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Untersuchungen zur Phytochemie und zur biologischen Aktivität von Pittosporum angustifolium Lodd.
(2014)
Pittosporum angustifolium Lodd. (Pittosporaceae) ist ein kleiner Baum, welcher ursprünglich in Australien beheimatet ist, wo er in den meisten inländischen Gebieten zwar zerstreut, aber lokal nie gehäuft vorkommt. Von dieser Spezies, welche oft auch mit der Trivialbezeichnung „Gumby Gumby” betitelt wird, werden im Bereich der Ethnomedizin Zubereitungen für verschiedenste Indikationsbereiche wie Schmerzen, Krämpfe, Erkältungen oder Hauterkrankungen verwendet. Auch in der Komplementärmedizin werden Präparationen dieser Pflanze als Additivum bei malignen Erkrankungen eingesetzt. Zielstellung der vorliegenden Dissertation war eine exakte Charakterisierung der Phytochemie von Pittosporum angustifolium sowie eine Untersuchung von Extrakten, Fraktionen und Isolaten auf deren biologische Aktivitäten. Neben zwei grundlegenden Diplomarbeiten [35,36] lagen zu Beginn dieser Arbeit (Januar 2010) keinerlei wissenschaftliche Publikationen diesbezüglich vor. Im Rahmen der Untersuchungen zur Phytochemie wurden aus australischem Drogenmaterial (Blätter und Samen) sowie aus selbstgezogenen Pflanzen (Blätter) insgesamt 55 Triterpensaponine isoliert. Von diesen konnten 33 vollständig und fünf teilweise strukturell aufgeklärt werden, wobei 29 Verbindungen, welche als Pittangretoside A-Z und A1-C1 bezeichnet wurden, erstmalig als Naturstoffe beschrieben werden konnten. Hierbei handelt es sich um Aglyka vom Oleanan-, 17,22 seco Oleanolsäure- und Taraxasterol-Typ, welche mono- oder bisdesmosidisch vorliegen. Zwischen den verwendeten Drogen-Chargen konnten sowohl quali- als auch quantitative Unterschiede hinsichtlich der Phytochemie festgestellt werden. In allen untersuchten Pflanzenteilen (Blatt, Samen, Spross, Wurzel) wurden Triterpensaponine nachgewiesen. Von weiteren 13 isolierten Polyphenolen konnten drei als glykosylierte Flavonole und weitere drei als Derivate von mit Kaffeesäure substituierter Chinasäure identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um bekannte Verbindungen. Über weitere Bestimmungen konnten Fettsäuren sowie als Bestandteile des ätherischen Öls Mono- und Sesquiterpene sowie C13 Isoprenoide bestimmt werden. Über verschiedene Testsysteme und Assays wurden Überprüfungen hinsichtlich biologischer Aktivitäten der Polyphenole und insbesondere der Triterpensaponine durchgeführt. Für letztere konnten über Agardiffusionstests antimikrobielle Wirkungen gegen mehrere Candida Arten, hämolytische und gegen mehrere tumorigene Zelllinien zytotoxische Effekte nachgewiesen werden. Weiterhin wurde eine Hemmung der humanen Topoisomerase I belegt. Alle beobachteten Aktivitäten sind an strukturelle Voraussetzungen der Triterpensaponine wie das Acylierungsmuster und die Zuckerverknüpfung gebunden. Hierzu konnten interessante Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet werden. So scheint für viele der gezeigten biologischen Effekte eine Acylierung mit hauptsächlich C5-Resten an Position C-22 bzw. C-21 und C-22 des Aglykons essentiell zu sein, während sich Verbindungen mit fehlender oder an C-28 vorhandener Acylierung in den durchgeführten Untersuchungen als vergleichsweise schwächer oder nicht aktiv erwiesen. Unterschiedliche Zuckerkompositionen zeigten hierbei einen abschwächenden oder verstärkenden Einfluss. Für die isolierten Polyphenole wurde eine antioxidative Aktivität nachgewiesen. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche Induktion von IL8 durch den Rohextrakt der australischen Blattdroge. Eine Überprüfung von Saponinen und Polyphenolen via NMDA-Rezeptor- und Cholinesterase-Inhibitionsassay erbrachte keinen Anhaltspunkt für eine antidementive Wirkung. Ebenso konnte kein Nachweis für eine antiphlogistische Wirkung (Bestimmung von TNFalpha) und für die Beeinflussung weiterer Zytokine (IL1beta und IL10) erbracht werden. Über einige dieser Ergebnisse lassen sich Anwendungsbebiete im Bereich der Komplementärmedizin wie z. B. bei malignen Erkrankungen erklären. Für andere ethnomedizinische Indikationen konnten aufgrund nicht zur Verfügung stehender oder nicht adequater Testsysteme keine abschließenden, beurteilenden Aussagen getroffen werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu zellulären Abwehrmechanismen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) während einer Infektion mit dem wirtschaftlich bedeutsamen Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHSV) durchgeführt. Unter Verwendung eines in vitro-Testsystems zur Erfassung der zellvermittelten Zytotoxizität wurde festgestellt, dass Forellen ab dem 10. Tag nach Infektion antivirale zytotoxische Abwehrzellen generieren. Anfangs lysierten diese zytotoxischen Leukozyten ausschließlich virusinfizierte Targetzellen mit identischem MHC-Klasse-I und erst später nach Zweitinfektion MHC-Klasse-I-inkompatible Zellen. Ein mit dem Anstieg des Zytotoxizitätsvermögens einhergehender Anstieg der CD8α-mRNA-Expression im Verlauf der Infektion deutet auf die Beteiligung spezifischer zytotoxischer Zellen bei der antiviralen Abwehr hin. Eine erneute Infektion bereits infizierter Forellen mit homologem Virus führte bei erhöhter CD8α-mRNA-Expression zu einer gesteigerten zellvermittelten Zytotoxizität. Das deutet darauf hin, dass Forellen, ähnlich wie höhere Vertebraten, über spezifische zytotoxische T-Zellen sowie über ein immunologisches Gedächtnis verfügen. Im Unterschied zu Säugern konnte eine zytotoxische Aktivität gegen MHC-Klasse-I-inkompatible Targetzellen und damit eine Beteiligung von NK-ähnlichen Zellen zeitlich erst nach der T-Zell-ähnlichen Zytotoxizität gemessen werden, wobei ein Anstieg der mRNA-Expression des indirekten NK-Zellmarkers NKEF durch die Effektorzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt erfolgte. NKEF wird bei Säugern von hämatopoetischen Zellen gebildet. Deshalb ist die erhöhte Expression von NKEF als Folge einer kompensatorischen Reaktion bei der hämorrhagischen Erkrankung VHS zu werten. Zum Zeitpunkt der NK-ähnlichen Aktivität hatte das Niveau VHSV-spezifischer Antikörper ein Maximum erreicht, weshalb die Bewaffnung von NK-ähnlichen Zellen mit Antikörpern denkbar ist, die ihrerseits natives VHSV-Protein auf infizierten Targetzellen erkannt und letztere lysiert haben könnten. Gegenstand dieser Arbeit war es ferner, den Einfluss des Glyko(G)- beziehungsweise Nukleo(N)-proteins des VHSV auf das zelluläre Abwehrsystem der Forelle zu untersuchen. Dazu wurde die DNA-Immunisierungstechnologie eingesetzt. Nach Applikation von VHSV-Protein-kodierenden Plasmid-DNAs konnte als Voraussetzung für eine erfolgreiche Antigenpräsentation am Applikationsort die Expression viraler Proteine in den Forellenmuskelzellen gezeigt werden. Ebenso generierten Forellen nach Immunisierung antivirale zytotoxische Zellen gegen beide Proteine. Das Glykoprotein, welches nach der Virusreplikation auf der Virushülle und auch auf der Membran infizierter Wirtszellen exprimiert wird, regte die Bildung von virusspezifischen CTL-ähnlichen, aber auch NK-ähnlichen zytotoxischen Effektorzellen an, da zytotoxische Zellen aus DNA-immunisierten Forellen sowohl infizierte MHC-Klasse-I-identische als auch Zellen mit einem anderen MHC-Klasse-I lysierten. Das Nukleoprotein dagegen bewirkte lediglich die Bildung CTL-ähnlicher Zellen, da ausschließlich MHC-Klasse-I-kompatible Zellen lysiert wurden. Diese Aktivität erreichte nur in den Sommermonaten ein signifikantes Niveau. Solche, bei poikilothermen Vertebraten zu erwartenden saisonbedingten Schwankungen im Niveau und in der Qualität antiviraler zellvermittelter Zytotoxizität, sind bei Fischen bisher nicht beschrieben worden. Diese Unterschiede sind umso bemerkenswerter, als dass die Forellen ganzjährig einem konstanten Temperatur- und Lichtregime ausgesetzt waren. Die Kombination eines Testsystems für zellvermittelte Zytotoxizität mit Untersuchungen zur mRNA-Expression, zum Antikörperstatus und zur Expression von Leukozyten-Oberflächenmarkern lassen bei paralleler Analyse bereits veröffentlichter Daten wichtige Schlussfolgerungen zum allgemeinen Verständnis der Immunreaktionen bei Fischen zu. Es sind Parallelen aber auch Unterschiede (verspätete NK-zellähnliche Aktivität, Saisonabhängigkeit) zum Immunsystem höherer Vertebraten feststellbar. Ferner leisten diese Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der VHS und geben Anhaltspunkte für Vakzinationsstrategien insbesondere von DNA-Vakzinen.
In der vorliegenden Arbeit sollen bekannte und neuartige Inhibitoren der Glutathionperoxidasen sowohl in ihrer Eigenschaft als Inhibitor, als auch deren Effekte in Tumorzellen näher charakterisiert werden. Dabei standen zu Beginn die Mercaptobernsteinsäure sowie Tiopronin besonders im Fokus. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen effektiv bovine Glutathionperoxidase inhibieren, wobei die Effektivität sowohl in IC50-Werten als auch in Inhibitionskonstanten (Ki) ausgedrückt werden konnten. Durch Adaption des GPx-Assays auf humane GPx-Aktivität konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Mercaptobernsteinsäure in der Lage ist, humane GPx-Aktivität zu reduzieren, allerdings nicht Tiopronin. Kombinationen von Mercaptobernsteinsäure mit Wasserstoffperoxid auf Tumorzellen zeigten erhöhte Akkumulationen reaktiver Sauerstoffspezies in Relation zu Zellen, die nur mit Wasserstoffperoxid inkubiert wurden. Die Glutathionperoxidase könnte in zellulären Systemen durch Mercaptobernsteinsäure gehemmt sein. Entsprechende Kombinationen mit Tiopronin zeigten den gegenteiligen Effekt, Tiopronin scheint als Antioxidans zu fungieren. Auch Kombinationen von Tiopronin mit Cisplatin, Doxorubicin und Methotrexat zeigten teilweise Wirkungsverluste der Zytostatika. Weiterführend wurde im Rahmen der Arbeit eine neue Klasse von Inhibitoren der Glutathionperoxidase identifiziert, die Pentathiepine. Durch unterschiedliche heteroaromatische Grundkörper sowie verschiedenen Substituenten konnten interessante Struktur-Wirkungsbeziehungen detektiert werden. Bei der Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase stellte sich heraus, dass es sich offenbar um irreversible- sowie kompetitive Inhibitoren handelt. Die inhibitorischen Eigenschaften sind dabei in Bezug auf inhibitorische Potenz sowie Selektivität aller bisher bekannten Inhibitoren überlegen. Pentathiepine zeigen aber auch auf zellulärer Ebene interessante Eigenschaften, da sie in einer Vielzahl verschiedener Tumorzellen viabilitäts- bzw. proliferationsinhibierende Eigenschaften besitzen, mit IC50-Konzentrationen im unteren mikromolar-Bereich. Korrelationsanalysen zeigten, dass offenbar die Proliferationsinhibition der Pentathiepine mit der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase einhergeht. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass Pentathiepine massiv reaktive Sauerstoffspezies in den Zellen induzieren und Apoptose auslösen. Die Apoptose-Einleitung wurde durch Annexin-V/Propidiumiodid-Markierung, Detektion von PARP-Spaltprodukten sowie durch die Bestimmung der Mitochondrien-Funktionalität durch Visualisierung des mitochondrialen Membranpotentials bestätigt. Zusammenfassend scheint eine Apoptoseauslösung über den intrinsischen Signalweg vorzuliegen. Durch die Zelllinie HAP-1 sowie deren Glutathionperoxidase-1 ausgeknockten Variante konnten Zytostatika identifiziert werden, auf die knockout-Zellen besonders sensitiv reagieren. Zu diesen gehören Cisplatin-Analoga, Lomustin und Temozolomid. In Kombinationsuntersuchungen mit diesen Zytostatika konnte gezeigt werden, dass für die Kombination von Cisplatin mit Pentathiepinen kein positiver Effekt resultiert. Die Zytotoxizität von Cisplatin wurde dabei in verschiedenen Tumorzellen durch die gleichzeitige Inkubation mit Pentathiepinen abgeschwächt. Kombinationen von Lomustin bzw. Temozolomid mit Pentathiepinen und Mercaptobernsteinsäure führten zu signifikanten Wirkverstärkungen in den untersuchten Zelllinien. Zusammenfassend lässt sich verfassen, dass die neuen Glutathionperoxidase-Inhibitoren ein nützliches Werkzeug zur Aufklärung biologischer Prozesse in Tumorzellen in Bezug auf den Umgang mit oxidativem Stress darstellen können. Gezeigt wurde, dass die kombinatorische Gabe von Inhibitoren der Glutathionperoxidase mit verschiedenen Tumortherapeutika durch eine verstärkte Toxizität aussichtsreich erscheint und in Hinblick auf die häufig sehr schlechten Prognosen verschiedener Tumorerkrankungen, die Tumortherapie durch Zusatz von Pentathiepinen verbessert werden könnte.
In der Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung von trans-Platin(IV)-Diaziden beschrieben. Es wird gezeigt, dass sie durch die Verwendung von UV- und Weißlicht photoaktiviert werden können, wobei Photoreduktionen, Photosubstitutionen oder Photoisomerisierungen auftreten können. Ähnlich wie der bekannte Antitumorwirkstoff Cisplatin, sind die Verbindungen in der Lage irreversiblel an DNA zu binden. In Zellversuchen konnte zusätzlich eine antiproliferierende Aktivität festgestellt werden, wenn mit Licht bestrahlt wurde. Im Dunkeln zeigten die Verbindungen keine Wirkung. Durch Zellzyklusanalysen und der Beobachtung von morphologischen Veränderung nach der Behandlung mit Platin(IV)-Diaziden kann jedoch auf einen zu Cisplatin unterschiedlichen Wirkmechanismus geschlossen werden.
Durch in vitro-Studien konnte gezeigt werden, dass Polihexanid im Vergleich zu anderen bekannten antimikrobiellen Wirkstoffen sowie in Anwesenheit anwendungsnah simulierter organischer Belastungen ein für die Wundantisepsis geeigneter Wirkstoff ist. Im Kontext mit den bekannten Daten zur Verträglichkeit zumindest im Bereich der medizinischen Anwendungskonzentrationen (0,02 % und 0,04 % Polihexanid) und zum Einfluss auf die Wundheilung stützen die hier erhobenen Daten die bestehende Konsensusempfehlung zur Wundantiseptik, nach der Polihexanid zwar auch zur akuten Wundantiseptik, insbesondere aber zur Behandlung chronischer Wunden als geeignet angesehen wird. Auf Basis der biochemischen und biopysikalischen Grundlagen der Wirksamkeit von Polihexanid wurde die Möglichkeit der weiteren Verminderung der Zytotoxizität des Polihexanids bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der bakteriziden Wirksamkeit durch die Bindung an Phosphatidylcholin-haltige o/w-Emulsionen gezeigt; im Testsystem bei gleichzeitiger Anwesenheit von Bakterien und eukaryotischen Zellen unter simulierten Wundbedingungen war bereits die Kombination 0,05 % PHMB / 0,4 % EPC vollständig bakterizid und dabei ohne zytotoxischen Effekt wirksam. Diese Darreichungsform fungiert weiterhin als PHMB-Depot, das auch nach wiederholter Passage durch eine Bakteriensuspension noch die gleiche wundantiseptische Wirksamkeit aufweist wie in der ersten Passage. Erste in vitro- und in vivo-Erfahrungen mit den hier beschriebenen PHMB-haltigen o/w-Emulsionen wurden bereits durch andere Arbeitsgruppen publiziert. Demnach führt diese neue Darreichungsform zu einer größeren Eindringtiefe des Wirkstoffs in die Haarfollikel, die in Bezug auf die Hautfläche das mit Abstand größte Reservoir für die mikrobielle Hautflora und nicht zuletzt auch für eine Repopulation oberflächlich desinfizierter Haut darstellen. Die in vivo–Daten deuten darauf hin, dass mit partikel-gebundenem PHMB eine bessere und nachhaltigere Antisepsis erreicht werden kann als mit freiem PHMB. Zusätzlich zum Beitrag an der Konsensusempfehlung des Polihexanids zur Behandlung chronischer Wunden wird damit als wesentliches Ergebnis der Dissertation die Erschließung von bisher für wässrige PHMB-Lösungen nicht möglicher medizinischer Einsatzorte wie in sensiblen Geweben oder Anwendung bei Neugeborenen, am Auge, in Gegenwart von Knorpel, am Peritoneum und in anderen Körperhöhlen (Blase, Harnröhre, vereiterte Gelenkhöhlen), zur Mukositis-Prophylaxe, bei der Krebschemotherapie, bei Verbrennungen 3. Grades, aber auch in der antimikrobiellen Behandlung von Zellkulturen vorstellbar. Bis zu einer solchen therapeutischen Nutzung sind jedoch noch weitere Studien notwendig. Als günstig dürfte sich erweisen, dass es sich sowohl beim Polihexanid, als auch bei dem hier verwendeten Lipofundin ® um bereits etablierte und gut verstandene Medizinprodukte handelt. Im Kontext der weltweit zunehmenden Antibiotikaresistenzen und Verbreitungswege nosokomialer Erreger bei entsprechend geringer werdenden chemotherapeutischen Interventionsmöglichkeiten durch Antibiotika gewinnt die Möglichkeit des Einsatzes von Antiseptika mit breitem Wirkungsspektrum und guter Verträglichkeit immer mehr an Bedeutung, und dabei auch umso mehr die Erweiterung bestehender Einsatz-Indikationen. Neben der auf den ersten Blick vordringlich erscheinenden Identifikation neuer Wirkstoffe kann nicht zuletzt auf Basis der hier vorgelegten Ergebnisse die auf das gewünschte Wirkumfeld zugeschnittene Modifikation der Darreichungsform bekannter antiseptischer Wirkstoffe als möglicher Weg zur verbesserten antimikrobiellen Therapie herausgestellt werden. Diesem Gedanken folgen beispielsweise bereits Versuche, die die besonderen Eigenschaften von Nanopartikeln oder Peptid-basierten Nanostrukturen für die Bekämpfung von Infektionen und Kolonisationen zu nutzen, wobei deren Einsatz wegen der zum Teil hohen ökologischen Fremdartigkeit für biologische Systeme kritisch evaluiert werden muss. Im Gegensatz dazu ähnelt die Wirkung des Polihexanids auf die zwangsläufig und physiologisch kaum modifizierbar negativ geladenen bakteriellen Zellwandstrukturen dem Wirkmechanismen natürlich vorkommender antibakterieller Peptide wie dem β-Defensin, die einen wesentlichen Bestandteil des evolutionär sehr alten, angeborenen Immunsystems der Vertebraten darstellen – mikrobielle Zellumhüllungen sind anfällig gegenüber polykationischen Verbindungen mit hydrophoben Domänen. Auch das stellt einen Vorteil des Polihexanids gegenüber anderen Antiseptika dar.
In dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt und angewendet, mittels welcher Wundauflagen hinsichtlich Endotoxin-Bindungskapazität, bakteriozider Wirkung, Endotoxin-Freisetzung und Zytotoxizität untereinander verglichen werden können. Hierzu werden die Wundauflagen in einer Endotoxin- bzw. Bakterien-Lösung inkubiert und nach festgelegten Kontaktzeiten der Endotoxin- bzw. der Bakteriengehalt im Überstand gemessen. Der Endotoxin-Nachweis erfolgt mittels LAL-Test, die Bakteriensuspensionen werden auf CSA-Platten kultiviert und ausgezählt. Die Untersuchung der Wundauflagen auf Zytotoxizität erfolgt in einem Agarose-Overlay In-vitro-Zytotoxizitätstest. Für Aquacel® ergibt sich die höchste Bindungskapazität für LPS. Der Aktivkohlekern der Wundauflage Actisorb® Silver hat ebenfalls eine hohe Endotoxin-Bindungskapazität. Die Aktivkohle-Auflage CarboFlex® bindet nur eine viel geringere Menge Endotoxins. Bei Contreet-H® kommt es zu einem Anstieg der Endotoxin-Konzentration nach Inkubation. Die silberhaltigen Wundauflagen Actisorb® Silver und Contreet-H® zeigen die beste bakteriozide Wirksamkeit. CarboFlex® und Aquacel® können die Bakterien in geringem Umfang binden, zeigen aber keine bakteriozide Wirksamkeit im eigentlichen Sinne. Unter Inkubation mit der Bakteriensuspension kommt es zu einer maximalen Endotoxin-Freisetzung von 100 EU/ml. Der Zytotoxizitätstest ergibt für Actisorb® Silver eine starke, für die übrigen Wundauflagen eine leichte Zytotoxizität.
Der Gesetzgeber verlangt aus Gründen der Arzneimittelsicherheit für nasal anwendbare Arzneimittel und Medizinprodukte (Nasalia) in Mehrdosisbehältnissen den Zusatz von geeigneten Konservierungsmitteln in angemessener Konzentration (Eu. Pharm. 2001). Diese dienen dem Schutz des Inhalts vor Keimen aus der Umgebung nach Anbruch (mikrobiologische Anbruchstabilität). Es gibt kein Konservierungsmittel, das alle Anforderungen erfüllt und universell für alle Formulierungen einsetzbar ist. Da Konservierungsmittel per Definition Keime abtöten bzw. ihre Vermehrung verhindern muss, ist zwangsläufig eine gewisse Zytotoxizität gegeben. Da die meisten Nasalia immer noch konserviert sind, lässt sich die Forderung des Arzneibuchs nach Zubereitungen zur nasalen Applikation, die nicht reizend sind und keine unerwünschten Wirkungen auf die Funktion der mukoziliaren Clearance ausüben, in diesem Fall nur bedingt erfüllen. Der Kompromiss zwischen Verträglichkeit und mikrobiologischer Sicherheit geht bei den konservierten Präparaten auf Kosten der Verträglichkeit. Dabei addieren sich die zytotoxischen Eigenschaften der arzneilich wirksamen Substanz mit der Zytotoxizität des Konservierungsmittels. Grundsätzlich ist daher der Einsatz von Konservierungsmitteln in der heutigen Zeit zu hinterfragen. Mit Hilfe dieser Substanzen werden nur die Folgen einer mikrobiologischen Kontamination bekämpft, anstatt die Ursachen auszuschließen. Moderne Pumpsysteme machen es möglich, konservierungsmittelfreie Nasensprays herzustellen und so den umstrittenen Zusatz des am häufigsten eingesetzten Konservierungsmittels Benzalkoniumchlorid zu vermeiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: - In der größten und am häufigsten eingesetzten Gruppe der Vasokonstriktiva (Xylometazolin, Oxymetazolin, Tetryzolin, Tramazolin) wurde durch den Verzicht auf Benzalkoniumchlorid ein signifikanter Anstieg der Verträglichkeit registriert. Da diese Kombination von Wirkstoff und Konservierungsmittel besonders zellschädigend ist, ist es empfehlenswert auf konservierte Formulierungen zu verzichten. In der Gruppe der Antiallergika wurden mit Ausnahme von Cromo-ratiopharm analoge Ergebnisse erzielt. Die schlechte Verträglichkeit (Zellwachstum nur 1,1%) der unkonservierten Formulierung ist auf die Matrix (hypoton) zurückzuführen. In der Gruppe der Kortikosteroide sind alle Formulierungen konserviert und schlecht verträglich. Neue Entwicklungspräparate (ölige Matrix, unkonserviert, ohne Hilfsstoffe) sind dagegen gut verträglich. Hier bietet sich eine Möglichkeit, preiswerte und gut verträgliche Präparate herzustellen, vor allem für die Patientengruppen, die über Brennen, Trockenheit oder Irritationen nach Benutzung der herkömmlichen Nasalia klagen. In der Gruppe der Heil- und Pflegemittel mit arzneilichen Zusätzen sind alle un-konservierte Präparate gut verträglich. Der Verzicht auf Benzalkoniumchlorid erhöht die Verträglichkeit. Die getesteten Öle sind ebenfalls gut verträglich. In Bereich der Hormone scheint die Faustregel der besseren Verträglichkeit nach Verzicht auf Benzalkoniumchlorid nicht immer zu gelten. Die wachstumsfördernde Wirkung des Hormons Calcitonin scheint einen Einfluss auf die Ergebnisse der Zytotoxizitätstest zu haben. In der Gruppe saliner Lösungen sind alle Nasensprays konservierungsmittelfrei und gut verträglich. Der Zusatz von Dexpanthenol hat einen positiven Einfluss auf die Verträglichkeit. Der Zusatz von Aloe vera hat keinen keinen Einfluss auf die Verträglichkeit. Die Gruppe der Analgetika besteht vorwiegend aus Entwicklungspräparaten. Der Zusatz von Hyaluronsäure hat einen positiven Einfluss auf die Verträglichkeit, die bis auf Werte im Bereich saliner Lösungen liegen. Hier eröffnet sich eine zukünftige Möglichkeit, gut verträgliche Analgetika herzustellen. Die Reaktion des Gesetzgebers auf die in der Literatur reichlich beschriebenen Nebenwirkungen von Benzalkoniumchlorid lässt hoffen, dass vor allem die neu zugelassenen Nasensprays konservierungsmittelfrei und somit besser verträglich werden.
Ein neuer vielversprechender Ansatz, die Resistenz von Tumorzellen gegen Zytostatika zu umgehen, stellte die Hemmung von selenhaltigen Redoxenzymen, Glutathionperoxidase (GPx) und Thioredoxinreduktase (TrxR), dar. Das Ziel dieser Arbeit war, neuartige GPx-Inhibitoren zu entdecken und zu entwickeln. Der erste Ansatz war die Synthese und biologische Testung einer Zuckeracetal-Struktur, die als GPx-1-Inhibitor postuliert wurde. Synthetische Abwandlungen ergaben vier Acetale aus Glucosederivaten und Benzaldehyden. Jedoch zeigten diese ersten hergestellten Verbindungen keinerlei Hemmwirkung auf die bovine GPx-1. Der zweite Ansatz war, bereits bekannte, schwach aktive Leitstrukturen durch Koordinierung von Pt(II) an den Heterozyklus (2-Methylimidazol, Imidazol oder Pyrazol) zu stärkeren Hemmstoffen der GPx abzuwandeln, wobei das Platin(II)-atom an das Selen des Enzyms koordiniert und dies irreversibel hemmt. Es wurde eine Substanzbibliothek aus 15 heterozyklischen Liganden synthetisiert, welche anschließend mit Cis- oder Transplatin zu den cis- bzw. trans-Monochlorido-Platin(II)-Komplexen umgesetzt wurden. So wurden 28 Platinverbindungen in guter Reinheit erhalten und verschiedenen biologischen Testungen unterzogen. Diese Testungen umfassten Versuche zur Hemmung der bovinen GPx-1, wobei jedoch festgestellt wurde, dass dieses Enzym nicht gehemmt wurde. Weiterhin wurde untersucht, ob die TrxR, ein weiteres Selen-abhängiges Redoxenzym, durch diese Verbindungen inhibiert wird, was teilweise der Fall war, auch wenn keine eindeutigen Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufgestellt werden konnten. Die Pt(II) enthaltenden Substanzen wurden auch auf ihre Fähigkeit, die Proliferation von humanen Krebszelllinien zu hemmen, getestet. Es wurde festgestellt, dass einige der Verbindungen in der Lage sind, die Zellteilung mit IC50-Werten unterhalb 1 µM zu unterbinden. Dabei handelte es sich meist um cis-konfigurierte Platin(II)-Verbindungen, aber auch manche trans-Pt-Komplexe waren aktiv. Auch konnte gezeigt werden, dass der Zelluntergang durch Apoptose herbeigeführt wird Diese ermutigenden Ergebnisse belegen, dass ein Platinkomplex nicht zwangsläufig bifunktionell sein muss, um das Zellwachstum effektiv zu hemmen. Weiterhin wurde eine starke Kreuzresistenz zu Cisplatin nur bei ein paar Substanzen beobachtet, manche Verbindungen konnten die Kreuzresistenz sogar vollständig umgehen. Ein paar Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnten beschrieben werden. Zwei cis-trans-Paare der Platin(II)-Komplexe wurden dann für weitergehende Bindungsstudien an DNA ausgewählt. Hierzu wurde die Bindung an Kalbsthymus-DNA untersucht, ebenso wie die Bindung an zelluläre DNA, das Aufwinden von supercoiled DNA, die Veränderung des DNA-Schmelzverhaltens und des Circulardichroismus (CD) von DNA durch Bindung der Platinkomplexe, sowie die Veränderung der Ethidiumbromid-Fluoreszenz durch Hinzugabe der Verbindungen. Es stellte sich heraus, dass die strukturell ähnlichen Verbindungen sehr unterschiedliche Einflüsse auf die DNA haben, was auch in Zusammenhang mit ihrem hydrolytischen Zerfall während der Assays stehen könnte. Da Stabilitätsprobleme bemerkt wurden, wurden die hergestellten Verbindungen mittels HPLC und UV/Vis-Spektroskopie genauer untersucht um ihre Stabilität in wässrigen Medien beurteilen zu können. Es wurde festgestellt, dass die verwendeten Hydrazone in wässrigen Medien zu Benzaldehyden bzw. Acetophenonen und wahrscheinlich zu den korrespondierenden Hydraziden zerfallen. Die Stabilität der Verbindungen könnte starke Einflüsse auf die Ergebnisse der biologischen Testungen haben, sodass dies immer mit berücksichtigt werden sollte, wenn die Ergebnisse interpretiert werden. Es kann nicht aus-geschlossen werden, dass (i) die dargestellten Ergebnisse in Wirklichkeit die Ergebnisse der Zerfallsprodukte sind, und dass (ii) es einen gemeinsamen Grund für den Zerfall und die Auswirkungen im DNA- und Zellmodell gibt. Trotzdem oder auch deswegen handelt es sich um eine vielversprechende Substanzklasse, bei der sich eine nähere Untersuchung hinsichtlich Aufnahme in die Zelle, DNA-Bindung und -Reparatur lohnt, um zu ergründen, ob Resistenzen umgangen werden können. Auch die Zerfallsprodukte sollten hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität untersucht werden. Eine weitere Verbindungsklasse, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, waren N-heterozyklische Carben (NHC)-Au(I)-Komplexe. Sie basierten hauptsächlich ebenfalls wie die Platinverbindungen auf Hydrazonen, auch hier sollte durch die Koordinierung des Metallatoms an den Heterozyklus Imidazol eine Wirkungssteigerung erreicht werden. Die untersuchten Verbindungen zeigten eine starke Inhibition der GPx, der Glutathionreduktase (GR) sowie der TrxR. Eine Selektivität für ein bestimmtes Redoxenzym ist somit mit diesen Verbindungen nicht gegeben, weshalb sie keine guten Kandidaten für weitere Wirkstoffentwicklungen darstellen.
In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.