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Einige Oberflächenstrukturen, die sogenannten aktiven Zentren, sind Katalysatoren für heterogene Reaktionen. Ihre Beständigkeit ist von Art und Zusammensetzung der Phasengrenze abhängig. Eine Wechselwirkung mit reaktiven Molekülen ändert die Oberfläche durch Auflösung, Adsorption oder Oberflächendiffusion. In dieser Arbeit werden die Änderungen der Oberflächenaktivität und –struktur von Gold und Platin nach der Behandlung mit den Hydroxyl-Radikalen aufgezeigt.
Die elektrochemische Aktivität von Platin gegenüber Hydrochinon, K3Fe(CN)6 und [Ru(NH3)6]Cl2 wurde durch die Behandlung mit Hydroxyl-Radikalen nicht beeinflusst. Die Oberfläche wurde allerdings, durch die Bildung einer Oxidschicht, rauer. Die Oxidschichtbildung konnte zyklovoltammetrisch und potentiometrisch nachgewiesen werden. Im Verlauf der Wechselwirkung von H2O2 mit Platin ging Platin in Lösung (ICP-AES).
Bei Gold wurden im letzten Jahrzehnt Oberflächenstrukturen mit vielfach erhöhter Aktivität nachgewiesen. Die Experimente zeigten, dass Hydroxyl-Radikale die reaktiven Goldstrukturen (aktiven Zentren) selektiv beeinflussen. Die elektrokatalytische Sauerstoffreduktionsreaktion und die defektorientierte Platinabscheidung wurden durch die vorherige Behandlung mit Hydroxyl-Radikalen inaktiver. Der Keimbildungsmechanismus blieb hingegen unverändert (instantaneous). Dies wurde mit Hilfe der Zyklovoltammetrie und der Chronoamperometrie nachgewiesen. Topographische Experimente mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) zeigten ein Platinwachstum auf den oberen Teilen der polykristallinen polierten Goldelektrode. Verschiedene Politurmethoden (fein und grob) wiesen zudem eine komplett unterschiedliche Aktivität und Reproduzierbarkeit auf. Mit einer groben Politur konnte eine deutlich bessere Reproduzierbarkeit erreicht werden.
Die Identifizierung chemisch aktiver Zentren ist sehr reizvoll. Mit Hilfe von AFM Experimenten konnte die Auflösung von Gold direkt verfolgt werden und damit die aktiven Zentren charakterisiert werden. Morphologische Untersuchungen mit dem Rasterkraftmikroskop belegen eine selektive Änderung der Kristallite und Korngrenzen nach der Wechselwirkung einer ausgeheilten Goldoberfläche mit Hydroxyl-Radikalen (in- und ex-situ). Es kann angenommen werden, dass die selektive Oberflächenänderung bei Gold durch die inhomogene Verteilung der Elektronendichte und verschiedene Bindungszustände der Oberflächengoldatome beeinflusst ist. Herausstehende Kristallstrukturen sind nach der Wechselwirkung mit den Hydroxyl-Radikalen kleiner und die Korngrenzen zwischen den Goldkristallen tiefer. Die nach der einmaligen elektrochemischen Zyklisierung auftretenden Oberflächenänderungen sind den Änderungen nach Behandlung mit Hydroxyl-Radikalen ähnlich. Ein mehrmaliges Zyklisieren führt hingegen zu ein er deutlich veränderten Oberflächenstruktur.
Surface and electrode modifications allow the alteration of surface and electrode properties required for certain applications. In the first part of this thesis, a pH sensitive graphite/quinhydrone composite electrode for Flow-Injection-Analysis (FIA) systems was optimized by using polysiloxane as binder material. This allows an easier handling of the electrode. Furthermore, new applications of the FIA system in conjunction with the pH sensitive detection system were developed. The electrode used here in conjunction with a common reference electrode proved to be a very useful potentiometric detector for FIA acid-base titrations of aqueous solutions. Even acid-base titrations in buffered solutions were performed successfully with the FIA system allowing the determination of activities of enzymes, which catalyse reactions with increasing or decreasing proton concentrations. A FIA system was applied to measure calcium and magnesium ions in different water samples by measuring the hydronium ion release during the complexometric reaction between EDTA and calcium or magnesium ions. A method was established to determine sequentially the titratable acidity and the pH of different wine samples. The new FIA method fulfils the official requirements of the "Organisation Internationale de la Vigne et du Vin" with respect to reproducibility and repeatability and can be easily adjusted to the legal requirements in USA and Europe. In summary, the first part of this thesis shows that the FIA system in conjunction with the graphite/quinhydrone/polysiloxane composite electrode is very well suited for simple, rapid and automatic determinations of small sample volumes in the areas of water analysis, food analysis or even biochemical analysis, provided that hydronium ions are involved. For all applications, one and the same measuring device without changing the detection system is used. Only different carrier solutions are necessary, which can be provided by a proper stream selector. The second part of this thesis is focused on the modification of gold surfaces of medical devices by treatment with OH radicals. These investigations are based on previous studies of the impact of OH radicals on mechanically polished gold surfaces resulting in a smoothing of the surface by dissolution of highly reactive gold atoms. In this thesis, the effect of OH radicals, generated either ex vivo by Fenton solutions or in vivo by immune reactions, on gold implants was analysed using atomic force microscopy. It was found that there is an analogy between the exposure of gold to Fenton solutions and the exposure of gold to immune reactions. The pre-treatment of gold implants with OH radicals of Fenton solution prevents surface alterations of the gold implants in vivo. This indicates that the in vivo release of gold from implants can be reduced by exposing the gold implants to Fenton solution before implantation. Finally, the modification of gold surfaces by OH radicals was applied to a medical nanodetector, which is coated with a gold layer and functionalized with antibodies, for isolating circulating tumour cells (CTCs) from the blood stream of cancer patients. By treating the gold layer of the nanodetector with OH radicals generated by Fenton solution or by UV-photolysis of hydrogen peroxide, the cytotoxicity of the gold layer after gamma irradiation was reduced to almost zero. This modification of the gold surface with OH radicals allows applying the nanodetector for in vivo applications.
The Atomic Force Microscope (AFM) has become an important tool for probing the mechanical properties of cells and microparticles by force-indentation experiments. In this thesis optimized AFM approaches for these experiments are developed and applied to three types of living human cells in order to answer biologically relevant questions about their mechanics. These microscopic investigations are then interpreted with respect to nanoscopic and macroscopic biologic parameters, such as the function of cell surface receptors or the size of human heart ventricles. This thesis comprises two physical/technical chapters and three medical/biological chapters. The physical/technical chapters discuss the measurement process itself, aiming for its improvement with respect to a proper data analysis and contact model (for spherical cells). The medical/biological chapters investigate the elasticity of cells by the use of optimized AFM approaches, with respect to the used data analysis.
Heparin is an anticoagulant drug. It is important in the treatment of deep vein thrombosis,pulmonary embolism and during surgeries. Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is a severe adverse reaction caused by the formation of ultralarge complexes of platelet factor 4 (PF4) with unfractionated heparin (UFH). It can lead to limb loss or fatal events like stroke, myocardial infarction or pulmonary embolism. HIT has an incidence of about 3% in patients receiving anticoagulative heparin treatment. PF4 is a tetrameric protein, released from the α-granules of platelets upon activation. PF4 is known to form antigenic complexes with UFH accompanied by structural changes of PF4. In this thesis, the size and size distribution of PF4 and PF4/heparin complexes were analyzed using asymmetrical flow field-flow-fractionation (AF4), photon correlation spectroscopy (PCS) and atomic force microscopy (AFM). PF4 tends to form auto-aggregates and to adsorb to different surfaces, including regenerated cellulose, polyethersulfone, quartz and glass. The aggregates are less pronounced in solutions at isotonic NaCl concentration. Arginine and Tween 20 were identified as possible ingredients to hinder the auto-aggregation of PF4. Also, it is shown by combining circular dichroism (CD) spectroscopy, atomic force microscopy (AFM) and isothermal titration calorimetry (ITC) with UFH and defined chain length (16-, 8-, 6-, 5-mer) heparins that structural changes (i.e., increase in β-sheets) alone are not sufficient to induce antigenicity. While UFH, 16-, 8-, and 6-mer heparins all induced an increase in the antiparallel β-sheet content to > 30% (as determined by CD spectroscopy), complex antigenicity as measured by anti-PF4/heparin antibody binding in an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) was only induced by UFH and 16-mer heparin. Fondaparinux (5-mer heparin), which forms in vitro non-antigenic complexes with PF4, did not induce structural changes of PF4. Interestingly, the structural changes induced by antigenic UFH and 16-mer heparin but not by non-antigenic shorter heparins were reversible at higher heparin concentrations. Furthermore, the complexes formed by PF4 with longer heparins were larger than those formed with shorter heparins as shown by atomic force microscopy (AFM). UFH, HO16 and HO08 are able to form ultralarge multimolecular complexes with PF4. ITC data indicated strong electrostatic interactions and energetically unfavorable conformational changes of PF4 with longer heparins, while for the short heparins, favorable conformational changes in the structure of PF4 are induced. This explains the reversibility of the structural changes seen for UFH and HO16 upon addition of an over-saturating amount of heparin. Finally, using differential scanning calorimetry (DSC) the thermal stability of PF4 and PF4/heparin complexes was assessed. Despite its tendency to form auto-aggregates, PF4 is a heat-stable protein. This stability is, length dependently, even increased in complex with heparins. This work shows important differences in the binding between PF4 and heparins of different chain length and might be relevant for the understanding of other biological functions of heparins (e.g., involvement in allergic and inflammatory reactions).
In dieser Arbeit wird ein einfaches Verfahren zur Herstellung ultradünner (3 nm) Galliumschichten unter Umgebungsbedingungen beschrieben. Die Schichten sind stabil bis zu einem Auflage-Druck im GPa-Bereich und replizieren die zugrundeliegende Substratrauheit sowie größere Strukturen. Weiterhin wird ihre Eignung als Permeationsbarriere gezeigt. Mithilfe von optischen und elektrischen Messungen wird schließlich anhand des Drude-Modells die Alterung (Oxidation) der Schichten unter Umgebungsbedingungen beschrieben.
Die Transfusionsassoziierte Akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist die häufigste tödliche Nebenwirkung der Transfusion von Blutprodukten und wird oft durch mittransfundierte leukozytenreaktive Antikörper (AK) induziert. AK gegen das Humane Neutrophilenantigen (HNA)-3a verursachen häufig schwere Fälle der TRALI. HNA-3a ist auf dem Großteil der Blutzelltypen exprimiert und entsteht durch einen Einzelnukleotidpolymorphismus im Gen des „choline transporter-like protein 2“ (CTL2), welcher zur Substitution der Aminosäureposition 154 in der Sequenz des Proteins führt. Klinische Beobachtungen und zahlreiche Studien legen nahe, dass TRALI-induzierende AK die Akkumulation und Aktivierung von Granulozyten im Lungenkapillarbett verursachen. Durch den Zusammenbruch der Kapillarbarriere kommt es in der Folge zu einem Lungenödem. Die Entwicklung eines Hochdurchsatzverfahrens zur Detektion von HNA-3a-AK in Blutprodukten und die Identifizierung therapierelevanter Schaltstellen, im Pathomechanismus der HNA-3a-AK-induzierten TRALI, waren daher Hauptschwerpunkte dieser Studie. In diesem Zusammenhang wurde ein Nachweissystem für HNA-3a-AK auf der Grundlage von CTL2-Fragmenten etabliert. Ein Screening zahlreicher Anti-HNA-3a-Plasmen ergab, dass mit CTL2-Peptiden in Festphasentests jedoch nur etwa 50% aller HNA-3a-AK nachgewiesen werden können. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Detektion aller HNA-3a-AK nur mit zellbasierten Methoden möglich ist, bei denen CTL2 in seiner natürlichen Konformation vorliegt. Diese Studie leistet damit einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung des konformationssensitiven Epitops der HNA-3a-AK und identifiziert wichtige Grundvoraussetzungen für Methoden zum Nachweis dieser AK. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Interaktion zwischen HNA-3a-AK und Granulozyten. Dieser experimentelle Ansatz gründet auf histopathologischen Lungenuntersuchungen verstorbener TRALI-Patienten, die eine massive Akkumulation und Aggregation von Granulozyten in den Kapillaren aufzeigen. Aus diesem Grund erfolgte die Untersuchung dieser Interaktion zunächst hinsichtlich verschiedener Parameter, die zu einer gesteigerten Sequestrierung von Granulozyten in der Lunge führen können. Hierzu gehören die Granulozytenaggregation (GA), die Versteifung von Zellen und die Zelladhäsion. Die Modifikation des Standard-Granulozytenaggregationstests ergab, dass die HNA-2- und HNA-3a-AK-induzierte GA aktive Prozesse sind, welche unabhängig von Plasmafaktoren stattfinden, jedoch von der Aktivität einer bislang noch nicht identifizierten Serinprotease abhängig sind. Hierbei wurden potente Aggregationsinhibitoren identifiziert welche auch als potenzielle Therapeutika zur Behandlung von TRALI in Frage kommen. Mit Hilfe desselben Testsystems konnte ermittelt werden, dass voraktivierte Granulozyten eine erhöhte Aggregationsneigung aufweisen. Im Zusammenhang mit dem Schwellenwertmodell der TRALI liefert dieses Ergebnis eine mögliche Erklärung, warum Patienten mit schweren Vorerkrankungen häufiger an TRALI erkranken. Neben der GA wurden in dieser Studie zwei weitere Eigenschaften identifiziert, die eine Akkumulation der Zellen in den engen Lungenkapillaren erklären: deren Elastizität und Adhäsivität. Mithilfe der Rasterkraftmikroskopie wurde nachgewiesen, dass HNA-3a-AK eine Versteifung von Granulozyten induzieren. Ebenso wurde gezeigt, dass HNA-3a-AK das Integrin Mac-1 (CD11b/CD18) auf der Granulozytenoberfläche aktivieren, was zu einer verstärkten Adhäsion der Zellen an Fibrinogen führt. Steifere und adhäsivere Granulozyten akkumulieren möglicherweise vermehrt in den Lungenkapillaren. Eine weitere wichtige Fragestellung dieser Studie war, ob HNA-3a-AK eine direkte Aktivierung von Granulozyten auslösen. Die Untersuchungen ergaben, dass die Aktivierung von CD11b, weder mit der Erhöhung der CD11b-Expression, bzw. mit der proteolytischen Abspaltung von L-Selektin, noch mit einer Sauerstoffradikalproduktion einhergeht. Dieses ungewöhnliche Muster an Veränderungen deutet nicht auf eine Aktivierung zytotoxischer Antworten hin. Seit kurzem ist bekannt, dass HNA-3a-AK Kapillarendothelzellen auch auf direktem Wege aktivieren und dass selbst in Granulozyten-depletierten Mäusen schwache TRALI-Symptome auftreten. Demzufolge ergibt sich ein neues Modell der HNA-3a-AK-induzierten TRALI: Nach Transfusion von HNA-3a-AK bleiben aggregierte, steifere und adhäsivere Granulozyten in den engen Lungenkapillaren stecken und interagieren dort mit dem aktivierten Gefäßendothel. Durch diese Interaktion kommt es vermutlich zur Aktivierung der Granulozyten und zu einer starken Inflammationsreaktion, welche eine weitere Zerstörung der Lungenkapillaren und schließlich ein schweres Lungenödem zur Folge hat. Die besondere Schwere der HNA-3a-AK-induzierter TRALI entsteht also vermutlich nicht aufgrund einer direkten und starken Granulozytenaktivierung, sondern vielmehr durch die gleichzeitige Beeinflussung verschiedener epitoptragender Zelltypen.
The here presented dissertation investigated the molecular mechanisms, by which the food industry model bacteria Pseudomonas fluorescens and Listeria monocytogenes, grown either as planktonic cultures, were inhibited by plasma treated water (PTW) produced by a microwave-induced plasma source (MidiPLexc). As a starting point, optimal operating parameters were determined with 5 standard liters per minutes(slm)compressed air during the treatment of 10 ml deionized water within a treatment time of up to 15 min (pre-treatment time). Treatment times of 1, 3 and 5 min were selected (post-treatment time). In addition to physical parameters, i.e. temperature measurements at different spots at the plasma source during the production of the PTW, the chemical composition of PTW was determined by pH measurements, chronoamperometry (determination of the H2O2 concentration), ion chromatography (determination of the NO2-, NO3- and ONOO- concentrations) and mass spectrometry (qualitative determination of the molecules). In addition, concentration changes of reactive species over a period of 3 h indicated a decrease of the NO2- concentration as well as an increase of the NO3- and ONOO- concentration in the PTW. Microbiological assays, i.e. quantification of colony-forming units (CFU), fluorescence and XTT assays, revealed a significant reduction of the proliferation ability of the cells, membrane damages and metabolic activity have been demonstrated for planktonic cultures as well as mono- and multispecies biofilms. PTW effects on biofilm structures were investigated using microscopic methods such as fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy (CLSM), atomic force microscopy (AFM), and scanning electron microscopy (SEM), as well as physical methods such as contact angle measurements. Significant changes in the biofilm structure have been shown, which indicate an ablation of the biofilm mass from top to bottom by approximately 2/3 of the biofilm mass and a destruction of the extracellular matrix (ECM) by the reactive species within the PTW. Subsequently, fresh-cut lettuce has been treated with PTW produced by up-scaled plasma sources. Apart from qualitative parameters of the lettuce after PTW treatment such as texture and color, the concentration of PTW reactive species have been determined. These experiments showed that the composition of the reactive species were slightly different from that of the laboratory-scaled plasma source MidiPLexc. Notably, the PTW treatment did not cause significant changes in texture and color of the fresh-cut lettuce. Finally, a synergistic effect of PTW treatment followed by plasma-processed air (PPA) drying was demonstrated application-specific.
Free radicals are known to induce significant structural and functional modifications to the cell membrane and its components. Biophysical quantification of such changes using single molecule studies highlight the role of these individual biomolecules. In this PhD work, we focus on nitric oxide radical and try to understand how they influence interaction of different biomolecules with lipid membranes by using biomimetic systems. In specific we try to answer how cell membrane permeability and bilayer thickness would be influenced by the nitric oxide radical with different phospholipids compositions (i.e. on planar supported lipid bilayers). Later we tested, interaction of transmembrane protein integrin αiibβ3 incorporated into the bilayer (i.e. nanodiscs) with nitric oxide. Finally, how to overcome the negative effects encountered by the phospholipids and proteins using biopolymer coated gold nanoparticles as delivery system. The study involved use of atomic force microscopy and quartz-crystal microbalance with dissipation as primary investigation tools complemented with other relevant biophysical and biochemical techniques.
Die Forschung mit kaltem Atmosphärendruckplasma (CAP) eröffnet neue medizinische Behandlungsmöglichkeiten im Bereich der Tumorbehandlung, eine verbesserte Wundbehandlung und vielfältige Anwendungsmöglichkeiten im dentalen Bereich. Trotz eines zunehmenden Erkenntnisgewinns im Bereich der Plasmaforschung gibt es nach wie vor viele ungeklärte Fragen im Bereich der Anwendungssicherheit von kaltem Atmosphärendruckplasma. Da der kINPen® MED im intraoralen Bereich an Patient(inn)en Anwendung findet, ist es notwendig, Untersuchungen in Bezug auf mögliche Interaktionen zwischen den dentalen Restaurationsmaterialen und kaltem Atmosphärendruckplasma durchzuführen, um die Patientensicherheit während der Behandlungen mittels in vitro und in vivo Studien weiter auszubauen. Studien zur Untersuchung dieser Interaktionen fehlen bisher in der Literatur.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss von kaltem Atmosphärendruckplasma auf die Oberflächeneigenschaften von drei verschiedenen dentalen Kompositen zu untersuchen. Die dentalen Komposite Arabesk Flow, Arabesk Top und GrandioSO (VOCO GmbH, Cuxhaven, Deutschland) unterscheiden sich in Bezug auf ihren Füllerkörpergehalt (niedrig-, mittel-, hochgefüllt) voneinander. Die Plasmabehandlung erfolgte mittels des kINPen® (neoplas tools GmbH, Greifswald, Deutschland) über einen Untersuchungszeitraum von 19 Tagen zu sechs Zeitpunkten (0., 3., 5., 15., 17. und 19. Tag). Gruppe I diente als Kontrollgruppe und wurde nicht mit Plasma behandelt. Gruppe II wurde 30 Sekunden stationär und Gruppe III 60 Sekunden mäanderförmig mit kaltem Plasma behandelt. Im Rahmen der materialografischen Untersuchungen wurden insgesamt 2160 Profilometermessungen, 240 Raster-Kraft-Mikroskopie (AFM)-Messungen, 117 Photoelektronenspektroskopie(XPS)-Messungen und 27 Wasserkontaktwinkelmessungen durchgeführt.
Die statistische Analyse wurde für die einzelnen Gruppen der Profilometermessung durchgeführt. Aufgrund der schiefen Verteilung der Ergebnisse wurden nicht-parametrische Tests wie der Kruskal-Wallis- und der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test angewendet.
Im Ergebnis konnten in der Wasserkontaktwinkelmessung und der Photoelektronenspektroskopie Veränderungen der Probenoberfläche nach der 30 s stationären und der 60 s mäanderförmigen Plasmabehandlungsvarianten aufgezeigt werden. Nach der Plasmabehandlung zeigte sich in den XPS-Messungen mit der Häufigkeit der Behandlungen eine Abnahme der Kohlenstoffanteile und gleichzeitig steigende Sauerstoff- und Füllkörperanteile wie Silizium an der Probenoberfläche. Der vermehrte Einbau von Sauerstoffverbindungen nach den erfolgten Plasmabehandlungen resultierte im Rahmen der Kontaktwinkelmessungen in einer Entwicklung zu hydrophileren Oberflächen. Das Absinken der Kohlenstoffverbindungen und der Anstieg von Elementen der Füllkörper lässt ein Abtragen der Matrix zwischen den Füllkörpern der dentalen Komposite vermuten. Im Rahmen der AFM- und Profilometermessungen konnte keine eindeutige Veränderung der Oberflächenrauheit nach einer Plasmabehandlung festgestellt werden. Die in dieser Studie aufgezeigten Ergebnisse tragen zu einem ersten Erkenntnisgewinn im Themenbereich des plasmaassoziierten Risikopotentials in Bezug auf dentale Komposite bei. Es sind weiterführende Untersuchungen in diesem Zusammenhang nötig, um die aufgezeigten Ergebnisse dieser Studie in Bezug auf die intraorale Anwendungssicherheit der Plasmabehandlung für die Patient(inn)en weiter auszubauen.