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Class I and class II glutaredoxins (Grxs) are glutathione (GSH)-dependent proteins, that function as oxidoreductases (class I) or mediate cellular iron trafficking (class II). Some members of class I Grxs like human Grx2 are able to complex a [2Fe-2S] cluster and form a dimeric holo complex, which renders them catalytically inactive and is the basis for their function as redox sensors. Class II Grxs like human Grx5 also complex [2Fe-2S] clusters, however these proteins transfer the clusters to other proteins. Both functionally distinct classes share a similar thioredoxin fold and conserved interaction sites for the non-covalently binding of GSH, which is required to complex the [2Fe-2S] cluster. Furthermore, the proteins from both classes contain a highly nucleophilic active site cysteine that would allow both classes to catalyze GSH-dependent oxidoreduction reactions. Despite of these similar features, only class I Grxs are able to form a mixed disulfide with GSH and to reversibly transfer it to protein thiols (de-/glutathionylation). Interestingly, neither class I Grxs nor class II Grxs can effectively compensate the loss of an essential member of the other class. Even though some structural differences were described earlier, the basis for their different functions remained unknown. In particular, the lack of catalytic activity of class II Grxs as oxidoreductases could not be explained. Here, we demonstrate that the different conformations of a conserved lysyl side chain are the molecular determinant of the oxidoreductase or Fe-S transfer activity of class I and II Grxs, respectively. A specific loop structure that is conserved in all class II Grxs determines one lysyl conformation that prevents the formation of a mixed disulfide of the active site cysteinyl thiol with GSH. Using engineered mutants of hGrx2 and hGrx5, we demonstrated that the exchange of the distinct loop between the classes results in a loss of oxidoreductase function of class I hGrx2 and the gain of oxidoreductase activity of class II hGrx5. The altered GSH binding mode also profoundly changes the [2Fe-2S] cluster binding of the engineered mutants and thereby also influences stability of the holo complexes, a pre-determinant for [Fe-S] cluster transfer activity. With the minor shift of 2 Å in a conserved lysyl side chain orientation we were not only able to modify the catalytic activity of two small human mitochondrial proteins, but on a much larger scale also provided evidence for the previously unknown structural basis that determines the function of all class I and class II Grxs.
The oxidoreductase activity of hGrx2 was also analyzed in vivo in a model of doxorubicin cell toxicity. Applying a mass spectrometrical approach, we identified various mitochondrial proteins as targets for redox regulation. Furthermore, our results gave reason to reconsider some common assumptions regarding doxorubicin-induced apoptosis and the protective function of mitochondrial Grx2.
Qualitative und quantitative massenspektrometrische Analyse von Virionen des Pseudorabies Virus
(2006)
Das Ziel dieser Arbeit war die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Partikeln des Pseudorabies Virus (PrV), des Erregers der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein. In Partikeln des PrV-Virusstammes Kaplan wurden nach ein- oder zweidimensionaler Elektrophorese und Identifizierung durch peptide mass fingerprint 27 Strukturproteine viraler und vier Strukturproteine zellulärer Herkunft (Annexin I und -II, HSP70 und Aktin) identifiziert. Die viralen Strukturproteine pUL37, pUL48, pUL18, pUL19, pUL29 (gB) und alle Strukturproteine zellulärer Herkunft wurden nach zweidimensionaler Elektrophorese in mehreren Isoformen nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Zusammensetzung von Deletionsmutanten des PrV mit derjenigen von Wildtyp-Virionen verglichen. Ziel war hier die Analyse von Veränderungen in der Partikelzusammensetzung über den Verlust des deletierten Proteins hinaus, z.B. als Folge einer dadurch nicht mehr möglichen Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer abweichenden Morphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Untersuchung der Tegumentproteine, da diese in eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionen einbezogen sind und ihnen eine entscheidende Rolle während der Virusmorphogenese zukommt. Die quantitative Analyse von Mutanten mit Deletionen der Tegumentproteine pUS3, pUL11, pUL13, pUL16, pUL21, pUL35, pUL41, pUL43, pUL47, pUL49, pUL51, sowie der Deletion eines C-terminalen Fragments des UL36-Gens und des Glykoproteins E erfolgte massenspektrometrisch mit der SILAC Strategie. Nach Untersuchung der Strukturproteinprofile von allen oben genannten Deletionsmutanten lässt sich über die genannten Details hinaus generell folgendes feststellen: (1) Kapsid- beziehungsweise kapsid-assoziierte Proteine (pUL18, pUL25, pUL35 und pUL38) werden in stöchiometrischen Mengen zum Hauptkapsidprotein MCP142 (pUL19) in die Viruspartikel eingebaut. Diese Stöchiometrie war robust gegen alle untersuchten Deletionen. (2) Größere Flexibilität beim Einbau in das reife Virion zeigten Komponenten des Teguments. Kapsidnahe Tegumentproteine wie das pUL36 wurden meist stöchiometisch eingebaut. Größere Schwankungen beim Einbau in die verschiedenen untersuchten Deletionsmutanten zeigten die Tegumentproteine pUL11, pUL16, pUL21, pUL46, pUL48, pUL49 und pUS3. Deletionen in einzelnen Tegumentproteinen führten zu vermindertem Einbau anderer Proteine, was z.B. durch den Ausfall von Protein-Protein Wechselwirkungen erklärt werden kann, oder auf einen vermehrten Einbau anderer Tegumentproteine hindeutet. (3) Virale Hüllglykoproteine zeigten die größten quantitativen Schwankungen im Einbau, was die Bewertung des Einbaus der Glykoproteine in die verschiedenen Deletionsmutanten erschwerte. Ausnahme war hier das essentielle Glykoprotein gH, dessen Einbau in die untersuchten Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp durchgängig unverändert war.