dabei wurden neben der Proliferation von B-Zellen auch Hinweise auf die Induktion einer spezifischen zellvermittelten Immunantwort durch die Proliferation von CD4- und CD8-positiven Zellen erhalten. Somit konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine Immunisierung mit rekombinanten BacMam Viren in Mäusen zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen MKSV führt und diese Viren somit möglicherweise gute Kandidaten für eine Markervakzine zur Bekämpfung von MKSV-Infektionen darstellen.
Viral diseases are a threat to bacteria and enormous animals alike. Vaccines are available against several viruses. However, for some viruses, like ASFV, we still lack vaccines, while for others, like IAV, they are not as effective as we need them to be. To a large extent, this is because we do not fully understand the mechanisms conferring antiviral immunity. To improve our understanding of antiviral immunity, we used a model species that is in many immunological aspects closer to humans than the widely used laboratory mice, pigs. In this thesis, pigs were investigated as a potential biomedical model species for viral respiratory infections in humans and as a natural host for viral infections. Both approaches provide valuable insights into aspects of porcine immunology that can either be used as the foundation for translational research or for the design of targeted therapeutics and vaccines for pigs.
Insights into fundamental characteristics of the porcine immune system form the basis for translational studies. Paper I pioneered a detailed characterization of porcine iNKT cells. To make pigs and porcine iNKT cells more available for scientific investigations, we established multicolor flow cytometry analysis platforms that allow for a more detailed investigation of these cells than previously possible. We found porcine iNKT cells circulating in peripheral blood to be a rare population among CD3+ lymphocytes that displays a pre-activated effector state and can be divided into at least three functional subsets. Upon antigenic activation, they proliferated rapidly, secreted pro-inflammatory cytokines, and exerted cytotoxicity. Moreover, we provided first evidence for a role of iNKT cells in porcine IAV and ASFV infections, which we investigated in more detail in paper IV. Central characteristics, i.e., phenotype and functional properties, exhibit a high degree of similarity between humans and pigs. Moreover, differences between human and murine iNKT cells are more pronounced than between humans and pigs.
Based on the results obtained in paper II, the established biomedical model could be used for further studies of infectious respiratory diseases. IAV infections pave the way for secondary co-infections with increased morbidity and lethality. These bactoviral co-infections are a threat to both pigs and humans. The shared susceptibility as well as homologies on the physiological and immunological level make pigs exceptionally suitable animal models for studies of these infections. Paper I and II can also be interpreted under translational aspects. Activation of iNKT cells in porcine vaccination studies showed promising results. Based on these and our findings, this might be a suitable approach for humans as well. Along with other studies, our results suggest that pigs might be a well-suited large animal model for research in infectious diseases. This is true especially for respiratory infections, such as seasonal IAV infections, for which pigs are natural hosts and contribute to viral spread and emergence as “mixing vessels”, which can result in pandemic strains like H1N1pdm09. We could show that porcine iNKT cells as well as the antiviral responses of cTC against H1N1pdm09 in pigs are comparable to human cells and processes. The increased implementation of pigs in basic and applied research might enable an improved translation of scientific knowledge to human and veterinary medicine.
In two further studies, papers III and IV, we investigated T-cell responses during a viral infection, ASF, for which pigs are the only natural hosts. Immune responses were similar after highly and moderately virulent ASFV infection in domestic pigs and wild boar, respectively. However, they differed between both species. Antiviral immunity in domestic pigs was predominantly exerted by αβ T cells, CD8α+ and DP αβ T cells, while the response in wild boar was dominated by γδ T cells, mainly CD8α+ effector cells. Since wild boar show a higher disease severity and lethality, even during infection with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, a shift to γδ T cells seems to be detrimental. In contrast, domestic pigs survive infections with moderately virulent ASFV “Estonia2014”, which indicates that CD8α+ or DP αβ T cells confer protection at least in infections with non-highly virulent ASFV strains. Interestingly, in paper V we found higher and prolonged inflammation in domestic pigs, correlating with increased T-cell influx. However, histopathological analyses revealed no direct explanation for the differences in disease progression and lethality in domestic pigs and wild boar. These findings require further studies to elucidate the underlying mechanisms.
The lack of basic data about immunological differences between domestic pigs and wild boar hampers attempts to understand immunity against ASFV. We found differences between both suid subspecies already at steady state and even more prominent during ASFV infections in papers III-V. Most apparently, T-cell responses in wild boar were heavily biased towards γδ T cells, while immune responses in domestic pigs were based on αβ T cells. However, information about even basic characteristics, like the composition, phenotypes, and functional qualities of wild boar’s immune system, is missing. Therefore, essential baseline data must be obtained in order to adequately assess changes in future studies.
Analyses like these reveal major advantages of pigs as a biomedical model. On the one hand, similar to conventional model species, researchers can investigate every tissue at any desired time. Tissue from human patients is often scarce or not at all available, so models that can be investigated at specific times after infection are needed. On the other hand, results obtained in pigs are more comparable to humans than data from murine studies. Moreover, pigs are susceptible to similar pathogens as humans and experimental infections can be investigated without the need for major genetic manipulations. However, there are also limitations of the porcine model system. Analysis tools are not as advanced as they are for mice, especially in terms of availability of mAbs or genetically modified organisms. Still, given the major advantages that become more and more obvious, efforts should be made to make pigs more applicable for basic and translational research. In addition, findings derived from pigs can be used for the species itself. Pigs are a major livestock species and new treatments, or vaccines could also be used for them. Therefore, this research could eventually also improve animal welfare.
In summary, the presented thesis significantly enhanced our knowledge of porcine immune processes for cTC in general and iNKT cells in particular. Results were obtained both at steady state and in the context of IAV and ASFV infections, and thus, made pigs more available as a model for future research. The use of multicolor flow cytometry provided a broad overview of the ongoing immune reactions and enables further, more wide-ranging studies that can also address open questions in even more complex infection scenarios.
The immune system of all vertebrates primarily is responsible to maintain the organisms homeostasis by either eliminating neoplastic or altered body cells and to protect against foreign invaders (viruses, bacteria, fungi, parasites) (Murphy 2012). It is a highly regulated network of innate and adaptive mechanisms between humoral factors and leukocytes. The successful elimination or protection is crucially based on differentiation of self from non-self. Pathogens and altered body cells are recognized by different receptor complexes on immune cells. Expressed pathogen- or danger-associated molecular patterns (PAMPs or DAMPs, respectively) are bound by pattern recognition receptors (PRR) (Takeuchi and Akira 2010). Missing major histocompatibility (MHC) class I molecules or non-self (e.g. allogeneic or xenogeneic cells) MHC are recognized by natural killer cell receptors (Fischer, Koppang and Nakanishi 2013, Raulet 2006). Foreign non-self peptides are presented through MHC class I (intracellular) or through MHC class II (extracellular) to B- cell or T cell receptor complexes. This initial activation is regulated by humoral factors or cellular interactions (receptor-ligand interactions) resulting in the activation, proliferation and effector function within an immune response. Some of the cellular receptors are permanently expressed on all leukocytes on a high level (MHC class I), whereas others only are expressed during certain developmental or activation stages or on certain leukocyte populations (monocytes, granulocytes, NK cells, lymphocytes) (Murphy 2012, Biosciences 2010). For different mammals (man, mouse, rat, but also swine, cattle, dog), a system of characterized leukocyte surface molecules primarily based on the recognition of these molecules by specific monoclonal antibodies (mabs) was summarized at international workshops as clusters of differentiation (CD) (Cobbold and Metcalfe 1994, Hopkins, Ross and Dutia 1993, Haverson et al. 2001, Mason et al. 2001). Using these mabs, it is not only possible to characterize the developmental and functional stage of different leukocyte subpopulations but also to define the interactions between these populations. For bony fish, such a system does not exist. Only a limited number of mabs against leukocyte surface molecules is available and most of them are strongly specific for species (Köllner et al. 2004, Köllner et al. 2001, Zhang et al. 2010, Ramirez-Gomez et al. 2012, Wen et al. 2011, DeLuca, Wilson and Warr 1983, Toda et al. 2011, Toda et al. 2009, Takizawa et al. 2011a, Hetland et al. 2010, Araki et al. 2008). The goal of this PhD work, therefore, was to develop monoclonal antibodies against surface markers of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) T cell population (chapter 2). The lymphocytes are characterized by the expression of a T cell receptor complex composed of TCR chains (α and β) and CD3 chains (α, β, γ, δ, ε and ζ). Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) binds to MHC class I bound peptide on the infected host cell using their T cell receptor (TCR) and its co-receptor CD8 resulting in specific killing. Th cells recognize peptides through their T cell receptor (TCR) and their co-receptor CD4 after extracellular antigens uptake, processing and presentation via MHC class II by professional antigen presenting cells (macrophages, dendritic cells and B cells). During recent years, genes encoding MHC class I and II, TCR and their co-receptors CD8 and CD4 have been cloned in several fish species and antibodies have been developed to study protein expression in morphological and functional contexts. However, mabs specific for TCR or CD3 have not been established yet. Therefore, using pan-T cell marker specific mabs, the activation and kinetics of T cell subpopulation should be investigated (chapter 2). Moreover, a flow cytometry method was established using different lineage marker specific mabs to measure different leukocyte populations and their involvement in immune mechanisms of trout using a single tube assay (chapter 3). The first line of defense against altered body cells or pathogens is provided by evolutionarily ancient macrophages and natural killer (NK) cells. These innate mechanisms are well developed in bony fish. Two types of NK cell homologues have been described in fish: non-specific cytotoxic cells and NK-like cells (Shen et al. 2002, Shen et al. 2003, Shen et al. 2004, Fischer et al. 2013). Functional assays for innate and adaptive lymphocyte responses have been developed in only a few fish species. However, there are no tools available until now in trout to follow these cells directly in the immune response. The molecular characteristics and the expression on leukocyte subpopulations of CD56 were therefore analyzed. Furthermore, a mab that is specific for a molecule expressed only in NK cells but with uncommon expression kinetics was established (chapter 4). Overall, the established tools and methods allow a more detailed characterization of cellular immune mechanisms against intracellular pathogens in rainbow trout.
Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) represents the third most produced species of diadromous fish, with the total production of 0,732 million tonnes in 2009. More than one third of this production comes from Europe, where it is dominated by Norway, Italy and France. Germany is the fifth biggest producer in Europe, producing 21 thousand tonnes of rainbow trout in the value of 6,1 million Euro. However, the conditions in the intensive aquaculture often increase the disease susceptibility to many pathogens. One of the highest economic threats for a salmonids aquaculture is the causative agent of furunculosis, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Several strategies have been developed to protect the fish, but the traditional methods are either laborious or represent a potential risk for the environment. The selective breeding established more than 35 years ago in the brackish waters of Baltic Sea represent a attractive alternative, delivering a novel strain of rainbow trout better adapted to the brackish environment and exhibiting reduced mortality in the infection with A.salmonicida. Nevertheless, no information was available about the fundaments of this phenomenon. Thus, the aim of presented study was the identification of immune adaptations, which occurred during the 30 years of selection and favoured increased survival of “born” trout to the bacterial diseas es. In the presented work, the peritoneal cavity of rainbow trout has been used as a model for the investigation of disease resistance in fish. In the first chapter, the peritoneal cavity has been described as a unique niche of teleost immune system and the kinetic of peritoneal leukocytes induced by the stimulation has been analysed. Furthermore, a unique set of monoclonal antibodies has been used to evaluate the contribution of distinct cell populations on the inflammation and its resolution. In the second part of the study, the transcriptional changes of peritoneal leukocytes have been evaluated using the GRASP microarray. The following analysis provided unique insights into the local immune response in rainbow trout. The unprecedented combination of both data sets offers an unparalleled description of the local immune response in teleost fish and can be summarized into following facts. In general, the obtained results revealed, that the unstimulated peritoneal cavity is populated predominantly by lymphocytes with IgM+ Bcells being the major cells type. The rapid changes in the composition induced by the stimulation were underlined by the upregulation of major proinflammatory molecules such as IL1β, IL8 and TNFα within 12hpi. Although the initial phase of the reaction was dominated by myeloid cells, the cavity underwent within 72 hours two complete changes in the composition corresponding with the massive changes in the transcriptome. Eventually, the resolution of inflammation was marked by an increasing number of lymphocytes and correlated with the downregulation of pro-inflammatory genes to the initial level and upregulation of anti-inflammatory cytokines IL10 and TGFβ. Besides the general observations common to all treatments and both strains, our experiments revealed also remarkable differences between the antigenic stimulation and reaction towards pathogen. From these differences following conclusions can be drawn; the infection induces comparable reaction pattern as the stimulation, although the intensity of the reaction and number of cells is higher. These observations correlated with the higher expression of inflammatory molecules after the infection. Viable bacteria also prolong the myeloid phase of the reaction and delay the resolution of inflammation. Finally, model of peritoneal inflammation caused by A. salmonicida has been applied also to the second strain of rainbow trout, known for its higher resistance to infection. The comparison of obtained data suggested that resistant trout reacted to the antigenic stimulation and infection with a lower number of cells despite minor differences in the expression level of major pro-inflammatory molecules during early stages of the infection. Eventually, the resolution of inflammation and onset of adaptive immune response occurred in resistant trout almost 24 hours earlier and was correlating with an increased expression of anti-inflammatory cytokines IL10 and TGFβ. Notably, the increased survival of resistant strain correlates with the increased expression of antibacterial proteins such as NRAMP and hepcidin. Taken together, obtained data provided unprecedented insights into the local immune response in teleost fish and identified features conserved during the selection breeding in the brackish water of Baltic Sea. Additionally, combination of cellular and molecular data elucidates the peritoneal inflammation in fish and suggested high conservation of the immune response in the evolution.
Lipoproteins of Staphylococcus aureus represent a major class of surface proteins, which are anchored to the outer leaflet of the cell membrane. Although they play a key role in the immune response and virulence, the majority of lipoproteins in this organism is still of unknown function. The aim of our study was to investigate the function of so far poorly or uncharacterized lipoproteins in S. aureus strain Newman. To this end, an integrated bioinformatical approach was applied to define the pan-lipoproteome of 123 completely sequenced S. aureus strains. In total, this analysis predicted 192 different potential lipoproteins, with a core lipoproteome of 39 and a variable lipoproteome of 153 lipoproteins. Out of those 192 lipoproteins, 141 are so far functionally uncharacterized. Primarily focusing on members of the core-lipoproteome with unknown or poorly characterized function, 24 lipoproteins or co-encoded neighbor proteins were selected for further characterization. Of those 24 proteins, 20 S. aureus markerless deletion mutants were constructed (S. aureus delta l01 - delta l20) and screened for an altered growth behavior under various conditions. Here, three mutants showed a temperature-sensitive phenotype, two mutants formed aggregates in the TSB of the manufacturer Merck (TSBMerck), and four mutants showed reduced growth under osmotic stress with 8% NaCl. An altered aggregation behavior was observed for four mutants in the presence of Triton X-100 and for eleven mutants in the presence of SDS. Furthermore, ten mutants revealed an impaired biofilm formation capacity as well as reduced hemolytic activity. Interestingly, S. aureus deletion mutants delta l14 (delta NWMN_1435) and delta l16 (delta NWMN_0646) showed an altered phenotype under nearly all tested growth and stress conditions. Most strikingly, both deletion mutants demonstrated dramatic defects in cell morphology and cell division during the transient growth phase in TSBMerck and were therefore selected for further detailed characterization. Electron microscopy imaging of the two mutants revealed an irregular cell shape, increased cell size, multiple displaced division septa, and incomplete separation of daughter cells resulting in the formation of cell aggregates in TSBMerck. Complementarily, microarray-based transcriptome analysis and whole-genome sequencing of S. aureus delta l14 and delta l16 suppressor mutants strongly point to a functional association of both lipoproteins with cell envelope- or cell division-related processes. Specifically, multiple hints suggest a functional connection of both lipoproteins with lipo- or wall teichoic acids. Of note, the phenotypes of S. aureus delta l14 and delta l16 are conditional and appear under some, but not all growth conditions. Thus, it is conceivable that the function of L14 and L16 is modulated by metabolic processes, or that the proteins might be part of a “backup system” becoming important only under certain conditions. Collectively, we propose that L14 and L16 fulfill a basic role in cell envelope- or cell division-related processes under specific growth conditions. Particularly, the activity of L14 and L16 might be necessary for the function or localization of lipo- or wall teichoic acids, and thus, might be linked to the regulation of autolysins. In conclusion, this study reveals important insights into the function of two so far uncharacterized but highly conserved lipoproteins in S. aureus.
Ebolaviruses are zoonotic pathogens causing severe hemorrhagic fevers in humans
and non-human primates with high case fatality rates. In recent years, the number and
scope of outbreaks has increased, highlighting the importance of better understanding
the molecular aspects of ebolaviral infection and host cell interactions in order to be able to better control this virus.
To facilitate virus genome replication, transcription and protein expression,
ebolaviruses recruit and interact with specific host factors. These interactions play a key role in viral infection and influence virus survival and disease outcome. Based on a genome-wide siRNA screen, the three host factors CAD, NXF1 and UAP56 were
recently identified to be involved in ebolavirus genome replication and/or transcription
and/or mRNA-translation. However, mechanistical details of how these host factors
affect the ebolavirus lifecycle remained elusive.
In this thesis I analyzed the functional interactions between EBOV and these newly
identified host proteins in order to better understand the virus-host interface. To this
end I used siRNA knockdown as well as overexpression of these host proteins in
combination with different reverse-genetics based lifecycle modelling assays to
investigate the influence of CAD, NXF1 and UAP56 on individual aspects of the EBOV
lifecycle. Using these systems in relation with a host factor knockdown I was able to
show that the provision of pyrimidines by CAD plays an important role for both EBOV
genome replication and transcription, whereas NXF1 is predominantly required for
mRNA transport. I furthermore used immunofluorescence analysis to examine whether
these host factors are recruited by one or more EBOV proteins to inclusion bodies,
which represent physical sites of ebolavirus genome replication. During these
experiments, I was able to show that CAD and NXF1, and possibly also UAP56, are
recruited to EBOV inclusion bodies in order to fulfill their individual function for EBOV RNA synthesis or later steps in protein expression. Additionally, I was able to show that the uptake of NXF1 into NP-induced inclusion bodies is most likely mediated via the C-terminal domain of NP, and that the FG-repeat interaction domains of NXF1 are sufficient for recruitment. Further, my data indicate that RNA interaction of both NXF1 and NP is not required for this process, but rather important for exit of NXF1 from inclusion bodies. I therefore suggest that the viral mRNA is transferred in inclusionbodies from NP to NXF1, which leads to a rapid export of the NXF1 packed viral mRNA into the cytosol for mRNA translation.
The exact mechanism of how these host factors are recruited into inclusion bodies and whether they have similar functions in the lifecycle of other negative-sense RNA viruses still needs to be investigated. Nevertheless, this study increases our understanding of virus-host interaction of ebolaviruses, and thus helps to identify targets for the development of novel therapeutics against these viruses.
Funktionelle Charakterisierung des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus
(2008)
Das Pseudorabies Virus ist der Erreger der Aujeszkyschen Erkrankung, einer fieberhaften Allgemeinerkrankung mit neurologischen Symptomen beim Schwein. Aufgrund seiner biologischen Eigenschaften und unkomplizierten Kultivierung in Zellkultur sowie der Verfügbarkeit eines Mausmodells hat sich PrV als geeignetes Modellsystem zur Untersuchung der alphaherpesviralen Replikation etabliert. Das Tegument stellt den komplexesten und noch am wenigsten verstandenen Teil des Herpesviruspartikels dar. Für PrV konnten mehr als 15 dem Tegument zugeordnete Proteine identifiziert werden, die neben ihrer strukturellen Bedeutung auch regulatorische Funktionen erfüllen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung funktioneller Domänen des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus. Mit Hilfe eines Transkomplementationsassays konnten verschiedene rekombinante UL36-Proteine auf ihre Fähigkeit, den letalen Replikationsdefekt einer UL36-Deletionsmutante zu komplementieren, überprüft werden. Bei positiver Komplementation wurden stabile Virusrekombinanten isoliert und diese auf ein möglicherweise verändertes Replikationsverhalten in der Zellkultur (in vitro) oder im Mausmodell (in vivo) untersucht. Negative Komplementationsergebnisse weisen auf eine essentielle Funktion dieser Region innerhalb des UL36-Proteins hin. Die durchgeführten Primärsequenzvergleiche homologer UL36-Proteine zeigten einen geringen Grad an Sequenzhomologie. Jedoch konnten mehrere konservierte Domänen und putative Motive identifiziert werden. Dem im N-Terminus gelegenen Modul konnte die für HSV-1 sowie Vertretern aller drei Unterfamilien beschriebene Deubiquitinylierungsaktivität zugeordnet werden. Weiterhin zeigte sich, dass die 62 C-terminalen Aminosäuren innerhalb der Alphaherpesviren stark konserviert sind, was auf eine wichtige Bedeutung dieser Region für die Funktion des UL36-Proteins hindeutet. Eine große prolinreiche Domäne im C-terminalen Bereich spricht für eine extreme Flexibilität des Proteins und eine mögliche Konformationsänderung während des Replikationszykluses. Leucin-Zipper-Motive könnten eine pUL36-Homodimerisierung oder eine bisher noch nicht beschriebene Interaktion mit viralen oder zellulären Proteinen vermitteln. Nach Charakterisierung verschiedener rekombinanter UL36 Proteine lässt sich Folgendes zum essentiellen Tegumentprotein pUL36 des Pseudorabies Virus sagen: 1) Es konnten verschiedene Domänen innerhalb des PrV-UL36-Proteins identifiziert werden, die für die Replikation sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell von unterschiedlich wichtiger Bedeutung sind. Insgesamt wurden fast 50% des Proteins deletiert, ohne einen letalen Funktionsverlust zu bewirken. 2) Der C-Terminus des UL36-Proteins des Pseudorabies Virus ist für die Funktion des Proteins im Replikationsgeschehen essentiell, was auf eine mögliche Interaktion mit Kapsid- und/oder kapsidassoziierten Proteinen zurückzuführen sein könnte. 3) Die reifen Virionen der Mutanten zeigen keine Veränderungen hinsichtlich ihrer Morphologie. Auch biochemisch wurden keine Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der untersuchten Virionen festgestellt. 4) Keine der charakterisierten Mutanten wies einen Defekt bei der Freisetzung neugebildeter Kapside aus dem Zellkern auf, d. h., die deletierten Bereiche haben keine Bedeutung während der nukleären Phasen der Virusmorphogenese. 5) PrV-pUL36 könnte weiterhin für den Ablauf der Infektion des Nervensystems von Bedeutung sein, da eine deutliche Einschränkung der Neuroinvasion einiger Mutanten im Mausmodell beobachtet wurde.
Influenzaviren zählen zu den gefährlichsten Infektionserregern, die im Menschen weltweit schwere respiratorische Erkrankungen auslösen. Von großer Relevanz sind allerdings auch Reservoirwirte, in denen die Infektionen häufig mild verlaufen, aber durch Mutationen und Reassortierung einzelner Genomsegmente neue, potentiell auch humanpathogene Influenzaviren entstehen können. Die im Jahre 2009 aufgetretene humane Influenzapandemie, welche durch ein H1N1 „swine origin“ Influenza A Virus (SoIV) ausgelöst wurde, verdeutlichte die besondere Bedeutung porziner Reservoirwirte. Da Schweine sowohl für aviäre als auch humane Influenza A Viren empfänglich sind, wird ihnen eine wichtige Rolle als „mixing vessel“ für die Entstehung neuer Influenzaviren zugeschrieben. Aufgrund vielversprechender Entwicklungen auf dem Gebiet der Lebendvirus-Vektor-Vakzine war es das Ziel dieser Arbeit, einen neuartigen Vektor-Impfstoff für Schweine gegen das pandemische H1N1 SoIV auf der Basis eines attenuierten porzinen Virus zu generieren. Da das Pseudorabies Virus (PrV) nicht humanpathogen ist und in seinem natürlichen Wirt, dem Schwein, hervorragend repliziert, eignete es sich besonders für die Entwicklung eines rekombinanten Vektor-Impfstoffs. Hierzu wurde der bewährte Impfstamm PrV-Bartha genetisch so verändert, dass anstelle des nicht essentiellen herpesviralen Glycoproteins gG immunogene Influenzavirusproteine wie die Hüll-Glykoproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA), aber auch das Nukleoprotein (NP) und die Matrixproteine (M1 und M2) des pandemischen H1N1 SoIV exprimiert werden. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle des humanen oder murinen Cytomegalievirus immediate-early Promotors, wobei sich letzterer als stärker erwies. Durch Insertion eines synthetischen Introns in der 5´-nicht-translatierten Region konnte die Expression der Transgene weiter gesteigert werden. Zu einer substantiellen Verbesserung der Expression führte die Insertion synthetischer HA- (synH1) und NA-Gene (synN1), deren Sequenzen an die Codon-Präferenzen von PrV angepasst waren. In tierexperimentellen Studien wurde gezeigt, dass sowohl die optimierte HA- (PrV-BaMI-synHI), als auch die optimierte NA-exprimirende PrV-Rekombinante (PrV-BaMI-synN1) nach intramuskulärer prime-boost Vakzinierung sieben Wochen alter Saugferkel deutlich höhere Antigen-spezifische Antikörpertiter induzierte als eine intranasale Infektion mit H1N1 SoIV. Auch die ein- bzw. zweimalige intranasale Impfung mit PrV-BaMI-synH1 führte in allen Tieren zur Bildung HA-spezifischer Serumantikörper, allerdings in deutlich geringen Mengen. In allen Fällen führte die 3 Wochen nach Erstimmunisierung durchgeführte Auffrischungsimpfung zu einem beträchtlichen Anstieg der HA- bzw. NA-spezifischen Antikörpertiter. In durchflusszytometrischen Analysen peripherer Blutlymphozyten konnte ebenfalls eine vermehrte Aktivierung und Proliferation von B-Zellen zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen nach der Auffrischungsimpfung beobachtet werden. Außerdem wurde festgestellt, dass die durch PrV-BaMI-synN1 induzierte NA-spezifische Immunantwort deutlich später einsetzte als die durch PrV-BaMI-synH1 vermittelte HA-spezifische Reaktion. Versuchstiere, die gleichzeitig mit PrV-BaMI-synH1 und PrV-BaMI-synN1 geimpft wurden, entwickelten sowohl HA- als auch NA-spezifische Antikörper zu vergleichbaren Titern wie mit den einzelnen Viren immunisierte Tiere. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden alle mit PrV-BaMI-synH1 und/oder PrV-BaMI-synN1 geimpften Schweine sowie mit dem leeren Vektor PrV-Bartha vakzinierte und naive Kontrolltiere einer Belastungsinfektion mit dem pandemischen H1N1 SoIV A/California/7/09 unterzogen. Beide potentiellen Vektor-Impfstoffe verhinderten die Ausbildung klinische Symptome und hemmten die Replikation und Ausscheidung des Belastungsvirus signifikant, wie real-time RT-PCR Analysen von Nasentupferproben zeigten. Allerdings war die durch intramuskuläre prime-boost Vakzinierung mit PrV-BaMI-synN1 bewirkte Reduktion der Viruslast deutlich geringer als die mit PrV-BaMI-synH1. Die kombinierte intramuskuläre Applikation beider Vektor-Vakzine zeigte keine additiven Effekte, sondern eine ähnliche Schutzwirkung wie PrV-BaMI-synH1 allein. Während die zweimalige intramuskuläre Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 oder beiden Viren die Übertragung des Belastungsvirus auf naive Kontakttiere zwar erheblich verzögerte, aber nicht verhinderte, wurde dieses Ziel durch eine zweimalige intranasale Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 erreicht. Die RNA-Analysen der Tupferproben zeigten dabei eine fast vollständige Inhibition der Belastungsvirusreplikation, obwohl die HA-spezifischen Antikörper in diesen Tieren weitaus geringer waren als in intramuskulär geimpften Versuchstieren. Auch im Vergleich zu einer einmaligen intranasalen Vakzinierung reduzierte die intranasale Auffrischungsimpfung mit PrV-BaMI-synH1 die Replikationsdauer und die nachweisbaren Mengen des H1N1 SoIV erheblich.
Avian influenza viruses (AIVs) have their natural reservoir in wild aquatic birds but occasionally
spread to terrestrial poultry. While AIVs of subtypes H5 and H7 are well known to evolve highly
pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs) during circulation in domestic birds, non-H5/H7
subtypes exhibit only a low to moderate pathogenicity. Furthermore, spillover events to a broad
range of mammalian hosts, including humans, with self-limiting to severe illness or even fatal
outcomes, were reported for non-H5/H7 AIVs and pose a pandemic risk. The evolution of high
virulent phenotypes in poultry and the adaptation of AIVs to mammalian hosts are predominantly
linked to genetic determinants in the hemagglutinin (HA). The acquisition of a polybasic cleavage
site (pCS) is a prerequisite for the evolution of HPAIVs in poultry, while changes in the receptor
binding preference and virus stability are essential for adaptation of AIVs to mammals.
In August 2012, an H4N2 virus with the pCS motif 322PEKRRTR/G329 but preserved trypsin
dependend replication and low pathogenicity in chickens was isolated on a quail farm in California.
In the first two publications, we followed different approaches to investigate virulence factors and
the potential risk for the transition of H4N2 to high virulence in chickens. The loss of N-terminal
glycosylations in the vicinity of the pCS resulted in decreased binding to avian-like receptors and
dramatically decreased virus stability. On the other hand, one deglycosylation increased virus
replication and tissue tropism in chicken embryos but did not alter virulence or excretion in
chickens. Furthermore, additional basic amino acids in the natural pCS motif improved the trypsin-independent
cleavage of HA and caused slightly increased tissue tropism in chickens. However,
the engineered motifs alone did not affect virulence in chickens. Intriguingly, they even had a
detrimental effect on virus fitness, which was restored after reassortment with segments of HPAIV
H5N1. Together, the results show the importance of HA glycosylations on the stability of H4N2 and
reveal the important role of non-HA segments in the transition of this virus to high virulence in
poultry.
The transmission of another non-H5/H7 AIV of subtype H10N7 from birds to seals resulted in mass
deaths in harbor seals in 2014 in northern Europe. The third publication describes nine mutations
in the HA1 subunit of seal isolates compared to avian H10Nx viruses. We found that some of these
mutations conferred a dual specificity for avian and mammalian receptors and altered
thermostability. Nevertheless, the H10N7seal remained more adapted to avian host cells, despite
of the alteration in the receptor binding specificity.
Altogether, this thesis demonstrates that naturally evolved AIVs beside H5 and H7 subtypes
support a highly pathogenic phenotype in the appropriate viral background and alter virulence and
host receptor specificity by few amino acid substitutions in the HA. These findings improve our
knowledge of the potential of non-H5/H7 AIVs to shift to high virulence in birds and the adaptation
in mammals.
LPAIV H9N2 and HPAIV H5N8 clade 2.3.4.4 viruses have been frequently isolated from domestic and wild birds in Germany and they are endemic in poultry worldwide. H9N2 is known to donate gene segments to other AIV with high case fatality rate in humans (e.g. H5N1, H7N9). Similarly, H5N8 devastated poultry worldwide since 2014 and has been recently isolated from humans. Therefore, it is important to understand the genetic predisposition for adaptation of H9N2 and H5N8 AIV in poultry and mammals. In the first publication, we focused on the variable hemagglutinin cleavage site (HACS) of European and Non-European H9N2 viruses, since the HACS is a main virulence determinant of AIV in birds. We found a preferential substitution of non-basic amino acids (G, A, N, S, D, K) in the HACS at position 319 of European H9N2 viruses compared to non-European H9N2 viruses. Recombinant viruses carrying different non-basic amino acids in the HACS modulated replication in vitro. While these non-basic amino acids did not affect virulence or transmission in chickens, they modulated virulence and replication in turkeys. Moreover, H9N2 viruses with non-basic amino acids in the HACS were able to replicate in mammalian brain cells for multiple cycles even without trypsin. In the second publication, we addressed the question whether reassortment between two recent German H9N2 and H5N8 clade 2.3.4.4. B viruses is possible and analysed the impact on virus fitness in mammals and birds. We found that H9N2 PB1 and NP segments were not compatible to generate infectious H5N8 viruses and this incompatibility was due to mutations outside the packaging region. However, H9N2 NS alone or in combination with PB2 and PA significantly increased replication of H5N8 in human cells. Moreover, H9N2 PB2, PA and/or NS segments increased virulence of H5N8 in mice. Interestingly, in chickens, reassortment with H9N2 gene segments, particularly NS, partially or fully impaired chicken-to-chicken transmission. These results indicate that the evolution of H9N2/H5N8 reassortants showing high virulence for mammals is unlikely to occur in chickens. In the third publication, we focused on the NS1 protein of different HPAIV H5N8 clade 2.3.4.4 viruses from 2013 to 2019 and studied the impact of its C-terminus (CTE) variation on virus fitness in chickens and ducks. Our findings revealed a preferential selection for a certain NS1 CTE length in 2.3.4.4. H5N8 clade A (237 aa) and B (217 aa) viruses over the common length of 230 aa. Indeed, the NS1 CTE can affect virus virulence and pathogenesis in a species and virus clade dependent manner. In chickens, although there was no impact on virulence, NS1 CTE of H5N8-A and H5N8-B, regardless of the length, have evolved towards higher efficiency to block the IFN response. In ducks, NS1 CTE contributed to efficient transmission, replication and high virulence of H5N8-B. In the fourth publication, we assessed the impact of variable length of NS1 on H5N8 virus replication in human cells and virulence in mice. We showed that NS1 of H5N8-B virus unlike the vast majority of NS1 of AIV, shared preferences for short NS1 similar to human and zoonotic influenza viruses. This virus (i) was able to efficiently block IFN and apoptosis induction which might be the first steps for efficient adaptation to human cells and (ii) without prior adaptation replicated at higher levels and was more virulent in mice than H5N8-A. The virulence of the latter virus increased after shortening the NS1 similar to H5N8-B virus. Therefore, it is conceivable that truncation in NS1 is a determinant for adaptation of H5N8 in mammals irrespective of its impact on virus fitness in poultry. Findings in this dissertation indicated that HA mutations in the European H9N2 and NS1 variations in H5N8 viruses play a role in virus fitness in poultry and/or mammals. These results improve our current understanding for AIV adaptation and are useful to assess the potential of these viruses to infect mammals.
Die Spezies Kuhpockenvirus (CPXV), ein Mitglied des Genus Orthopoxvirus, ist endemisch in weiten Teilen Europas und Asien verbreitet. CPXV besitzt ein sehr breites Wirtsspektrum und zählt zu den zoonotischen Erregern. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass CPXV polyphyletisch ist. Die bisher definierten Kladen wurden in vorliegender Arbeit bestätigt. Die 20 neu gewonnenen CPXV-Stämme verschiedenster Wirtsspezies gruppieren vorrangig in die CPXV-like 1 und CPXV-like 2 Kladen. Ein CPXV-Stamm, isoliert von einem Neuweltaffen, erscheint jedoch als single branch und lässt sich keiner bisher bekannten Klade zuordnen.
Gegenwärtig ist über die Rolle der Wühlmäuse, die als Reservoirwirt der Kuhpockenviren betrachtet werden, wenig bekannt. In vorliegender Arbeit sollte deshalb das aus einer Feldmaus (Microtus arvalis) stammende CPXV-Isolat FM2292 eingehend charakterisiert werden. CPXV FM2292 weist das bisher längste CPXV-Genom auf, das in die CPXV-like 1 Klade clustert. Neben der Sequenzanalyse sollten vergleichende experimentelle Infektionsstudien in Feldmäusen und Wistar-Ratten durchgeführt werden. Der Krankheitsverlauf nach intranasaler CPXV FM2292-Infektion bei Feldmäusen verlief subklinisch; Wistar-Ratten hingegen zeigten ausgeprägte klinische Symptome. Im Gegensatz dazu verursachte die Infektion mit einem aus einer Schmuseratte isolierten CPXV-Stamm bei den Feldmäusen eine starke Klinik. Daraus lässt sich schließen, dass Feldmäuse gegenüber Wühlmaus-assoziierten Stämmen, wie CPXV FM2292, eine Adaptation entwickelt haben. Die nachgewiesene Virusausscheidung weist auf eine Tröpfchen-basierte Übertragung hin.
Neben Feldmäusen sollten auch Rötelmäuse im Tierversuch näher betrachtet werden. Unabhängig vom eingesetzten CPXV-Stamm resultierten die experimentellen CPXV-Infektionsstudien in Rötelmäusen (Myodes glaerolus) in subklinischen Verläufen. Eine nasale Virusausscheidung konnte nicht detektiert werden, was im starken Kontrast zu den Ergebnissen aus experimentell infizierten Feldmäusen steht. Dennoch deuteten die Serokonversionsraten der Rötelmäuse darauf hin, dass eine Replikation im Wirt stattgefunden hat. Zudem entwickelten zwei Kontakttiere ebenfalls OPV-spezifische Antikörper, was auf eine Übertragung des Virus schließen lässt.
Wühlmäuse als Reservoirwirt dienen der Übertragung des Kuhpockenvirus auf akzidentielle Wirtsspezies wie Hauskatzen oder Nutztiere. Der in dieser Arbeit betrachtete Fallbericht eines mit CPXV-infizierten Fohlens zeigt, dass CPXV-Infektionen bei akzidentiellen Wirten mit stark ausgeprägter Klinik verbunden sein können. Zudem wird die wachsende Gefahr der Übertragung von CPXV auf Nutztiere und Menschen deutlich.
Zusammenfassend unterstreicht die in der vorliegenden Arbeit verwendete phylogenetische Betrachtung die genetische Variabilität der Spezies CPXV. Zudem konnten neue Erkenntnisse zu Feldmäusen und Rötelmäusen als Reservoirwirtsspezies gewonnen werden. CPXV-Infektionen von Wühlmäusen verlaufen subklinisch, im Gegensatz zu dem hier ebenfalls beschriebenen, lethal endenden CPXV-Infektionsverlauf eines akzidentiellen Wirts, eines abortierten Fohlens.
The Gram-positive bacterium Bacillus licheniformis is an important industrial host for the production of enzymes. Genomic DNA arrays and proteomics are being used to investigate the physiology of this bacterium. A genome-wide transcriptional profiling analysis of the adaptation of B. licheniformis to phosphate starvation shows more than 100 induced genes. Most of strongly induced genes belong to the putative Pho regulon. The data of the transcriptome analysis have been verified by the analysis of the extracellular and cytoplasmic proteome. The main response of B. licheniformis to glucose starvation was a switch to the usage of alternative carbon sources. In addition, B. licheniformis seems to be using other organic substances like amino acids and lipids as carbon sources when subjected to glucose starvation. This was indicated by the induction of a high number of genes the proteins of which are involved in amino acid and lipid degradation. During nitrogen starvation genes necessary for the recruitment of nitrogen from alternative sources were induced, e.g. genes for nitrate and nitrite assimilation, several proteases and peptidases. Both starvation conditions led to a down-regulation of the transcription of most vegetative genes and subsequently to a reduced synthesis of the corresponding proteins. Only a few genes were induced by both starvation conditions like yvyD, citA and the methylcitrate shunt genes mmgD, mmgE and yqiQ. Data of this study use to better understand the physiology of this bacterium during fermentation processes and thus to identify and circumvent bottlenecks of B. licheniformis based bioprocesses. In addition, the phytase promoter was tested for the construction of an alternative phosphate regulated expression system for B. licheniformis.
Die Analyse bakterieller Phosphoproteome rückt durch die Einflussnahme von Phosphorylierungsereignissen im Virulenzgeschehen pathogener Mikroorganismen immer weiter in den Vordergrund. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der globalen Analyse bakterieller Phosphoproteome unter Anwendung verschiedener Techniken der Proteomforschung. Ziel war es, einen möglichst umfassenden Überblick über das cytosolische Phosphoproteom zu gewinnen, die Dynamik der Protein-Phosphorylierungen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu analysieren und daraus folgend Hinweise auf regulatorische Mechanismen zu erhalten. Im Zuge der Untersuchungen zum Phosphoproteom von Bacillus subtilis wurde das auf den phosphosensitiven Pro-Q® Diamond-Farbstoff basierende 2D-Gel-Färbeprotokoll optimiert und validiert. Ferner wurde dieses Protokoll erfolgreich für die Untersuchungen des Phosphoproteoms von Mycoplasma pneumoniae und Staphylococcus aureus eingesetzt. Durch die Etablierung einer Methode zur Phosphopeptidanreicherung konnte der Blick auf das Gesamtphosphoproteom von S. aureus komplementiert werden. Insgesamt war es dadurch möglich, 103 phosphorylierte Proteine und 68 verschiedene Phosphorylierungsstellen von S. aureus zu identifizieren, darunter z. B. den Virulenzregulator SarA, dessen Phosphorylierung einen Hinweis auf seine mögliche Regulation aufzeigt. Zusätzlich konnten die Phosphorylierungsergebnisse der Fruktose-1,6-Bisphosphataldolase erste Hinweise auf eine Regulation der Substratbindung liefern und einen Erklärungsansatz enstehen lassen, der die Wirkungslosigkeit einiger in der Literatur beschriebenen Enzyminhibitoren (potentielle antimikrobielle Wirkstoffe) in in vivo Studien darlegt. In einem auf der Pro-Q® Diamond-Färbung beruhenden Quantifizierungsansatz konnten 10 signifikante Veränderungen in der Signalintensität der phosphorylierten Proteine unter Glukosehunger, nitrosativem, oxidativem und osmotischem Stress festgestellt werden. Diese liefern erste Indizien auf durch Phosphorylierungsereignisse gesteuerte Regulationsmechanismen. Besonders die unter nitrosativen Stress neu auftretenden putativ phosphorylierten Proteinspots der Proteine FdaB (Fruktose-Bisphosphataldolase) und HchA (molekulares Chaperon Hsp31/Glyoxalase 3) lassen Spekulationen über neue Stoffwechselwege, wie z. B. einen Methylglyoxal detoxifizierenden Mechanismus, zu. Darüber hinaus konnten durch die Glukosehungerexperimente und die Spezifizierung der Phosphorylierungsstelle T537 der Pyruvatkinase von S. aureus ein Regulationsmechanismus vorgeschlagen werden, der das "Finetuning" des Energieladungszustandes der Zelle über einen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsmechanismus beschreibt. Von weiterem Interesse war die Identifizierung von am Arginin phosphorylierten Peptiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde hierfür das Phosphopeptid-anreicherungsprotokoll optimiert, so dass in Zusammenarbeit mit A. Elsholz (Inst. f. Mikrobiologie, EMAU Greifswald) die Identifizierung von phosphorylierten Argininresten der Argininkinase McsB und der ATPase ClpC in B. subtilis möglich wurde. Darüber hinaus wurde die Methode in globalen Untersuchungen einer Phosphatasemutante (∆ywlE, B. subtilis) angewandt. Mittels der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten massenspektrometrischen Analyse der angereicherten Peptide konnten 111 Arginin-Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Zur Verbesserung der Quantifizierung von phosphorylierten Proteinen in B. subtilis wurde ein Protokoll entwickelt, indem das Auftrennungspotential des 2D-Gels, die Identifizierung phosphorylierter Proteine anhand des Pro-Q® Diamond-Farbstoffs und die auf die metabolische Markierung beruhende Quantifizierung miteinander kombiniert wurde. Im Ergebnis konnte anhand dieser Methode eine bessere Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität bei geringeren Veränderungen im Vergleich zu dem Pro Q® Diamond basierten Quantifizierungsansatz erzielt werden.
Herpesviruses are enveloped DNA viruses which are dependent on two fusion steps for efficient replication in the host cell. First, they have to fuse their envelope with the cellular plasma membrane or with the vesicle membrane after endocytic uptake to enter the host cell and second, they have to export the newly generated nucleocapsids from the site of assembly to the cytoplasm by fusion of the primary virion envelope with the outer nuclear membrane (ONM). The main goal of this project was to provide a better understanding of how herpesvirus capsids exit the nucleus. On the one hand this thesis aimed at finding cellular proteins involved in nuclear egress (Paper I), while on the other the focus was on further characterization of the viral nuclear egress complex (NEC, Paper II) and its interaction with the capsid (Paper III).
It is the hallmark of viruses, including herpesviruses, to hijack host cell proteins for their efficient replication. Some of those interactions are well characterized, while others might not yet have been discovered. In the last step of the nuclear egress, where the primary virion membrane fuses with the ONM, most likely a cellular machinery is involved. The presented work focused on Torsin, the only known AAA+ ATPase localizing in the endoplasmic reticulum and the perinuclear space (PNS). For this, the effect of overexpression of WT and mutant proteins, as well as CRISPR/Cas9 generated knock-out cell lines, on PrV replication was analyzed. Neither single overexpression nor single knockouts of TorA or TorB had any significant effects on virus titers. However, infection of TorA/B double knockout cells revealed reduced viral titers and an accumulation of primary virions in the PNS at early infection times, indicating a delay in nuclear egress.
The process of nuclear egress has been intensively investigated without revealing all its details. To address some of the missing aspects we generated monoclonal antibodies (mAbs) against the NEC and its components (pUL31 and pUL34) for a better visualization of the process in transfected as well as infected cells. These mAbs provide a useful tool for future analyses.
The publication of the NEC crystal structure formed the basis for intensive research on the molecular details of the NEC formation and its interaction with the nucleocapsid. Recently, our lab showed that lysine (K) at position 242 in the membrane-distal part of pUL31 is crucial for incorporation of the nucleocapsid into budding vesicles. Replacing K by alanine (A) resulted in accumulations of vesicles in the PNS, while mature capsids were not incorporated. To test whether this is due to electrostatic interference or structural restrictions we substituted K242 by different aa to determine the requirements for nucleocapsid uptake into the nascent primary particles. To analyze whether the defect of pUL31-K242A can be compensated by second-site mutations, PrV-UL31-K242A was passaged and mutations in revertants were analyzed. Different mutations have been identified compensating for the K242A defect. A considerable number of mutations indicates that the NEC is much more flexible than previously thought. Further, we gained information that the K at position 242 is not directly involved in capsid interaction, while it is more likely involved in rearrangements within the NEC coat.
Herstellung sicherer und wirksamer Lebendvakzine gegen die Koi Herpesvirus Infektion von Karpfen
(2019)
Das Koi Herpesvirus (KHV, Cyprinid herpesvirus 3) verursacht eine tödliche Erkrankung bei Kois und Karpfen. Um sichere und wirksame Lebendvirusimpfstoffe zu erhalten, haben wir Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von KHV erzeugt, aus deren Genom die für die beiden Nukleotidstoffwechselenzyme Thymidinkinase (TK, ORF55) und Desoxyuridin-Triphosphatase (DUT, ORF123) codierenden Leserahmen gezielt entfernt worden waren. Die Mutationen wurden durch homologe Rekombination in den zellkulturadaptierten aber noch virulenten Stamm KHV-T eingeführt. Umfangreiche in vitro Tests zeigten, dass die Deletion der TK- und DUT- Gene die KHV-Replikation in Zellkultur (CCB Zellen) nicht erkennbar beeinträchtigt. In vivo Tests an Jungkarpfen zeigten jedoch eine im Vergleich zum Ausgangsvirus signifikant reduzierte Virulenz der Einzelgen-Deletionsmutanten eine fast vollständige Attenuierung der Doppelmutante. Dennoch waren alle immunisierten Karpfen gegen eine letale Belastungsinfektion mit virulentem KHV geschützt. Mittels einer neu entwickelten Triplex-Real-Time-PCR und aus Kiementupferproben isolierter DNA war es möglich, mit TK-negativem KHV immunisierte und Wildtyp- infizierte Karpfen zu differenzieren. Daher könnte die Doppelmutante KHV- TΔDUT/TK als genetischer Marker-Impfstoff geeignet sein.
In einer zweiten Studie wurde die Funktion von vier immunogenen Hüllglykoproteinen der ORF25-Genfamilie (ORF25, ORF65, ORF148 und ORF149) von KHV untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass alle vier Gene für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Während die Deletion von ORF65 keinen erkennbaren Einfluss auf die Virusvermehrung hatte, führte die Deletion von ORF148 sogar zu einer leicht erhöhten Replikationsrate. Im Gegensatz dazu bewirkten Deletionen von ORF25 oder ORF149 einen verzögerten Eintritt in die Wirtszellen und damit auch eine verlangsamte Vermehrung und Ausbreitung der Viren. Interessanterweise führte die gemeinsame Deletion der Gene ORF148 und
ORF149 zu einem wildtypähnlichen Wachstumsverhalten, das auf gegensätzlicher Funktionen der beiden Proteine hindeutete. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von CCB-Zellen, die mit den verschiedenen Glykoproteindeletionsmutanten infiziert waren, zeigten keine Auswirkungen auf die Bildung und Reifung der Virionen im Zellkern oder im Zytoplasma, oder die Virusfreisetzung. Im Tierversuch erwiesen sich KHV-Mutanten mit Deletionen der Gene ORF148 und/oder ORF149 als geringfügig, aber für eine Verwendung als Lebendvirus-Impfstoff nicht ausreichend abgeschwächt. Überlebende Fische waren jedoch gegen Belastungsinfektionen ebenso gut geschützt wie Wildtyp-infizierte Karpfen, so dass die Deletion dieser antikörperinduzierenden Proteine zur Entwicklung von KHV-Markerimpfstoffen beitragen könnte, die eine serologische Differenzierung von Wildtyp-infizierten und geimpften Fischen erlauben (DIVA- Prinzip). In einer dritten Studie wurden durch serielle Zellkulturpassage von virulentem KHV und anschließende in vivo Infektionsversuche Hinweise darauf gefunden, dass das bislang nicht näher charakterisierte, neben dem ORF149 Gen lokalisierte ORF150 für einen weiteren Virulenzfaktor von KHV codiert. Möglicherweise könnte also durch eine kombinierte Deletion der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten KHV-Gene ein sicherer und wirksamer, genetisch und serologisch differenzierbarer Markerimpfstoff hergestellt werden.
Trotz der Verfügbarkeit von verschiedenen Impfstoffen zählen Influenza-A-Viren (IAV) nach wie vor zu den gefährlichsten humanpathogenen Krankheitserregern weltweit. Ebenso verursachen einige animale IAV-Stämme bei zahlreichen Wild- und Nutztierarten schwerwiegende und teilweise tödlich verlaufende Infektionen. Daher ist die Entwicklung moderner und effektiver Impfstoffe gegen IAV für die Tier- und Humanmedizin von größter Wichtigkeit. Im ersten Teil der Arbeit wurde auf Basis des IAV-Stamms A/Bayern/74/2009 (pH1N1) eine doppelt-attenuierte IAV-Mutante, genannt BY74-NS1-99-E, mit einem Elastase-sensitiven HA-Spaltmotiv und einer C-terminalen Verkürzung des Interferon-Antagonisten NS1 generiert und hinsichtlich ihrer Eignung als IAV-Lebendimpfstoff untersucht. In vitro zeigte sich BY74-NS1-99-E streng Elastase-abhängig und replizierte ausschließlich unter dessen Zugabe zu ähnlich hohen Titern wie der Wildtyp unter Zugabe von Trypsin. Aufgrund der geringen Elastase-Verfügbarkeit in vivo war die Mutante in ihrer Replikationsfähigkeit stark eingeschränkt und zeigte sich im Gegensatz zum Wildtyp sowohl im Mausmodell als auch im Schwein vollkommen apathogen. In der Maus führte die einmalige intranasale Applikation von BY74-NS1-99-E zu einer deutlichen Bildung von H1-spezifischen Serumantikörpern. Ihr Auftreten korrelierte mit dem Schutz der Mäuse gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen Wildtyp-Virus. Während eine singuläre Immunisierung mit einer Dosis von 106 TCID50 BY74-NS1-99-E komplett vor einer Replikation des homologen Belastungsvirus schützte, verhinderten Dosen ab 104 TCID50 die Ausbildung klinischer Symptome, einen Gewichtverlust und reduzierten die pulmonale Viruslast. Im Schwein erwies sich die Mutante als wenig immuogen. So ließ sich selbst nach zweifacher intranasaler Applikation mit der Mutante keine H1- oder NP- spezifische Antikörper-Antwort nachweisen. Um künftig leichter Fragen zum Zelltropismus und zur Virusausbreitung auch in Echtzeit sowohl in vitro als auch in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen des zweiten Teils der Arbeit ein replikationsfähiges IAV mit einem membranständigen eGFP generiert. Die Strategie zur Herstellung des rekombinanten, Fremdgen exprimierenden Virus, basierte auf einer Veröffentlichung von Gao et al. (2010), in welcher ein IAV mit einem zusätzlichen neunten Gen-Segment beschrieben wird. Bei den in vitro Untersuchungen zum Wachstumsverhalten der mittels reverser Genetik hergestellten Mutante BY74-eGFP, wurde eine im Vergleich zum parentalen Wildtyp verminderte Replikationseffizienz festgestellt. Genetisch zeigte sich BY74-eGFP weitgehend stabil. Die Ergebnisse der Western-Blots sowie die Immunfärbungen zur konfokalmikroskopischen Auswertung deuteten stark auf eine Inkorporation des NA-eGFP-Fusionsproteins in die virale Membran der Mutante hin. Ein solches Reportergen-exprimierendes Virus könnte zukünftig als molekulares Werkzeug bei der Untersuchung und Aufklärung der genauen Verläufe einer IAV-Infektion in vitro und in vivo dienen. Ziel des dritten Teils dieser Arbeit war es, auf Grundlage der Arbeiten von Gao et al. (2010) und Stech et al. (2005), ein Elastase-abhängiges IAV, welches zwei verschiedene Hämagglutinine (H1 und H3) exprimiert, zu generieren und auf seine Eignung als LAIV im Mausmodell zu untersuchen. Als Basis für das generierte Neunsegmentvirus BY74-H1H3-E diente der Stamm A/Bayern/74/09 (pH1N1). Das zusätzlich bereitgestellte neunte Gensegment codierte für das H3-HA des Stammes A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) (SB03). Bei den In-Vitro-Untersuchungen zur Expressions-Stabilität konnte zwar zunächst eine schwache H3-HA-Expression in den infizierten Zellen beobachtet werden, jedoch reduzierte sich diese von Passage zu Passage und verschwand letztendlich. Die Genomanalyse zeigte, dass das H3-tragende Gensegment letztlich verloren ging. Im Vergleich zum Wildtyp wies das potentielle Impfvirus in vitro eine stark verringerte Replikationsfähigkeit auf. Im Mausmodell erwies sich die BY74-H1H3-E-Mutante im Gegensatz zu A/Bayern/74/09 (pH1N1) und A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003 (H3N2) als vollkommen apathogen. Eine zweifache intranasale Immunisierung mit 103 TCID50 der dualen Virusmutante induzierte eine deutliche H1-spezifische und zum Teil eine moderate H3-spezifische Antikörper-Antwort. Sie schützte die Tiere bei einer homologen Belastungsinfektion BY74-Wildtyp (H1N1) komplett vor einem Gewichtsverlust und der Ausbildung klinischer Symptome. Bei einer heterosubtypischen Belastungsinfektion mit SB03-Wildtyp (H3N2) reduzierte sie den Gewichtsverlust und die klinischen Symptome. Die Doppelimmunisierung führte sowohl bei den Tieren, die einer homologen als auch bei den Tieren die einer heterologen Belastungsinfektion unterzogen worden waren zu einer Reduktion der pulmonalen Viruslast. Insgesamt erfüllte BY74-H1H3-E die Anforderungen eines potentiellen dualen LAIV-Kandidaten nur bedingt.
Infectious diseases remain a significant threat to the wellbeing of humans and animals
worldwide. Thus, infectious disease outbreaks should be investigated to understand the
emergence of these pathogens, leading to prevention and mitigation strategies for future
outbreaks. High-throughput sequencing (HTS) and bioinformatic analysis tools are reshaping
the surveillance of viral infectious diseases through genome-based outbreak investigations. In
particular, analyzing generic HTS datasets using a metagenomic analysis pipeline enable
simultaneous identification, characterization, and discovery of pathogens.
In this thesis, generic HTS datasets derived from the 2018-19 WNV epidemic and USUV
epizooty in Germany were evaluated using a unified pipeline for outbreak investigation and an
early warning system (EWS). This pipeline obtained 34 West Nile virus (WNV) whole-genome
sequences and detected several sequences of Usutu virus (USUV) and other potential
pathogens. A few WNV and USUV genome sequences were completed using targeted HTS
approaches. Phylogenetic and phylogeographic inferences, reconstructed using WNV wholegenome sequences, revealed that Germany experienced at least six WNV introduction events.
The majority of WNV German variants clustered into the so-called “Eastern German clade
(EGC),” consisting of variants derived from birds, mosquitoes, a horse, and human cases. The
progenitors of the EGC subclade probably circulated within Eastern Europe around 2011. These
flavivirus genome sequences also provided substantial evidence for the first reported cases of
WNV and USUV co-infection in birds. Phylogenetic inferences of USUV genome sequences
showed the further spread of the USUV lineage Africa 3 and might indicate the overwintering
of the USUV lineage Europe 2 in Germany. Among viral sequences reported in the EWS, Hedwig
virus (HEDV; a novel peribunyavirus) and Umatilla virus (UMAV; detected in Europe for the
first time) were investigated using genome characterization, molecular-based screening, and
virus cultivation since these viruses were suspected of causing co-infections in WNV-infected
birds. The EWS detected overall 8 HEDV-positive and 15 UMAV-positive birds in small sets of
samples, and UMAV could be propagated in a mosquito cell culture Future studies are necessary
to investigate the pathogenicity of these viruses and their role in the health of wild and captive
birds.
In conclusion, this study provided a proof-of-concept that the developed unified and
generic pipeline is an effective tool for outbreak investigation and pathogen discovery using the
same generic HTS datasets derived from outbreak and surveillance samples. Therefore, this
thesis recommends incorporating the unified pipeline in the key response to viral outbreaks to
enhance outbreak preparedness and response.
Phenolics and its derivatives are aromatic compounds with a wide range of industrial applications. Gallic acid, protocatechuic acid, catechol or pyrogallol are only a few examples of industrially relevant aromatics. The production of bulk fine chemicals primarily for chemical and pharmaceutical industry has put a strong emphasis on optimizing manufacturing conditions. Commercial production of many chemicals is still based on organic chemical synthesis using petroleum derivatives as starting material. Since these processes are considered environmentally unfriendly and posing an irresponsible strain on limited fossil resources, much attention is paid to the development of new microbial factories for the bioproduction of industrially relevant chemicals using renewable sources or organic pollutants as starting material. Arxula adeninivoras is a non-conventional yeast possessing attractive properties for industrial application such as thermo- and osmotolerance. Another major advantage of this organism is its broad substrate spectrum with tannin at the forefront. The present project is dedicated to the study of the tannic acid degradation pathway in A. adeninivorans. Two genes encoding enzymes annotated as gallic acid decarboxylase (AGDC1) and catechol-1,2-dioxygenase (ACDO1) have been selected and investigated. Both enzymes were characterized and their function in tannin catabolism analyzed.
Primary producers, alongside heterotrophic bacteria and viruses, modulate the essential global carbon cycle. About half of the Earth’s net primary production originates in the marine environment. By effecting these systems and the burial of carbon, bacteria play a significant role in the world’s climate, especially with regard to rising temperatures and increasing anthropogenic carbon dioxide production.
Particles present substrate-rich niches for particle-associated bacteria, but are rare in the marine system. Particle-associated bacteria, comprising of chemotactic motile free-living and particle-attached bacteria, were shown to have higher respiration rates, were larger in cell and genome size and showed a higher hydrolytic activity of extracellular enzymes compared to the free-living fraction.
Understanding the contribution of particle-associated bacteria to the degradation of algal biomass is essential to understand the marine carbon cycle. However, the identification of this group is difficult and required refinement.
Sequential filtration, the most commonly used technique for the separation of bacterial fractions, provides only access to a part of the particle-associated microbiome, and includes with large and clustered bacteria undesired false-positives. To overcome these limitations, separation by gravity in Imhoff sedimentation cones was explored in this thesis to access, identify and define particle-associated microbiomes, in comparison and conjunction with the established separation techniques like sequential filtration and centrifugation.
The cultivability on agar plates was assessed, aiming at the question which portion of the colony-forming bacteria belong to free-living non-motile or motile bacteria or to particle-attached bacteria. As continuous cultivation on plates often involves loss of cultures, colonies of the original plate were used to obtain partial 16S rRNA sequences of individual colonies and of plate microbiomes.
For future studies on particle-associated bacteria, a representative strain collection was established from particle-attached bacteria retained on 3 μm filters and from particle-associated bacteria collected together with settled algae in sedimentation cones.
To understand the contribution of top-down selection to a yearly recurring bacterioplankton bloom at our sampling site Helgoland, particle-associated strains were included in isolation experiments for flavophages, since Flavobacteriia are among the most important responder to the yearly observed blooms.
Overall, this thesis provides new insights into the isolation and cultivation of particle-associated bacteria – an important, but currently not fully understood fraction of organisms within the marine system.
Hepeviruses are small viruses with a RNA-genome of positive polarity that form the family Hepeviridae. The family includes two genera: members of the genus Piscihepevirus were detected in fish species and members of the genus Orthohepevirus were found in different mammal and bird species. The genus Orthohepevirus contains four different species, namely Orthohepevirus A, B, C and D. The species Orthohepevirus A contains five human pathogenic genotypes, with three of them being zoonotic. The species Orthohepevirus C contains mammal-associated pathogens, which were identified in rats and carnivores. The human pathogenic genotypes are responsible for a self-limiting acute hepatitis in humans, which could become chronically in immunocompromised individuals. The main route of transmission is the consumption of undercooked meat and direct contact with HEV-positive excreta or blood. In Germany, hepatitis E is a notifiable disease since 2001 with an increased number of cases per year. Rats are the reservoir of rat-associated HEV (ratHEV), but also the zoonotic HEV-3 genotype was detected in rats. The European rabbit (Oryctolagus cuniculus) was identified as a reservoir host of a subgenotype of human pathogenic HEV-3 (HEV-3ra).
For the development of small mammal animal models, the objective of this study was to evaluate different small mammal populations for novel hepeviruses and to study the presence of HEV and sequence divergence of ratHEV and rabbitHEV in rat and rabbit populations from Europe.
Approximately 3000 rodents from Germany and the Czech Republic were screened by broad spectrum HEV-RT-PCR. As a result, 13 common voles (Microtus arvalis) and one bank vole (Myodes glareolus) were detected to be HEV-RNA positive. Comparison of the obtained sequences, complete genome determination and phylogenetic analysis indicated the finding of a novel common vole-associated HEV (cvHEV), which shows a high sequence divergence towards other members of the species Orthohepevirus C, but shares a high sequence similarity to a HEV-genome derived from a kestrel (Falco tinnunculus). The finding of cvHEV-RNA in a bank vole might be caused by a spillover infection. The cvHEV genome shares the hepevirus-typical open reading frames, but also has unique cvHEV-specific attributes in its genome.
The investigation of 420 Norway rats (Rattus norvegicus) and 88 Black rats (Rattus rattus) identified HEV-RNA in Norway rats from eight of nine and Black rats from two of four European countries. In a single Norway rat from Belgium, a HEV-3-strain with high sequence similarities to rabbitHEV (HEV-3ra), was detected. The investigation of zoo animals revealed a ratHEV spillover infection in a Syrian brown bear (Ursus arctos syriacus). This infection was most likely caused by ratHEV-infected free-living, wild rats from the same zoo.
Investigation of wild rabbit populations trapped in and around Frankfurt am Main, Germany, showed anti-HEV antibodies (34.7%) and rabbitHEV-RNA (25%). A high sequence similarity of rabbitHEV in the animals trapped at the urban site was observed, whereas a high sequence divergence was seen for the animals trapped at the rural trapping sites.
In conclusion, hepeviruses are widespread among different small mammal populations in Europe. The broad geographical distribution of these hepeviruses should be taken into account in further public health risk assessments. Further investigations are needed to characterize the presence of cvHEV in more detail, especially by taking the population dynamics of common voles into account. The detected HEV-strains could be taken as basis for the establishment of novel HEV-animal models, which might replace the so far used swine and non-human primate models.
Herpesviruses are a fascinating group of enveloped DNA viruses, which rely on membrane fusion for infectious entry and direct cell-to-cell spread. Compared with many other enveloped viruses, they utilize a remarkably complex fusion machinery. Three conserved virion proteins, the bona fide fusion protein gB, and the presumably gB activating gH/gL heterodimer constitute the conserved core fusion machinery and are believed to drive membrane fusion in a cascade-like fashion. Activation of this cascade in most alphaherpesviruses is proposed to be triggered by binding of gD to specific host cell receptors. The molecular details of this fusion process, however, remain largely elusive. Yet, a detailed mechanistic knowledge of this process would be greatly beneficial for the development of efficient countermeasures against a variety of diseases. In this thesis, the functional relevance of individual components of the essential gH/gL complex of the alphaherpesvirus PrV has been assessed by two different approaches: by reversion analysis (paper II) and site-directed mutagenesis (papers III-V). In contrast to other herpesviruses, gL-deleted PrV is able to perform limited cell-to-cell spread, providing the unique opportunity to passage the entry-deficient virus in cell culture to select for PrV revertants capable of infecting cells gL-independently. This approach already resulted in an infectious gL-negative PrV mutant (PrV-ΔgLPass), in which the function of gL was compensated by formation of a gDgH hybrid protein. Here, the requirements for gL-independent infectivity of a second independent revertant (PrV-ΔgLPassB4.1), were analyzed. Sequencing of the genes encoding for gB, gH and gD, revealed mutations in each of them. By means of a robust infection-free, transfection-based cell-cell fusion assay (paper I), we identified two amino acid substitutions in the gL-binding domain I of gHB4.1 (L70P, W103R) as sufficient to compensate for lack of gL. Two mutations in gB (G672R, ΔK883) were found to enhance fusogenicity, probably by lowering the energy, required for gB refolding from pre- to postfusion conformation. Coexpression of gHB4.1 and gBB4.1 led to an excess fusion, which was completely suppressed by gDB4.1 in the fusion assays. This was surprising since PrV gD is normally not required for in vitro fusion or direct viral cell-to-cell spread, clearly separating this process from fusion during entry, for which PrV gD is essential. The fusion inhibiting effect of gDB4.1 could be attributed to a single point mutation resulting in an amino acid substitution within the ectodomain (A106V). In conclusion, these results indicated that gL is not central to the fusion process, as its function can be compensated for. As found so far, gL-independent infectivity can be realized by compensatory mutations in gH (as in PrV-ΔgLPass) or in gH plus gB (as in PrV-ΔgLPassB4.1). Excessive fusion induced by gHB4.1 and gBB4.1 was counter-regulated by gDB4.1, indicating that the interplay between these proteins is precisely regulated and further implies that gL and gD, despite being not absolutely essential for the fusion process, have important regulatory functions on gH and/or gB.
Both PrV-ΔgLPass mutants had acquired compensatory mutations in gH affecting the predicted gL-binding domain I in gH. By construction of an artificial gH32/98, which lacked the predicted gL-binding domain and was similar to the recently crystallized gH-core fragment present in the gDgH hybrid protein, we identified the N-terminal part of PrV gH as essential for gH function during fusion (paper III). gH32/98 was unable to promote fusion of wild-type gB in fusion assays and led to a total loss of function in the viral context. These results indicated that the gD moiety, present in gDgH, is critical for proper function of the gH-core fragment. We hypothesize that the gD moiety may adopt a stabilizing or modulating influence on the gH structure, which is normally executed by gL and important for interaction of gH with wild-type gB. Remarkably, substitution of wild-type gB by gBB4.1 rescued function of gH32/98 in the cellular and viral contexts. These findings suggest that gBB4.1 has been selected for interaction with “gL-less” gH. In conclusion, these results demonstrated that gL and the gL-binding domain are not strictly required for membrane fusion during virus entry and spread but that compensatory mutations must be present in gB to restore a fully functional fusion machinery. These results strongly support the notion of a functional gH-gB interaction as a prerequisite for membrane fusion.
In addition to the N-terminal domain, we identified the transmembrane domain of PrV gH as an essential component of the fusion machinery, while the cytoplasmic domain was demonstrated to play a modulatory but nonessential role (paper IV). Whereas truncation or substitution of the PrV gH TMD by a gpi-anchor or the analogous sequence from PrV gD rendered gH non-functional, the HSV-1 gH TMD was found to functionally substitute for the PrV gH TMD in cell-cell fusion and complementation assays. Since residues in the TMD which are conserved between HSV and PrV gH but absent in PrV gD, are placed on one face of an α-helical wheel plot, we hypothesize that the gH TMD has an intrinsic property to interact with membrane components such as lipids or other molecules as a requirement for promoting membrane fusion.
In a final study focusing on the function of gH, we identified the N-glycosylation sites utilized by PrV gH, and determined their individual role in viral infection (paper V). PrV gH was found to be modified by N-glycans at five potential glycosylation sites. N-glycans at PrV specific N77 and the highly conserved site N627 were found to be critical for efficient membrane fusion in the fusion assays, and during viral entry and cell-to-cell spread. N627 was further shown to be crucial for proper gH transport and maturation. In contrast, inactivation of N604, conserved in the Varicellovirus genus, enhanced in vitro fusion activity and viral cell-to-cell spread. These findings demonstrated a role of the N-glycans in proper localization and function of PrV gH.
Wie andere Vertreter der Paramyxoviridae vergrößert das NDV durch Editierung von Transkripten seine Kodierungskapazität. Durch co-transkriptionelle mRNA-Editierung kodiert das P-Gen beim NDV sowohl für das P-, das V-, als auch das W-Protein. Die drei Proteine gleichen sich N-terminal, wohingegen die C-Termini in Länge und AS-Zusammensetzung variieren. Während sowohl Expression als auch Inkorporation des P- und V-Proteins in das NDV-Partikel nachgewiesen wurde, gab es bisher keinen Beweis für die Existenz des W-Proteins.
Für den Nachweis der Expression des NDV W-Proteins wurden W-spezifische Seren auf Grundlage von Peptiden generiert, welche im spezifischen C-Terminus lokalisiert waren und vorhersagbare antigene Regionen beinhalteten. Je eines der Kaninchenseren ermöglichte die Detektion von Plasmid-exprimiertem NDV W-Protein, sowie W-Protein in infizierten Zellen mittels indirekter IF und WB-Analyse.
Eine Inkorporation des W-Proteins in NDV-Virionen deuteten WB- und massen-spektrometrische Analysen an, während die Abwesenheit des Proteins für rekombinante NDV deren W-Protein Expression durch unterschiedliche Mutations-ansätze unterbunden wurde, in infizierten Zellen und Viruspartikeln bestätigt werden konnte.
Untersuchungen infizierter Zellen mit Hilfe konfokaler Mikroskopie zeigten eine Akkumulation des W-Proteins im Zellkern. Diese Lokalisation wurde auf eine zweigliedrige NLS im spezifischen C-Terminus zurückgeführt und die Funktionalität der NLS anhand der zytoplasmatischen Verteilung des Proteins in transfizierten bzw. infizierten Zellen nach Mutation der zwei basischen Cluster bestätigt.
Vergleichende Untersuchungen rekombinanter und WT-NDV zeigten keinen Einfluss der NLS bzw. der Expression des W-Proteins auf die Virusreplikation in vitro.
Bei der Analyse wirtsspezifischer, IFN-antagonistischer Funktionen des NDV W-Proteins in der späten Phase der Typ-I-IFN-Antwort mit Hilfe eines Hühnerzell-basierten IFN signaling Assays konnte sowohl für das W-Protein eines lentogenen (NDV Cl30), als auch eines velogenen NDV-Stammes (NDV Herts_I) kein inhibierender Effekt auf den untersuchten Signalweg gezeigt werden. Stattdessen deutete sich für das NDV Cl30 W-Protein ein aktivierender Effekt an.
Sequenzanalysen zur Vorhersagbarkeit von W-Proteinen bzw. C-terminal kodierten NLS in NDV-Stämme unterschiedlicher Virulenz und Genotypen ließen keinen Rückschluss auf einen Einfluss des W-Proteins auf die Pathogenität von NDV zu.
Im Gegensatz zum W-Protein war die Expression des NDV V-Proteins essentiell für die Replikation von NDV in vitro und in ovo.
Für die Analyse des Einflusses von V-Proteinen unterschiedlicher Herkunft auf die Replikation eines lentogenen NDV in vitro wurden diese in verschiedenen rekombinanten Viren von einem zusätzlich inserierten ORF exprimiert und die Expression der homo- und heterologen V-Proteine durch stammspezifische Seren überprüft, wofür im Vorfeld ein NDV R75/95 V-spezifisches Peptidserum generiert wurde. Keines dieser rekombinanten Viren zeigte Replikationsvorteile in vitro im Vergleich zum parentalen Virus.
Ein Hinweis auf einen Einfluss der Herkunft des V-Proteins konnte mit Hilfe des Hühnerzell-IFN signaling Assays erhalten werden. Während das V-Protein eines lentogenen NDV (NDV Cl30) keinen inhibierenden Effekt zeigte, deutete sich ein leicht inhibierender Effekt für das velogene NDV Herts_I V-Protein in einer Zelllinie an.
Pilotstudien zur potenziellen IFN-antagonistischen Funktion des V-Proteins wurden nach vorheriger Transfektion und Überexpression von V-Proteinen unterschiedlicher Pathotypen bzw. nach Vorbehandlung von Zellen mit Hühner-IFN-α vor Infektion durchgeführt. Die Replikation des korrespondierenden WT-Viruses bzw. rekombinanten Virus mit homo- oder heterologer V-Proteinexpression war in vitro in beiden Fällen nicht verändert.
Die nicht-konventionelle, dimorphe, asexuelle und hemiascomycetale Hefe Blastobotrys (Arxula) adeninivorans wurde in den letzten Jahren in vielfältiger Weise eingesetzt und zahlreichen interessanten biotechnologischen Anwendungen unterzogen. Ein herausragendes Merkmal dieser Hefe ist das breite Substratspektrum, welches eine Vielzahl an Zuckern, Alkoholen sowie Purinen und Alkanen umfasst. In Folge der Genomsequenzierung des Stammes A. adeninivorans LS3 wurden drei putative Cutinase-Gene identifiziert. Cutinasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage sind, Cutin der pflanzlichen Cuticula abzubauen. Dies ermöglicht es beispielsweise pflanzenpathogenen Pilzen wie Fusarium solani f. sp. pisi, die durch Cutin geschützten Bereiche zu penetrieren, um in die Wirtspflanze einzudringen. Trotz der Isolation von A. adeninivorans Stämmen aus Holzhydrolysat in Sibirien sowie humusreichen Böden wurde diese Hefe bisher nicht als pflanzenpathogen beschrieben. Auch das Vorhandensein von Cutinasen oder Cutinase-ähnlichen Enzymen blieb bisher gänzlich unbemerkt. Cutinasen sind für ein breites Spektrum an technischen Anwendungen zum Beispiel im Bereich des Abbaus und des Recyclings von bioabbaubaren Kunststoffen interessant. Aus diesem Grund wurden die drei Gene ACUT1, ACUT2 und ACUT3 aus dem Genom von A. adeninivorans LS3 isoliert. Mittels Homologie-Modellierung und Sequenzvergleich mit bekannten und charakterisierten Cutinasen konnten die α/β-Hydrolase Struktur, die katalytisch aktive S-D-H Triade mit dem in das G-Y-S-Q-G Motiv eingebetteten nucleophilen Serin, die Substratbindeschleife sowie die sogenannte „Flap-Helix“ identifiziert werden. Außerdem wies Acut3p eine einzigartige C-terminale Glycin-Threonin-Serin reiche Sequenz (GTS-Sequenz) auf, die unabhängig von der katalytisch aktiven Domäne gefaltet ist. Unter Verwendung des Xplor®2 Transformations/Expressionssystems wurden rekombinante Varianten der drei putativen Cutinasen Acut1-6hp, Acut2-6hp und Acut3-6hp mit A. adeninivorans G1212 synthetisiert, im Kulturüberstand lokalisiert sowie über den 6xHistidin-Tag gereinigt. Die anschließende biochemische Charakterisierung ergab ein nahezu uniformes Verhalten bezüglich pH-Optimum (pH 5,0 – 5,5) und Temperatur-Optimum (20 – 30 °C). Darüber hinaus wurde eine Instabilität der drei Cutinasen unter optimalen pH Bedingungen festgestellt. Diese konnte jedoch durch Zugabe von Osmolyten wie PEG200 vollständig behoben werden. Das Substratspektrum wurde als entscheidender Parameter für die Einordnung der putativen Arxula-Cutinasen untersucht. Die höchste Aktivität bei Substraten mit vier bis acht C-Atomen in der Acylkette entsprach dem Verhalten bereits bekannter Cutinasen. Weiterhin konnte der Abbau des Modellpolyesters Polycaprolacton sowie die Degradation von Apfelcutin erfolgreich durchgeführt werden, womit A. adeninivorans LS3 die erste ascomycetale Hefe mit nachgewiesenen cutinolytischen Enzymen ist. Zusätzlich konnte die im Vergleich zu Acut1-6hp und Acut2-6hp erhöhte Temperaturstabilität von Acut3-6hp auf die GTS-Sequenz zurückgeführt werden. Als mögliche Ursache für diesen Effekt wurde eine starke Glykosylierung der GTS-Sequenz angenommen. Durch Übertragung der GTS-Sequenz auf Acut1-6hp konnte die Temperaturstabilität dieses Enzyms erhöht werden. Eine Übertragung auf die bereits stark glykosylierte Tannase 1 führte dagegen nicht zu einer Erhöhung der Stabilität gegenüber der Temperatur. Weiterhin wurden in zwei verschiedenen Fermentationsverfahren mit Fed-Batch-Betriebsweise bis zu 1.000.000 U L-1 (Acut2-6hp) im Medium akkumuliert. Dies stellte bereits einen ersten Hinweis auf das Potenzial für eine Anwendung im technischen Bereich dar. Dieses Potenzial konnte durch den erfolgreichen Abbau von Polyestern wie Polycaprolacton, Polybutylensuccinat, Polylactid, Poly[3-Hydroxybutyrat] sowie Poly[3-Hydroxybutyrat-Co-3-Hydroxyvalerat] verstärkt werden. In weiteren Schritten müssen nun konkrete Anwendungsfelder für die in dieser Arbeit untersuchten Arxula-Cutinasen erschlossen werden. Der Abbau von real anfallenden Kunststoffabfällen aus bioabbaubaren und nicht-abbaubaren Folien oder Behältern sowie die Rückgewinnung der aus der Hydrolyse erhaltenen Monomere sollten dabei überprüft werden. Auf der anderen Seite wäre eine Anpassung der Kultivierungsmedien für die Gewinnung der Cutinasen im Pilot-Maßstab angebracht, um eine Produktionskostenreduktion zu erreichen.
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Interaktion der Rabiesvirus Polymerase L und des Hendravirus Matrixproteins M mit zellulären Proteinen und intrazellulären Strukturen durchgeführt. Mit ASS1 und DLC1 wurden zwei zelluläre Proteine identifiziert, die direkt oder indirekt mit der Rabiesvirus Polymerase L interagieren. Zellkulturuntersuchungen zum Einfluss von ASS1 auf die Rabiesvirus Replikation lieferten bisher keinen Hinweis auf eine Beeinflussung der Polymerasefunktionen und die Diskussion möglicher Mechanismen einer Interferenz mit der NO-Synthese in infizierten Organismen blieb spekulativ. Für DLC1 wurde erstmals gezeigt, dass das L Protein des Rabiesvirus ein Konsensusmotiv für die Bindung von DLC1 enthält und die Effizienz der viralen Primärtranskription durch die Anwesenheit dieses Motivs beeinflusst wird. Vergleichende Untersuchungen mit Virusmutanten, in denen das in L identifizierte Motiv und ein bereits beschriebenes DLC1-bindendes Motiv in P mutiert waren, zeigten, dass beide Motive in vergleichbarer Weise die virale Primärtranskription beeinflussen. Die Kombination entsprechender Mutationen hatte jedoch keinen additiven Effekt auf die Polymeraseaktivität. Für die Funktionalität des Rabiesvirus Polymerasekomplexes P/L im Rahmen der viralen Primärtranskription scheint eine Interaktion mit beiden Komponenten des Komplexes erforderlich zu sein. Quantitative Analysen zur Verteilung von in die Zelle eingedrungenen Viruspartikeln zeigten, dass eine Akkumulierung viraler Ribonukleoproteine (RNP) nur in Anwesenheit des DLC1 Motivs in P erfolgte, und dass dies unabhängig von Mutationen in L war. Dies deutete darauf hin, dass die P-abhängige Akkumulierung von RNPs in frühen Phasen der Virusinfektion und die P und L abhängige Steigerung der Primärtranskription zwei funktionell voneinander trennbare Prozesse sind. Neben der DLC1 abhängigen Regulation der viralen Primärtranskription zeigten Untersuchungen zur Regulation der DLC1 Mengen in virusinfizierten Zellkulturen, dass die zelluläre DLC1 Genexpression durch die Anwesenheit der DLC1 Motive in P und in L reguliert wird. Diese Erkenntnisse und neuere Erkenntnisse zur Autoregulation der DLC1 Genexpression zeigen, dass die Bindung von DLC1 an beide Proteine des P/L Polymerasekomplexes, sowie die Retention von DLC1 in viralen Inclusion Bodies vermutlich die Verfügbarkeit an freiem DLC1 limitiert, und damit eine DLC1 abhängige Inhibition des DLC1 Genexpression regulierenden Transkriptionsfaktors ASCIZ aufhebt. Inwieweit dieses Modell einer virusabhängigen DLC1 Regulation zutrifft, weitere über einen derartigen Mechanismus regulierte Zellgene betroffen sind und diese einen Einfluss auf die Virusreplikation haben, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Darüber hinaus wurde mittels Fluoreszenzprotein-markiertem L von Rabies- und verwandten Lyssaviren erstmals gezeigt, dass die virale Polymerase an Mikrotubuli akkumuliert und diese reorganisiert. Die Abhängigkeit der Mikrotubuli-Lokalisation von einem intakten DLC1 Motiv in L deutete darauf hin, dass DLC1 ein Faktor bei der Rekrutierung von L an die Mikrotubuli ist. Auch für das Hendravirus M-Protein wurden mittels Affinitätschromatographie und Analyse von M haltigen Proteinkomplexen potentielle Interaktionspartner identifiziert. Dabei zeigte sich, dass nukleäres ANP32B Hendravirus M entweder direkt oder indirekt bindet. Aufgrund einer ANP32B-abhängigen Kernretention von M und der hier gezeigten Analysen zur Interaktion dieser Proteine, kann davon ausgegangen werden, dass ANP32B eine nukleäre Zielstruktur für das Hendravirus M darstellt. Ebenso kann davon ausgegangen werden, dass die Interaktion entweder direkt die Virusreplikation oder pro oder antiviral wirkende Mechanismen der Wirtszelle beeinflusst. Im Hinblick auf Funktionen von ANP32B beim Crm1 vermittelten Kernexport von mRNAs, der Regulation der zellulären Genexpression und der Apoptoseregulation erscheint eine weiterführende funktionelle Charakterisierung der entsprechenden ANP32B abhängigen Mechanismen sinnvoll. Auch wenn die Rolle von ANP32B im Replikationszyklus von Hendraviren noch nicht geklärt ist, zeigten Untersuchungen mit M Proteinen anderer Paramyxoviren (Newcastle Disease Virus und Bovines Respiratorisches Synzytialvirus), dass die Interaktion mit ANP32B in mindestens zwei unterschiedlichen Virusgattungen innerhalb der Unterfamilie der Paramyxovirinae konserviert ist. Daher wird angenommen, dass die Interaktion mit ANP32B Teil eines bei Paramyxoviren konservierten Mechanismus ist. Zusammenfassend wurde mit den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung von wirtszellabhängigen Funktionen viraler Proteine geleistet. Mit der Identifizierung von zellulären Zielproteinen der Rabiesvirus Polymerase und paramyxoviraler Matrixproteine wurde eine wichtige Grundlage für weiterführende Arbeiten zu den involvierten molekularen Mechanismen und deren Relevanz im infizierten Wirt geschaffen.
Die reverse Genetik ist ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung und Impfstoffentwicklung der Influenza-A- und -B-Viren. Oft ist der limitierende Schritt für die Erstellung eines solchen Systems der reversen Genetik, bestehend aus mehreren Plasmiden für die einzelnen Gensegmente, die Klonierung der Virusgene in den Expressionsvektor. Für eine schnellere und einfachere Klonierung wurde in dieser Arbeit das LacZa-Fragment mittels modifizierter QuikChange-Reaktion in den Klonierungsvektor pHWSccdB inseriert. Mit dem so entstandenen Vektor pHWSccdBLacZa ist es nun möglich, zusätzlich eine Blau/Weiß-Selektion durchzuführen. Beider target-primed plasmid amplification zur Insertion des viralen Gensegmentes werden hierbei die beiden Selektionsmarker ccdB und LacZa durch das virale Gen ersetzt. Bakterienkolonien mit kloniertem Gensegment können von denen ohne komplettes Insert nun leichter und frühzeitiger durch eine nicht vorhandene Blaufärbung unterschieden werden. Schweine spielen in der Influenzavirus-Transmission eine besondere Rolle, da sie als sog. „mixing vessel“ gelten. Sie können z. B. Reassortanten aus aviären und porzinen Influenzaviren auf den Menschen übertragen, die sich bei einer zeitgleichen Infektion mit beiden Viren im Schwein bilden können. In dieser Arbeit wurden die seit 1979 in Europa zirkulierenden aviären H1N1- Schweineviren betrachtet. Sie sind Schweinestämme, deren Gene von einem aviären Vorläufervirus abstammen. Unter dem Ziel der Untersuchung der molekularen Determinanten des Wirts-Tropismus dieser aviären H1N1-Schweineviren wurden Reassortanten und Zufallsressortanten hergestellt unter Verwendung des aviären Virus A/Duck/Bavaria/1/77 (H1N1) (DkBav) und des aviären Schweinevirus A/Swine/Belgium/1/79 (H1N1) (SwBelg). Zunächst wurde die Replikationseffizienz von DkBav, SwBelg und den hergestellten Reassortanten auf einer aviären und einer porzinen Zelllinie untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass für das aviäre Virus DkBav das HA von SwBelg ausreicht, um in porzinen Zellen das Wachstumsniveau von SwBelg zu erreichen. Das HA-Segment ist also entscheidend für den Wirtstropismus von DkBav in einer porzinen Zelllinie. Experimente im Schwein zeigten jedoch, dass DkBav nicht alleine durch das HA von SwBelg zu einem Schweinevirus wird. Für diese Experimente wurden Schweine intranasal mit den hergestellten Viren, SwBelg und DkBav infiziert. Um die Replikation im Schwein zu steigern, benötigt DkBav zusätzlich zum HA noch das NA von SwBelg und für die Transmission von Schwein zu Schwein das NP sowie eines oder mehrere der anderen Gensegmente von SwBelg. Für eine starke Virusvermehrung in der Lunge benötigt DkBav den Polymerasekomplex, HA und NA von SwBelg. Für die Transformation in ein Schweinevirus benötigt DkBav also kein bestimmtes Gensegment, sondern eine Kombination mehrerer Gensegmente. Für hochpathogene aviäre Influenzaviren ist die polybasische Spaltstelle des Oberflächenproteins HA der wichtigste Virulenzfaktor. Das HA ist u. a. für die Bindung und die Fusion der Endosomenmembran von Influenzaviren mit der Wirtszelle zuständig. Da eine polybasische HA-Spaltstelle alleine jedoch nicht ausreicht, um die Virulenz eines LPAIV deutlich zu erhöhen, wurde in dieser Arbeit nach weiteren Virulenzdeterminanten im HA des hochpathogenen Influenzavirus A/Swan/Germany/R65/2006 (H5N1) (R65wt) zusätzlich zur polybasischen Spaltstelle gesucht. Hierzu wurden von den Viren R65wt und A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) mit eingesetzter polybasischer Spaltstelle (TG05poly) verschiedene HA-Chimären und -Mutanten hergestellt und diese in vitro und in vivo untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die eingefügten Mutationen nicht ausreichten, um TG05poly zu einem hochpathogenen Virus zu machen. Für das hochpathogene Virus R65wt wurden die Aminosäuren HA-R123 und HAI124 als weitere Virulenzdeterminanten identifiziert. Bei HA-Sequenz- und HAStrukturanalysen wurde festgestellt, dass die Aminosäuren HA-123 und HA-124 innerhalb des niedrigpathogenen bzw. des hochpathogenen Phänotyps hoch konserviert vorliegen. Mutationen an diesen Positionen verringern nicht nur HA-Aktivierungs-pH und Virus-Inaktivierungs-pH deutlich, sondern auch die Letalität des Virus um fast 50 % (HA-I124T) oder das Virus wurde sogar avirulent (HA-R123S). Im Falle einer polybasischen Spaltstelle ist also eine erhöhte pH-Stabilität des HA vermittelt durch die Aminosäure R123 essentiell für die Entstehung eines hochpathogenen aviären H5N1-Virus aus einem niedrigpathogenen Vorläufer.
The order of bats (Chiroptera) account for ~20% of all mammalian species and attracted immense global attention due to their identification as important viral reservoir. Bats can harbour a plethora of high-impact zoonotic viruses, such as filoviruses, lyssaviruses, and coronaviruses without displaying clinical signs of disease themselves. Given this striking diversity of the bat virome, their ability of self-powered flight, and global distribution, understanding chiropteran immunity is essential to facilitate assessment of future spillover events and risks.
However, scarcity of bat-specific or cross-reactive tools and standardized model systems impede progress until today. Furthermore, the richness of species led to generation of isolated datasets, hampering data interpretation and identification of general immune mechanisms, applicable for various chiropteran suborders/families. The key to unlocking bat immunity are coordinated research approaches that comprehensively define immunity in several species. In this work, an in-depth study of innate and adaptive immune mechanisms in the fructivorous Egyptian Rousette bat (Rousettus aegyptiacus, ERB) is presented.
Detailed stability analyses identified EEF1A1 as superior reference gene to ACTB, and GAPDH, which rendered unstable upon temperature increase or presence of type-I-IFN. Since the body core temperatures of pteropid bats reach from 35°C to 41°C and it has been postulated that bats display constitutive expression of IFNs, a suitable reference gene has to be stable under these physiologically relevant conditions. To study cellular innate immunity in detail, cell lines from the nasal epithelium, the olfactory compartment and the cerebrum were generated. To include immune responses of epithelia cells, essential for immunity at sites of primary viral infection, primary epithelia cells from the nasal epithelium, trachea, lung and small intestine were generated. Cellular identities were determined by comprehensive analyses of transcripts and proteins expressed by each cell line. The capacity of each cell line to produce type-I- and III-IFNs was assessed at 37°C and 40°C upon stimulation with viral mimetics. This revealed cell type-dependent differences is the capability to express IFNs upon stimulation. Furthermore, the constitutive expression of type-I- and III-IFNs was significantly elevated in higher temperatures and quantified at mRNA copy levels. To characterize ERB innate immunity upon infection with high-impact zoonotic viruses, cells from the nasal epithelium, the olfactory system, and the brain were infected with several lyssaviruses. This revealed striking differences in susceptibility: cells from the nasal epithelium rendered least whereas cells from the olfactory epithelium rendered most susceptible to viral infection and replication. Additionally, due to a lack of IFN expression in infected cells, it could be shown that LBV possibly possesses advanced strategies to ensure successful replication in ERB cells. Since the current SARS-CoV-2 pandemic put bats even further in the focus of zoonotic research, primary epithelial cells and animals were infected with this virus to monitor ERB-specific immune transcripts in cells and tissues. These studies revealed a notably early IFNG expression in the respiratory tract of infected individuals.
To understand immunomaturation in bats, the immune cell landscape in periphery and various tissue in adult and juvenile ERB was analyzed by flow cytometry and scRNA-seq, revealing intriguing, age-dependent variations in the abundance of granulocytes and lymphocytes. Flow cytometry revealed a significantly higher number of granulocytes in adults, as well as higher numbers of B cells in juveniles. scRNA-seq allowed detailed identification of different leukocyte subsets, uncovering the presence of highly-abundant NKT-like cells and a unique PLAC8 expressing B cell population. A functional characterization of phagocytic cells and lymphocytes derived from adult and juvenile ERB revealed no significant differences in cellular functionality.
In conclusion, the presented work demonstrated suitability of all established ERB cell lines to study bat immunity in vitro, which led to striking findings regarding IFN expression at steady state, or upon stimulation or viral infection. In addition, established qRT-PCR protocols allowed definition of constitutive and temperature-dependent elevation of IFN expression magnitudes, as well as insights into expression of immune-related transcripts in SARS-CoV-2 infected ERB. Finally, based on optimized scRNA-seq technologies and flow cytometry, frequencies and absolute cell counts could be determined in ERB of different ages, revealing e.g. age-dependent variations in leukocyte profile compositions.
Die Newcastle Disease (ND) und die hochpathogene aviäre Influenza (HPAI) sind zwei der bedeutendsten Viruserkrankungen des Geflügels. Neben hohen wirtschaftlichen Verlusten stellt besonders das zoonotische Potential des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) auch eine Gefahr für den Menschen dar. Eine erfolgreiche Prophylaxe erfordert effektive Impfstoffe, die hohe Anforderungen wie die Verträglichkeit in sehr jungen Tieren, Massenapplizierbarkeit, eine sichere und kostengünstige Produktion sowie die Möglichkeit der Differenzierung zwischen infiziertem und vakziniertem Geflügel (DIVA) erfüllen müssen. Replikationsfähige Vektorviren sind dafür besonders geeignet. Mit Hilfe des reversen genetischen Systems konnte ein rekombinantes Newcastle Disease Virus (NDV) generiert werden, welches das Hämagglutinin H5 eines HPAIV exprimiert (rNDVH5Vm). Dieses vermittelt in SPF-Hühnern nach Immunisierung einen bivalenten Schutz vor HPAI und ND, versagt jedoch als Vakzine in Geflügel mit maternalen NDV-Antikörpern (Veits, Wiesner et al. 2006). Aufgrund der flächendeckenden NDV-Impfung in Geflügelbeständen müssen NDV-basierte Vektorvakzinen jedoch die maternale NDV-Immunität überwinden. Ein neuer Ansatz zur Entwicklung eines entsprechenden Vakzinevirus wird in dieser Arbeit gezeigt. Dazu erfolgte ausgehend von rNDVH5Vm die Generierung eines chimären rekombinanten NDV, in welchem die NDV-Oberflächenproteine F und HN durch die des aviären Paramyxovirus-8 (APMV-8) ausgetauscht wurden (chNDVFHNPMV8H5). Nach Generierung der neuen Virusrekombinante wurde sowohl die Expression und Inkorporation der drei Oberflächenproteine F, HN und H5 in das Viruspartikel, als auch eine Replikation zu hohen Endtitern nachgewiesen. Die geringe Virulenz und die damit mögliche Eignung als Vakzinevirus wurde durch einen ICPI von 0,288 bestätigt. Auch die in vivo-Charakterisierung in SPF-Hühnern zeigte eine gute Verträglichkeit, eine lokale Virusreplikation und eine detektierbare Immunantwort gegen APMV-8 und AIV. Drei Wochen nach Vakzinierung ein oder sieben Tage alter Küken, die eine maternale NDV-Immunität aufwiesen, mit chNDVFHNPMV8H5 erfolgte die Infektion mit einer letalen Dosis HPAIV. Es konnte ein vollständiger klinischer Schutz, einhergehend mit einer signifikant verringerten Virusausscheidung im Vergleich zur Kontrollgruppe detektiert werden. Die Vakzinierung mit chNDVFHNPMV8H5 ermöglicht außerdem die DIVA-Diagnostik auf Basis des Nachweises von AIV-NP Antikörpern. Aufgrund der Substitution der Oberflächenproteine des NDV ist chNDVFHNPMV8H5 nicht mehr in der Lage, einen Schutz gegen ND zu vermitteln. Die fehlende Kreuzreaktvität der Antikörper gegen die Oberflächenproteine von NDV und APMV-8 konnte auch in vitro gezeigt werden. Da die ND neben der HPAI einen hohen ökonomischen Stellenwert besitzt, wurde ein kombiniertes Vakzinierungsschema entwickelt, welches Geflügelbestände vor beiden Erkrankungen schützen soll. Dafür wurden ein oder sieben Tage alte, maternale NDV-Antikörper tragende Hühner mit chNDVFHNPMV8H5 und sieben Tage später mit einem lentogenen rekombinanten NDV (rNDVGu) immunisiert. Die Replikation des rNDVGu wurde dabei weder durch chNDVFHNPMV8H5 noch durch die Immunantwort gegen interne NDV-Proteine gestört, so dass beide Vakzinen eine Immunantwort induzierten. Diese vermittelte nach Infektion mit einer letalen Dosis HPAIV oder velogenem NDV einen klinischen Schutz und eine signifikant verringerte Virusausscheidung bei den geimpften Hühnern gegenüber den ungeimpften Kontrolltieren. Dieses erfolgreiche Vakzinierungsschema vereint zudem Massenapplizierbarkeit mit sicherer, kostengünstiger Produktion des Vakzinevirus. Von den bisher beschriebenen zwölf aviären Paramyxoviren ist NDV (APMV-1) aufgrund seiner wirtschaftlichen Bedeutung das am besten charakterisierte. APMV-8 hingegen ist bisher nur wenig untersucht. Um eine APMV-8-Infektion im Huhn zu charakterisieren, wurden drei Wochen alte SPF-Hühner mit APMV-8/goose/Delaware/1053/76 infiziert. Die Tiere zeigten nach Infektion keine klinischen Symptome, aber die Replikation des Erregers konnte bis vier Tage nach Infektion im oberen Respirationstrakt nachgewiesen werden. Sie verursachte jedoch keine histologischen Gewebeveränderungen, was die geringe Pathogenität des Erregers bestätigt. Eine Immunantwort konnte bereits sieben Tage nach Infektion detektiert werden. Um die Schutzwirkung einer APMV-8-Vakzinierung vor einer NDV- und APMV-8-Infektion zu ermitteln, erfolgte drei Wochen nach Immunisierung der Hühner eine Infektion mit homologem APMV-8 oder velogenem NDV. Dabei konnte gezeigt werden, dass nach erneuter APMV-8-Infektion die Virusausscheidung signifikant verringert war, was die Wirksamkeit der induzierten Immunantwort bestätigt. Nach Infektion mit einem velogenen NDV waren jedoch weder hinsichtlich Morbidität und Mortalität, noch Virusausscheidung signifikante Unterschiede zwischen vakzinierten und nicht vakzinierten Tieren nachweisbar. Das macht deutlich, dass eine Immunität gegen APMV-8 die Virusausscheidung nach erneuter APMV-8-Infektion zwar signifikant reduziert, jedoch nicht vor der Infektion mit einer letalen Dosis von velogenem NDV schützt.
Gram-negative bacteria are known to naturally produce outer membrane vesicles (OMVs), which are closed nanoparticles (10 to 450 nm) containing virulence factors and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). For over 20 years, OMVs of Neisseria meningitidis (N. meningitidis), in combination with three purified outer membrane proteins, have been successfully used as parts of human vaccines which illustrates the safety and potential of OMV based vaccines. So far only little is known about the OMVs of fish pathogenic bacteria. The production of OMVs has been described for the fish pathogenic gram-negative bacterium Aeromonas salmonicida (A. salmonicida) which is the causative agent of furunculosis resulting in high morbidity and mortality of salmonid fish. The immunostimulatory potential of OMVs derived from A. salmonicida as well as the possibility of establishing an oral vaccine model in Oncorhynchus mykiss (O.mykiss) (Rainbow trout) has been investigated in this study by conducting in vitro and in vivo experiments. Innate immune cells such as macrophages are one of the first cells to respond to pathogens once they breach the skin barrier, therefore the monocyte/macrophage cell line RTS-11 as well as leukocytes from the head kidney, consisting of a high percentage of phagocytic cells have been investigated. Additionally, leukocytes isolated from the peritoneal cavity as the main target for injectable vaccines have been studied in the in vitro experiments. These experiments indicate that OMVs derived from A. salmonicida are recognized by the monocyte/macrophage cell line RTS-11 as well as by leukocytes from the head kidney resulting in significant changes of the mRNA expression pattern of early inflammatory markers (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TGFβ). Having used the established peritoneal inflammation model of rainbow trout it could be shown that intraperitoneal (i.p.) vaccination of rainbow trout with OMVs results in a similar local immune response, especially in the recruitment of myeloid cells, compared to the injection of inactivated bacteria. The systemic cellular immune response differed between the two vaccine groups, even though a similar humoral immune response could be observed. Interestingly, i.p.vaccination with 10 µg of OMVs resulted in similar antibody titers as observed for fish, that were i.p. vaccinated with 108 CFU of inactivated A. salmonicida. The similar antibody titers after vaccination with OMVs might be explained by a stronger activation of CD8- T cells (likely CD4+ T cells) in the head kidney as well as in the blood in the OMV vaccinated group alone, which might result in an increased stimulation of B cells to produce antibodies.
Oral vaccination has been described as the ideal vaccination method for fish, but only few vaccines for oral application are licensed. Therefore, the established oral model for vaccination of rainbow trout with attenuated viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) was adapted to be used for inactivated A. salmonicida, even though initial trials indicated great similarities in the cellular response after i.p. and oral vaccination with inactivated strains of A. salmonicida, particularly in the response of the myeloid cells and lymphocytes in the target organs as well as the thrombocytes in the spleen. This could not be confirmed in a second oral vaccination trial. These results show how challenging the development of oral vaccines for fish is. The main challenge is the reproducibility of reliable results, since this is influenced by the difference in uptake of vaccine pellets or antigen degradation in the gut. Future oral vaccine trials should investigate different vaccination regimes, e.g., consecutive feeding, or a different composition of vaccine pellets, in order to further investigate the possibility of establishing an oral vaccine model for trout and so that future vaccine candidates, like OMVs, can be reliably tested in fish.
The advances in high-throughput sequencing technologies have revolutionized the possibilities for pathogen identification in cases of unknown disease origin. Diagnostic metagenomics allows the unbiased and simultaneous detection of almost all nucleic acids in a clinical sample, with the potential to provide pivotal insights into otherwise undeterminable causes of human or animal disease.
In this thesis, possibilities, pitfalls and the suitability of Ion Torrent and Illumina sequencing platforms for comprehensive use in diagnostic metagenomics were assessed and optimized procedures developed. Clinical field samples, undiagnosable by standard diagnostics, were taken as real-life examples for the investigations. The results show that cross-contamination due to index swapping and run-to-run-carryover constitute a major issue on Illumina platforms, severely compromising the correct interpretation of results for clinical specimens. In contrast, Ion Torrent platforms did not display any form of cross-contamination, however, the commercial library preparation method is less efficient. Combining the advantages of both platforms, customized Y adapters, facilitating highly efficient library preparation, were developed for Ion Torrent sequencing and applied in further experiments. The obstacles of strongly degraded RNA in formalin-fixed paraffin-embedded samples were identified and the workflow adapted to meet the requirements of smaller fragments. Additionally, it was shown that adequate sampling is a very important step, if not the most important step, in the workflow, as well as subsequent validation of the obtained results in terms of causation. The achievements in this study allow other researchers the application of a sensitive and optimized diagnostic metagenomics workflow.
Furthermore, the investigations on the clinical samples resulted in the discovery of a novel respirovirus with putative zoonotic potential, the first description of Borna disease virus 1 in human organ transplant recipients, and the discovery of a very distantly related novel ovine picornavirus. These discoveries build a basis for further research and expand the knowledge regarding new and emerging viruses.
In vitro and in vivo analyses of mono- and mixed-species biofilms formed by microbial pathogens
(2022)
Microbial biofilms can be defined as multicellular clusters of microorganisms embedded in a self-produced extracellular matrix (ECM), which is primarily composed of polymeric biomolecules. Biofilms represent one of the most severe burdens in both industry and healthcare worldwide, causing billions of dollars of treatment costs annually because biofilms are inherently difficult to prevent, treat, and eradicate. In health care settings, patients suffering from cystic fibrosis, or patients with medical implants are highly susceptible to biofilm infections. Once a biofilm is formed, it is almost impossible to quantitatively eradicate it by mechanical, enzymatical, chemical, or antimicrobial treatment. Often the only remaining option to fully eradicate the biofilm is removing of the infected implant or body part. The primary reasons for the inherent resistance of biofilms against all forms of antimicrobial treatment are (I) a reduced metabolic activity of biofilm-embedded cells climaxing in the presence of metabolic inactive persister cells, as well as (II) the protective nature of the biofilm matrix acting as a (diffusion) barrier against antimicrobials and the host immune system. Consequently, there is an urgent need to better understand microbial biofilms from a structural and (patho-) physiological point of view in order to be able to develop new treatment strategies.
Therefore, the aims of this study were to investigate fundamental physiological properties of different clinically relevant single and multi-species biofilms, both in vitro and in vivo. Furthermore, the effectiveness of a novel treatment strategy using cold atmospheric pressure plasma was evaluated in vitro to treat biofilms of the pathogenic fungus C. albicans.
In article I, the intracellular and ECM protein inventory of Staphylococcus aureus during in vitro biofilm growth in a flow reactor was analyzed by liquid-chromatography coupled to tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS) analysis combined with metabolic footprint analysis. This analysis showed that anaerobiosis within biofilms releases organic acids lowering the ECM pH. This, in turn, leads to protonation of alkaline proteins – mostly ribosomal proteins originating from cell lysis as well as actively secreted virulence factors – resulting in a positive net charge of these proteins. As a consequence, these proteins accumulate within the ECM and form an electrostatic network with negatively charged cell surfaces, eDNA, and metabolites contributing to the overall biofilm stability.
In article II, the in vivo metaproteome of the multi-species biofilm community in cystic fibrosis sputum was investigated. To this end, an innovative protocol was developed allowing the enrichment of microbial cells, the extraction of proteins from a small amount of cystic fibrosis sputum, and subsequent metaproteome analysis. This protocol also allows 16S sequencing, metabolic footprint analysis, and microscopy of the same sample to complement the metaproteome data. Applying this protocol, we were able to significantly enhance microbial protein coverage providing first insights into important physiological pathways during CF lung infection. A key finding was that the arginine deaminase pathway as well as microbial proteases play a so far underappreciated role in CF pathophysiology.
In articles III and IV, a novel treatment strategy for biofilms formed by the important fungal pathogen Candida albicans was evaluated in vitro. Biofilms were treated with two different sources of nonthermal plasma (with the Nonthermal Plasma Jet “kINPen09” as well as with the Microwave-induced plasma torch “MiniMIP”) and the effect on growth, survival, and viability was assessed by counting colony-forming units (CFU), by cell proliferation assays, as well as by live/dead staining combined with fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy, (CLSM) and atomic force microscopy (AFM). These tests revealed that biofilms were effectively inactivated mostly on the bottom side of biofilms, indicating a great potential of these two plasma sources to fight biofilms.
As the animal-to-human interface becomes increasingly narrow, transmission events of zoonotic pathogens between animals and humans become more and more probable. While SARS-CoV-2 already accomplished a spillover infection to humans and is responsible for the current pandemic, the bat H9N2 IAV with so far unknown zoonotic potential was only recently discovered. In order to identify I) the role and potential of a newly discovered, potentially pre-pandemic virus, such as the bat H9N2, or II) possible future prevailing virus mutant variants of an already known pandemic virus, such as SARS-CoV-2, it is important to characterize these emerging viruses in vivo as soon and as good as possible.
The first objective in this dissertation (Publications I and II) therefore deals with the characterization of bat H9N2 and the estimation of its zoonotic or even pandemic potential.
In Publication I, a general susceptibility of directly inoculated Egyptian fruit bats to bat H9N2 was confirmed by successful seroconversion, although exhibiting only moderate viral shedding. All three contact animals remained seronegative, though one contact bat showed slight lesions in the histopathological analysis.
Publication II further addressed the question of the zoonotic potential of this virus. Inoculation of day-old turkey hatchlings demonstrated moderate susceptibility to bat H9N2 infection with a measurable seroconversion, while day-old chicken hatchlings were not susceptible to bat H9N2. Ferrets proved to be highly susceptible to bat H9N2 with high viral shedding, a transmission efficiency rate of 100% to direct contact animals at 2 days post contact, but with only minimal clinical signs. Importantly, the virus demonstrated the ability to evade the MxA-restriction factor and to replicate efficiently in human lung tissue explants. Furthermore, seasonal IAV- and standard IAV-vaccines showed no cross reactivity against the bat-N2 protein in humans. Therefore, further research on such viruses is urgently needed in order to prevent a renewed pandemic situation in the future as caused by SARS-CoV-2.
The second objective in this dissertation dealt with the identification and characterization of emerging SARS-CoV-2 Variants of Concern (VOCs).
Therefore, in Publication III, competitive infection experiments were performed using the Syrian golden hamster, the ferret, and transgenic mouse models (K18-hACE2 and hACE2-KI). These studies revealed replicative and transmissive predominance of Alpha VOC over Beta VOC, but not over SARS-CoV-2 WT in the hamster model, although Beta VOC substantially replicated in the lungs of donor animals. In contrast, the Alpha VOC had an unambiguous replication and transmission advantage over WT SARS-CoV-2 in the ferret and both mouse models. A recombinant SARS-CoV-2 WT-SAlpha virus helped to assign the fitness advantage of this variant particularly to the spike protein-associated mutations.
In Publication IV, in vitro results inferred an early replicative fitness advantage of Omicron BA.1 over Delta VOC, although the opposite was observed in competitively inoculated hamsters, ferrets and naive hACE2-KI mice. In addition, Publication IV demonstrated a disadvantage in transmission for the VOC Omicron BA.1 over the Delta VOC and a lack of susceptibility of ferrets after a single infection with the VOC Omicron BA.1. An mRNA vaccination of K18-hACE2 mice caused a drastic reduction of infectious virus particles in organ material following an infection with a recombinant SARS-CoV-2 WT-SDelta, but not when challenged with the SARS-CoV-2 SOmicron BA.1 clone.
This dissertation includes numerous, comprehensive experimental studies that are generally important for the characterization of emerging, potentially pre-pandemic viruses and may provide crucial information about the future dominance of certain virus variants in an ongoing pandemic. Here, the need for the use of a variety of animal models becomes apparent. By characterizing and classifying potentially zoonotic strains, these methods will help to better prepare for potentially upcoming pandemics and, in the case of a zoonotic or even pandemic event, to better detect and understand the circulating strains and their evolution.
Lyssaviruses, the causative agents of rabies, are a long-known threat for animals and humans. To date, terrestrial rabies still accounts for tens of thousands of human deaths annually, notwithstanding ambitious vaccination campaigns targeting susceptible dog and wildlife populations that act as reservoirs for the prototypic rabies virus. Moreover, the continuing discovery of newly emerging virus species in hitherto unconcerned chiropteran hosts and geographic regions drive the expansion of the Lyssavirus genus by unveiling its actual variety, host range and distribution.In this work, the genetic diversity of three distinct lyssaviruses, namely EBLV-1, KBLV and RABV, was elucidated by in-depth genomic analyses to provide further insight into lyssavirus evolution. The generation of full-genome sequences from primarily bat-associated Danish EBLV-1 samples significantly increased the number of available Danish EBLV-1 genome sequences while phylogenetic and phylogeographic analysis revealed a stronger phylogeographic structure for the cluster A1 of the sublineage EBLV-1a than it was postulated in previous studies. In addition, the acquisition of a nearly complete genome sequence for the Kotalahti bat lyssavirus provided the basis for the classification of this putative new lyssavirus species as a recognized member of the genus. Furthermore, phylogenetic analysis revealed the affiliation of KBLV to a group of Myotis-associated lyssaviruses giving a deeper insight into the shared evolutionary history of lyssaviruses co-evolving with particular bat species. Moreover, a deep-sequencing approach was utilized to assess the high genetic diversity of vaccine virus populations, uncovering three independent patterns of single nucleotide variants (SNVs) that became selected in ERA-related vaccine-induced cases. However, no apparent influence of the genetic diversity of vaccine viruses on microevolutionary processes like a potential reversion to virulence or a species-specific adaptation of the vaccine virus strains could be detected, leaving the question for the cause of rabies induction in the affected animals unanswered. Lastly, the successful implementation of a hybridization capturing system for the generation of full-genome sequences and deep-sequencing variant analyses of RABV and KBLV samples was demonstrated for a diagnostic bait set, highlighting the versatility and consistency of this approach to assess the genetic spectrum of known and novel lyssavirus species while setting the basis for its application and optimization in upcoming projects.In conclusion, as shown by the studies in this work, the investigation of lyssavirus genomes at the sub-consensus, full-genome and population level remains crucial to assess the complexity of lyssavirus evolution, as it provides an indispensable source of information to cover the diversity of the genus and understand evolutionary dynamics on a long-term and microevolutionary scale.
Bats are ancient mammals that evolved more than 50 million years ago. There are 1,240 different species (> 20% of mammalian species) described so far, which represent one of the most abundant, diverse and widely distributed mammalian groups. Bats are the only mammals which actively fly and therefore can migrate to different areas of the world. It has been increasingly recognized that bats are reservoirs for more than 100 virus species, and several are associated with animal and human epidemics. As natural hosts of rabies virus (RABV) and related lyssaviruses, bats have become a focus of research not only in South America and Africa, but also in Europe and North America. Bats are also considered to be unique in their potential to host emerging and re-emerging zoonotic viruses. To evaluate and reduce the potential risk of rabies transmission to humans or carnivore hosts (like fox, raccoon and dog etc.), active and passive surveillance studies of bat have been performed. Using these approaches diverse lyssaviruses have been detected in bats. However, these studies did not explain the rarely discovered epidemics and the underlying resistance or immune mechanisms in bats as natural hosts for lyssaviruses. Probably, bats are more resistant to lyssavirus infections than other animals. This hypothesis is introducing the research questions of the present thesis: (1) How do the innate immune responses protect bats from fatal outcome of lyssavirus infections? Interferon (IFN) responses which can be induced by the recognition of viruses by pattern recognition receptors act as the first line of defense against lyssavirus infections. Therefore, type I and type III IFNs from European bats were cloned and functionally characterized in this thesis (Chapter 2 and 4). (2) How do the lyssaviruses adapt to escape the host defenses by counteracting the IFN-mediated immune responses? And how do the bats control the viral replication via the IFN responses? To explore the complicated interactions and understand how European bats (Eptesicus serotinus, Myotis myotis and Nyctalus noctula) interact with European bat lyssaviruses (EBLV-1 and 2), a natural host related model for investigations of the bat´s immune system and the virus-host interactions has to be established. Since all of 52 identified European bats species are endangered and strictly protected, stable cell lines from different tissues of M. myotis for in vitro studies were developed and used for molecular and functional studies (Chapter 3 and 4). The data obtained from this thesis revealed that: (a) European bat IFNs do have similar but also distinct molecular characteristics compared with other mammalian IFNs (Chapter 2 and 4); (b) Both investigated bat type I IFNs, IFN-Kappa; and IFN-Omega; present potent anti-lyssaviral activities and display a pathogen associated pattern in the tested cell line (Chapter 2); (c) The established immortalized M. myotis cell lines are differently susceptible to lyssaviruses and contain a functional IFN-mediated signaling cascade (Chapter 3); (d) Bat type III IFN-Lambda;s display cell-type specific functions due to the distinct expression of the IFN-Lambda; receptor (Chapter 4); (e) In bat cell lines a possible evasive strategy of lyssavirus is based on the counteraction of IFN production and/or IFN-mediated defensive pathways (Chapter 3); (f) The higher resistance of brain derived cell line MmBr compared to other cell lines to lyssavirus infection indicates the natural ability of bat´s central nervous system to control the growth of neurotropic virus, which might be an essential reason for the nonclinical outcome (Chapter 3). Overall, the present thesis provides first insights into IFN-mediated innate immune responses against RABV and EBLVs infection in their natural reservoir hosts and an useful toolbox for comparative analysis of virus-host interactions.
The general stress response comprises approximately 200 genes and is driven by the alternative sigma factor SigB. Besides the process of sporulation with approximately 500 involved gene products under initial control of Spo0A are the two most significant and extensive cellular responses that can be observed in B. subtilis. The general stress response provides vegetative growing as well as non-growing and non-sporulating cells with a comprehensive cross-protective and preventive multiple stress resistance to various hostile environmental conditions. In contrast, the endospore is the most resistant but also dormant cell type produced by B. subtilis. The scope of this study was the identification of regulatory cascades driven by the general stress response sigma factor SigB to further elucidate the structure and function of the general stress regulon itself and to uncover potential intersections between the SigB response and other major developmental programs in the regulatory network of B. subtilis. It could be shown that the general stress regulon member yqgZ encodes a functional paralogue of Spx, the global regulator of the diamide stress regulon in B. subtilis. Global transcriptome and proteome studies led to the characterization of an YqgZ sub-regulon consisting of 53 positively and 18 negatively regulated genes. Due to its stringent SigB-dependent expression as well as its concerted action with SigB in regulation of its target genes YqgZ was renamed to MgsR which stands for “modulator of the general stress response”. Activity control of MgsR is stringently controlled at multiple levels. In addition to induction by SigB these mechanisms include (i) a positive autoregulatory loop of MgsR on the transcription level of its own structural gene, (ii) a post-translational redox-sensitive activation step by the formation of an intramolecular disulfide-bond within a conserved -CXXC-motif and (iii) rapid proteolytic degradation of MgsR by the ClpCP and ClpXP proteases, resul ting in extremely short in vivo half-lifes below 6 minutes. It was demonstrated that the activation of SigB is a prerequisite but not sufficient for a full expression of all general stress genes and that the SigB-dependent expression of MgsR provides the opportunity for additional redox-sensitive signal-reception, -processing and -integration beyond the primary decision of SigB activation. Our results describe a regulatory cascade integrating secondary oxidative stress signals into a SigB mediated regulatory cascade that is aimed at a precise fine tuning of target gene expression whose products are necessary for proper management of oxidative stress. Although primary oxidative stress stimuli do not typically induce SigB, our observation of redox-sensitive control by MgsR and several other reports that pointed at the implication of the general stress proteins in oxidative stress management led to the proposal that secondary oxidative stress may be a common component of multip le severe physical stress stimuli. This assumption could be supported by the results of a comprehensive phenotype screening of 94 mutants in single general stress genes upon treatment with hydrogen peroxide and the superoxide generating agent paraquat. A substantial amount of 62 mutants (66%) displayed significantly decreased survival rates in response to oxidative stress. The information gained by this phenotypic screening analysis provides a valuable basis for more directed assays to elucidate the biochemical functions of many so far uncharacterized general stress proteins and demonstrates that the SigB response and the regulatory fine tuning by MgsR plays a pivotal role in protection from secondary oxidative stress. Furthermore, it has been intensively discussed throughout the literature of the last years that the general stress response and the process of sporulation may represent mutually exclusive survival strategies of a non-growing B. subtilis cell, but the molecular basis for this assumption was missing until recently. By the identification of a functional SigB-type promoter (PsigB) adjacent to the spo0E, this gene was newly assigned to the general stress regulon. The spo0E gene encodes a phosphatase that specifically inactivates the master regulator of sporulation Spo0A~P by dephosphorylation. The SigB dependent induction of spo0E causes a block of sporulation specific transcription and produces a sporulation deficient phenotype. This effect was overcome by a deletion of the spo0E-SigB promoter, thus clearly addresses SigB activity. This regulatory mechanism is the first example for an integration of SigB inducing stimuli into the decision making process of sporulation initiation that provides a link to interconnect these two dominant and very likely mutually exclusive responses in the regulatory network of B. subtilis. The data presented here provide deeper insights into the structure and function of the general stress regulon in stress management.
Phospholipide wie Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin sind essenzielle Bestandteile aller biologischen Membranen und für deren Integrität und Funktion unerlässlich. Sind Inositol und Cholin (IC) im Medium vorhanden, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae in der Lage, diese aufzunehmen und zu verarbeiten. Unter Mangelbedingungen können diese Stoffe von der Zelle selbst synthetisiert werden. Daher ist es sinnvoll, die Phospholipid¬biosynthese-Gene differenziell zu exprimieren, was auf der Ebene der Transkriptions¬initiation geschieht. Bei IC-Mangel werden die Gene (z. B. das Inositol-3-Phosphat Synthase Gen INO1) durch Bindung des heterodimeren Aktivatorkomplexes Ino2/Ino4 an das Promotorelement ICRE („inositol/ choline responsive element“) aktiviert, um die Biosynthese zu gewährleisten. Sowohl Ino2 als auch Ino4 sind für die ICRE-Bindung nötig, während die transkriptionale Aktivierung nur durch Ino2 mit Hilfe zweier Transkriptionsaktivierungsdomänen TAD1 und TAD2 vermittelt wird. Ist dagegen ausreichend IC vorhanden, werden die Gene reprimiert, indem der Repressor Opi1 an den Aktivator Ino2 bindet, sodass es zu einer Konformationsänderung kommt und eine Dimerisierung mit Ino4 nicht mehr möglich ist.
Um eine erfolgreiche Transkriptionsinitiation zu gewährleisten, bilden neben der RNA-Polymerase II eine Reihe genereller Transkriptionsfaktoren (A, B, D, E, F und H) sowie der Mediatorkomplex im Promotorbereich der Zielgene den sog. Präinitiationskomplex (PIC). Die von diesen basalen Faktoren gewährleistete geringe Grundexpression kann von Aktivatorproteinen, die an positiv-regulatorische Elemente („upstream activation site“, UAS) binden, deutlich verstärkt werden. Hierzu nutzen Aktivatorproteine verschiedene Mechanismen, zu denen die Auflockerung der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationskomplexe wie SAGA oder Chromatinremodellierungskomplexe wie SWI/SNF, die bessere Bindung der Transkriptionsfaktoren am Basalpromotorbereich oder die Beschleunigung des Übergangs vom geschlossenen zum offenen PIC gehören.
Im Verlauf dieser Arbeit konnten zahlreiche Interaktionen zwischen dem Aktivator Ino2 und Faktoren der Transkriptionsmaschinerie nachgewiesen werden, die vermutlich die Häufigkeit der Trans¬kriptions-initiation beeinflussen. Einige der Untereinheiten des Transkriptionsfaktors TFIID interagie¬ren mit Ino2. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung der Interaktion der Ino2-TAD1 mit Taf1 und Taf12. Der Austausch der Aminosäuren Asparaginsäure-20 und Phenyl¬alanin-21 in Ino2 führte zu einem Interaktionsausfall mit beiden Tafs. In Taf1 konnten zwei basisch-hydro¬phobe Aminosäure-Bereiche (K206 Y207 und L208 L209 K210) innerhalb der minimalen Aktivator¬binde¬domäne 2 (ABD2) identifiziert werden, die kritisch für den Kontakt zum Aktivator sind. Es konnte ferner gezeigt werden, dass basische und hydrophobe Aminosäuren in Kombination für die Bindung an den Aktivator verantwortlich sind und dass der Austausch gegen Alanin (KY-AA) zu einem Abfall der Expression des INO1-Gens auf 44% führt. Darüber hinaus konnte der Bromo¬domänen¬faktor Bdf1 als Interaktionspartner von Ino2 identifiziert werden. Bdf1 vervollständigt Hefe-Taf1, während Säuger-Taf1 selbst Bromodomänen zur Erkennung von Histonacetylierungen beinhaltet. Innerhalb der Taf12-Minimaldomäne sind die Aminosäuren K150 L151 R175 und L176 wesentlich für die Bindung an Ino2. Eine Teildeletion von Taf12, die unter anderem den Verlust dieser Aminosäuren zur Folge hat, führt zu einer auf 76% reduzierten INO1-Expression.
Ein weiterer Transkriptions¬faktor, der von Ino2 kontaktiert wird, ist TFIIA mit seinen Untereinheiten Toa1 und Toa2. Die Proteine kontaktieren beide TADs des Aktivators, allerdings konnten innerhalb der minimalen Interaktionsdomänen der Toa-Proteine keine für diese Interaktion verantwortliche Aminosäuren identifiziert werden. Veränderungen der Toa1-Sequenz hatten keinen phänotypischen Einfluss auf die Phospholipidbiosynthese, allerdings führten einige Veränderungen (RKRK-Motiv im AS-Bereich 253-259) zu letalen Folgen für das Wachstum der Zellen, weil die Bildung des TFIIA-TBP-TATA-Komplexes beeinträchtigt ist. Wahrscheinlich hat die Interaktion zwischen Ino2 und TFIIA eine verstärkende Wirkung auf die Transkriptionsinitiation der Phospholipidbiosynthese-Gene, indem die Interaktion zwischen TFIIA und TFIID stabilisiert wird und TFIIA die interaktive Oberfläche am Promotor für Interaktionen mit anderen Proteinen vergrößert.
Die Verschiebung der Nucleosomen in Promotorbereichen durch Chromatinremodellierungs¬kompexe wie SWI/SNF ist ein weiterer Mechanismus der Transkriptionsaktivierung. In früheren Arbeiten wurde bereits die Interaktion zwischen Ino2, Aro80 bzw. Gal4 und der SWI/SNF ATPase-Untereinheit Swi2 beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit konnte eine minimale Interaktionsdomäne im AS-Bereich 238-307 kartiert werden. Essenzielle Aminosäuren für die Bindung an Ino2 und andere Aktivatoren konnten nicht identifiziert werden.
Sug1 und Sug2 sind ATPasen der regulatorischen 19S-Untereinheit des 26S Proteasoms. Neben der Degradation fehlgefalteter polyubiquitinierter Proteine haben sie auch eine nicht-proteolytische Bedeutung für die Transkriptionsinitiation. Bekannt ist, dass proteasomale ATPasen an aktiven Promotoren zu finden sind und mit Aktivator¬proteinen (z. B. Gal4) interagieren können. Die vorlie¬gende Arbeit zeigt, dass auch Ino2 von Sug1 und Sug2 kontaktiert wird. Möglicherweise dienen sie am INO1-Promotor als Stabilisatoren und Vermittler zwischen Ino2 und der Transkriptionsmaschi¬nerie und erleichtern den Übergang des Präinitiationskomplexes in den Elongationskomplex.
Unter reprimierenden Bedingungen bindet Opi1 an Ino2 und rekrutiert die Corepressorkomplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die ihrerseits Histondeacetylasen in Promotornähe bringen und die Transkrip¬tion durch lokale Chromatinverfestigung reprimieren. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass die Corepressoren auch mit Ino2 und weiteren Aktivatoren (Hac1 und Pho4) interagieren und dass sie in Abhängigkeit von Ino2, nicht aber von Opi1, am INO1-Promotor vorliegen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Ino2 und Sin3 bzw. Cyc8 charakterisiert. Sin3 und Cyc8 kontaktieren einen Bereich des Aktivators, der die TAD2 und die RID (Repressorinteraktionsdomäne) enthält. Es war bekannt, dass die Aminosäuren Phenylalanin-130, Leucin-131 und Asparaginsäure-132 essenziell für die Interaktion mit Opi1 sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass deren Austausch gegen Alanin auch einen Interaktionsverlust mit Cyc8 und Sin3 bewirkt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese FLD-AAA-Mutation zu einer praktisch konstitutiven Expression des INO1-Gens führt, allerdings auf niedrigerem Niveau als im Fall dereprimierter Zellen mit einem Wildtyp Ino2. In Hac1 und Pho4 konnten Aminosäuren mit vergleichbarer Bedeutung für die Corepressorbindung nicht identifiziert werden. Offenbar können die Corepressoren je nach physiologischer Situation in der Zelle positiv oder negativ auf die Transkriptionsinitiation wirken.
Streptococcus pneumoniae is one of the leading human pathogen causing morbidity and mortality worldwide. The pneumococcus can cause a variety of different diseases ranging from mild illnesses like otitis media and sinusitis to life-threatening diseases such as pneumonia, meningitis and sepsis. Mostly affected are infants, elderly and immune-suppressed patients. Although, there are vaccines against pneumococci available, still hundreds of thousands of people got infected each year. These vaccines are targeting the pneumococcal polysaccharide capsule. Because of the high number of different serotypes, it is not possible to generate a vaccine against all present serotypes. In the last years a shift to non-vaccine serotypes was noticed. This strengthens the need for the development of vaccines which do not target polysaccharides. Thus, proteins came into focus as potential new vaccine candidates or targets for drug treatment, because several proteins are highly conserved among different strains or even genera. Proteome analyses can give insights into the protein composition in a certain state of a bacterium. So, targets can be identified, which are especially expressed under infection-relevant conditions. Iron limitation is one of these conditions and the knowledge on iron acquisition in pneumococci is still limited. Iron is an essential trace element and as redox-active catalyst or as cofactor involved in various key metabolic pathway in nearly all living organisms and thus also in bacteria. For instance, iron is necessary during biosynthesis of amino acids and in electron transport as well as in DNA replication. Within the human host iron is extremely limited due to its high insolubility under physiological conditions, which is part of the nutritional immunity of its human host. Hence, bacteria had to evolve mechanism to overcome iron starvation. In this thesis the adaptation process triggered by iron limitation in the S. pneumoniae serotype 2 strain D39 was investigated in a global mass spectrometry-based proteome analysis.
In preceding growth experiments the pneumococcal growth was adapted to the needs of proteomic workflows. In order to investigate the pneumococcal response to iron limitation, the organic iron-chelating agent 2,2’-bipyridine (BIP) was applied. For the quantification of changes in protein abundances comparing stress to control conditions the very reliable and robust metabolic labeling technique Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) was used. This method requires the bacterial cultivation in a chemically defined medium, for which reason modified RPMI 1640 medium was chosen. A pooled protein extract with heavy labeled amino acids was applied as an internal standard, which included proteins expressed under control and stress condition, to control, BIP and BIP-iron-complex (BIP control experiment) samples. Samples were analyzed by liquid chromatography coupled directly to a tandem mass spectrometer. It is described that under iron-restricted conditions proteins associated to pathogenesis are higher abundant in pathogenic bacteria like Staphylococcus aureus. Hence, similar observations were expected also for the proteomic adaptation of S. pneumoniae, but the first results showed a reduction in protein abundance of virulence factors. In order to explain these results inductively-coupled-plasma mass spectrometry was executed to determine the iron concentration of chemically defined medium (CDM) used in this experiment. The analysis revealed a relatively low iron concentration of approximately 190 µg l-1. Therefore, the iron concentration of the complex medium THY, in which pneumococci are usually grown, was investigated. THY contains four-fold (740 µg l-1) more iron than the CDM. Subsequently, an additional iron limitation approach was carried out in THY. As SILAC is not applicable in complex media like THY, MaxLFQ was applied as quantification method in this case. Because two different media were used, an additional comparative proteome analysis with regard to the two investigated media was executed.
Comparing the protein composition in both cultivation media it became clear that pneumococci exhibit a totally different proteome depending on the medium. Major differences were found in metabolisms of amino acids, vitamins and cofactors as well as in pathogenesis-associated proteins. These differences have to be taken into account during the analyses of both iron limitation approaches. Overall, more proteins were identified and quantified in CDM samples. The pneumococcal adaptation to iron limitation in both media was different; especially, the alterations in protein abundances of virulence factors. In contrast to the iron limitation in CDM, proteins involved in pathogenesis were higher abundant under iron limitation in THY, which was the expected result. Because of proteomic changes of cell division and lipid metabolism involved proteins in iron-limited pneumococci in CDM, electron microscopic pictures were taken in order to proof cell morphology. The pictures showed an impaired cell division in iron-limited CDM, but not in THY medium. However, both datasets have similarities as well. Thus, the iron uptake protein PiuA is strongly increased in iron-restricted conditions and the abundance of the iron storage protein Dpr is significantly decreased in both datasets. Notably, PiuA and Dpr seem to have important roles during the pneumococcal adaptation to iron-restricted environments.
One the basis of these results, it could be shown that the proteomic response of pneumococci to iron limitation is strongly dependent to the initial iron concentration of the environment. Hence, pneumococci will adapt differently to varying niches and thus potential vaccine candidates should be expressed independently of the localization within the human host.
Lyssavirus Matrixproteine (M) sind essentielle Komponenten im Virus-Assembly. Zusätzliche Virus RNA-Synthese regulierende und wirtszellmanipulierende Funktionen machen das M Protein zu einem zentralen Faktor der wirtszellabhängigen Virusreplikation und Pathogenese im infizierten Organismus. Damit könnte das M Protein einen wesentlichen Faktor bei der Anpassung von Lyssaviren an bestimmte Wirtsspezies darstellen und als Pathogenitätsdeterminante die spezifische Virulenz unterschiedlicher Lyssavirus Isolate begründen. Inwieweit Lyssavirus M Proteine sich tatsächlich in grundlegenden Funktionen der Virusreplikation und Wirtszellmanipulation unterscheiden, ist bisher nur unzureichend geklärt. Hier wurden M Proteine aus einem attenuierten Rabies Virus Stamm (RABV M) und aus einem fledermausassoziierten Lyssavirus (Europäische Fledermaus Lyssavirus Typ 1; EBLV 1 M) hinsichtlich funktioneller Unterschiede im Virus-Assembly und ihrer intrazellulären Lokalisation in virusinfizierten Zellen verglichen. Zusätzlich wurde durch die gezielte Insertion von Mutationen in das RABV M Protein ein stark attenuiertes RABV generiert, das eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung M abhängiger Mechanismen der Pathogenese und Viruseliminierung aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) darstellt. Tatsächlich wurden mit chimären RABV M und EBLV 1 M exprimierenden Viren M abhängige Unterschiede in der Virusmorphogenese bestätigt. Eine RABV M abhängige Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rauen Endoplasmatischen Retikulum (rER) wurde mit der Kombination unterschiedlicher RABV und EBLV 1 M Sequenzen auf fünf C terminale Aminosäuren an den Positionen 187, 190, 192, 196 und 197 eingegrenzt. Mit der Identifizierung dieser Positionen konnte postulierte werden, dass es sich bei den beobachteten ultrastrukturellen Unterschieden nicht um Virusspezies sondern um Isolat-spezifische Unterschiede handelt, die möglicherweise einen Einfluss auf in vivo Virusreplikation und Pathogenese haben. Die vergleichende fluoreszenzmikroskopische Analyse infizierter Zellen zeigte, dass EBLV 1 M Protein im Gegensatz zum RABV M Protein an Membranen des Golgi-Apparates akkumulierte. Im Gegensatz zur Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rER konnte die EBLV 1 M spezifische Golgi-Apparat Lokalisation nicht auf einzelne Bereiche des M Proteins eingegrenzt werden, weshalb davon ausgegangen werden muss, dass hier die Integrität des gesamten EBLV 1 M Proteins notwendig ist. Erstmals wurden Lyssavirus M Proteine in viralen Einschlusskörpern und Zellkernen infizierter Zellen nachgewiesen. Während die Präsenz in den Einschlusskörpern ein wichtiges Element bei der Erforschung RNA-Synthese regulativer M Funktionen darstellt, können mit dem Nachweis von Lyssavirus M Proteinen im Zellkern wirtszellmanipulierende Funktionen auf nukleärer Ebene postuliert werden. Neben dem Nachweis der Proteine im Nukleus wurde mit fluoreszenzmarkiertem M Protein gezeigt, dass die Kernmembran eine Diffusionsbarriere für das M Protein darstellt und dass ein aktiver Transport in den Zellkern stattfinden muss. Zusammenfassend werden mit dieser Arbeit wichtige Erkenntnisse zu Unterschieden und Gemeinsamkeiten von Lyssavirus M Proteinen bezüglich Virusmorphogenese und wirtszellmanipulierender M Funktionen vorgelegt, die das aktuelle Verständnis der Lyssavirus Replikation vertiefen und weiterführende Arbeiten zu molekularen Mechanismen der Virusreplikation und Pathogenese ermöglichen.
Posttranslational modifications are involved in the regulation of virtually all cellular processes, including immune response, nevertheless, they are also targets manipulated by invading pathogens. The first investigated example is protein citrullination which is an important posttranslational modification that acts on a multitude of processes like supervision of cell pluripotency and rheumatoid arthritis. Citrullination of targeted arginine residues is performed by the Peptidylarginine deiminase. Within the first published manuscript, being part of this thesis, it was possible to show the use of this posttranslational modification by the human pathogen Porphyromonas gingivalis to facilitate innate immune evasion at three distinct level. P. gingivalis was demonstrated to citrullinate proteins by Porphyromonas peptidylarginine deiminase resulting in diminished phagocytosis and subsequent killing by neutrophils. Furthermore, it was shown that citrullination of histone H3 enables P. gingivalis to survive in neutrophil extracellular traps and incapacitate the lysozyme-derived peptide LP9.
The second investigated posttranslational modification is ubiquitination and its role in respiratory tract infections. Ubiquitination is the covalent attachment of a small protein that consisting of only 76 amino acids to the ε-amino group of lysine residues to posttranslational modify proteins. Acute infections of the lower respiratory tract such as viral and bacterial co-infections are among the most prevalent reasons of fatal casualties worldwide. Therefore, the interactions between host and pathogens resulting in the impairment of the hosts immune response and immune evasion of the pathogens, need to be elucidated. To get new insights in the infection driven changes in protein polyubiquitination and alterations in the abundance of ubiquitin E3 ligases involved in ubiquitination, cellular proteomes were monitored in detail by high resolution mass spectrometry. Therefore, the epithelial cell lines 16HBE14o- (Manuscript II) and A549 (Manuscript III) were co-infected with influenza A virus H1N1 and Streptococcus pyogenes or Staphylococcus aureus or with influenza A virus H1N1 and Streptococcus pneumoniae, respectively. Here, it could be shown in 16HBE14o- cells that co-infection of epithelial cells is not characterized by decreased cell survival and that observable effects on the proteome and ubiquitinome are mostly additive rather than synergistic. S. pyogenes infection affected the mitochondrial function, cell-cell adhesion, endocytosis and actin organization. Viral infection affected mRNA processing and Rho signaling. Viral and bacterial co-infection was detected to affect processes that were already affected by both of the corresponding single infections. No further pathways were strongly affected by the co-infection. A similar result has been observed in A549 cells co-infected IAV and S. pneumoniae. Overrepresented gene ontology terms depict the sum of those observed in the viral and bacterial single infection. Moreover, no significant change in cell survival upon co-infection compared to single bacterial infection was noticed for A549 cells either. This led to the suggestion that co-infection of investigated epithelial cells under examined conditions possesses additive rather than synergistic effect and thus, may not worsen the outcome of the infection within the studied conditions. Infections in other systems, may provide varying results and thus should be examined in future studies.
Deciphering the entire protein complement of a living cell together with the elucidation of dynamic processes on protein level are the main goals of proteomics as it is used today. To achieve this goal, namely the elucidation of dynamic processes of the entire bacterial cell, we have developed strategies and distinct workflows to cover the most proteins in different subcellular localizations in bacteria together with a stable isotopes labeling approach to follow temporal and spatial changes in different proteomic subfractions. In this work, it has been shown that the use of mass spectrometry based in vivo quantitation techniques and the application of subcellular and chromatographic fractionation has lead to a new level of qualitative and quantitative proteomics data. Emphasizing on the studies revealing the dynamics of the bacterial physiology on a time resolved base, both spatial and temporal processes can be monitored to obtain knowledge on physiological processes in a depth that has not been reached before in comparable global studies.
Mass spectrometry-based Proteome analysis of porcine cells infected with African swine fever virus
(2023)
ASFV, a highly contagious, pathogenic and lethal pathogen of swine, poses a major threat to domestic and wild suids worldwide as neither vaccines nor treatments are available. Compared to other well-characterized similarly complex viruses like herpesviruses or adenoviruses, the understanding of ASFV biology is poor.
To improve the understanding of ASFV biology, following the establishment of a robust protocol for the isolation of primary monocyte-derived porcine macrophages (moMΦ) and their infection with ASFV for mass spectrometry (MS)-based proteome analysis was performed.
Under both conditions, naïve and infected, the isolated cells showed cell type-specific characteristics like phagocytosis and antigen presentation and protein expression patterns, including the expression of swine leucocyte antigens and CD markers. Furthermore, moMΦ could be reproducibly infected with ASFV isolates of different genotypes and pathogenicity.
The ASFV protein expression patterns in moMΦ correlate well with those observed in established cell lines at transcript and protein level. The expression of 27 ASFV proteins was confirmed at the protein level. Among them, 9 members of multi-gene families (MGF) and 12 novel open reading frames (nORFs) were recently predicted based on transcription start site mapping.
The direct comparison of closely related ASFV genotype II isolates revealed no virulence-associated protein expression patterns beyond those expected based on the genome sequences of the isolates.
Using different MS quantification strategies, it was shown that ASFV affects both static protein expression levels and protein synthesis. These changes in protein expression impact proteins and pathways known to be targeted by ASFV, including CD-markers, ER-stress and cell death pathways, and cellular antiviral responses. Beyond these observations that further validated the moMΦ infection model, novel effects of the ASFV infection on the cellular proteome were noticed.
These effects include the decreased expression levels of cathepsins, especially cathepsins D (CTSD), H (CTSH) and L (CTSL) as well as the transient activation of MAPK14/p38 prior to its strong downregulation. In addition to MAPK14/p38 further members of the MAPK14/p38 signaling pathway, like MAPKAPK2, were affected by ASFV infection.
As these modulations of the cellular proteome would in general result in decreased pro-inflammatory responses, it did stand out that the synthesis of interferon-response related genes including MX1 and ISG15 evaded the ASFV-induced global reduction of protein synthesis. In contrast, the synthesis of genes involved in RNA processing and splicing was significantly impaired. In total, the regulations of individual host proteins assessed in the context of the whole cellular proteome integrate well with each other and other cellular responses to ASFV infection and may help to improve the understanding of host-virus interactions.
Overall, this thesis provides novel insights into the expression of ASFV-encoded ORFs of different isolates and the host response to ASFV infection. It points out that the current knowledge of the ASFV coding capacity, temporal protein expression patterns, protein functionality, post-translational modifications and host interactions is still sketchy as many aspects of ASFV replication have yet to be understood. The established moMΦ-model to study ASFV infections in vitro provides a powerful tool for future applications to increase the understanding of ASFV biology.
Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASPV) ist ein wirtschaftlich wichtiger und in Haus- und Wildschweinen Hämorrhagie mit hoher Sterblichkeitsrate verursachender viraler Erreger.
1921 erstmals in Kenia beschrieben, breitete sich die ASP seit 2007 auch über den
Kaukasus, ins Baltikum (2014), weiter in europäische und asiatische Länder und seit 2020 in Deutschland aus. Trotz der hohen genetischen Stabilität des Afrikanischen
Schweinepestvirus (ASPV) wurden Genomvarianten identifiziert, bei denen Unterschiede
in der Genexpression von Multigenfamilien (MGF) dominieren. Letztlich divergieren ASPV-Stämme in ihrer Virulenz und verursachen akut-letale bis chronische Verläufe im Schwein. Aufgrund der enormen Komplexität des Virus und seiner vielfältigen
Immunevasionsstrategien sind viele Mechanismen der Virus-Wirts-Interaktion, die zur
Immunpathogenese beitragen, nicht ausreichend verstanden und erschweren somit die
Impfstoffentwicklung. Dabei können virale Subversionsmechanismen der Wirtszelle die
antivirale Immunantwort modulieren und stehen deshalb im Fokus dieser Arbeit. Zur
Charakterisierung und mechanistischen Aufklärung dieser ASPV-spezifischen
Immunsubversionsmechanismen wurden primäre porzine Monozyten von Hausschweinen
mit hochvirulentem (Armenia) und natürlich-attenuiertem (Estonia) ASPV infiziert. Die
Resultate ergaben sowohl stammunabhängige als auch -abhängige Unterschiede in der
Regulation myeloider Oberflächenmarker infizierter Monozyten. Insbesondere
beobachteten wir eine stammunabhängige Suppression des Phagozytose-regulierenden
CD172a und eine stammabhängige Regulation von porzinem MHC I (SLA I). Weitere
Experimente zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen ergaben, dass zwar
beide Stämme die Oberflächenexpression von CD172 unterdrücken, jedoch nur Armenia-,
im Gegensatz zu Estonia-infizierten Monozyten, eine reduzierte Recyclingrate sowie eine Abspaltung (Shedding) von CD172a von der Zelloberfläche zeigten. Dies lässt vermuten, dass die Virus-vermittelte Suppression von CD172a der beiden ASPV-Stämme auf unterschiedlichen Subversionsmechanismen beruht. Reinfektionsexperimente und
molekularbiologische Untersuchungen belegten zudem, dass das abgespaltene
Oberflächen-CD172a der Armenia-infizierten Monozyten mit einer gesteigerten
Infektionsrate einhergeht, dies ist wahrscheinlich das Ergebnis (entweder direkt oder indirekt) einer Komplexbildung zwischen dem virulenten Armenia-Virus und löslichem
CD172a. Im Gegensatz dazu resultierte die Infektion von Monozyten mit Armenia, jedoch nicht mit Estonia, in einem deutlichen Oberflächenverlust von porzinem SLA I, welches für die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T-Zellen essentiell ist. Weitere Versuche zeigten einen Reifungsdefekt von SLA I, der mit dem Abbau funktioneller ER-Strukturen und der Induktion von ER-Stress in Armenia-infizierten Monozyten in Zusammenhang stand. Gleichzeitig wurde eine deutlich reduzierte Überlebensfähigkeit Armenia-infizierter Monozyten beobachtet, die mit einem Verlust mitochondrialer Funktionen und der Bildung von Aggresomen aus fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma einherging. Vertiefende Analysen dazu zeigten einen Caspase-3 aktivierten Zelltodmechanismus und ein infektionsbedingtes, progressives Abschalten der Proteintranslation in Armenia-infizierten Zellen. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen den beobachteten
Subversionsmechanismen und der Expression bestimmter viraler MGF-Gene zu finden,
wurden weitere ASPV-Stämme in die Untersuchungen zur CD172a- und SLA I-Oberflächenexpression einbezogen. Ähnlich wie Armenia zeigte sich auch für die Stämme
NHV und OURT88/3 eine deutliche Reduktion der SLA I-Oberflächenlevel, auch wenn diese
in vivo gering-virulent sind. Andererseits zeigte das hochvirulente Benin97/1-Isolat im Gegensatz zu Armenia keine SLA I-Subversion, sondern ähnlich wie nach Estonia-Infektion kaum veränderte SLA I-Level, was vermuten lässt, dass der SLA I Subversionsmechanismus nicht alleinig den Virulenzgrad der ASPV-Stämme bestimmt. Ein direkter Genomvergleich identifizierte verschiedene Mitglieder der MGF110- und MGF505-Gene als möglicherweise beteiligte virale Genkandidaten. Im Gegensatz hierzu ergaben sich keine detektierbaren Unterschiede bei den Analysen zur Oberflächensuppression von CD172a innerhalb der verwendeten Isolate, wie bereits bei Armenia und Estonia Infektion beobachtet. Interessanterweise beobachteten wir dabei das Vorhandensein von MGF110-14 als eine genomische Gemeinsamkeit, die für die generelle Oberflächenreduktion von CD172a, zusätzlich zu anderen Genen, die ein Shedding und die Armenia-spezifische Interaktion bestimmen könnten, verantwortlich sein könnte.
Insgesamt zeigen die Resultate dieser Arbeit erstmals, dass das virulente ASPV Armenia, anders als das attenuierte ASPV Estonia, einen ausgeprägten Funktions- und Vitalitätsverlust in seinen primären Zielzellen (z. B. Monozyten) bewirkt. Die gesteigerte Infektiosität, Induktion von zellulärem Stress und Beeinträchtigung der SLA I-vermittelten Antigenpräsentation werden in infizierten Schweinen eine entscheidende Rolle in der Virus-Verbreitung und der Immunevasion spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Befunde dieser Arbeit neue und vertiefte Einblicke in die zellulären Mechanismen der SLA I- und CD172a-Subversion im Zusammenhang mit der Immunevasion durch hoch-virulentes ASPV Armenia und attenuiertes ASPV Estonia gibt und zudem wichtig für das bessere Verständnis der ASP-Immunpathogenese sind.
A significant fraction of the decaying algal biomass in marine ecosystems is expected to be mineralized by particle-associated (PA) heterotrophic bacterial communities, which are thus greatly contributing to large-scale carbon fluxes. Whilst numerous studies have investigated the succession of free-living (FL) marine bacteria, the community structure and functionality of PA bacterial communities remained largely unexplored and knowledge on specific contributions of these microorganisms to carbon cycling is still surprisingly limited. This has mostly been due to technical problems, i.e., caused by the enormous complexity of marine particles and the high abundance of eukaryotic microorganisms within these particles. This thesis presents (a) an optimized metaproteomics protocol for an in-depth characterization of marine PA bacteria, (b) an application example with FL and PA communities sampled during a spring phytoplankton bloom in 2009 in the North Sea, which confirmed the reliability of the optimized metaproteomic workflow, (c) the metaproteomic analysis of particulate communities sampled during a spring phytoplankton bloom in 2018, resulting in an as yet unprecedented number of identified protein groups of the bacterial response bloom and (d) a proteomic analysis of a PA bacterial isolate grown on the two naturally abundant marine polysaccharides laminarin and alginate. The observed succession of bacterial clades during metaproteomic analyses of the investigated blooms highlights individual niche occupations, also visible on genus level. Additionally, functional data shows evidence for the degradation of different marine polysaccharides e.g., laminarin, alginate and xylan supporting the important role of PA bacteria during the turnover of oceanic organic matter. Furthermore, most of the identified functions fit well with the current understanding of the ecology of an algal- or surface-associated microbial community, additionally highlighting the importance of phytoplankton-bacterial interactions in the oceans. More detailed insights into the metabolism of PA bacteria were gained by the proteomic characterization of a selected PA bacterial isolate grown on laminarin and alginate. Functional analyses of the identified proteins suggested that PA bacteria employ more diverse degradation systems partially different from the strategies used by FL bacteria.
Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Bakterien- und Hefestämme der Stammsammlung Biologie des Institutes für Mikrobiologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (SBUG) auf einen Umsatz von 9H-Carbazol untersucht. Neben Ralstonia spec. SBUG 290, Rhodococcus erythropolis SBUG 271 sowie den zwei im Rahmen dieser Arbeit als Pseudomonas putida identifizierten Stämmen SBUG 272 und SBUG 295 zählten zu den Bakterienstämmen 22 weitere noch nicht abschließend charakterisierte Isolate. Die geprüften Hefestämme umfassten neben 7 Vertretern der Gattung Trichosporon auch 19 nicht identifizierte Stämme. Basierend auf der für diese Mikroorganismen bereits nachgewiesenen Verwertung von Biphenyl beziehungsweise Dibenzofuran bestand die Hypothese, dass diese Stämme aufgrund von Strukturanalogien der Substrate auch in der Lage sind, weitere Heterozyklen zu transformieren. Angesichts des sehr breiten pharmakologischen Wirkungs- und Anwendungsspektrums von Carbazol-Derivaten wurde primär geprüft, inwieweit sich mit Hilfe dieser spezialisierten Mikroorganismen hydroxylierte Carbazol-Derivate als Ausgangssubstanzen für spätere Synthesen herstellen lassen. Da die verwendeten Bakterien im Gegensatz zu den Hefen zu einer Transformation von 9H-Carbazol befähigt waren, wurden mit diesen Stämmen Untersuchungen zur mikrobiellen Transformation von insgesamt 9 zusätzlichen stickstoffhaltigen Biarylverbindungen (2,3,4,9-Tetrahydro-1H-carbazol, 9-Methyl-9H-carbazol, Carbazol-9-yl-methanol, Carbazol-9-yl-essigsäure, 3-Carbazol-9-yl-propionsäure, 2-Carbazol-9-yl-ethanol, Acridin, 10H-Acridin-9-on, Phenazin) durchgeführt. Aufgrund der im Unterschied zu bisherigen Publikationen zum Umsatz von Biarylen festgestellten abweichenden Produktbildung bei Inkubation mit 9H-Carbazol wurden die Bakterienstämme für vergleichende Analysen ebenfalls auf die Transformation von Dibenzothiophen sowie 9H-Fluoren geprüft. Insgesamt wurden bei der Transformation der getesteten Biarylverbindungen 55 Produkte untersucht, von denen 34 bislang für Bakterien noch nicht beschrieben wurden. Basierend auf GCMS-, LCMS- und NMR-Analysen konnten insgesamt 29 Verbindungen identifiziert und für 14 Transformationsprodukte anhand der erhaltenen Daten vorläufige Strukturvorschläge unterbreitet werden. Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit für weitere 8 der in den Versuchen gebildeten Produkte bereits eine erste strukturanalytische Charakterisierung vorgenommen. In weiterführenden Versuchen wurden die durch die Bakterienstämme gebildeten Produkte als Substrate eingesetzt, um zu analysieren auf welche Weise die über primäre Hydroxylierungsreaktionen hinausgehenden Transformationen dieser Substanzen erfolgen. Dazu wurden, in erster Linie am Beispiel von Ralstonia spec. SBUG 290, insgesamt 28 der gebildeten Produkte auf einen weiteren Umsatz geprüft, darunter 14 Substanzen, die kommerziell nicht verfügbar sind und daher zuvor in größeren Mengen aus den Transformationsansätzen gereinigt wurden. Basierend auf diesen Untersuchungen konnten schließlich anhand der nachgewiesenen Produkte Aussagen zu den durch die Stämme katalysierten Transformationswegen abgeleitet werden. In Versuchen mit dem rekombinanten Stamm Escherichia coli DH5alpha SBUG 1575, der die Gene bphA1–A3 der Biphenyl-2,3-dioxygenase aus Ralstonia spec. SBUG 290 trägt, wurde die Beteiligung dieses Enzyms am Umsatz der eingesetzten Biarylverbindungen untersucht.
In this study the potential of molecular RT-PCR based methods for diagnostic or epidemiological investigations concerning negative-sense RNA viruses should be demonstrated exemplary for orthobunyaviruses (segmented genome) and lyssaviruses (non segmented genome). The recent discovery of a novel orthobunyavirus from the Simbu serogroup, Schmallenberg virus (SBV), via next generation sequencing and metagenome analysis led to the development of novel molecular detection methods. Due to the potential emergence of further orthobunyaviruses from the Simbu serogroup, a generic pan-Simbu real-time RT-PCR system was developed. This system was able to detect all tested Simbu serogroup viruses. As additional feature a species classification via sequencing is possible. Moreover, the novel pan-Simbu real-time RT-PCR system seems to offer a broad detection spectrum for orthobunyaviruses in general. Hence, this protocol allows a broad screening of samples predominantly for Simbu serogroup virus genomes but also might allow the identification of some related orthobunyaviruses in mammalian or insect samples. A comparison of the pan-Simbu real-time RT-PCR system with diagnostic real-time RT-PCRs revealed an overall higher sensitivity of the diagnostic assays for SBV detection. The diagnostic SBV-S3 assay convinced with the highest sensitivity and reliability for SBV detection. Additionally, the SBV-M1 assay turned out as highly specific for SBV and therefore is a valuable tool for a precise diagnosis in geographical regions where multiple orthobunyaviruses are endemic. Furthermore, the SBV genome diversity in Germany was investigated using a molecular epidemiological approach. Genome variability was extremely high in the N-terminal region of the putative envelope glycoprotein Gc which might have an impact on immunogenicity or host-cell infection. Phylogenetic analyses indicated that sequence variation is independent of host species and geographical distribution. In contrast to SBV as a novel pathogen, rabies encephalitis (caused by the prototype lyssavirus Rabies virus) is known for more than 4000 years. Thus numerous molecular techniques have been developed for lyssavirus detection, considering the diversity of this genus they all have certain limitations as regards their diagnostic range. Results of a lyssavirus ring trial among European laboratories indicate that RT-PCR could be a highly reliable diagnostic tool if at least two independent tests with broad diagnostic range are applied. Another approach suggested that a change from two-step to one-step PCR strategy or a variation of the RT-chemistry may have a remarkable influence on assay performance. However, no ultimate approach or strategy has been found yet, that would facilitate rabies routine diagnosis or epidemiological surveys on molecular grounds. Thus, there is a need for a potent, reliable and practical system for lyssavirus diagnosis and characterization, suitable as a second diagnostic line next to classical techniques like the fluorescent antibody test. For this purpose a diagnostic two level cascade protocol was developed with emphasis on the most relevant European lyssaviruses. On a first level two independent generic pan-lyssavirus screening assays, targeting different genomic regions, were applied. On a second level two probe-based species-specific multiplex PCR systems for the rapid classification of European lyssaviruses were used. All applied assays displayed an overall highly sensitive and specific detection with an excellent reproducibility and repeatability. Moreover, the diagnostic cascade protocol combines all known advantages of the real-time PCR technology including speed and reduced risk of cross-contamination with improved safety of molecular testing based on a double-check strategy for the screening as well as the confirmatory assays. In the frame of the second Bokeloh bat lyssavirus case in a German bat, the capability of real-time PCR for the quantification of viral loads was demonstrated. Another convenient example for the potential of molecular RT-PCR based methods is the epidemiological investigation of the rabies epizootic in Namibian kudu antelopes. Phylogenetic analyses of a 602 bp fragment of the nucleoprotein gene indicated a separate grouping of the Rabies virus (RABV) isolates from kudu apart from RABV isolates from jackals. Full genome sequencing revealed unique mutations in the glycoprotein gene of RABV isolates from kudu, suggesting an independent rabies cycle in Namibian kudu antelopes. All given examples were used to illustrate the application spectrum of molecular RT-PCR based methods for diagnostic or epidemiological purposes. The advantages of molecular techniques were emphasized and in particular real-time RT-PCR systems proved their fitness for purpose and appear to represent standard techniques for the next decade.
Molekular-epidemiologische Untersuchungen veterinärmedizinisch relevanter Pathogene beruhen auf der Auswertung und Einordnung verlässlicher und detailreicher Sequenzinformationen. In den letzten Jahren haben sich die Sequenziermethoden des sogenannten Next-Generation Sequencing (NGS) kontinuierlich weiterentwickelt, so dass nun Nukleinsäureproben unterschiedlichster Herkunft zur Volllängensequenzierung viraler Genome herangezogen werden können. Des Weiteren sind Metagenomanalysen möglich geworden, d.h. die Untersuchung der Zusammensetzung der Organismenpopulation in einer Probe durch Sequenzierung der gesamten Nukleinsäurepopulation. Letzteres erlaubt auch die Untersuchung viraler Varianten in einer Probe (Quasispeziesanalysen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden NGS-Methoden und Arbeitsabläufe zur Ausnutzung metagenomischer Datensätze optimiert, verfeinert und nachfolgend in praxisrelevanten Studien zu Lyssa- und Coronaviren erprobt. In einer ersten Studie zur Charakterisierung des neu entdeckten Bokeloh Fledermaus-Lyssavirus konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, akkurate Volllängensequenzinformationen direkt aus Zellkulturüberständen zu generieren, die nicht nur die mittels der klassischen Kettenabbruch-Synthese generierten Daten bestätigen, sondern darüber hinaus auch virale Varianten aufzeigen. Eine detaillierte, hochauflösende Variantenanalyse (Tiefensequenzierung) lag im Fokus einer weiteren Studie zu Lyssaviren. Hier wurden kommerzielle Oralimpfstoffe gegen die Tollwut und ihre Ausgangsvirusstämme hinsichtlich ihrer Quasispezieszusammensetzung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Tiefensequenzierung einen wichtigen Beitrag zur Qualitätskontrolle (Stammidentität und -stabilität) eines Lebendimpfstoffes liefern kann, der in den Lizensierungsprozess eingebunden werden könnte. Dabei ist die Analyse auf Ebene der viralen Gesamtpopulation der Auswertung auf Konsensusebene überlegen. Metagenomische Datensätze erlauben nicht nur die Analyse viraler Populationen, es sind auch Wirtsinformationen ableitbar. Die kombinierte Auswertung viraler und wirtsspezifischer Informationen erlaubte eine phylogeographische Studie zur genetischen Diversität arktischer Tollwutviren und ihrer Reservoirwirte. Die Methode konnte erfolgreich angewendet werden um zu zeigen, dass es zwar eine räumliche Populationsstruktur bei den untersuchten Polarfüchsen gibt, diese jedoch nicht mit unabhängigen Tollwutvirusvarianten assoziiert werden können. Neben den oben genannten Lyssavirusprojekten waren zwei Studien zum Virus der porzinen epidemischen Diarrhoe Teil der vorliegenden Arbeit. Metagenomische Datensätze wurden verwendet, um Volllängensequenzen abzuleiten und diese phylogenetischen Detailanalysen und Netzwerk-Untersuchungen zu unterziehen. Außerdem konnten die Datensätze verwendet werden, um virale und bakterielle Koinfektionen zu untersuchen, die möglicherweise einen Einfluss auf die Schwere der Erkrankung gehabt haben könnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass uns die optimierten NGS-Methoden in die Lage versetzen, metagenomische Datensätze zu nutzen, um nicht nur unverfälschte Volllängensequenzen für phylogenetische Detailanalysen zu generieren, sondern auch Quasispezies-Analysen durchzuführen sowie Wirts- und Virusfaktoren vergleichend zu untersuchen.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene grundlegende Ansätze zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest entwickelt und teilweise evaluiert. Die ersten beiden befassten sich mit der Impfstoffentwicklung, wobei einerseits eine vektorbasierte Strategie verfolgt und zum anderen auf eine attenuierte ASPV Lebendvakzine hingearbeitet wurde. Die dritte Herangehensweise war auf die Inhibierung der viralen Replikation in Schweinezellen mittels CRISPR/Cas9 fokussiert, um Hinweise auf die generelle Anwendbarkeit des Systems in transgenen Schweinen zu gewinnen.
Der Pseudorabies-Virus Impfstamm Bartha (PrV-Ba) wurde als potenzieller Vektor für die Expression von ASPV-Antigenen im Schwein gewählt. Dazu wurde zunächst eine Methode etabliert, mit der PrV-Rekombinanten effizient generiert werden konnten. Dabei erwies sich die Verwendung eines artifiziellen bakteriellen Chromosoms (BAC), welches das infektiöse PrV-Genom enthielt, als hilfreich. In diesem wurde ein essentielles PrV-Gen inaktiviert, dass dann durch homologe Rekombination mit einem Transferplasmid in co-transfizierten Säugerzellen rekonstituiert werden konnte. Durch gleichzeitiges CRISPR/Cas9-vermitteltes Schneiden der BAC-DNA am gewünschten Insertionsort konnte die Rekombinationsrate weiter gesteigert werden. Diese Strategie wurde anschließend für die Insertion verschiedener ASPV Gene in das PrV-Genom genutzt, wobei unterschiedliche Promotoren und Kodonoptimierungen getestet wurden. In den meisten Fällen konnten durch Verwendung des CAG-Promotors und eine Kodonadaptation an porcine Gene die höchsten Expressionsraten erreicht werden. Somit wurde eine Methode entwickelt, mit der prinzipiell alle ASPV Gene im PrV Vektorsystem exprimiert und in Impfstudien getestet werden könnten.
In der zweiten Untersuchung wurden zwei Proteine des ASPV mittels monospezifischer Antiseren näher charakterisiert und ASPV-Deletionsmutanten generiert, um Hinweise auf die Funktionen der Proteine zu erhalten. Bei diesen Proteinen handelte es sich um p285L und pK145R. Sie wurden anhand von Daten aus einer vorhergehenden Proteomanalyse von Keßler et al. (2018) ausgewählt, da sie in großen Mengen in ASPV infizierten Zellen nachgewiesen wurden und deshalb wichtige Funktionen (beispielweise auch Virulenz-determinierende Funktionen) haben könnten. Bei p285L handelt es sich um ein früh exprimiertes Virionprotein, das zunächst in den sogenannten Virusfabriken infizierter Wildschweinlungenzellen (WSL) akkumuliert. pK145R ist ein spätes ASPV Protein, das in Virionen nicht nachweisbar ist und eine diffuse Verteilung im Zytoplasma infizierter Zellen zeigt. Beide Proteine sind für die Virusreplikation nicht essentiell, und ihre Deletion führte zu keiner (285L) oder einer nur mäßigen (K145R) Titerreduktion in infizierten WSL Zellen oder primären Blutzellkulturen (PBMC). Durch in vivo Analysen der Deletionsmutanten muss nun geklärt werden, ob p285L und pK145R für die Virulenz bzw. die Wechselwirkung von ASPV mit dem Wirtsimmunsystem wichtig sind und ob sich die Mutanten deshalb als lebend attenuierte Impfstoffe eignen könnten.
In der dritten Studie wurde untersucht, ob das CRISPR/Cas9 System zur Inhibition der ASPV Infektion in vitro geeignet ist. Dazu wurden WSL-Zelllinien generiert, die Cas9 und verschiedene sgRNAs konstitutiv exprimierten. Durch die Expression einer sgRNA gegen das Gen des ASPV Phosphoproteins p30 (CP204L) wurde die Virusreplikation nahezu komplett inhibiert. Die Spezifität des Effektes konnte durch parallele Versuche mit einem Virusisolat, dessen Zielsequenz nicht mit der genutzten sgRNA Sequenz übereinstimmte, gezeigt werden. Dieses ASPV Isolat konnte im Gegensatz zum Virus mit der passenden Zielsequenz in den rekombinanten Zellen genauso gut replizieren, wie in nicht modifizierten Zellen. Zudem wurde die Spezifität durch die Analyse von sporadisch auftretenden Escape-Mutanten bestätigt, die verschiedene Basenaustausche in der Zielsequenz aufwiesen. Somit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9 System eine effiziente Inhibition der ASPV Replikation in Zellkultur bewirken kann und deshalb möglicherweise auch in entsprechenden transgenen Schweinen eine Resistenz gegen letale ASPV-Infektionen vermitteln könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen drei Studien grundlegende Experimente erfolgreich durchgeführt wurden, die zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest beitragen können.
Von den bisher beschriebenen atypischen Pestiviren ist das Bungowannah-Virus das genetisch und antigenetisch am weitesten von den klassischen Pestiviren entfernte Virus-Isolat. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das N-terminale Protease-Protein Npro des Bungowannah-Virus analysiert und charakterisiert. Es konnte die volle funktionelle Kompatibilität des Bungowannah-Virus-Npro in einem BVDV-1-Hintergrund (vCP7_Npro-Bungo) demonstriert werden. Trotz einer sehr geringen Aminosäuresequenzidentität von Bungowannah-Virus-Npro und CP7-Npro zeigten das parentale BVDV-1 CP7 sowie das neu generierte Virus vCP7_Npro-Bungo ein vergleichbares Replikationsverhalten in bovinen Zellen. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass das Bungowannah-Virus-Npro die Funktionen des CP7-Npro als Autoprotease, aber auch als Interferon-Antagonist, vollständig übernehmen kann und sich demnach trotz der großen Sequenzunterschiede nicht von den pestiviralen Npro-Proteinen der klassischen Spezies innerhalb des Genus unterscheidet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Zelltropismus des Bungowannah-Virus analysiert. Vergleichende Studien erfolgten mit ausgewählten klassischen (BVDV-1, BVDV-2) und atypischen Pestiviren (HoBi-Virus, Giraffe-Virus und Pronghorn Antilope-Virus). Dabei zeigte das Bungowannah-Virus den breitesten Zelltropismus und war im Gegensatz zu den anderen Pestiviren in der Lage, Primaten-, Fledermaus-, Human- und Mauszellen zu infizieren und dort zu replizieren. Um die Bedeutung der Virushülle für den außergewöhnlichen in vitro-Zelltropismus des Bungowannah-Virus zu untersuchen, wurde mittels heterologer Komplementierung ein chimäres rekombinantes Virus generiert, in dem die BVDV-Strukturproteine (C, Erns, E1 und E2) durch die des Bungowannah-Virus substituiert wurden (vCP7_C-E2-Bungo). Mit Hilfe der Chimäre konnte demonstriert werden, dass die Virushülle des Bungowannah-Virus allein nicht ausreicht, um den erweiterten Zelltropismus auf BVDV zu übertragen. Einzig das Bungowannah-Virus war in der Lage, effizient in Affen-, Fledermaus- und Humanzellen zu replizieren. In einigen Zelllinien (Zellen der Westlichen Grünen Meerkatze, Human- und Fledermauszellen) ist daher nicht die Virushülle allein, sondern vielmehr das Zusammenspiel des Replikationskomplexes mit den Strukturproteinen entscheidend. Die Empfänglichkeit von Fledermauszellen für das Bungowannah-Virus und die darüber hinaus erreichten hohen Virustiter in diesen Kulturen werfen die Frage nach einem möglichen Ursprung des Bungowannah-Virus in der Ordnung Chiroptera auf. Möglicherweise kam es zu einer Spill-over-Infektion und schnellen Anpassung des Erregers an Vertreter der Ordnung Artiodactyla. Da bislang keine monoklonalen Antikörper zum Nachweis von Bungowannah-Virus-Proteinen existierten, wurden am FLI neu etablierte monoklonale Antikörper auf ihre Proteinspezifität untersucht. Die Charakterisierung dieser Bungowannah-Virus-spezifischen monoklonalen Antikörper unter der Verwendung verschiedener chimärer Pestiviren erlaubte die Identifizierung von 18 Bungowannah-Virus-Erns- und einem Bungowannah-Virus-E2-spezifischen monoklonalen Antikörper. Diese sind wichtige Werkzeuge für zukünftige wissenschaftliche Untersuchungen und für die Etablierung einer einfachen und effizienten Bungowannah-Virus-Diagnostik, welche bei einem erneuten Ausbruch des Virus in australischen Schweinehaltungen oder in anderen Regionen der Welt von großer Bedeutung sein kann.
Herpesviren nutzen einen Vesikel-vermittelten Transportweg für die Translokation von Nukleokapsiden aus dem Zellkern, um für die weitere Virusmorphogenese in das Zytoplasma zu gelangen. Den dafür notwendigen Kernfreisetzungskomplex (nuclear egress complex; NEC) bilden zwei konservierte herpesvirale Proteine, die als pUL34 und pUL31 bezeichnet werden. Die Kristallstrukturen der NECs aus verschiedenen Herpesviren zeigten eine stabile Interaktion zwischen der N-terminalen Domäne von pUL31 und dem Kern von pUL34. Darüber hinaus gehören die am stärksten konservierten Reste von pUL31 zu einem Zinkfinger-Motiv (ZNF). Zur Klärung der funktionellen Bedeutung des ZNF-Motivs in PrV pUL31, das aus drei Cysteinen (C73, C89 und C92) der CR1 und einem Histidin (H188) der CR3 besteht, wurden die Cysteine einzeln zu Serinresten und das Histidin H188 zu Alanin substituiert. Funktionelle Analysen der mutierten Proteine, die in vitro mit artifiziellen Membranen und in situ in eukaryotischen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass das ZNF-Motiv eine wesentliche Voraussetzung für die NEC-Bildung und die notwendige Membranveränderung darstellt. Der N-terminale Bereich von pUL31 und der anderen Homologen ist sehr variabel und wurde daher in den Konstrukten für die Kristallisierung weggelassen. Wie auch einige andere pUL31-Homologe enthält PrV pUL31 ein Kernlokalisationssignal (NLS) im N-Terminus für einen effizienten Kernimport. Neben der Funktionalität des Kernimports scheint dieser spezifische Bereich ebenfalls eine Rolle bei der Freisetzung von Nukleokapsiden aus dem Kernspalt, der Vorbeugung von einer vorzeitigen Komplexbildung im Zytoplasma, der Translokation der reifen Kapside an die INM und bei der Regulierung des envelopment/deenvelopment Prozesses über Phosphorylierung zu spielen. Um zu untersuchen welche zusätzlichen Funktionen der N-terminale Bereich einnimmt, wurde der N-Terminus von PrV pUL31 schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 2-13 (pUL31-N14), einschließlich des Hauptteils des vorhergesagten NLS, für die NEC-Bildung und -Funktion entbehrlich sind. Die Deletion von vier zusätzlichen Aminosäuren (pUL31-N18), die alle grundlegenden Patches eliminierte, führte jedoch zu einem defekten Protein. Die vollständige Deletion der 25 N-terminalen Aminosäuren zeigte in Gegenwart von Wildtyp pUL31 eine Inhibierung des Kernaustritts. pUL31-N18, was überwiegend im Zytoplasma gefunden wurde, zeigte keinen dominant-negativen Effekt. Die Phosphorylierung der beiden vorhergesagten Stellen im N-Terminus von PrV pUL31 (S12/S13) spielt offensichtlich keine Rolle beim Kernaustritt. Die Titer von PrV-Mutanten denen pUL34 oder pUL31 fehlt, werden drastisch reduziert, jedoch die Freisetzung infektiöser Nachkommen nicht komplett inhibiert, was auf einen alternativen Austrittsweg hinweist. Wiederholtes Passagieren dieser Mutanten führte zu Revertanten, die eine Wildtyp-ähnliche Replikation wiedererlangten. PrV-ΔUL34Pass und PrV-ΔUL31Pass umgingen dabei den vesikulären Transportweg durch das Induzieren einer Fragmentierung der Zellkernmembran (NEBD). Um zu testen, ob CDKs eine Rolle im viral induzierten NEBD spielen, wurden Wildtyp- (wt) oder dominant-negative (DN) Versionen der zellulären CDKs 1-6 getestet. In Gegenwart von CDK2DN wurden die Titer für beide Viren signifikant reduziert. Ultrastrukturelle Analysen zeigten, dass die Freisetzung von PrV-Ka primären Virionen aus dem perinukleären Raum beeinträchtigt oder verzögert war und NEBD nur selten in PrV-ΔUL34Pass-ΔgG-CDK2DN-infizierten Zellen beobachtet wurde. Die genaue Zusammensetzung der primären Virionen sowie der Maschinerie für die Verschmelzung der primären Hülle mit der äußeren Kernmembran sind nicht bekannt. Um virale und/oder zelluläre Proteine und andere primäre Virion-Komponenten zu identifizieren, sollen primär umhüllte Virionen aus dem perinukleären Raum isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert werden. Da die Reinigung der primären Virionen aus dem perinukleären Raum nicht ganz einfach ist, wurde das membranverankerte pUL34 mit verschiedenen Affinitätsmarken markiert. Vier markierte pUL34-Konstrukte wurden nach Transfektion und Infektion generiert und getestet. Drei von ihnen erwiesen sich als funktionell während des herpesviralen Kernaustritts und es konnten stabil exprimierende Zelllinien hergestellt werden. Diese Zelllinien bilden nun eine solide Grundlage für weitere Experimente, um zuverlässige Protokolle für die Reinigung von primären Virionen aus dem perinukleären Raum zu etablieren.
Das durch Gnitzen übertragene Schmallenberg-Virus (SBV) wurde erstmals im Herbst 2011 nahe der deutsch-niederländischen Grenze nachgewiesen und hat sich in der Folge rasant in Europa ausgebreitet. SBV gehört zur Simbu-Serogruppe innerhalb des Genus Orthobunyavirus, Familie Bunyaviridae, und stellt das erste in Europa nachgewiesene Virus dieser Serogruppe dar. SBV infiziert hauptsächlich Wiederkäuer, in denen schwere fetale Missbildungen und Aborte ausgelöst werden können, wenn naive Muttertiere in einem kritischen Zeitfenster während der Trächtigkeit infiziert werden. Effiziente Lebendimpfstoffe gegen SBV oder verwandte Simbuviren sind bisher nicht verfügbar.
Für die molekularbiologische Charakterisierung des neu aufgetretenen Virus wurde im Rahmen dieser Arbeit ein reverses genetisches System entwickelt, welches unter anderem für die Generierung von geeigneten attenuierten Lebendvakzinen genutzt werden sollte. In Anlehnung an einen sicheren und effizienten Impfstoffkandidaten gegen das Bunyavirus Rift Valley Fever-Virus wurden SBV-Mutanten mit Deletionen der Nichtstrukturproteine NSs und NSm generiert. Dabei zeigte sich, dass beide Nichtstrukturproteine von SBV für die Entstehung infektiöser Virionen nicht essentiell sind. In einer Impfstudie wurde gezeigt, dass eine einmalige Vakzinierung mit der ΔNSs/ΔNSm-Doppelmutante eine effiziente Immunantwort in Rindern induziert und zum vollständigen Schutz vor einer SBV-Belastungs-Infektion führt. Damit bietet die Doppel-Deletionsmutante eine Basis für die Entwicklung sicherer und effizienter SBV-Lebendimpfstoffe und könnte auch als Modell für weitere Viren der Simbu-Serogruppe und verwandte Orthobunyaviren dienen.
Mit Hilfe zahlreicher neu generierter NSm-Deletionsmutanten wurde das NSm, dessen Funktion bei Orthobunyaviren weitestgehend ungeklärt ist, näher charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass das reife NSm (Domäne II bis V) für das Viruswachstum in Mammalia-Zellkulturen nicht essentiell ist und dass Domäne I die Signalsequenz von Domäne V ersetzen kann.
Mit dem im Rahmen dieser Arbeit etablierten SBV-spezifischen NSm-Antikörper konnte erstmals das NSm eines Virus der Simbu-Serogruppe intrazellulär nachgewiesen werden. Dabei wurde eine Lokalisation des NSm im endoplasmatischen Retikulum und eine von Domäne IV abhängige Ko-lokalisation von SBV-NSm mit dem Glykoprotein Gc im Golgi-Apparat beobachtet
Molekulare Mechanismen der Adaptation sowie Impfstudien zur Bekämpfung von aviären Influenza-A-Viren
(2010)
Wildvögel stellen die natürlichen Wirte und das Hauptreservoir für Influenza-A-Viren dar. Einige Influenza-Stämme konnten sich zudem an verschiedene Säugetierarten wie Mensch, Schwein oder Pferd anpassen. Die molekularen Mechanismen der Adaptation von Influenza-A-Viren an einen neuen Wirt sind komplex. Sie werden u. a. auf eine modifizierte Interaktion viraler Proteine mit Wirtszellproteinen zurückgeführt, die in Verbindung mit dem Auftreten von Punktmutationen in viralen Proteinen, vor allem den Polymeraseproteinen, steht und zu einer optimierten Replikation von Influenza-A-Viren im neuen Wirt führen kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden molekulare Werkzeuge entwickelt, die der Identifizierung wirtsspezifischer Interaktionspartner der viralen Ribonukleoprotein-Komplexe (vRNP) dienen können. Dazu wurden mittels reverser Genetik rekombinante Influenza-A-Viren unterschiedlichen Wirtsspektrums mit einem Strep-tag als Markierung am C-Terminus der Polymerase-Untereinheit PB2 generiert. Zu den verwendeten Viren zählten das humane A/HongKong/1/68 (H3N2), die beiden speziesübergreifenden Viren A/swan/Germany/R65/06 (H5N1) (‚R65‘) sowie A/seal/Massachusetts/1/80 (H7N7) und das aviäre A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8). Durch Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen wurde die stabile Expression des Strep-PB2-Fusionsproteins in infizierten Zellen bestätigt. Es wurde zudem gezeigt, dass die markierten Viren auf Säuger- und Vogelzellen vergleichbar mit den entsprechenden unmarkierten Viren replizieren. Anhand des Strep-getaggten PB2-Proteins des R65-Virus wurden erfolgreich virale RNP-Komple xe aus infizierten Säuger- und Vogel-Zellen mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt und deren vier Protein-Bestandteile PB2, PB1, PA und NP durch MALDI-tof-Massenspektrometrie identifiziert. Die Palette getaggter Viren bildet die Grundlage für weiterführende Studien zur Untersuchung Virus-Wirt-spezifischer Wechselwirkungen, die für den Wirtswechsel und die Adaptation von Influenza-A-Viren entscheidend sein können. Die Entstehung des pandemischen Influenza-Virus A/HongKong/1/68 (H3N2) (‚Hk68‘) geht auf ein Reassortment zwischen dem zuvor zirkulierenden humanen H2N2-Virus und einem aviären H3-Stamm zurück. Hierbei wurden die Segmente des humanen Virus, die für das Rezeptor-bindende Protein Haemagglutinin (HA) und die Polymerase-Untereinheit PB1 kodieren, gegen die entsprechenden Segmente des aviären H3-Virus ausgetauscht. Bei einem Sequenzvergleich zwischen dem Hk68-PB1 und dem PB1 des dem unbekannten aviären Donor nahestehenden Isolates A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (‚dUk‘) wurden lediglich sechs Unterschiede in der Aminosäuresequenz identifiziert, die möglicherweise Folge der Adaptation des Hk68-Virus an den humanen Wirt sind. Nach dem Einfügen der einzelnen Mutationen in das dUk-PB1 wurden homologe RNP-Komplexe (PB2, PB1 und PA sowie NP von Hk68) und heterologe RNP-Komplexe (PB2, PA, NP von Hk68 und PB1 bzw. PB1-Punktmutante von dUk) in transfizierten Säugerzellen rekonstituiert. Mit Hil fe eines Luciferase-Reportertests konnte gezeigt werden, dass der heterologe Hk68/dUk-PB1-Komplex im Vergleich zum homologen Hk68-Komplex eine um 50% erniedrigte Polymerase-Aktivität aufweist. Dieser negative Effekt konnte durch das Einfügen der Mutation PB1 I12V in das dUk-PB1, aber nicht durch eine der anderen fünf Punktmutationen, vollständig aufgehoben werden. Folglich könnte es sich bei dieser Mutation um eine adaptive Mutation handeln. Untersuchungen an in vitro rekonstituierten RNP-Komplexen anderer Viren konnten diese Theorie unterstützen. Wachstumskinetiken des homologen Hk68- und dUk-Virus sowie von ihnen abgeleiteter PB1-Reassortanten und PB1-Mutanten deuteten ebenfalls auf einen Einfluss von Aminosäureposition 12 im PB1-Protein auf die Virusreplikation hin. Mit Hilfe eines ELISAs durchgeführte Bindungsstudien zwischen den PA-Proteinen verschiedener Influenza-A-Viren und PB1-Peptiden mit Valin oder Isoleucin an Position 12 legten zudem eine Zu- bzw. Abnahme der Af finität zwischen PA und PB1 als Ursache für die veränderte Polymeraseaktivität nahe. Hochpathogene aviäre Influenza-A-Viren (HPAIV) vom Subtyp H5 oder H7 verursachen enorme wirtschaftliche Schäden und stellen eine potentielle Bedrohung für den Menschen dar. Die Entwicklung effektiver Impfstoffe ist deshalb in vielfacher Hinsicht sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels reverser Genetik eine Elastase-abhängige Mutante des HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1), genannt R65-E, als potentielle lebend-attenuierte Vakzine erzeugt. Dazu wurde die polybasische Spaltstelle im HA des hochpathogenen Virus gegen eine Spaltstelle für die in vivo kaum verfügbare Protease Elastase ersetzt. In vitro wurde mit Hilfe von Plaquetests, Wachstumskinetiken und Western-Blot-Analysen die strikte Abhängigkeit der R65-E-Replikation und der R65-E-HA-Spaltung von Elastase nachgewiesen. Im Gegensatz zum R65-Wildtyp war die R65-E-Mutante in vivo aufgrund der Abwesenheit von Elastase auf einen Replikationszyklus beschränkt und somit hochgradig attenuiert. Insgesamt erwies sich die R65-E-Mutante im Huhn jedoch als wenig immunogen. So kam es 7 Tage nach okulonasaler Infektion von Eintagsküken lediglich zu einer schwachen zellulären Immunantwort basierend auf CD8+ zytotoxischen T-Zellen in der Milz. Eine Antikörper-Antwort wurde nach o kulonasaler oder in ovo Infektion nur bei jeweils einem von zehn bzw. einem von sieben Tieren induziert. Das Vorhandensein H5-spezifischer Antikörper korrelierte hierbei mit einem Schutz der Tiere gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen HPAIV R65. Gleichermaßen ging die Abwesenheit H5-spezifischer Antikörper bei den übrigen Versuchstieren mit einem letalen Verlauf der homologen R65-Belastungsinfektion einher. Ein partieller Schutz gegen eine heterosubtypische Belastungsinfektion mit dem HPAIV R65-H9R66mutR65 sowie eine reduzierte Virusausscheidung bei einigen Tieren der Boostergruppe, die drei Wochen nach okulonasaler Infektion eine zweite Dosis R65-E erhalten hatten, deuteten auf eine R65-E-induzierte zellvermittelte Schutzwirkung hin. Es ist zu vermuten, dass die R65-E-Mutante in vivo überattenuiert war und aus diesem Grund keine protektive Immunabwehr induzieren konnte. R65-E eignet sich daher nicht als lebend-attenuierte Geflügelvakzine.
Die Glykoproteine gB und gH-gL sind bei allen Herpesviren konserviert und wichtig für den Viruseintritt und die direkte Zell-Zell-Ausbreitung. Allerdings kann sich PrV in Abwesenheit von gL noch in einem sehr geringen Ausmaß von Zelle zu Zelle ausbreiten, was Reversionsanalysen durch serielle Zellkultur-Passagen einer gL-negativen PrV-Mutante erlaubt. So konnte in einem Passageexperiment die Revertante PrV-ΔgLPassB4.1 isoliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen der gL-unabhängigen Infektiosität von PrV-ΔgLPassB4.1 untersucht. Dabei wurden Mutationen in den Glykoproteinen gB, gH und gD nachgewiesen und deren Auswirkung auf die Proteinfunktion mit Hilfe von transienten Transfektions-Fusionsassays untersucht. Die Aufklärung der Kristallstrukturen eröffnete die Möglichkeit, über zielgerichtete Mutagenese die Funktion von gH-gL besser zu analysieren. Erstaunlich war, dass im gH des Impfstammes PrV-Bartha ein ansonsten hochkonserviertes Prolin durch Serin ersetzt ist. Für dieses Prolin wurde postuliert, dass es für die Ausbildung einer ebenfalls bei allen Herpesviren konservierten Disulfidbrücke notwendig ist. Um den Effekt der Substitution und die Funktion der Disulfidbrücke zu testen, wurden gH Mutanten hergestellt, die entweder Prolin oder Serin an Position 438 oder Serin statt Cystein an Position 404 exprimierten. Diese wurden in transienten Transfektions-Fusionsassays sowie während einer Virusinfektion getestet. Obwohl die Aminosäuresequenzen der gH-Proteine der Herpesviren nur eine geringe Homologie aufweisen, sind die Kristallstrukturen erstaunlich ähnlich. Daher sind konservierte Strukturmotive wie die Disulfidbrücke in der Domäne III, für die eine Bedeutung für die Faltung und Stabilität der Domäne III postuliert wurde, von besonderem Interesse. Um weitere funktionsrelevante konservierte Regionen in Domäne III aufzudecken, welche für die Lokalisierung und Funktion des gH wichtig sein könnten, wurden zunächst Sequenzvergleiche zwischen EBV und PrV gH unter Berücksichtigung der vorhandenen gH-Kristallstrukturen durchgeführt. Hierbei wurden komplexe Interaktionsnetzwerke über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen konservierten und benachbarten nicht-konservierten Aminosäuren vorhergesagt. Diese wurden im EBV und PrV gH mutiert und die gH-Proteine anschließend auf ihre Oberflächenexpression und Fusionsfunktion untersucht. Zusätzlich wurden PrV Rekombinanten mit entsprechenden gH-Mutationen hergestellt und charakterisiert.
Herpesviren nutzen zwei unterschiedliche Zellkompartimente für die Morphogenese. Während der Kapsid-Zusammenbau und die DNA Verpackung im Zellkern stattfinden, erfolgt die weitere Assemblierung im Zytoplasma. Um dorthin zu gelangen muss die Kernmembranbarriere überwunden werden. Hierfür knospen die Nukleokapside an der inneren Kernmembran und erhalten dort eine primäre Virushülle, die allerdings nach Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren geht. Für diesen als envelopment-deenvelopment bezeichneten Vorgang ist ein Komplex aus zwei viralen Proteinen notwendig. Er besteht aus pUL34, einem Membranprotein der Kernmembran und dessen Interaktionspartner pUL31. Beide Proteine allein reichen aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran abzuschnüren. Ziel dieser Arbeit war, diesen nuclear egress weiter zu charakterisieren. Hierfür sollte zunächst geklärt werden, welche Domänen von pUL34 für dessen korrekte Lokalisierung in der Kernmembran und der Interaktion mit dem Komplexpartner pUL31 notwendig sind. Dazu wurden chimäre Proteine aus Teilen des pUL34 und zellulären Proteinen der inneren Kernmembran hergestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die pUL34-Transmembrandomäne keine virusspezifische Funktion besitzt und durch entsprechende Bereiche zellulärer Proteine ausgetauscht werden kann. Auch die Erweiterung der Substitution auf 50 C-terminale Aminosäuren führte zu einem funktionellen Protein, während ein Konstrukt mit einem Austausch von 100 C-terminalen Aminosäuren durch entsprechende Lap2ß Sequenzen den Defekt der PrV-deltaUL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementieren konnte. Dennoch war noch immer eine Interaktion mit dem Komplexpartner möglich. Dies zeigte, dass zwischen den C-terminalen Aminosäuren 50 und 100 ein virusspezifischer, funktionell wichtiger Bereich liegt, der in nachfolgenden Arbeiten weiter eingegrenzt werden muss. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 1-162 des PrV pUL34 für die Interaktion mit pUL31 ausreichen. Für das engverwandte HSV-1 konnte dieser Bereich jedoch auf die Aminosäuren 137 und 181 eingegrenzt werden. Um dies für PrV pUL34 näher zu untersuchen wurde das Konstrukt pUL34-LapNT hergestellt, bei dem die 100 N-terminalen Aminosäuren durch Lap2ß Sequenzen ersetzt wurden. Hier zeigte sich jedoch, dass pUL34-LapNT das pUL31 nicht mehr an die innere Kernmembran rekrutieren konnte und folglich den Defekt der PrV-delta UL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementierte. Im Gegensatz zu HSV-1 scheinen hier auch die N-terminalen 100 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 notwendig zu sein. Da die Expression von pUL34 und pUL31 allein ausreicht, um die Bildung von Membranvesikeln von der inneren Kernmembran abzuschnüren, sollte im Weiteren getestet werden, ob auch Kapside in diese Vesikel aufgenommen werden. Da bei Herpesviren die Kapside autokatalytisch gebildet werden und dies bereits für einige Herpesviren über Expression in rekombinanten Baculoviren nachgestellt werden konnte, sollte versucht werden, dies auch für PrV zu etablieren. Dabei sollte die Kapsidbildung über Transduktion in Säugerzellen unabhängig von einer PrV Infektion nachgestellt werden. Hierbei sollte geklärt werden, welche weiteren viralen Proteine, neben den eigentlichen Kapsidproteinen, wie z.B. das pUL17 und pUL25, für den nuclear egress notwendig sind. Obwohl alle Kapsidkomponenten kloniert und auch in Zellen exprimiert werden konnten, konnte keine Kapsidbildung nachgewiesen werden. Die Ursachen hierfür konnten nicht geklärt werden. Auffällig war, dass das Triplexprotein pUL38 in den Baculovirus-transduzierten Zelllysaten ein etwas anderes Laufverhalten als das in Zelllysaten PrV-infizierter Zellen aufwies, dessen Ursache nicht auf der Verwendung eines downstream lokalisierten Startkodons beruhte. Mit Hilfe dieser rekombinanten Baculovirusvektoren konnte jedoch gezeigt werden, dass das Hauptkapsidprotein pUL19 mit dem Gerüstprotein (pUL26 bzw. pUL26.5) und die Triplexproteine pUL18 und pUL38 gemeinsam in den Kern transportiert werden. Die Beteiligung zellulärer Proteine am nuclear egress sollte über siRNA Experimente untersucht werden. In einer vorangegangen Arbeit war gezeigt worden, dass p97, eine zelluläre AAA+ATPase, nach Infektion vermehrt exprimiert wurde. Ziel war es, die p97 Expression über siRNA zu reduzieren und den Effekt auf die Virusinfektion zu untersuchen. Eine erfolgreiche siRNA Studie war bereits für p97 in Rattenzellen publiziert und sollte hier angewandt werden. Leider waren die zur Verfügung stehenden Rattenzelllinien nur sehr ineffizient transfizierbar und zusätzlich auch schlecht mit PrV infizierbar. Das eigene Design und die Anwendung von p97 spezifischer siRNA für Kaninchenzellen zeigte zwar die gewünschte Reduktion der p97 Expression, war jedoch nur sehr schlecht reproduzierbar und konnte daher nicht für aussagekräftige Infektionsversuche verwendet werden.
Influenza-A-Viren sind wichtige Pathogene von Mensch und Tier. Als Erreger der klassischen Geflügelpest führen hoch-pathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) weltweit zu hohen Verlusten in der Geflügelindustrie. Des Weiteren stellen der zoonotische Charakter und das pandemische Potential, vor allem von Stämmen des Subtyps H5N1, eine ernste gesundheitliche Bedrohung für die Bevölkerung dar. Zur Risikobewertung dieser Viren ist es daher notwendig, genetische Marker zu ermitteln, welche die Virulenz und das Wirtsspektrum beeinflussen. Für die Identifizierung dieser Virulenzdeterminanten sind Pathogenese-Studien in verschiedenen Tiermodellen wie Hühnern und Mäusen essenziell. Bisher wurde gezeigt, dass HPAIV aus niedrig-virulenten Vorläufern durch den Erwerb eines polybasischen Spaltmotives im Hämagglutinin (HA) im Zuge der Adaptation an terrestrisches Geflügel hervorgehen. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher die Fähigkeit eines niedrig-pathogenen aviären Influenzavirus (LPAIV) vom Subtyp H5N1 zur Ausbildung eines HPAIV-Phänotyps untersucht werden. Dazu wurde das revers-genetische System für das Isolat A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) etabliert und das Virus TG05 generiert. In-vitro konnte die Trypsin-Abhängigkeit als Merkmal von LPAIV bestätigt werden. Im Huhn verhielt sich dieses Virus avirulent. Durch zielgerichtete Mutagenese wurde die HA-Spaltstelle in ein polybasisches Motiv mutiert und das Virus TG05poly generiert. Das Virus war wie ein HPAIV zur in-vitro-Replikation ohne Trypsin-Zusatz fähig, löste aber nach der Infektion von Hühnern nur eine zeitlich begrenzte Erkrankung aus. Des Weiteren wurde die HA-Reassortante TG05-HAR65 generiert, deren Genom aus dem HA-Gen des HPAIV-Isolates A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) und den anderen sieben Gensegmenten von TG05 besteht. Dieses Virus konnte in-vitro ebenfalls Trypsin-unabhängig replizieren, führte aber zu einer Letalität von 30%. Eine weitere Reassortante, R65-HATG05poly, enthielt die umgekehrte Genkonstellation: das mutierte TG05-HA und die anderen Gensegmente des R65. An der Infektion verstarben acht von zehn Hühnern, was der Letalität von „natürlichen“ HPAIV entspricht. Der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle ist daher ein notwendiger, aber nicht hinreichender Schritt in der Evolution von LPAIV zu HPAIV. So kann nicht jeder H5- oder H7-LPAIV-Stamm als unmittelbarer HPAIV-Vorläufer dienen. Zusätzlich zur HA-Spaltstelle sind weitere Virulenz-Determinanten im HA selbst, aber auch in den anderen viralen Proteinen, vorhanden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher auch der Einfluss der Aminosäuren der unmittelbaren Spaltstellen-Umgebung untersucht. Dazu wurden verschiedene Virus-Mutanten des R65 mit Aminosäure-Substitutionen in der HA-Spaltstelle selbst (Motive ETR und ER) und in ihrer direkten Umgebung (HA-S346V) generiert und hinsichtlich der in-vitro-Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HA-346S einen Vorteil für die Replikation von LPAIV und HPAIV vermittelt. T an Position 2 der Spaltstelle unterstützt die Replikation von LPAIV. Bei Erwerb der polybasischen Spaltstelle während der Evolution von LPAIV zu HPAIV müssen also auch die benachbarten Regionen im HA angepasst werden. Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich über infizierte Vögel von Südostasien nach Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von Säugerspezies. Normalerweise weisen aviäre Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K, was sonst in humanen Stämmen zu finden ist. Um im dritten Teil dieser Arbeit den Einfluss dieser Mutation auf das breite Wirtspektrum der Clade 2.2-Viren zu untersuchen, wurde im HPAIV-Isolat R65 PB2-627K durch E ersetzt und die Virusmutante R65-PB2K627E generiert. Im Vergleich zu R65 war die Replikation von R65-PB2K627E in Säugerzellen drastisch reduziert, in Vogelzellen replizierten beide Viren jedoch gleich. Des Weiteren führte die Substitution zu einer extrem verringerten Polymerase-Aktivität auf 5% in Säugerzellen, aber nur zu einer vergleichsweise wenig verringerten Aktivität in Vogelzellen. Während die Virulenz im Huhn durch die Mutation nicht verändert wurde, konnte bei der Bestimmung der LD50 in der Maus eine drastische Attenuierung gezeigt werden. Interessanterweise revertierte bereits nach einer Mauspassage PB2-K627E zurück zu K, im Huhn erfolgte diese Reversion aber nicht. Um zu untersuchen, ob andere virale Proteine für diese Reversion notwendig sind, wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder mehrere Gensegmente des R65 im Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1) tragen, welches natürlicherweise PB2-627E besitzt. Mittels Zellkultur-Passagen dieser Reassortanten konnte gezeigt werden, dass die Reversion zu PB2-627K nur in Säugerzellen auftritt, und dass dazu das Nukleoprotein des R65 notwendig ist. Die schnelle Reversion zu PB2-627K in Säugerzellen und in Mäusen zeigt, dass die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 in ihrer Evolution möglicherweise mehrere Wirte gehabt haben, zu denen wahrscheinlich auch Säuger gehörten.