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Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der MilchdrĂŒse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die WirtsspezifitĂ€t von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfĂŒgbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der StĂ€mme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst StĂ€mme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. fĂŒr HĂ€molysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen StĂ€mmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. ZusĂ€tzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulĂ€ren Proteommuster der einzelnen StĂ€mme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte âCore-Exoproteomâ. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der KulturĂŒberstĂ€nde auf humane und bovine PBMC (mononukleĂ€re Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen PathogenitĂ€tsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stĂ€rker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der AktivitĂ€t dieser Superantigene hindeutet. SchlieĂlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die hĂ€ufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die VariabilitĂ€t in der ExpressionshĂ€ufigkeit dieser Proteine könnte mit der WirtsspezifitĂ€t von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das VerstĂ€ndnis ĂŒber seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. FĂŒr jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschlieĂender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine fĂŒr einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstĂ€rkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von NukleinsĂ€uren oder DNA beteiligt sind, was bestĂ€tigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter SchĂ€digung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. AminosĂ€uresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress fĂŒhrte wie erwartet zur verstĂ€rkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative DisulfidbrĂŒcken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schlieĂen. Die Effekte von NO Ă€hnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere AktivitĂ€t fermentativer Stoffwechselwege bestĂ€tigt werden. Die FĂ€higkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell fĂŒr seine höhere Resistenz gegenĂŒber NO sein.
The influence of regulatory proteins on the physiology and virulence of Streptococcus pneumoniae
(2015)
In conclusion, this work identifies the regulator ArgR2 as activator of the S. pneumoniae TIGR4 arginine deiminase system and arginine-ornithine transporter ArcD, which is needed for uptake of the essential amino acid arginine. Although ArgR2 activates ArcD expression and uptake of arginine is required to maintain pneumococcal fitness, the deficiency of ArgR2 increases TIGR4 virulence under in vivo conditions, suggesting that other factors regulated by ArgR2 counterbalance the reduced uptake of arginine by ArcD. Thus this works illustrates that the physiological homeostasis of pneumococci is complex and that ArgR2 plays a key role in maintaining bacterial fitness. Moreover, Rex was identified as a regulator of housekeeping genes including genes encoding glycolytic enzymes. In vitro studies and gene expression analyses suggested that the regulator Rex does not have an influence on the physiology of S. pneumoniae. However, a co-infection experiment demonstrated that Rex is involved in maintaining pneumococcal fitness and robustness under in vivo conditions.
Bei dem gramnegativen Pathogen Burkholderia pseudomallei, auch bekannt als Erreger der âMelioidoseâ, handelt es sich um einen saprophytischen Bodenbewohner, der in den tropischen und subtropischen Regionen SĂŒdostasiens und Nordaustraliens endemisch verbreitet ist. Als fakultativ intrazellulĂ€rer Erreger ist B. pseudomallei neben einer Vielzahl nicht phagozytierender Zellen auch in professionellen Phagozyten zur Replikation fĂ€hig. In Makrophagen sind cytosolische NOD-like Rezeptoren (NLR) als Bestandteil der angeborenen Immunabwehr maĂgeblich an der Erkennung intrazellulĂ€rer Gefahrensignale beteiligt. Bei entsprechender Signalgebung wird durch Assemblierung eines als âInflammasomâ bezeichneten Multiproteinkomplexes die Rekrutierung und nachfolgende Autoaktivierung von Caspase-1 bewirkt. Nach Infektion mit B. pseudomallei geht die Aktivierung von Caspase-1 in Verbindung mit dem NOD-like Rezeptor Nlrp3 mit der Prozessierung und Sekretion der Cytokine IL-1ÎČ und IL-18 einher, wohingegen der Sensor Nlrc4 in erster Linie fĂŒr die Induktion einer inflammatorischen Form des Zelltodes namens âPyroptoseâ verantwortlich ist. Da der Knockout von Caspase-1 bei muriner Melioidose einen signifikanten Anstieg der MortalitĂ€tsrate nach sich zieht, sollten in der vorliegenden Arbeit Caspase-1-vermittelte Effektormechanismen gegenĂŒber B. pseudomallei nĂ€her untersucht werden. Infolge der Infektion muriner C57BL/6 Makrophagen mit B. pseudomallei wurde bereits 60 Minuten post infectionem eine Caspase-1 und -9-abhĂ€ngige Prozessierung von Caspase-7 sowie des DNA-Reparaturenzyms PARP deutlich. Als verantwortlicher Sensor ist hierbei der NOD-like Rezeptor Nlrc4 identifiziert worden. Obwohl in Caspase-1/11 knockout Makrophagen wĂ€hrend der FrĂŒhphase der Infektion keine Spaltprodukte der drei genannten Caspasen vertreten waren, konnte zu spĂ€teren Zeitpunkten eine massive Aktivierung der apoptotischen Caspasen-8, -9, -3 und -7 sowie der Stress-induzierten MAP-Kinasen JNK und p38 beobachtet werden. Vergleichende Proteomanalysen B. pseudomallei-infizierter C57BL/6 Makrophagen lieĂen ebenfalls eine verstĂ€rkte Expression proapoptotischer und proinflammatorischer SignalmolekĂŒle in Caspasen-1/11-defizienten Makrophagen erkennen. Im Gegensatz dazu wies der Knockout von Caspase-7 nach Infektion mit B. pseudomallei weder in vitro noch in vivo einen charakteristischen PhĂ€notyp auf. Im Vergleich zu B. pseudomallei konnte durch die Infektion mit der avirulenten Spezies Burkholderia thailandensis erst bei verhĂ€ltnismĂ€Ăig hohen Infektionsdosen eine sichtbare Prozessierung der Caspasen-1, -9 und -7 in C57BL/6 Makrophagen erreicht werden. DarĂŒber hinaus wurde trotz einem mit B. pseudomallei vergleichbaren Replikationsvermögen, ein geringeres MaĂ an Pyroptose in B. thailandensis - infizierten Makrophagen nachgewiesen. Zur Identifizierung, welche bakteriellen Komponenten von B. pseudomallei fĂŒr die Aktivierung von Caspase-1 verantwortlich sind, wurden zwei Deletionsmutanten der Bsa T3SS-Proteine BopE und BsaK hergestellt. Dem Bsa T3SS konnte in vorausgehenden Studien eine wesentliche Funktion fĂŒr die Virulenz von B. pseudomallei im Tiermodell zugeschrieben werden und dessen Bestandteile weisen Homologien zu den Inv/Mxi-Spa-Sekretionssystemen von S. typhimurium und S. flexneri auf. Die Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 sowie die Spaltung von PARP wurde durch die Infektion muriner Makrophagen mit der Mutante des âinner rod proteinsâ BsaK vollstĂ€ndig aufgehoben, wohingegen die Mutagenese des Effektors BopE keinen Einfluss ausĂŒbte. Neben einer verminderten Freisetzung von LDH und IL-1ÎČ konnte dabei auch ein Anstieg der intrazellulĂ€ren Keimzahl in ÎBsaK-infizierten Makrophagen verzeichnet werden. DemgegenĂŒber fĂŒhrte die Verwendung einer Flagellin-Transposonmutante lediglich zu einer Reduktion der B. pseudomallei-induzierten Prozessierung der Caspase-1, -9 und -7 sowie der Spaltung von PARP. Mittels Ăberexpressionsstudien in HEK-293 Zellen konnte ferner die potentielle FĂ€higkeit des Bsa T3SS-Effektors BopE zur Aktivierung von Caspase-1 in AbhĂ€ngigkeit von der FunktionalitĂ€t der BopE-eigenen GEF-DomĂ€ne demonstriert werden. In verschiedenen in vivo Experimenten wurde gezeigt, dass ÎBsaK-infizierte BALB/c MĂ€use im Vergleich zum Wildtyp und in Verbindung mit geringen Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz durch eine signifikant verminderte MortalitĂ€tsrate sowie eine Reduktion proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet sind. Insgesamt betrachtet zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass BsaK, als strukturelle Komponente des Bsa Typ-III-Sekretionsapparates, in murinen Makrophagen sowohl fĂŒr die B. pseudomallei-induzierte Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 durch das Nlrc4-Inflammasom als auch den nachfolgenden pyroptotischen Zelltod verantwortlich ist. Durch die Attenuierung der BsaK-Mutante im Mausmodell wird gleichzeitig die Bedeutung von Typ-III-Sekretionssystemen fĂŒr die Virulenz pathogener Bakterien unterstrichen.
Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von zwei putativen Virulenzgenen von Burkholderia pseudomallei. Es wurde ein klassischer LysR-Typ Transkriptionsregulator (BPSL0117) mittels Tn5 Mutagenese als wichtiger Virulenzfaktor gefunden und mit verschiedenen in vitro, in vivo und weiterer molekularer Methoden wie gelfreie Proteomics untersucht. Daneben wurde ein hypothetisches Protein (BPSS1528 = bapA) mit unbekannter Funktion aus einen Typ-III-Sekretionssystem gezielt deletiert und funktionell beschrieben. Diese Mutante wies letztlich keine eingeschrÀnkte Virulenz im Vergleich zum Wildtypstamm aus.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. Itâs multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the hostâs immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor ÏB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor ÏB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and ÏB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on ÏB. A potential ÏB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, TĂŒbingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, TĂŒbingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
Als Mitglieder der Ordnung Lactobacillales ist das Hauptkatabolit der Pneumokokken sowohl unter aerober wie auch microaerophiler AtmosphĂ€re Lactat. Des Weiteren synthetisiert S. pneumoniae eine groĂe Bandbreite an ABC-Transportersystemen, die an der Assimilation und an dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten, löslichen Verbindungen und AminosĂ€uren beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde der Kohlenstoffmetabolismus mittels 13C-Isotopologen Verteilung nach Wachstum der Pneumokokkenkultur in chemisch definiertem Medium (CDM) mit [U-13C6]Glucose, [1,2-13C2]Glucose oder [U-13C2]Glycin analysiert. GC/MS-Analysen zeigten ein Muster an schwer-markierten und unmarkierten Kohlenstoffatomen in den AminosĂ€uren. Die Ergebnisse lieĂen den Schluss zu, dass Pneumokokken sowohl einzelne AminosĂ€uren aufnehmen, wie auch ĂŒber klassische oder nicht-klassische Biosynthesewege de novo synthetisieren können. His, Glu, Ile, Leu, Val, Pro und Gly blieben im Isotopolog Profiling unmarkiert, was ein Hinweis auf das Fehlen von Biosynthesewegen oder ihrer Regulation unter bestimmten Umweltbedingungen sein könnte. Obwohl die genetische Information fĂŒr die Biosynthese der essentiellen verzweigtkettigen AminosĂ€uren (BAA; Ile, Leu und Val) in S. pneumoniae vorhanden ist, ergaben die 13C-Markierungsversuche keine de novo Synthese. Jedoch konnte durch Langzeit-1H-NMR (LT-NMR) Analysen eine aktive Aufnahme dieser AminosĂ€uren nachgewiesen werden. DarĂŒber hinaus wird Aspartat nicht ĂŒber den allgemeinen Stoffwechselweg mit Pyruvat und Acetyl-CoA synthetisiert. Die Aspartat-Synthese erfolgt im ersten Schritt durch die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und CO2 zu Oxalacetat. Im zweiten Schritt wird Oxalacetat dann in Aspartat mit der Nebenreaktion Glutamat zu alpha-Ketoglutarat durch die Aspartat-Transaminase metabolisiert. GC/MS Analysen ergaben weiterhin, dass komplett markierte aromatische AminosĂ€uren aus Erythrose-4-Phosphat und zwei MolekĂŒlen PEP ĂŒber das Intermediat Chorismat synthetisiert wurden. Es zeigte sich auĂerdem, dass [M+1] markiertes Serin durch die Hydroxymethylierung von unmarkiertem Glycin ĂŒber 5,10-Methylentetrahydrofolat als Teil des C1-Pools hergestellt wurde. Weiterhin wurden In LT-NMR-Untersuchungen KonzentrationsĂ€nderungen der extrazellulĂ€ren Metabolite quantifizert. Die homofermentative MilchsĂ€uregĂ€rung konnte in Pneumokokken durch einen extrazellulĂ€ren Anstieg der Lactatkonzentration nachgewiesen werden. Als essentielle Kandidaten wurden Glutamin und Uracil identifiziert, die das Pneumokokkenwachstum bei Mangel einschrĂ€nken. Diese Ergebnisse zeigen die Vielzahl von AminosĂ€uren-Synthesewegen in Pneumkokken und die notwendige Rolle der Transportersysteme in Pneumokokken fĂŒr die bakterielle Fitness und fĂŒr die Adaption an verschiedene Wirtsnischen. Sechs mögliche Glutamin-Aufnahmesysteme konnten durch Genomanalysen von Streptococcus pneumoniae StĂ€mmen identifiziert werden. Die Reverse Transkriptions-PCR haben gezeigt, dass die sechs gln-Operons unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Vier der gln-Gencluster bestehen aus den Genen glnQPH, wĂ€hrend in zwei Regionen das Gen glnH, welches fĂŒr eine lösliche Glutamin-BindungsdomĂ€ne kodiert, fehlt. In dieser Arbeit wurde der Einfluss zwei dieser Glutamin-ABC-Transporter, mit den Operons glnQPH0411/0412 und glnQPH1098/1099, in S. pneumoniae D39 auf Virulenz und Phagozytose untersucht. Die zwei charakterisierten Transportersysteme bestehen jeweils aus der ATPase GlnQ und einem translatorischem Fusionsprotein aus der Permease GlnP und dem Bindungsprotein GlnH. FĂŒr die Untersuchungen wurden diese beiden Transporter mittels Insertations-Deletions-Mutagenese inaktiviert. CD-1 MĂ€use, die intranasal mit biolumineszierenden D39delgln0411/0412 infiziert wurden, zeigten in Echtzeit eine signifikant erhöhte Ăberlebenszeit und eine Attenuierung bei der AusprĂ€gung einer Pneumonie im Vergleich zu biolumineszierenden Wildtyp D39 Pneumokokken. Im murinen Sepsismodell mit der D39delgln0411/0412-Mutante zeigte sich eine gemĂ€Ăigte, aber signifikante AbschwĂ€chung der Pathogenese. Im Gegensatz dazu war die D39delgln1098/1099 Mutante sowohl im murinen Pneumonie- wie auch Sepsismodell massiv attenuiert. Es war eine 100- bis 10000- fach höhere Infektionsdosis erforderlich, um mit der D39delgln1098/1099-Mutante eine vergleichbare Pathogenese der Pneumonie oder Sepsis wie beim Wildtypstamm D39 hervorzurufen. Im experimentellen Meningitismodell zeigten sich bei der D39delgln1098/1099-Mutante eine erniedrigte Anzahl an Leukozyten im Liquor und ein reduzierter Bakterientiter im Blut im Vergleich zu D39 und D39delgln0411/0412. Auch die Phagozytose-Experimente bestĂ€tigten eine signifikante verminderte Ăberlebensrate der beiden gln-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp S. pneumoniae D39, was auf den Einfluss der bakteriellen Fitness auf den Schutz gegen oxidativen Stress hinweist. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass beide Glutamin-Aufnahmesysteme fĂŒr die vollstĂ€ndige Virulenz der Pneumokokken essentiell sind, aber verschiedene Auswirkungen auf die Pathogenese der Bakterien unter in vivo Bedingungen haben. Das ZelloberflĂ€chenprotein PavA der Pneumokokken ist ein Virulenzfaktor, der fĂŒr invasive Erkrankungen wichtig ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PavA essentiell fĂŒr die in vivo Besiedlung von Streptococcus pneumoniae D39 in den oberen Atemwegen von MĂ€usen ist. In dem murinen Pneumoniemodell wurden pavA-Mutanten nicht aus den infizierten Mauslungen eliminiert, sondern persistierten und lösten somit eine chronische Infektion aus, wĂ€hrend Wildtyp-Pneumokokken systemische Erkrankungen verursachten. PavA-defiziente Pneumokokken konnten unter experimentellen Bedingungen nicht aus der Lunge in die Blutbahn streuen. Diese Ergebnisse lieĂen den Schluss zu, dass PavA an der erfolgreichen Kolonisation der SchleimhautoberflĂ€chen und an der Translokation der Pneumokokken durch Wirtsbarrieren beteiligt ist.
Wildvögel stellen die natĂŒrlichen Wirte und das Hauptreservoir fĂŒr Influenza-A-Viren dar. Einige Influenza-StĂ€mme konnten sich zudem an verschiedene SĂ€ugetierarten wie Mensch, Schwein oder Pferd anpassen. Die molekularen Mechanismen der Adaptation von Influenza-A-Viren an einen neuen Wirt sind komplex. Sie werden u. a. auf eine modifizierte Interaktion viraler Proteine mit Wirtszellproteinen zurĂŒckgefĂŒhrt, die in Verbindung mit dem Auftreten von Punktmutationen in viralen Proteinen, vor allem den Polymeraseproteinen, steht und zu einer optimierten Replikation von Influenza-A-Viren im neuen Wirt fĂŒhren kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden molekulare Werkzeuge entwickelt, die der Identifizierung wirtsspezifischer Interaktionspartner der viralen Ribonukleoprotein-Komplexe (vRNP) dienen können. Dazu wurden mittels reverser Genetik rekombinante Influenza-A-Viren unterschiedlichen Wirtsspektrums mit einem Strep-tag als Markierung am C-Terminus der Polymerase-Untereinheit PB2 generiert. Zu den verwendeten Viren zĂ€hlten das humane A/HongKong/1/68 (H3N2), die beiden speziesĂŒbergreifenden Viren A/swan/Germany/R65/06 (H5N1) (âR65â) sowie A/seal/Massachusetts/1/80 (H7N7) und das aviĂ€re A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8). Durch Immunfluoreszenz- und Western-Blot-Analysen wurde die stabile Expression des Strep-PB2-Fusionsproteins in infizierten Zellen bestĂ€tigt. Es wurde zudem gezeigt, dass die markierten Viren auf SĂ€uger- und Vogelzellen vergleichbar mit den entsprechenden unmarkierten Viren replizieren. Anhand des Strep-getaggten PB2-Proteins des R65-Virus wurden erfolgreich virale RNP-Komple xe aus infizierten SĂ€uger- und Vogel-Zellen mittels AffinitĂ€tschromatographie aufgereinigt und deren vier Protein-Bestandteile PB2, PB1, PA und NP durch MALDI-tof-Massenspektrometrie identifiziert. Die Palette getaggter Viren bildet die Grundlage fĂŒr weiterfĂŒhrende Studien zur Untersuchung Virus-Wirt-spezifischer Wechselwirkungen, die fĂŒr den Wirtswechsel und die Adaptation von Influenza-A-Viren entscheidend sein können. Die Entstehung des pandemischen Influenza-Virus A/HongKong/1/68 (H3N2) (âHk68â) geht auf ein Reassortment zwischen dem zuvor zirkulierenden humanen H2N2-Virus und einem aviĂ€ren H3-Stamm zurĂŒck. Hierbei wurden die Segmente des humanen Virus, die fĂŒr das Rezeptor-bindende Protein Haemagglutinin (HA) und die Polymerase-Untereinheit PB1 kodieren, gegen die entsprechenden Segmente des aviĂ€ren H3-Virus ausgetauscht. Bei einem Sequenzvergleich zwischen dem Hk68-PB1 und dem PB1 des dem unbekannten aviĂ€ren Donor nahestehenden Isolates A/duck/Ukraine/1/63 (H3N8) (âdUkâ) wurden lediglich sechs Unterschiede in der AminosĂ€uresequenz identifiziert, die möglicherweise Folge der Adaptation des Hk68-Virus an den humanen Wirt sind. Nach dem EinfĂŒgen der einzelnen Mutationen in das dUk-PB1 wurden homologe RNP-Komplexe (PB2, PB1 und PA sowie NP von Hk68) und heterologe RNP-Komplexe (PB2, PA, NP von Hk68 und PB1 bzw. PB1-Punktmutante von dUk) in transfizierten SĂ€ugerzellen rekonstituiert. Mit Hil fe eines Luciferase-Reportertests konnte gezeigt werden, dass der heterologe Hk68/dUk-PB1-Komplex im Vergleich zum homologen Hk68-Komplex eine um 50% erniedrigte Polymerase-AktivitĂ€t aufweist. Dieser negative Effekt konnte durch das EinfĂŒgen der Mutation PB1 I12V in das dUk-PB1, aber nicht durch eine der anderen fĂŒnf Punktmutationen, vollstĂ€ndig aufgehoben werden. Folglich könnte es sich bei dieser Mutation um eine adaptive Mutation handeln. Untersuchungen an in vitro rekonstituierten RNP-Komplexen anderer Viren konnten diese Theorie unterstĂŒtzen. Wachstumskinetiken des homologen Hk68- und dUk-Virus sowie von ihnen abgeleiteter PB1-Reassortanten und PB1-Mutanten deuteten ebenfalls auf einen Einfluss von AminosĂ€ureposition 12 im PB1-Protein auf die Virusreplikation hin. Mit Hilfe eines ELISAs durchgefĂŒhrte Bindungsstudien zwischen den PA-Proteinen verschiedener Influenza-A-Viren und PB1-Peptiden mit Valin oder Isoleucin an Position 12 legten zudem eine Zu- bzw. Abnahme der Af finitĂ€t zwischen PA und PB1 als Ursache fĂŒr die verĂ€nderte PolymeraseaktivitĂ€t nahe. Hochpathogene aviĂ€re Influenza-A-Viren (HPAIV) vom Subtyp H5 oder H7 verursachen enorme wirtschaftliche SchĂ€den und stellen eine potentielle Bedrohung fĂŒr den Menschen dar. Die Entwicklung effektiver Impfstoffe ist deshalb in vielfacher Hinsicht sinnvoll. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels reverser Genetik eine Elastase-abhĂ€ngige Mutante des HPAIV A/swan/Germany/R65/06 (H5N1), genannt R65-E, als potentielle lebend-attenuierte Vakzine erzeugt. Dazu wurde die polybasische Spaltstelle im HA des hochpathogenen Virus gegen eine Spaltstelle fĂŒr die in vivo kaum verfĂŒgbare Protease Elastase ersetzt. In vitro wurde mit Hilfe von Plaquetests, Wachstumskinetiken und Western-Blot-Analysen die strikte AbhĂ€ngigkeit der R65-E-Replikation und der R65-E-HA-Spaltung von Elastase nachgewiesen. Im Gegensatz zum R65-Wildtyp war die R65-E-Mutante in vivo aufgrund der Abwesenheit von Elastase auf einen Replikationszyklus beschrĂ€nkt und somit hochgradig attenuiert. Insgesamt erwies sich die R65-E-Mutante im Huhn jedoch als wenig immunogen. So kam es 7 Tage nach okulonasaler Infektion von EintagskĂŒken lediglich zu einer schwachen zellulĂ€ren Immunantwort basierend auf CD8+ zytotoxischen T-Zellen in der Milz. Eine Antikörper-Antwort wurde nach o kulonasaler oder in ovo Infektion nur bei jeweils einem von zehn bzw. einem von sieben Tieren induziert. Das Vorhandensein H5-spezifischer Antikörper korrelierte hierbei mit einem Schutz der Tiere gegen eine Belastungsinfektion mit dem homologen HPAIV R65. GleichermaĂen ging die Abwesenheit H5-spezifischer Antikörper bei den ĂŒbrigen Versuchstieren mit einem letalen Verlauf der homologen R65-Belastungsinfektion einher. Ein partieller Schutz gegen eine heterosubtypische Belastungsinfektion mit dem HPAIV R65-H9R66mutR65 sowie eine reduzierte Virusausscheidung bei einigen Tieren der Boostergruppe, die drei Wochen nach okulonasaler Infektion eine zweite Dosis R65-E erhalten hatten, deuteten auf eine R65-E-induzierte zellvermittelte Schutzwirkung hin. Es ist zu vermuten, dass die R65-E-Mutante in vivo ĂŒberattenuiert war und aus diesem Grund keine protektive Immunabwehr induzieren konnte. R65-E eignet sich daher nicht als lebend-attenuierte GeflĂŒgelvakzine.
Hochpathogene aviĂ€re Influenza-Viren (HPAIV) entstehen aus niedrig pathogenen aviĂ€ren Influenza-Viren (LPAIV) durch die Erlangung einer polybasischen Spaltstelle im HĂ€magglutinin (HA). Diese gilt als Hauptvirulenzdeterminante. Durch die polybasische Spaltstelle kann das HA-VorlĂ€uferprotein ubiquitĂ€r durch Subtilisin- Ă€hnliche Proteasen gespalten werden, was zu einer systemischen Infektion fĂŒhrt. Bis jetzt sind in der Natur nur HPAIV der Serotypen H5 und H7 bekannt. Es ist noch unklar, ob die Umgebung der HA-Spaltstelle in der Evolution zum HPAIV angepasst werden muss, oder ob HA vom Serotyp H5 die polybasische HA-Spaltstelle besonders schnell erwerben können und ob die artifizielle EinfĂŒhrung einer polybasischen HA-Spaltstelle in verschiedene LPAIV HA-Serotypen zu einem hochpathogenen PhĂ€notyp fĂŒhrt. Diese drei Fragestellungen wurden in separaten Projekten in der vorliegenden Arbeit untersucht. Vergleiche der HA-Spaltstellenumgebungen zeigten, dass die meisten HPAIV H5- Isolate entweder Serin oder Threonin an Position 323 (H3-Nummerierung) des HA tragen. LPAIV H5-Isolate besitzen dagegen an der korrespondierenden Stelle Valin. DarĂŒber hinaus weisen die meisten LPAIV H5 an Position P2 der HA-Spaltstelle ein Threonin auf. Daher wurde der Einfluss dieser beiden Positionen auf die Virulenz untersucht. Hierzu wurden monobasische und polybasische HA-Spaltstellenmutanten des HPAIV A/Swan/Germany/R65/02 H5N1 (H5/R65) mit Hilfe der reversen Genetik hergestellt. In den in vitro Untersuchungen zeigten alle monobasischen HA-Spaltstellenmutanten den erwarteten PhĂ€notyp eines LPAIV. Beim Wachstumsverhalten fĂŒhrte allerdings Serin zu einer effizienteren frĂŒhen Replikation. AuĂerdem scheint das HA-Spaltmotiv E-R!G, welches bisher in keinem LPAIV H5 gefunden wurde, einen Nachteil gegenĂŒber dem HA-Spaltstellenmotiv E-T-R!G zu haben, welches bei LPAIV H5- Isolaten fast ausschlieĂlich zu finden ist. Dieser Nachteil kann allerdings durch den Austausch von Valin 323 zu Serin aufgehoben werden. Im Gegensatz dazu fĂŒhrte der Austausch von Serin 323 zu Valin im HPAIV H5/R65 zu keinen Unterschieden in vitro. In vivo zeigten mit H5/R65-V infizierte HĂŒhner aber ein verlĂ€ngertes Ăberleben. Daher ist anzunehmen, dass Serin an Position 323 zur Virulenz im Huhn beitrĂ€gt. Die Evolution vom LPAIV VorlĂ€ufer zum HPAIV scheint nicht nur den Erwerb der polybasischen HA-Spaltstelle zu benötigen sondern auch die VerĂ€nderung von Regionen auĂerhalb der Spaltstelle. Um zu untersuchen, ob auch andere LPAIV auĂer H5 und H7 in der Lage sind, polybasische HA-Spaltstellen zu erwerben, wurden Selektionsversuche durchgefĂŒhrt. Die HA verschiedener Serotypen (H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9) wurden, um möglichst naturnahe Bedingungen zu schaffen, degeneriert mutagenisiert und dann ohne Zugabe einer externen Protease auf Trypsin-unabhĂ€ngiges Wachstum hin selektiert. Es wurden nur von der monobasischen HA-Spaltstellenmutante des H5/R65 mit degeneriert mutagenisiertem HA, polybasische HA-Mutanten selektiert. Diese Viren zeigten eine ungewöhnliche AS-Komposition an der Spaltstelle, die weder der Wildtyp-Spaltstelle von H5/R65 noch einer natĂŒrlich bei HPAIV H5 vorkommenden Spaltstelle Ă€hnelt. Zwei der isolierten Selektanten zeigten in weiteren in vitro Charakterisierungen den PhĂ€notyp eines HPAIV. Da die Selektanten die restlichen sieben Gene und, auĂer der Spaltstelle, auch das HA mit H5/R65 gemeinsam haben, ist davon auszugehen, dass sie auch in vivo den PhĂ€notyp eines HPAIV zeigen wĂŒrden. AuĂerdem scheint es bei H5-StĂ€mmen eine PrĂ€disposition zum leichteren Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle zu geben, wohingegen andere LPAIV-HA unter naturnahen Bedingungen polybasische HA-Spaltstellen deutlich schwerer erwerben können. Bei A/Chicken/Emirates/R66/02 H9N2 (H9/R66) fĂŒhrte die artifizielle EinfĂŒhrung der polybasischen HA-Spaltstellen eines HPAIV H5 oder H7 allein zwar zu Trypsin- unabhĂ€ngigem Wachstum in vitro, bei Infektion von HĂŒhnern blieb der PhĂ€notyp aber unverĂ€ndert niedrigpathogen. Die HA-Reassortante H9/R66+HAH5/R65 fĂŒhrte zur vorĂŒbergehenden nicht-letalen Erkrankung mit influenzatypischen Symptomen. Dagegen wies die Reassortante H5/R65+HAH9/R66mutR65 mit einem intravenösen PathogenitĂ€s-Index von 1,23 den PhĂ€notyp eines HPAIV auf. Dies zeigt, dass ein HPAIV vom Serotyp H9 möglich ist, wenn das HA eine polybasische Spaltstelle erwirbt und einige oder alle anderen Gene von einem HPAIV H5 abstammen.
Streptococcus pneumoniae, more commonly known as the pneumococcus, is a Gram-positive bacterium colonizing the human upper respiratory tract as a commensal. However, these apparently harmless bacteria have also a high virulence potential and are known as the etiologic agent of respiratory and life-threatening invasive diseases. Dissemination of pneumococci from the nasopharynx into the lungs or bloodstream leads to community-acquired pneumonia, septicaemia and meningitis. Pneumococcal diseases are treated with antibiotics and prevented with polysaccharide-based vaccines. However, due to the increase of antibiotic resistance and limitations of the current vaccines, the burden of diseases remains high. Interactions of pneumococci with soluble host proteins or cellular receptors are crucial for adherence, colonization, transmigration of host barriers and immune evasion. The pneumococcal surface-exposed proteins are the main players involved in this host-pathogen interaction. Therefore, combating pneumococcal transmission and infections has emphasized the need for a new generation of immunogenic and highly protective pneumococcal vaccines, based on surface-exposed adhesins virtually expressed by all pneumococcal strains and serotypes. The genomic analysis of S. pneumoniae strains helped to identify pneumococcal virulence factors such as pili, PsrP and PavB, which have been demonstrated to interact with human proteins playing an important role during the pathogenic process of pneumococci, and are currently considered as new potential vaccine candidates against S. pneumoniae. A subclass of pneumococcal strains produces pili that are encoded by the pathogenicity islet pilus islet-1 (rlrA islet) and/or the pilus islet-2. Both types of pili are implicated in bacterial adherence to host cells. A further pathogenicity islet encoded protein is PsrP. The presence of the psrP-secY2A2 islet correlated positively with the ability of pneumococci to cause invasive pneumococcal diseases. Recent studies indicated that PsrP is a protective adhesin interacting with keratin 10 on lung epithelial cells. In this study, the genomic loci of the pneumococcal virulence factors pili, PsrP and PavB were molecularly analyzed and used as molecular markers for molecular epidemiology studies of S. pneumoniae. The genotyping results obtained here showed the impact of the PCV7 immunization of children, started in July 2006, on the distribution of these pneumococcal virulence factors among clinical isolates in Germany. These findings gave more insights into the role of pili, PsrP and PavB in pneumococcal pathogenesis and may strongly support the idea of including these pneumococcal constituents in a broad coverage protein-based vaccine against pneumococcal infections produced by invasive serotypes in the future. The mature PavB protein contains a variable number of repetitive sequences referred to as the Streptococcal Surface Repeats (SSURE). PavB has been demonstrated to interact with fibronectin and plasminogen in a dose-dependent manner and it was identified as a surface-exposed adhesin with immunogenic properties, which contributes to pneumococcal colonization and respiratory airways infections. The complete molecular analysis performed here for PavB, allowed to know more accurately its structure and to estimate the real number of SSURE units in different pneumococcal strains. With these findings, a new primary sequence-based structural model was constructed for the PavB protein and its SSURE domain, and, at least for TIGR4, the complete pavB gene and PavB protein sequences with five SSURE units was reported in the GenBank database of the NCBI website. Due to its immediate neighborhood on the pneumococcal genome with the tcs08 genes, PavB is likely linked with this pneumococcal TCS. Here, a significant reduction of the PavB protein expression was observed in delta-tcs08-mutant strains, which may strongly suggest that the TCS08 does play a role in pneumococcal virulence and metabolisme, as further observed in growth behaviour experiments carried out with the TCS08-deficient mutants, cultured in chemically defined medium. Despite several studies suggest that the molecular mechanism underlying the bacterial signal transduction is very sophisticated, the majority of reports in prokaryotic TCS, including those for S. pneumoniae, are still focused in single cognate pairs. The pneumococcal genome encodes 14 TCSs and an orphan response regulator. It is obvious that TCS pathways are often arranged into complex circuits with extensive cross-regulation at a variety of levels, thereby endowing cells with the ability to perform sophisticated information processing tasks. This study established also the experimental and molecular bases for the construction of a comprehensive genome-wide interaction map of the complex TCS pathways for its application in the gene regulation of pneumococcal virulence factors.
Burkholderia pseudomallei ist ein gram-negatives StĂ€bchenbakterium, das in tropischen und subtropischen Gebieten endemisch ist. Bedeutung erlangte das Bakterium als Modellorganismus fĂŒr intrazellulĂ€res Ăberleben. Als solches ist B. pseudomallei in der Lage in Wirtszellen einzudringen, sich aus dem Phagolysosom zu befreien, im Zytosol zu replizieren, Aktinschweife zu induzieren und sich von Zelle zu Zelle auszubreiten. B. pseudomallei ist der Verursacher der Melioidose, einer Erkrankung mit sehr unterschiedlichen klinischen VerlĂ€ufen. Sowohl schwere, septische Formen mit hoher MortalitĂ€t aber auch milde chronische Manifestationen treten auf. Trotz zunehmender Beachtung in der Ăffentlichkeit sind die molekularen Details seiner Virulenz weitestgehend unverstanden. Deswegen beschĂ€ftigt sich diese Forschungsarbeit mit der Identifizierung und Charakterisierung von neuen Virulenzfaktoren und -mechanismen bei B. pseudomallei. Dazu wurden mittels Tn5-Transposonmutagenese 2344 Mutanten hergestellt und auf ihre FĂ€higkeit Plaques in einem Agarose-ĂŒberschichteten Zellmonolayer zu induzieren gescreent. Mutanten mit Defekten in Genen, die in den intrazellulĂ€ren Lebenszyklus involviert sind, bilden weniger, kleinere oder keine Plaques im Vergleich zum Wildtyp. Insgesamt 44 Tn5-Transposonmutanten fielen im Screening durch eine verĂ€nderte Plaquebildung auf. Durch molekularbiologische Methoden wurden die Transposoninsertionsstellen ermittelt. Es lagen Defekte in Genen vor, die fĂŒr Stoffwechselproteine, Strukturkomponenten oder hypothetische Proteinen kodieren. WeiterfĂŒhrend wurden die Mutanten auf ihre intrazellulĂ€re Invasion und Replikation in Epithelzellen sowie auf ihre Aktinschweifbildung untersucht. Bei insgesamt vierzehn Mutanten konnte nach intranasaler Infektion eine starke Attenuierung in der Maus nachgewiesen werden, darunter beispielsweise eine Mutante mit einem Defekt in BPSL0918, einer Peptidyl-Proly-cis-trans-Isomerase und fĂŒnf Mutanten mit Defekten in Genen unbekannter Funktion. Um polare Effekte auszuschlieĂen, wurde die Komplementation mit dem mini-Tn7-System fĂŒr diese Tn5-Mutanten etabliert und exemplarisch an der BPSL0918-Mutante durchgefĂŒhrt. Diese Forschungsarbeit zeigt, dass es möglich ist mit den hier genutzten Methoden Tn5-Transposonmutagenese und anschlieĂendem Plaquescreening neue Virulenzgene zu identifizieren, die essentielle Funktionen im intrazellulĂ€ren Ăberleben von B. pseudomallei ĂŒbernehmen. Die weitere Charakterisierung dieser Gene kann Hinweise darauf geben, mit welchen Strategien das Pathogen sich im menschlichen Körper etabliert, ausbreitet und die Wirtsabwehr auĂer Kraft setzt.
Influenza-A-Viren sind wichtige Pathogene von Mensch und Tier. Als Erreger der klassischen GeflĂŒgelpest fĂŒhren hoch-pathogene aviĂ€re Influenzaviren (HPAIV) weltweit zu hohen Verlusten in der GeflĂŒgelindustrie. Des Weiteren stellen der zoonotische Charakter und das pandemische Potential, vor allem von StĂ€mmen des Subtyps H5N1, eine ernste gesundheitliche Bedrohung fĂŒr die Bevölkerung dar. Zur Risikobewertung dieser Viren ist es daher notwendig, genetische Marker zu ermitteln, welche die Virulenz und das Wirtsspektrum beeinflussen. FĂŒr die Identifizierung dieser Virulenzdeterminanten sind Pathogenese-Studien in verschiedenen Tiermodellen wie HĂŒhnern und MĂ€usen essenziell. Bisher wurde gezeigt, dass HPAIV aus niedrig-virulenten VorlĂ€ufern durch den Erwerb eines polybasischen Spaltmotives im HĂ€magglutinin (HA) im Zuge der Adaptation an terrestrisches GeflĂŒgel hervorgehen. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher die FĂ€higkeit eines niedrig-pathogenen aviĂ€ren Influenzavirus (LPAIV) vom Subtyp H5N1 zur Ausbildung eines HPAIV-PhĂ€notyps untersucht werden. Dazu wurde das revers-genetische System fĂŒr das Isolat A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) etabliert und das Virus TG05 generiert. In-vitro konnte die Trypsin-AbhĂ€ngigkeit als Merkmal von LPAIV bestĂ€tigt werden. Im Huhn verhielt sich dieses Virus avirulent. Durch zielgerichtete Mutagenese wurde die HA-Spaltstelle in ein polybasisches Motiv mutiert und das Virus TG05poly generiert. Das Virus war wie ein HPAIV zur in-vitro-Replikation ohne Trypsin-Zusatz fĂ€hig, löste aber nach der Infektion von HĂŒhnern nur eine zeitlich begrenzte Erkrankung aus. Des Weiteren wurde die HA-Reassortante TG05-HAR65 generiert, deren Genom aus dem HA-Gen des HPAIV-Isolates A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) und den anderen sieben Gensegmenten von TG05 besteht. Dieses Virus konnte in-vitro ebenfalls Trypsin-unabhĂ€ngig replizieren, fĂŒhrte aber zu einer LetalitĂ€t von 30%. Eine weitere Reassortante, R65-HATG05poly, enthielt die umgekehrte Genkonstellation: das mutierte TG05-HA und die anderen Gensegmente des R65. An der Infektion verstarben acht von zehn HĂŒhnern, was der LetalitĂ€t von ânatĂŒrlichenâ HPAIV entspricht. Der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle ist daher ein notwendiger, aber nicht hinreichender Schritt in der Evolution von LPAIV zu HPAIV. So kann nicht jeder H5- oder H7-LPAIV-Stamm als unmittelbarer HPAIV-VorlĂ€ufer dienen. ZusĂ€tzlich zur HA-Spaltstelle sind weitere Virulenz-Determinanten im HA selbst, aber auch in den anderen viralen Proteinen, vorhanden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher auch der Einfluss der AminosĂ€uren der unmittelbaren Spaltstellen-Umgebung untersucht. Dazu wurden verschiedene Virus-Mutanten des R65 mit AminosĂ€ure-Substitutionen in der HA-Spaltstelle selbst (Motive ETR und ER) und in ihrer direkten Umgebung (HA-S346V) generiert und hinsichtlich der in-vitro-Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HA-346S einen Vorteil fĂŒr die Replikation von LPAIV und HPAIV vermittelt. T an Position 2 der Spaltstelle unterstĂŒtzt die Replikation von LPAIV. Bei Erwerb der polybasischen Spaltstelle wĂ€hrend der Evolution von LPAIV zu HPAIV mĂŒssen also auch die benachbarten Regionen im HA angepasst werden. Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich ĂŒber infizierte Vögel von SĂŒdostasien nach Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von SĂ€ugerspezies. Normalerweise weisen aviĂ€re Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K, was sonst in humanen StĂ€mmen zu finden ist. Um im dritten Teil dieser Arbeit den Einfluss dieser Mutation auf das breite Wirtspektrum der Clade 2.2-Viren zu untersuchen, wurde im HPAIV-Isolat R65 PB2-627K durch E ersetzt und die Virusmutante R65-PB2K627E generiert. Im Vergleich zu R65 war die Replikation von R65-PB2K627E in SĂ€ugerzellen drastisch reduziert, in Vogelzellen replizierten beide Viren jedoch gleich. Des Weiteren fĂŒhrte die Substitution zu einer extrem verringerten Polymerase-AktivitĂ€t auf 5% in SĂ€ugerzellen, aber nur zu einer vergleichsweise wenig verringerten AktivitĂ€t in Vogelzellen. WĂ€hrend die Virulenz im Huhn durch die Mutation nicht verĂ€ndert wurde, konnte bei der Bestimmung der LD50 in der Maus eine drastische Attenuierung gezeigt werden. Interessanterweise revertierte bereits nach einer Mauspassage PB2-K627E zurĂŒck zu K, im Huhn erfolgte diese Reversion aber nicht. Um zu untersuchen, ob andere virale Proteine fĂŒr diese Reversion notwendig sind, wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder mehrere Gensegmente des R65 im Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1) tragen, welches natĂŒrlicherweise PB2-627E besitzt. Mittels Zellkultur-Passagen dieser Reassortanten konnte gezeigt werden, dass die Reversion zu PB2-627K nur in SĂ€ugerzellen auftritt, und dass dazu das Nukleoprotein des R65 notwendig ist. Die schnelle Reversion zu PB2-627K in SĂ€ugerzellen und in MĂ€usen zeigt, dass die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 in ihrer Evolution möglicherweise mehrere Wirte gehabt haben, zu denen wahrscheinlich auch SĂ€uger gehörten.
