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Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASPV) ist ein wirtschaftlich wichtiger und in Haus- und Wildschweinen Hämorrhagie mit hoher Sterblichkeitsrate verursachender viraler Erreger.
1921 erstmals in Kenia beschrieben, breitete sich die ASP seit 2007 auch über den
Kaukasus, ins Baltikum (2014), weiter in europäische und asiatische Länder und seit 2020 in Deutschland aus. Trotz der hohen genetischen Stabilität des Afrikanischen
Schweinepestvirus (ASPV) wurden Genomvarianten identifiziert, bei denen Unterschiede
in der Genexpression von Multigenfamilien (MGF) dominieren. Letztlich divergieren ASPV-Stämme in ihrer Virulenz und verursachen akut-letale bis chronische Verläufe im Schwein. Aufgrund der enormen Komplexität des Virus und seiner vielfältigen
Immunevasionsstrategien sind viele Mechanismen der Virus-Wirts-Interaktion, die zur
Immunpathogenese beitragen, nicht ausreichend verstanden und erschweren somit die
Impfstoffentwicklung. Dabei können virale Subversionsmechanismen der Wirtszelle die
antivirale Immunantwort modulieren und stehen deshalb im Fokus dieser Arbeit. Zur
Charakterisierung und mechanistischen Aufklärung dieser ASPV-spezifischen
Immunsubversionsmechanismen wurden primäre porzine Monozyten von Hausschweinen
mit hochvirulentem (Armenia) und natürlich-attenuiertem (Estonia) ASPV infiziert. Die
Resultate ergaben sowohl stammunabhängige als auch -abhängige Unterschiede in der
Regulation myeloider Oberflächenmarker infizierter Monozyten. Insbesondere
beobachteten wir eine stammunabhängige Suppression des Phagozytose-regulierenden
CD172a und eine stammabhängige Regulation von porzinem MHC I (SLA I). Weitere
Experimente zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen ergaben, dass zwar
beide Stämme die Oberflächenexpression von CD172 unterdrücken, jedoch nur Armenia-,
im Gegensatz zu Estonia-infizierten Monozyten, eine reduzierte Recyclingrate sowie eine Abspaltung (Shedding) von CD172a von der Zelloberfläche zeigten. Dies lässt vermuten, dass die Virus-vermittelte Suppression von CD172a der beiden ASPV-Stämme auf unterschiedlichen Subversionsmechanismen beruht. Reinfektionsexperimente und
molekularbiologische Untersuchungen belegten zudem, dass das abgespaltene
Oberflächen-CD172a der Armenia-infizierten Monozyten mit einer gesteigerten
Infektionsrate einhergeht, dies ist wahrscheinlich das Ergebnis (entweder direkt oder indirekt) einer Komplexbildung zwischen dem virulenten Armenia-Virus und löslichem
CD172a. Im Gegensatz dazu resultierte die Infektion von Monozyten mit Armenia, jedoch nicht mit Estonia, in einem deutlichen Oberflächenverlust von porzinem SLA I, welches für die Antigenpräsentation gegenüber CD8+ T-Zellen essentiell ist. Weitere Versuche zeigten einen Reifungsdefekt von SLA I, der mit dem Abbau funktioneller ER-Strukturen und der Induktion von ER-Stress in Armenia-infizierten Monozyten in Zusammenhang stand. Gleichzeitig wurde eine deutlich reduzierte Überlebensfähigkeit Armenia-infizierter Monozyten beobachtet, die mit einem Verlust mitochondrialer Funktionen und der Bildung von Aggresomen aus fehlgefalteten Proteinen im Zytoplasma einherging. Vertiefende Analysen dazu zeigten einen Caspase-3 aktivierten Zelltodmechanismus und ein infektionsbedingtes, progressives Abschalten der Proteintranslation in Armenia-infizierten Zellen. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen den beobachteten
Subversionsmechanismen und der Expression bestimmter viraler MGF-Gene zu finden,
wurden weitere ASPV-Stämme in die Untersuchungen zur CD172a- und SLA I-Oberflächenexpression einbezogen. Ähnlich wie Armenia zeigte sich auch für die Stämme
NHV und OURT88/3 eine deutliche Reduktion der SLA I-Oberflächenlevel, auch wenn diese
in vivo gering-virulent sind. Andererseits zeigte das hochvirulente Benin97/1-Isolat im Gegensatz zu Armenia keine SLA I-Subversion, sondern ähnlich wie nach Estonia-Infektion kaum veränderte SLA I-Level, was vermuten lässt, dass der SLA I Subversionsmechanismus nicht alleinig den Virulenzgrad der ASPV-Stämme bestimmt. Ein direkter Genomvergleich identifizierte verschiedene Mitglieder der MGF110- und MGF505-Gene als möglicherweise beteiligte virale Genkandidaten. Im Gegensatz hierzu ergaben sich keine detektierbaren Unterschiede bei den Analysen zur Oberflächensuppression von CD172a innerhalb der verwendeten Isolate, wie bereits bei Armenia und Estonia Infektion beobachtet. Interessanterweise beobachteten wir dabei das Vorhandensein von MGF110-14 als eine genomische Gemeinsamkeit, die für die generelle Oberflächenreduktion von CD172a, zusätzlich zu anderen Genen, die ein Shedding und die Armenia-spezifische Interaktion bestimmen könnten, verantwortlich sein könnte.
Insgesamt zeigen die Resultate dieser Arbeit erstmals, dass das virulente ASPV Armenia, anders als das attenuierte ASPV Estonia, einen ausgeprägten Funktions- und Vitalitätsverlust in seinen primären Zielzellen (z. B. Monozyten) bewirkt. Die gesteigerte Infektiosität, Induktion von zellulärem Stress und Beeinträchtigung der SLA I-vermittelten Antigenpräsentation werden in infizierten Schweinen eine entscheidende Rolle in der Virus-Verbreitung und der Immunevasion spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Befunde dieser Arbeit neue und vertiefte Einblicke in die zellulären Mechanismen der SLA I- und CD172a-Subversion im Zusammenhang mit der Immunevasion durch hoch-virulentes ASPV Armenia und attenuiertes ASPV Estonia gibt und zudem wichtig für das bessere Verständnis der ASP-Immunpathogenese sind.
Bisherige Analysen von RABV-Pathogenitätsdeterminanten wurden mit laboradaptierten, teils attenuierten Viren durchgeführt. Es ist unklar, ob bisher untersuchte Faktoren auch für hoch virulente RABV-Feldviren relevant sind. Der hier durchgeführte systematische Vergleich von Feldviren und Laborstämmen im infizierten Tier konnte Unterschiede hinsichtlich der Fähigkeit immunkompetente Neuroglia des ZNS zu infizieren als mögliche Pathogenitätsdeterminante aufzeigen. Darüber hinaus wurden erstmals SZ-Neuroglia peripherer Nerven als Zielzellen für die RABV-Infektion identifiziert.
Für die Analyse von RABV-infizierten Geweben wurde ein modernes 3D Imaging-Verfahren angewandt. Gehirne aus experimentell infizierten Mäusen und Frettchen wurden wie in Veröffentlichung 1 beschrieben immunfluoreszenz-gefärbt, optisch geklärt und hochauflösend mit einem konfokalen Laserscan Mikroskop untersucht. RABV N und P Protein konnten dreidimensional in räumlicher Umgebung zu zellulären Strukturen des Wirtes visualisiert werden. Diese Untersuchung bewies die besondere Eignung des Verfahrens zur Identifizierung vereinzelter Zielstrukturen und wurde für nachfolgende systematische Analysen im ZNS und PNS verwendet.
Der RABV-Zelltropismus wurde als vermutlich wichtige Pathogenitätsdeterminante in Veröffentlichung 2 untersucht. RABV Feldviren vom Hund (rRABV Dog), Fuchs (rRABV Fox) und Waschbär (rRABV Rac) konnten im Vergleich zu den laboradaptierten Viren (rCVS-11, SAD L16 und ERA) nicht-neuronale Zellen im ZNS wie Astroglia produktiv infizieren. Der Anteil infizierter Astrozyten ist mit 7-17 % nach i.m. Inokulation vergleichbar mit dem der Neuronen (7-19 %). Interessanterweise wurde eine Inokulationsroutenabhängige Infektion von Astrozyten mit dem moderat virulenten Laborstamm rCVS-11 beobachtet. Diese systematische und quantitative Analyse des RABV-Astrozyten- und Neuronentropismus zeigt, dass mit abnehmender Virulenz die Fähigkeit der Viren produktiv in Astroglia im ZNS zu replizieren abnimmt. Die Fähigkeit eine produktive Infektion in Astrozyten auszubilden, scheint demnach ein grundlegender Unterschied zwischen Feldviren und weniger virulenten Laborstämmen zu sein.
Weiterführend wurde in Veröffentlichung 3 die Virusausbreitung vom ZNS in periphere Nerven untersucht. Hinterbeine, Wirbelsäule inklusive Rückenmark, Gehirn und weitere Kopfbereiche experimentell infizierter Mäuse wurden mittels Lichtblatt- und konfokaler Laserscanmikroskopie analysiert. Zum Ersten Mal konnte eine RABV-Infektion peripherer Neuroglia dargestellt werden. Eine produktive Infektion immunkompetenter SZ im PNS ist also möglicherweise, genauso wie die Infektion von Astrozyten im ZNS, entscheidend für die RABV-Neuropathogenese. Die Detektion von RABV-Antigen im Hinterbein nach i.c. Inokulation beweist eine anterograde axonale Virusausbreitung vom ZNS in periphere Nerven. Interessanterweise konnte das Virus auch in Bereichen des Nasopharynx und des Zungenepithels nachgewiesen werden, worüber möglicherweise zusätzlich zur Speicheldrüse Virus in den Nasenrachenraum ausgeschieden wird. Zusammenfassend konnten mit dieser Arbeit neue Einblicke hinsichtlich des Zelltropismus und der Ausbreitung von RABV in vivo im Modellorganismus Maus gewonnen werden. Die Fähigkeit der untersuchten hoch virulenten Feldviren nicht-neuronale, immunkompetente Neuroglia des ZNS und PNS zu infizieren unterscheidet diese von den weniger virulenten bzw. apathogenen Virusstämmen und könnte ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer Tollwut-Enzephalitis darstellen.
Der Erreger des Q-Fiebers ist C. burnetii, ein zoonotisches intrazelluläres Bakterium. Die Gram-negativen Coxiellen kommen in zwei verschiedenen antigenen Lipopolysaccharid (LPS)-Formen vor: als virulente Ph I-LPS- und/oder avirulente Ph II-LPS-Bakterien. C. burnetii wird durch Kontakt mit infizierten Tieren sowie infektiösen Stäuben übertragen. Akute fiebrige Infektionen können beim Menschen im weiteren Verlauf eine Pneumonie oder Hepatitis auslösen. Zu einem geringen Prozentsatz entstehen chronische Infektionen mit persistierenden Coxiellen. Eine C. burnetii-Infektion bewirkt sowohl eine humorale als auch zelluläre Immunantwort. Neben Monozyten und Makrophagen dienen auch dendritische Zellen (DCs) den Coxiellen als geeignete Wirtszellen. DCs gehören zu den Immunzellen der first-line-of-defense des angeborenen Immunsystems und treten während einer Coxiellen-Infektion ebenso wie die mit ihnen kooperierenden natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) früh mit dem aufgenommenen bakteriellen Pathogen in Kontakt. Durch Antigenpräsentation infizierter DCs wird die für die anti-Coxiellen Abwehr maßgebliche T-Zell-Immunität initialisiert und die nachgeschaltete Immunantwort funktional ausgerichtet.
Trotz dieser zentralen Immunfunktion sind die zellulären Vorgänge von DCs während einer C. burnetii-Infektion, insbesondere mit Blick auf die zelluläre Selbstverteidigung gegenüber den vermutlich initial auftretenden Ph II-LPS-Varianten, nicht ausreichend verstanden. Zudem ist bisher nicht hinreichend geklärt, welchen Einfluss FN-γ, das von aktivierten NK-Zellen produziert wird, sowie die Sauerstoffumgebung auf die zelluläre Abwehr infizierter APCs nimmt.
Das Forschungsziel dieser Promotionsarbeit war es daher, einen detaillierten Einblick in die Prozesse der Coxiellen-Infektionen von DCs und NK-Zellen zu erhalten und hierbei insbesondere die IFN-γ-Wirkung auf die DC-Pathogen-Wechselwirkung sowohl unter norm- als auch hypoxischen Bedingungen zu untersuchen.
Die im ersten Teil der Promotionsarbeit durchgeführten zellbiologischen, immunologischen und proteinbiochemischen Analysen im murinen Zellsystem belegen eine pathogenausgelöste Subversion der funktionalen Aktivierung/Induktion der MHC I-Antigenpräsentation Coxiellen-infizierter DCs. Die infektionsbedingte Beeinträchtigung der MHC-Antigenpräsentation infizierter DCs lässt sich in direkter Weise auf einen autokrinen Suppressionseffekt des αVβ8-Integrin-aktivierten TGF-β und nicht auf die subversive Wirkung von Coxiellen-LPS als Virulenzfaktor zurückführen. Untersuchungen im Zusammenhang mit IFN-γ zeigen, dass dieses Zytokin in infizierten DCs eine Wiederherstellung der MHC I-Induktion und -Oberflächenexpression bewirkt, welche mit einer funktionalen Prozessierung und MHC-Präsentation pathogener Peptidantigene verbunden ist. Weitere Studien belegen zudem, dass IFN-γ-behandelte DCs in der Lage sind, die Etablierung/Vermehrung intrazellulärer Coxiellen negativ zu beeinflussen. Die durchgeführten siRNA- und CRISPR/Cas9-Experimente zeigen, dass die zelluläre Selbstverteidigung infizierter DCs maßgeblich durch das IFN-γ-induzierbare iNOS/NO-System vermittelt wird. Als reaktives Stickstoffradikal scheint Stickstoffmonoxid (NO) sowohl Komponenten der bakteriellen Elektronentransportkette als auch die autophagische Ausbildung und Integrität parasitophorer Vakuolen zu beeinträchtigen. Parallel hierzu schützen sich infizierte DCs über einen metabolischen Wechsel zur aeroben Glykolyse vor mitotoxischer NO-Wirkung und sichern so während der intrazellulären Coxiellen-Eliminierung ihr eigenes Überleben.
Weitere Untersuchungen dieser Arbeit belegen zudem, dass auch C. burnetii zu einer entsprechenden Gegenwehr fähig ist. Um der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs entgegenzuwirken, induzieren Coxiellen zur Minderung antibakterieller Radikal-Effekte ihre Cytochrom bd-, Katalase- und SOD-Expression. Infektionsstudien mit T4SS-defekten Coxiellen weisen ferner darauf hin, dass das bakterielle Sekretionssystem vermutlich eine wichtige Rolle bei der Wirksamkeit der NO-vermittelten Abwehr infizierter DCs spielt, da sich Coxiellen ohne intaktes T4SS offensichtlich dem negativen NO-Einfluss entziehen und/oder keine entsprechenden Angriffsziele für NO bieten. Studien C. burnetii-infizierter Makrophagen bestätigen, dass das iNOS/NO-System eine essenzielle antibakterielle Selbstverteidigung von APCs darstellt. So zeigen auch Makrophagen eine deutliche Beeinträchtigung intrazellulärer Coxiellen-Vermehrung unter iNOS-vermittelter NO-Synthese. Die im weiteren Verlauf der Arbeit untersuchten norm- und hypoxischen Infektionsmodelle infizierter DCs lassen vermuten, dass hypoxische Kulturbedingungen die Coxiellen dazu veranlassen, ein sporenähnliches Stadium ohne produktive Vakuolenbildung auszubilden. Diese hypoxische Überlebensform intrazellulärer Coxiellen zeichnet sich durch IFN-γ-Resistenz, eine durch modifizierte Genexpression optimierte Sauerstoffverwertung und Radikalentgiftung sowie die Erhaltung ihrer Infektiosität aus. Dies deutet darauf hin, dass Hypoxie den intrazellulären Coxiellen weitere Möglichkeiten zur effizienten Immunevasion eröffnet, die einen unentdeckten Bakterienverbleib innerhalb infizierter Wirtszellen begünstigt und so vermutlich chronische C. burnetii-Infektionen fördert.
Für die Synthese und Freisetzung des APC-stimulierenden IFN-γ sind im Zuge angeborener Immunität vor allem die mit DCs kooperierenden NK-Zellen verantwortlich. Die im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit durchgeführten Studien zur Charakterisierung der Interaktion zwischen NK-Zellen und Coxiellen belegen, dass NK-Zellen von C. burnetii infiziert werden, sie jedoch die Etablierung und Replikation internalisierter Bakterien durch Ausschleusung in die extrazelluläre Umgebung unterbinden. Dieser Prozess geht mit einer funktionalen NK-Zell-Aktivierung einher, welche durch Phospho-Aktivierung der PKC ϴ sowie IFN-γ- und Granzym B-Ausschüttung charakterisiert ist. Verschiedene mikroskopische Analysen zeigen zudem, dass die intrazellulären bakteriellen Strukturen in unmittelbarem Kontakt mit den sekretorischen Granula stehen und die Coxiellen-Freisetzung über Degranulierung infizierter NK-Zellen erfolgt. Der Abtötung innerhalb der sekretorischen Granula infizierter NK-Zellen scheint sich C. burnetii durch seine Säure- und Protease-Resistenz zu entziehen. Freigesetzte Coxiellen erhalten nach Degranulierung größtenteils ihre Integrität und Fähigkeit zur Infektion benachbarter Wirtszellen. Obschon Coxiellen der Eliminierung durch die sekretorischen Granula entgehen und dies eine kritische Achillesferse der angeborenen Immunantwort darstellt, verbleibt über das gleichzeitig ausgeschüttete IFN-γ infizierter NK-Zellen ein positiver Effekt auf die antibakterielle APC-Aktivität.
In ihrer Gesamtbetrachtung tragen die erzielten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit zu einem besseren und tieferen Verständnis der C. burnetii-Infektion von DCs und NK-Zellen bei und geben neue Einsichten in die zelluläre Selbstverteidigung sowie die IFN-γ-basierte Immunkooperation innerhalb der frühen Phase der anti-Coxiellen Abwehr. Im weiteren Infektionsverlauf können jedoch diese immunologischen Prozesse durch auftretende Hypoxie vermutlich eingeschränkt und die Eliminierung intrazellulärer Coxiellen erschwert sein.
Phospholipide wie Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin sind essenzielle Bestandteile aller biologischen Membranen und für deren Integrität und Funktion unerlässlich. Sind Inositol und Cholin (IC) im Medium vorhanden, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae in der Lage, diese aufzunehmen und zu verarbeiten. Unter Mangelbedingungen können diese Stoffe von der Zelle selbst synthetisiert werden. Daher ist es sinnvoll, die Phospholipid¬biosynthese-Gene differenziell zu exprimieren, was auf der Ebene der Transkriptions¬initiation geschieht. Bei IC-Mangel werden die Gene (z. B. das Inositol-3-Phosphat Synthase Gen INO1) durch Bindung des heterodimeren Aktivatorkomplexes Ino2/Ino4 an das Promotorelement ICRE („inositol/ choline responsive element“) aktiviert, um die Biosynthese zu gewährleisten. Sowohl Ino2 als auch Ino4 sind für die ICRE-Bindung nötig, während die transkriptionale Aktivierung nur durch Ino2 mit Hilfe zweier Transkriptionsaktivierungsdomänen TAD1 und TAD2 vermittelt wird. Ist dagegen ausreichend IC vorhanden, werden die Gene reprimiert, indem der Repressor Opi1 an den Aktivator Ino2 bindet, sodass es zu einer Konformationsänderung kommt und eine Dimerisierung mit Ino4 nicht mehr möglich ist.
Um eine erfolgreiche Transkriptionsinitiation zu gewährleisten, bilden neben der RNA-Polymerase II eine Reihe genereller Transkriptionsfaktoren (A, B, D, E, F und H) sowie der Mediatorkomplex im Promotorbereich der Zielgene den sog. Präinitiationskomplex (PIC). Die von diesen basalen Faktoren gewährleistete geringe Grundexpression kann von Aktivatorproteinen, die an positiv-regulatorische Elemente („upstream activation site“, UAS) binden, deutlich verstärkt werden. Hierzu nutzen Aktivatorproteine verschiedene Mechanismen, zu denen die Auflockerung der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationskomplexe wie SAGA oder Chromatinremodellierungskomplexe wie SWI/SNF, die bessere Bindung der Transkriptionsfaktoren am Basalpromotorbereich oder die Beschleunigung des Übergangs vom geschlossenen zum offenen PIC gehören.
Im Verlauf dieser Arbeit konnten zahlreiche Interaktionen zwischen dem Aktivator Ino2 und Faktoren der Transkriptionsmaschinerie nachgewiesen werden, die vermutlich die Häufigkeit der Trans¬kriptions-initiation beeinflussen. Einige der Untereinheiten des Transkriptionsfaktors TFIID interagie¬ren mit Ino2. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung der Interaktion der Ino2-TAD1 mit Taf1 und Taf12. Der Austausch der Aminosäuren Asparaginsäure-20 und Phenyl¬alanin-21 in Ino2 führte zu einem Interaktionsausfall mit beiden Tafs. In Taf1 konnten zwei basisch-hydro¬phobe Aminosäure-Bereiche (K206 Y207 und L208 L209 K210) innerhalb der minimalen Aktivator¬binde¬domäne 2 (ABD2) identifiziert werden, die kritisch für den Kontakt zum Aktivator sind. Es konnte ferner gezeigt werden, dass basische und hydrophobe Aminosäuren in Kombination für die Bindung an den Aktivator verantwortlich sind und dass der Austausch gegen Alanin (KY-AA) zu einem Abfall der Expression des INO1-Gens auf 44% führt. Darüber hinaus konnte der Bromo¬domänen¬faktor Bdf1 als Interaktionspartner von Ino2 identifiziert werden. Bdf1 vervollständigt Hefe-Taf1, während Säuger-Taf1 selbst Bromodomänen zur Erkennung von Histonacetylierungen beinhaltet. Innerhalb der Taf12-Minimaldomäne sind die Aminosäuren K150 L151 R175 und L176 wesentlich für die Bindung an Ino2. Eine Teildeletion von Taf12, die unter anderem den Verlust dieser Aminosäuren zur Folge hat, führt zu einer auf 76% reduzierten INO1-Expression.
Ein weiterer Transkriptions¬faktor, der von Ino2 kontaktiert wird, ist TFIIA mit seinen Untereinheiten Toa1 und Toa2. Die Proteine kontaktieren beide TADs des Aktivators, allerdings konnten innerhalb der minimalen Interaktionsdomänen der Toa-Proteine keine für diese Interaktion verantwortliche Aminosäuren identifiziert werden. Veränderungen der Toa1-Sequenz hatten keinen phänotypischen Einfluss auf die Phospholipidbiosynthese, allerdings führten einige Veränderungen (RKRK-Motiv im AS-Bereich 253-259) zu letalen Folgen für das Wachstum der Zellen, weil die Bildung des TFIIA-TBP-TATA-Komplexes beeinträchtigt ist. Wahrscheinlich hat die Interaktion zwischen Ino2 und TFIIA eine verstärkende Wirkung auf die Transkriptionsinitiation der Phospholipidbiosynthese-Gene, indem die Interaktion zwischen TFIIA und TFIID stabilisiert wird und TFIIA die interaktive Oberfläche am Promotor für Interaktionen mit anderen Proteinen vergrößert.
Die Verschiebung der Nucleosomen in Promotorbereichen durch Chromatinremodellierungs¬kompexe wie SWI/SNF ist ein weiterer Mechanismus der Transkriptionsaktivierung. In früheren Arbeiten wurde bereits die Interaktion zwischen Ino2, Aro80 bzw. Gal4 und der SWI/SNF ATPase-Untereinheit Swi2 beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit konnte eine minimale Interaktionsdomäne im AS-Bereich 238-307 kartiert werden. Essenzielle Aminosäuren für die Bindung an Ino2 und andere Aktivatoren konnten nicht identifiziert werden.
Sug1 und Sug2 sind ATPasen der regulatorischen 19S-Untereinheit des 26S Proteasoms. Neben der Degradation fehlgefalteter polyubiquitinierter Proteine haben sie auch eine nicht-proteolytische Bedeutung für die Transkriptionsinitiation. Bekannt ist, dass proteasomale ATPasen an aktiven Promotoren zu finden sind und mit Aktivator¬proteinen (z. B. Gal4) interagieren können. Die vorlie¬gende Arbeit zeigt, dass auch Ino2 von Sug1 und Sug2 kontaktiert wird. Möglicherweise dienen sie am INO1-Promotor als Stabilisatoren und Vermittler zwischen Ino2 und der Transkriptionsmaschi¬nerie und erleichtern den Übergang des Präinitiationskomplexes in den Elongationskomplex.
Unter reprimierenden Bedingungen bindet Opi1 an Ino2 und rekrutiert die Corepressorkomplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die ihrerseits Histondeacetylasen in Promotornähe bringen und die Transkrip¬tion durch lokale Chromatinverfestigung reprimieren. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass die Corepressoren auch mit Ino2 und weiteren Aktivatoren (Hac1 und Pho4) interagieren und dass sie in Abhängigkeit von Ino2, nicht aber von Opi1, am INO1-Promotor vorliegen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Ino2 und Sin3 bzw. Cyc8 charakterisiert. Sin3 und Cyc8 kontaktieren einen Bereich des Aktivators, der die TAD2 und die RID (Repressorinteraktionsdomäne) enthält. Es war bekannt, dass die Aminosäuren Phenylalanin-130, Leucin-131 und Asparaginsäure-132 essenziell für die Interaktion mit Opi1 sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass deren Austausch gegen Alanin auch einen Interaktionsverlust mit Cyc8 und Sin3 bewirkt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese FLD-AAA-Mutation zu einer praktisch konstitutiven Expression des INO1-Gens führt, allerdings auf niedrigerem Niveau als im Fall dereprimierter Zellen mit einem Wildtyp Ino2. In Hac1 und Pho4 konnten Aminosäuren mit vergleichbarer Bedeutung für die Corepressorbindung nicht identifiziert werden. Offenbar können die Corepressoren je nach physiologischer Situation in der Zelle positiv oder negativ auf die Transkriptionsinitiation wirken.
Pestivirus-Replikons als Werkzeug für heterologe Genexpression und molekulare Charakterisierung
(2021)
Replikons sind autonom replizierende RNA-Moleküle die nicht in der Lage sind, infektiöse Viren zu bilden. Sie sind wichtige Hilfsmittel zur molekularen Charakterisierung von Viren. Außerdem werden sie erfolgreich als Expressionssystem für Proteine und zur Entwicklung von Impfvektoren eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Replikon-basiertes Testsystem für den Nachweis spezifischer Antikörper gegen das atypische porzine Pestivirus (APPV) in Schweineseren etabliert. Auf Basis eines Klons des Virus der bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV) wurden die ursprünglichen BVDV Glykoproteine E1 und E2 gegen die Glykoproteine des APPV ausgetauscht. Die Expression mittels Replikon gewährleistet die natürliche Konformation der Proteine und damit die Bindung der entsprechenden Antikörper. Dieses System ermöglichte die serologische Untersuchung von 1115 Schweineseren ohne vorherige Isolation oder Zellkulturadaptation des Virus. Mit diesem neu entwickelten System konnte eine Seroprävalenzstudie gestartet und eine hohe Prävalenz von APPV in der untersuchten deutschen Schweinepopulation gezeigt werden.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden Replikons zur Charakterisierung des atypischen Pestivirus Bungowannah Pestivirus (BuPV) eingesetzt. Während die Replikons mit Deletionen der Gene für die einzelnen Strukturproteine C, E1 und E2 oder die gesamte Strukturproteinregion keine Besonderheiten im Vergleich zu bereits untersuchten Pestivirus-Replikons aufwiesen und keine infektiösen Virionen mehr produzieren konnten, zeigten BuPV-Replikons mit ERNS-Deletion die Fähigkeit, zwei weitere Replikationszyklen zu durchlaufen und Zellen zu infizieren, allerdings mit einem sehr deutlichen Wachstumsdefizit. Dieser Defekt scheint in der Virusassemblierung und/oder der Freisetzung aus der Zelle zu liegen. Es konnte somit erstmals gezeigt werden, dass ERNS nicht essentiell für die Bildung infektiöser Bungowannah-Viren ist, jedoch sehr wichtig für eine effiziente Virusvermehrung. Diese Eigenschaft der ERNS deletieren BuPV macht diese besonders interessant als Vektoren für die Entwicklung neuer Replikon-basierter Expressionssysteme und einer Vakzinplattform. ERNS-Deletionsmutanten wurden daher auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine effiziente Expression verschiedener immunogener Proteine zu gewährleisten. Die Konstrukte waren dabei in der Lage, die ausgewählten Proteine effizient zu exprimieren und konnten zudem effizient zu Virus-Replikon-Partikel (VRP) verpackt und in einer trans-komplementierenden Zelllinie vermehrt werden.
Auch der für das parentale Virus beschrieben Zelltropismus konnte für die generierten BuPV-VRP gezeigt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Eigenschaften sind es der nicht-zytopathogene Charakter und die in den meisten Regionen fehlende Immunität gegen BuPV, die das hohe Potential dieses Systems als universellen Vakzinvektor herausstellen.
Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein erstes DNA-basiertes System zur Herstellung rekombinanter BuPVs etabliert. Dieses System ermöglicht sowohl die Virusproduktion ausgehend von einem T7-RNA-Polymerase Promotor, als auch von einem Polymerase-II-Promotor. Die infektiösen Viren zeigten gleiche Wachstumseigenschaften wie Viren, welche mit dem konventionellen RNA-System generiert wurden. Auf Basis des neuen DNA-Systems konnte auch ein Replikon mit Deletion im ERNS-Gen etabliert werden. Dieser Klon zeigte nach der Transfektion eine sehr geringe Replikationsrate, konnte jedoch zur weiteren Konstruktion eines „single round infectious particle“ (SRIP) eingesetzt werden. Diese SRIP sind durch die Koexpression des deletierten ERNS in der Lage, sich selbst zu verpacken und bilden damit ein ideales System zum Transport selbst-replizierender RNA. Durch seine selbstlimitierenden Eigenschaften könnte es zur Entwicklung und Etablierung einer effizienten und sicheren Vakzineplattform eingesetzt werden. Allerdings ist dafür eine weiterreichende Optimierung notwendig.
Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass sich pestivirale Replikons sowohl als effizientes und schnelles Testsystem für die Untersuchung der Verbreitung neu auftretender Pestiviren, als auch zur Entwicklung effizienter RNA- und DNA-basierter Transport- und Verpackungssysteme viraler Proteine, eignet.
Der Kernexport neusynthetisierter Kapside stellt einen Schlüsselprozess in der Herpesvirus-Replikation dar. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Vesikel-vermittelten Translokation sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Der nuclear egress wird dabei maßgeblich von zwei viralen Proteinen dirigiert, die in PrV und HSV-1/-2 als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden und in allen Herpesviren konserviert sind. Beide Proteine interagieren an der inneren Kernmembran, wo sie den sogenannten nuclear egress complex (NEC) bilden. Während pUL34 ein membranständiges Protein in der Kernmembran ist, gelangt das lösliche pUL31 über einen aktiven Transport in den Kern. Obwohl der erste Schritt der Freisetzung aus dem Kern, die Vesikelbildung und Abschnürung an der inneren Kernmembran, schon gut untersucht ist und auch die Kristallstrukturen des NEC für verschiedene Herpesviren ermittelt werden konnte, sind noch viele Fragen offen. So war zu Beginn dieser Arbeit noch unklar wie die Kapside in diese Hüllen rekrutiert werden und welche Rolle die nicht konservierte und offensichtlich flexible N-terminale Domäne von pUL31, die nicht in den Kristallstrukturen dargestellt werden konnte, für die Regulierung dieses Prozesses spielt. So konzentrierte sich diese Arbeit auf die Fragen, wie die Kapside mit dem NEC interagieren (Paper I und II) und wie der pUL31-N-Terminus diesen ungewöhnlichen Transportweg beeinflusst (Paper III).
Paper I und II: Untersuchungen zur Nukleokapsid/NEC Interaktion
Unklar ist, wie der NEC mit seiner Fracht, den Nukleokapsiden, interagiert. Auf Grundlage der vorhandenen Kristallstrukturen des Komplexes unterschiedlicher Herpesviren wurde eine Interaktionsdomäne in pUL31 postuliert und angenommen, dass dies mittels elektrostatischer Wechselwirkungen erfolgt. Um dies näher zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit geladene Aminosäuren, die als mögliche Interaktionspartner in Frage kommen, zu Alanin mutiert. Die so generierten pUL31 Mutanten wurden, nach Transfektion entsprechender Expressionsplasmide in Kaninchennierenzellen (RK13), auf ihre Lokalisation und nach Koexpression mit pUL34 auf Interaktion getestet. Die Funktionalität der mutierten Proteine während der Virusreplikation wurde mit Hilfe stabiler Zelllinien nach Infektion mit PrV-∆UL31 untersucht. Über elektronenmikroskopische Analysen wurde der Einfluss auf den Kernexport im Detail betrachtet. Hierbei konnte einem konservierten Lysin an Position 242 in PrV pUL31 im Prozess der Kapsidumhüllung eine Schlüsselrolle zugeordnet werden. Dieses Lysin befindet sich im membrandistalen Bereich des NECs, in der Alphahelix H10 von PrV pUL31. Die Substitution des K242 zu Alanin führte zu einem Abschnüren und einer Akkumulation leerer, Virushüllen-ähnlicher Vesikel im PNS, obwohl reife Kapside im Kern und in unmittelbarer Nähe zu den Akkumulationen vorhanden waren. Dies führte zu der Hypothese, dass die Ladung des Lysins direkt an der Interaktion mit dem Kapsid beteiligt ist (Paper I).
Obwohl das Lysin 242 in der Struktur des Dimers oberflächenexponiert erschien, zeigten Modellierungen im NEC Oligomer, dass diese Aminosäure vermutlich zu tief in der Struktur verborgen ist um als direkter Interaktionspartner in Frage zu kommen. Um die im vorherigen Paper aufgestellte Hypothese zu verifizieren oder auch zu widerlegen, wurde das Lysin nicht nur durch Alanin, sondern auch durch andere nicht geladene, sowohl positiv als auch negativ geladene oder in ihrer Größe variierende Aminosäuren substituiert (Paper II).
Die neu generierten Substitutionsmutanten wurden nach Transfektion der Expressionsplasmide auf ihre Lokalisation und nach Kotransfektion mit pUL34, auf ihre Interaktion untersucht. Die Funktionalität der mutierten Proteine wurde ebenfalls mit Hilfe stabil exprimierender Zelllinien analysiert. Die vorliegenden Phänotypen wurden weiter mittels elektronenmikroskopischer Analysen bestimmt. Es stellte sich heraus, dass unabhängig von der vorhandenen Ladung der Aminosäure an Position 242 der Kernexport signifikant beeinträchtigt wurde. In Strukturanalysen der einzelnen Mutanten zeigte sich, dass vielmehr die Ausrichtung und Größe der Seitenkette der ersetzten Aminosäure entscheidend war. So störte beispielsweise die Substitution zu Serin und Tyrosin, die die Lage der Seitenketten des ursprünglich vorliegenden Lysins imitierten, die Funktion des pUL31 am wenigsten und die Titer erreichten fast Wildtypwerte. Dagegen führten Substitutionen zu deutlich längeren Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Arginin, zu massiven Beeinträchtigungen des nuclear egress. Allerdings führte keine der Substitutionen zu einem unkontrollierten Abschnüren von Vesikeln ohne Aufnahme eines Kapsids an der inneren Kernmembran.
Die hier gezeigten Ergebnisse entkräfteten die Annahme einer elektrostatischen Interaktion über pUL31 K242 mit den Nukleokapsiden in PrV. Vielmehr deuteten sie auf eine strukturell basierte Störung der Kapsidaufnahme in die Vesikel hin (Paper II).
Mittels serieller Passagen von Virusmutanten die das UL31 mit der K242A Substitution exprimierten, wurde nach möglichen kompensatorischen (second-site) Mutationen gesucht, die den Defekt ausgleichen und darüber hinaus Aufschluss auf die molekularen Ursachen ziehen lassen.
Die generierten Virusrekombinanten erreichten bereits nach ca. 10 Passagen Wildtpy-ähnliche Titer. Aus den Passagen wurden verschiedene Isolate charakterisiert. Es zeigte sich zwar keine Reversion zum Lysin 242, vielmehr waren jedoch entweder weitere Mutationen in pUL31 oder in pUL34 zu finden. Während die detektierten pUL34 Mutationen zu einem späteren Zeitpunkt charakterisiert werden müssen, wurden die second-site mutierten pUL31 Proteine auf Lokalisation, Kolokalisation und Kompensation des K242A Defektes getestet. Die Ergebnisse bestärkten die Annahme eines Strukturdefektes durch K242A. Darüber hinaus konnten durch Rückmutation des K242A Defektes in den second-site mutierten pUL31 zwei Helices bestätigt werden (H5 und H11), die ähnlich der H10 einen starken Einfluss auf den Kernexport besitzen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Aminosäure an Position 242 nicht direkt mit den Nukleokapsiden interagiert, dass eingeführte Mutationen jedoch die Umorganisation des NEC-Oligomers, welche offensichtlich notwendig für die effiziente Kapsidumhüllung an der inneren Kernmembran ist, stört und so den nuclear egress inhibiert (Paper II).
Es zeigte sich, dass sich die Struktur-Funktions-Beziehungen in den NECs komplexer darstellen als vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit können zwar nicht den Mechanismus des Kapsidexports bzw. der Kapsidbindung und -inkorporation aufklären doch zeigen sie, dass die Interaktionen der NECs miteinander sehr viel komplexer aber auch wesentlich flexibler sind als zunächst angenommen.
Paper III: Untersuchung der N-terminalen Domäne von PrV pUL31
Neben einem Kernlokalisationssignal (NLS) beherbergt der N-terminus verschiedener pUL31 Homologer auch zahlreiche vorhergesagte Phosphorylierungsstellen, die an der Regulation des Kernexportes beteiligt sind bzw. sein könnten. Dieser flexible N-terminale Bereich hat in PrV pUL31 eine Länge von 25 Aminosäuren, wobei auffallend viele basische Aminosäuren in Clustern und verschiedene mögliche Phosphorylierungsstellen enthalten sind. Computer-unterstütze Analysen (NLStradamus) erkennen in der Aminosäuresequenz ein bipartites NLS (AS 5-20). Um die Rolle des N-terminalen Bereiches in PrV pUL31 näher zu untersuchen, wurde dieser schrittweise verkürzt und die basischen Aminosäuren, sowie die möglichen Phosphorylierungsstellen, durch gerichtete Mutagenese durch Alanin ersetzt. Getestet wurden diese Mutanten nach Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in RK13 Zellen auf ihre Lokalisation und, nach Koexpression von pUL34, auf Interaktion und der Umorganisation der Kernmembran. Über stabil-exprimierende Zelllinien und nach Infektion mit der UL31 negativen Virusmutante (PrV-∆UL31) wurde die Funktionalität in eplikationsassays und auch ultrastrukturell charakterisiert. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass weder das bipartite NLS noch die vorhergesagten Phosphorylierungsstellen eine entscheidende Rolle spielen. Vielmehr konnte der größte Teil des N-Terminus ohne sichtbaren Funktionsverlust deletiert werden, sofern mindestens ein Cluster basischer Aminosäuren in dieser Region erhalten blieb. Die Ergebnisse zeigten, dass der basische Charakter dieser Region entscheidend für die korrekte Lokalisation, sowie für die Bildung und Funktionalität des NEC ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung im N-Terminus von PrV pUL31, wie auch die roteinkinase pUS3, zwar nicht essenziell für die Freisetzung der Nukleokapside aus dem perinukleären Spalt sind, jedoch diesen Prozess unterstützen (Paper III).
Rekombinante Vektorvakzinen, basierend auf Viren der Newcastle-Krankheit (NDV) haben sich als kostengünstig, schnell herstellbar und sicher für die Applikation bei Geflügel und Säugetieren erwiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei rekombinante Vakzineviren, die das lentogene NDV Clone 30 als Vektor nutzen, für die Prävention der hochpathogenen aviären Influenza (HPAI) bei Hühnerküken, die maternale aviäre Influenzavirus-spezifische Antikörper (AIV-MDA) aufweisen, und die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) bei Ziegen evaluiert.
Während bekannt ist, dass rekombinante NDV/AIV-H5-Vakzineviren in spezifisch pathogenfreien Eintagsküken eine protektive Immunantwort induzieren, ist diese bei Küken in HPAI-Endemiegebieten meist durch vorhandene AIV-MDA negativ beeinflusst. Durch die Generierung einer NDV-Rekombinanten (rNDVsolH5_H5), die das HA des HPAIV H5N1 von zwei individuellen Fremdgenen exprimiert, konnte eine Überexpression des H5 und in Folge der okulonasalen Immunisierung von zwei- und drei-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken die Überwindung der AIV-MDA und die Bildung von wirtseigenen AIV-H5-spezifischen Antikörpern erreicht werden. Die in Folge einer HPAIV H5N1-Belastungsinfektion vermittelten Protektionsraten beliefen sich auf 85 % bei zwei-Wochen-alten und auf 100 % bei drei-Wochen-alten Hühnern, deren Ausscheidung des virulenten Wildtypvirus im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant reduziert war. Auch wenn das rekombinante Impfvirus in ein-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken replizieren konnte, weist die Schutzrate von 40 % darauf hin, dass die Immunisierung sehr junger AIV-MDA+-Küken nicht zu empfehlen ist.
Die subkutane Immunisierung von Ziegen mit dem rekombinanten Vektorvirus rNDV_HKur, das das Hämagglutinin des Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer (small ruminant morbillivirus, PPRV) exprimiert, schützte diese vor einer virulenten Wildtypvirus-Infektion. Nach zweimaliger Applikation wurden, wie nach der Impfung mit einer atttenuierten PPRV-Lebendvakzine, weder Erkrankungszeichen beobachtet noch eine hämatogene Streuung und nur geringgradige Replikation bzw. Ausscheidung des PPR-Wildtypvirus nachgewiesen, was auf die Bildung PPRV-neutralisierender Antikörper nach der Immunisierung zurückzuführen ist. Somit konnte gezeigt werden, dass sich das rekombinante NDV/PPRV-H für die Prävention der PPR bei Ziegen eignet. Mit NDV als Vektorvirus konnten nachweislich die Anforderungen sowohl bezüglich der DIVA-Applikation als auch einer hohen Thermostabilität erreicht werden.
Um NDV als Vektorvirus gezielt zu verändern bzw. für dessen unterschiedliche Anwendungen zu verbessern, ist es von Vorteil die Funktion der einzelnen viralen Proteine zu kennen. Mit dem erstmaligen Nachweis der Expression des W-Proteins können nun mit Hilfe des generierten W-spezifischen Peptidantiserums weitere in-vitro- und in-vivo-Analysen erfolgen, um dessen Funktion im viralen Replikationszyklus näher zu untersuchen.
Die McsB Argininkinase spielt in grampositiven Bakterien wie Bazillen, Staphylokokken und Listerien durch die Phosphorylierung von Guanidinogruppen eine gesonderte Rolle innerhalb der Familie der Kinasen. Insbesondere während der bakteriellen Stressadaptation scheint diese Art der posttranslationalen Proteinmodifikation von großer Bedeutung zu sein. Um die Funktionsweise der McsB Kinasefunktion in Verbindung mit dessen McsA Modulatorprotein besser verstehen zu können, wurden konservierte Arginine gegen Lysin substituiert. Auf diese Weise konnten entscheidende intramolekulare Positionen identifiziert werden, die für die Ausbildung der Autokinase- bzw. Phospho-Transferase Aktivität von Bedeutung sind. Diese konnten darüber hinaus in Einklang mit der McsB Struktur (Suskiewicz et al., 2019) gebracht werden.
Eines der Zielproteine für die McsB vermittelte Argininphosphorylierung (Arg-P) ist dabei der CtsR Regulator, welcher die Genexpression der Clp-Maschinerie in Bacillus subtilis reprimiert. Mit Hilfe globaler Transkriptomanalysen war es möglich, neben den bereits etablierten Zielgenen auch eine Art fine-tuning Regulation des MhqR Regulons aufzuzeigen.
Zwei weitere Proteine, die durch McsB vermittelte Arg-Ps beeinflusst werden, sind der Modulator der generellen Stressantwort, MgsR, und die intrinsisch inaktive Glutamat-Dehydrogenase GudB. Insbesondere GudB fällt durch die Identifikation von 15 Phospho-sites auf, wohingegen lediglich zwei Arg-P Bindungsstellen für MgsR nachgewiesen werden konnten (Elsholz et al., 2012; Schmidt et al., 2014; Trentini et al., 2016). Dennoch ist die GudB Stabilität nur geringfügig durch die McsB Kinasefunktion beeinflusst, wohingegen die MgsR Degradation entscheidend durch Arg-Ps beeinflusst scheint. Durch die Substitution der Arginine von MgsR gegen Glutamat wurde eine Art Phospho-Mimikry integriert. So konnten die Auswirkungen auf Regulatoraktivität und Stabilität von MgsR durch mögliche Arg-Ps im Detail untersucht werden.
In diesem Zusammenhang wurden durch detaillierte Untersuchungen der MgsR Degradation zusätzliche Informationen zur Funktionsweise von McsB als Adapterprotein gesammelt. Dieses legten die Vermutung nahe, dass McsB nicht nur als ClpC-Adapterprotein fungiert, sondern darüber hinaus auch die ClpX-abhängige Proteindegradation unterstützt.
Vergleichende Untersuchungen zu rekombinanten Toxoplasma-gondii-Isolaten natürlichen Ursprungs
(2020)
Toxoplasma gondii ist ein weltweit vorkommender einzelliger Parasit mit hohem zoonotischen Potential. In Nordamerika und Europa haben sich drei klonale Toxoplasma-Linien durchgesetzt, Typ I, Typ II und Typ III. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Virulenz in Labormäusen: Toxoplasma gondii vom Typ I gilt im Allgemeinen als hochvirulent, wohingegen Typ II und III wenig virulent in Labormäusen sind. In Deutschland dominieren T. gondii vom Typ II. Trotz selten vorkommender natürlicher sexueller Rekombinationen von T. gondii in Deutschland konnten in einer vorausgegangenen Studie rekombinante T. gondii-Typ II-III-Oozysten aus dem Kot einer natürlich infizierten Katze in Deutschland isoliert werden. Mittels klonaler Vereinzelung wurden in einer weiteren vorausgegangenen Studie aus diesen Oozysten die fünf Tachyzoiten-Klone B6-H6, 2-C10, 2-H8, C12 und A7 generiert, die sich in der Verteilung ihrer Typ II- und III-Allele voneinander unterschieden. Ziel dieser Arbeit war es, die fünf Klone vergleichend zu untersuchen hinsichtlich ihrer Geno- und Phänotypen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die bekannten polymorphen Virulenzfaktoren ROP18, ROP5, ROP16 und GRA15 gelegt, die maßgeblich für Unterschiede in der Labormausvirulenz zwischen den klonalen Linien sorgen können. ROP18 und ROP5 sind an der Inhibition der IRG-vermittelten Zerstörung der parasitophoren Vakuole, dem Hauptabwehrmechanismus in Mäusen, beteiligt. Während alle fünf Klone das virulente Allel von ROP5 besaßen, hatten nur zwei der fünf Klone, B6-H6 und 2-C10, das virulente Allel von ROP18, dessen virulenter Genotyp in einer hohen Expression resultiert. Diese beiden Klone lösten auch eine 100 %-ige Mortalität in den infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier stimmte der virulente ROP18-Genotyp mit der hohen Mausvirulenz überein. Die anderen drei Klone, 2-H8, C12 und A7, besaßen das nicht virulente Allel von ROP18. Von letzteren drei Klonen lösten jedoch lediglich nur C12 und A7 eine geringere, 30 %-ige Mortalität in infizierten BALB/c-Mäusen aus. Hier würde der nicht-virulente ROP18-Genotyp die niedrigere Virulenz erklären. Der Klon 2-H8, der ebenso ein nicht-virulentes ROP18-Allel besaß, löste dagegen eine 100 %-ige Mortalität aus. Demnach ließe sich die Virulenz der infizierten BALB/c-Mäuse in dieser Studie nur in vier von fünf Klonen mit dem ROP18-Genotypen erklären. Neben ROP5 und ROP18 wurden auch die Virulenzfaktoren ROP16 und GRA15 untersucht. Diese regulieren das Zytokinprofil in infizierten Makrophagen und können dadurch Einfluss auf den klinischen Verlauf der Infektion nehmen. Von ROP16 und GRA15 besaßen jeweils alle fünf Klone das virulente Allel. Daher kann auch der Genotyp dieser Virulenzfaktoren hier nicht alleine die Unterschiede in der BALB/c-Mausvirulenz erklären. Auch das Expressionsprofil der Virulenzfaktoren in in-vitro inokulierten J-774A.1-Makrophagen mit geringen, wahrscheinlich nicht biologisch relevanten Abweichungen, ließ keine eindeutigen Rückschlüsse für die Ursache der unterschiedlichen Mausvirulenzen zu. Die in-vitro-Inokulation von J-774A.1-Makrophagen mit den Klonen ergab weiterhin, dass der mittelvirulente Klon C12 in der Lage war, die Makrophagen deutlich früher zu infizieren und eine höhere IL-12-Expression hervorzurufen. In überlebenden BALB/c-Mäusen verursachte er einen geringeren Gewichtsverlust gegenüber den anderen Klonen. Es kann für diese Studie festgehalten werden, dass sich die Virulenz der Klone in Labormäusen nicht allein durch das Vorhandensein virulenz-vermittelnder ROP18- oder anderer Virulenzgene erklären ließ. Durch die sexuelle Rekombination zwischen T. gondii des Typs II und III waren offenbar Allelkombinationen entstanden, welche auf ein komplexes multifaktorielles Netzwerk schließen lässt, das ursächlich für die Unterschiede in der Mausvirulenz und der Makrophagenfunktionalität zu sein schien.
Wie andere Vertreter der Paramyxoviridae vergrößert das NDV durch Editierung von Transkripten seine Kodierungskapazität. Durch co-transkriptionelle mRNA-Editierung kodiert das P-Gen beim NDV sowohl für das P-, das V-, als auch das W-Protein. Die drei Proteine gleichen sich N-terminal, wohingegen die C-Termini in Länge und AS-Zusammensetzung variieren. Während sowohl Expression als auch Inkorporation des P- und V-Proteins in das NDV-Partikel nachgewiesen wurde, gab es bisher keinen Beweis für die Existenz des W-Proteins.
Für den Nachweis der Expression des NDV W-Proteins wurden W-spezifische Seren auf Grundlage von Peptiden generiert, welche im spezifischen C-Terminus lokalisiert waren und vorhersagbare antigene Regionen beinhalteten. Je eines der Kaninchenseren ermöglichte die Detektion von Plasmid-exprimiertem NDV W-Protein, sowie W-Protein in infizierten Zellen mittels indirekter IF und WB-Analyse.
Eine Inkorporation des W-Proteins in NDV-Virionen deuteten WB- und massen-spektrometrische Analysen an, während die Abwesenheit des Proteins für rekombinante NDV deren W-Protein Expression durch unterschiedliche Mutations-ansätze unterbunden wurde, in infizierten Zellen und Viruspartikeln bestätigt werden konnte.
Untersuchungen infizierter Zellen mit Hilfe konfokaler Mikroskopie zeigten eine Akkumulation des W-Proteins im Zellkern. Diese Lokalisation wurde auf eine zweigliedrige NLS im spezifischen C-Terminus zurückgeführt und die Funktionalität der NLS anhand der zytoplasmatischen Verteilung des Proteins in transfizierten bzw. infizierten Zellen nach Mutation der zwei basischen Cluster bestätigt.
Vergleichende Untersuchungen rekombinanter und WT-NDV zeigten keinen Einfluss der NLS bzw. der Expression des W-Proteins auf die Virusreplikation in vitro.
Bei der Analyse wirtsspezifischer, IFN-antagonistischer Funktionen des NDV W-Proteins in der späten Phase der Typ-I-IFN-Antwort mit Hilfe eines Hühnerzell-basierten IFN signaling Assays konnte sowohl für das W-Protein eines lentogenen (NDV Cl30), als auch eines velogenen NDV-Stammes (NDV Herts_I) kein inhibierender Effekt auf den untersuchten Signalweg gezeigt werden. Stattdessen deutete sich für das NDV Cl30 W-Protein ein aktivierender Effekt an.
Sequenzanalysen zur Vorhersagbarkeit von W-Proteinen bzw. C-terminal kodierten NLS in NDV-Stämme unterschiedlicher Virulenz und Genotypen ließen keinen Rückschluss auf einen Einfluss des W-Proteins auf die Pathogenität von NDV zu.
Im Gegensatz zum W-Protein war die Expression des NDV V-Proteins essentiell für die Replikation von NDV in vitro und in ovo.
Für die Analyse des Einflusses von V-Proteinen unterschiedlicher Herkunft auf die Replikation eines lentogenen NDV in vitro wurden diese in verschiedenen rekombinanten Viren von einem zusätzlich inserierten ORF exprimiert und die Expression der homo- und heterologen V-Proteine durch stammspezifische Seren überprüft, wofür im Vorfeld ein NDV R75/95 V-spezifisches Peptidserum generiert wurde. Keines dieser rekombinanten Viren zeigte Replikationsvorteile in vitro im Vergleich zum parentalen Virus.
Ein Hinweis auf einen Einfluss der Herkunft des V-Proteins konnte mit Hilfe des Hühnerzell-IFN signaling Assays erhalten werden. Während das V-Protein eines lentogenen NDV (NDV Cl30) keinen inhibierenden Effekt zeigte, deutete sich ein leicht inhibierender Effekt für das velogene NDV Herts_I V-Protein in einer Zelllinie an.
Pilotstudien zur potenziellen IFN-antagonistischen Funktion des V-Proteins wurden nach vorheriger Transfektion und Überexpression von V-Proteinen unterschiedlicher Pathotypen bzw. nach Vorbehandlung von Zellen mit Hühner-IFN-α vor Infektion durchgeführt. Die Replikation des korrespondierenden WT-Viruses bzw. rekombinanten Virus mit homo- oder heterologer V-Proteinexpression war in vitro in beiden Fällen nicht verändert.
Das Bovine Virale Diarrhoe Virus (BVDV) gehört zum Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae. BVDV verursacht eine gefährliche Durchfallerkrankung bei Rindern,
besonders Kälbern, die Bovine Virusdiarrhoe (Mucosal Disease). BVDV gehört zu den einzelsträngigen RNA-Viren und ist eng verwandt mit dem Erreger der Klassischen Schweinepest sowie der Border Disease der Schafe. Wie andere Pestiviren, ist BVDV ein behülltes Virus, auf dessen Hülle drei Strukturproteine (Erns, E1 und E2) zu finden sind. In dieser Arbeit wurden die Glykoproteine E1 und E2 genauer charakterisiert, um Hinweise auf den Mechanismus der Knospung (Budding) von Pestiviren zu erhalten. Dazu ist die subzelluläre Lokalisation, die Topologie sowie der Retentionsmechanismus für E1 und E2 genauer untersucht worden. Die subzelluläre Lokalisation der Hüllproteine wurde mit Hilfe von Kolokalisationsanalysen mit spezifischen Kompartimentmarkerproteinen bestimmt. Sowohl als Einzelexpression als auch nach Expression als E1-E2-Vorläuferprotein zeigte sich eine Anreicherung der beiden Proteine vorwiegend im ER. Die Lokalisationsanalyse E2s in mit verschiedenen BVDV-Stämmen infizierten Zellen zeigte ein sehr ähnliches Bild wie die Einzelexpression. Die, die intrazelluläre Retention vermittelnden, Regionen wurden zunächst mit CD72-Fusionsproteinen eingegrenzt und zeigten, dass die Transmembrandomänen der Proteine für die Retention entscheidend waren.
Anhand verschiedenster Mutanten, welche Substitutionen, Insertionen und Deletionen im Bereich des C-Terminus von CD72-E1 bzw. E2 (ohne CD72-Fusionspartner) beinhalteten,
konnten einzelne Aminosäuren identifiziert werden, die essentiell für die Retention sind oder diese zumindest beeinflussen. Für E2 konnte das Arginin an Position 355 als wichtig für die Retention bestätigt und weiterführend untersucht werden. Mit Mutationen des Glutamins an Position 370 konnte außerdem der modulierende Effekt des cytoplasmatischen Rests auf die Retention E2s gezeigt werden. Die Retention von E1 ist unabhängig von der Länge der TMD und wird durch mehrere polare Aminosäuren (K174, R177, Q182) beeinflusst. Die Topologieuntersuchungen
für E1 und E2 nach Einzelexpression mit Tag-markierter Proteinvarienten zeigte, dass die reifen Proteine eine einspännige Transmembrandomäne mit dem N-Terminus auf der luminalen und dem C-Terminus auf der cytosolischen Seite des ERs besitzen.
Untersuchung von Virulenzdeterminanten des Newcastle Disease Virus mit Hilfe von Virusrekombinanten
(2020)
Die Newcastle Krankheit (Newcastle Disease, ND) wird durch das aviäre Paramyxovirus-1 (APMV-1) verursacht und zählt zu den bedeutendsten Viruserkrankungen des Geflügels, wobei die Ausprägung der Krankheitssymptome sehr stark variiert. Das APMV-1 der Taube (pigeontype paramyxovirus, PPMV-1) infiziert größtenteils Brief-, Rasse-, Stadt- und Wildtauben, jedoch ist auch Wirtschaftsgeflügel für diesen Erreger empfänglich. Die Krankheit ist weltweit verbreitet und besonders die schweren Verlaufsformen, ausgelöst durch den mesogenen und den velogenen Pathogenitätstyp, führen bis heute zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Durch die Entwicklung des reversen genetischen Systems für das NDV ist es möglich, verschiedene Bereiche des viralen Genoms unterschiedlich pathogener NDV-Isolate auszutauschen und rekombinante Viren zu generieren, um mögliche Virulenzdeterminanten zu identifizieren. Lange Zeit galt die Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des Fusionsproteins als die Virulenzdeterminante des NDV. Studien der letzten Jahre belegen aber zunehmend, dass es weitere Sequenzabschnitte im Genom gibt, die Einfluss auf die Pathogenität haben. Besonders bei den Taubenisolaten zeigte sich, dass diese trotz einer polybasischen Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des F-Proteins, die typisch für meso- und velogene APMV-1 ist, mit einem ermittelten intrazerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) < 0,7 als lentogen (niedrig virulent) einzuordnen sind.
Die Bestimmung der Gesamtsequenz des vorliegenden PPMV-1 Isolates R75/98 und die Herstellung des entsprechenden rekombinanten Virus rR75/98 waren Ziel dieser Arbeit. Nach der in vitro-Charakterisierung, die keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Rekombinante zeigte, verdeutlichte die ICPI-Bestimmung, dass sich R75/98 und rR75/98 in ihrer Pathogenität unterschieden. Während R75/98 mit einem ICPI von 1,1 als mesogen eingestuft wurde, entsprach das rekombinante Virus rR75/98 mit einem ICPI von 0,28 dem lentogenen Pathotyp. Durch einmalige Passage der Rekombinante im Tier entstand das Reisolat RrR75/98, welches sich in seinen in vitro-Eigenschaften nicht von den beiden anderen Isolaten unterschied, aber in seiner Pathogenität (ICPI 0,93) wieder dem mesogenen Ausgansvirus R75/98 entsprach. Unter Nutzung des Next Generation Sequencing war es möglich, die Grundlagen für diese Pathogenitätsunterschiede aufzuzeigen. Während es zwischen R75/98 und rR75/98 insgesamt acht Aminosäuresubstitutionen gab (drei im F-Protein, zwei im HN-Protein und drei im L-Protein), die zu einer Verminderung der Pathogenität führten, wurden nur zwei Aminosäuremodifikationen (jeweils eine im F- und L-Protein) nachgewiesen, um die Pathogenitätssteigerung vom lentogenen rR75/98 hin zum mesogenen RrR75/98 hervorzurufen. Beide Aminosäureaustausche haben einen Effekt auf die vorhergesagte Proteinstruktur und beeinflussen vermutlich die Proteinfaltung, was wiederum eine nicht unwesentliche Auswirkung auf die biologische Aktivität des Virus haben kann. Besonders die Modifikation im F-Protein an Aminosäureposition 472 verdeutlicht, dass neben der Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle andere Bereiche dieses Proteins Einfluss auf die NDV-Virulenz haben.
Zur Untersuchung des Einflusses einzelner Abschnitte des F-Proteins auf die Pathogenität wurden im ursprünglich lentogenen NDV Clone 30 einzelne Sequenzbereiche durch die des mesogenen PPMV-1 R75/98 substituiert, die entsprechenden rekombinanten Viren generiert und charakterisiert. Es zeigte sich, dass sowohl die Expression als auch die Inkorporation der chimären Fusionsproteine mittels Western-Blot nachgewiesen werden konnte. Die Rekombinanten unterschieden sich weder in Größe noch in Form (Elektronenmikroskopie) und die chimären Fusionsproteine konnten an der Plasmamembran der Wirtszellen detektiert werden. Alle Rekombinanten waren in der Lage, Synzytien auszubilden und in verschiedenen Zelllinien (Wachtelmuskelzelle, Hühnerembryofibroblasten) bzw. in embryonierten Hühnereiern zu replizieren. Bei der Bestimmung des ICPIs zeigten sich jedoch Unterschiede. Zwei der sechs Rekombinanten wurden als lentogen eingestuft, die anderen vier wurden dem mesogenen Pathogenitätstyp zugeordnet. Es konnte gezeigt werden, dass neben der Interaktion der homologen F1- und F2-Untereinheit, die zytoplasmatische Domäne des Fusionsproteins einen bedeutenden Einfluss auf die Pathogenität von NDV hat. Auch für andere Vertreter der Paramyxoviren ist bekannt, dass die zytoplasmatische Domäne der beiden Oberflächenproteine F und HN mit dem M-Protein interagiert und diese Interaktion wichtig für den Zusammenbau der Viruspartikel, den Knospungsvorgang und die Freisetzung der Viren ist.
Neben dem Fusionsprotein existieren zusätzlich Virulenzdeterminanten in den weiteren NDV-Proteinen. Während es bereits Untersuchungen zum Einfluss auf die Pathogenität für die Proteine NP, P, V, M, F, HN und L gibt, war es noch nicht möglich, eine Aussage zum W-Protein zu treffen, da der Nachweis dieses Proteins bis dato nicht erfolgte. Zunächst wurde für unterschiedlich pathogene NDV der Bereich der P-Gen-Editierungsstelle amplifiziert, gefolgt von einer Tiefensequenzierung, um zusätzlich zur P- und V-mRNA auch die W-mRNA nachzuweisen und deren mengenmäßigen Anteil zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem Plasmide hergestellt, die für weiterführende Arbeiten genutzt werden konnten, in denen erstmals der Nachweis des W-Proteins für NDV gelang.
Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruserkrankung, die Mitglieder der Suidae-Familie wie Buschschweine, Warzenschweine, Hausschweine und Wildschweine befällt. Das Virus wird durch direkten Kontakt zwischen infizierten und naiven Tieren, durch Zecken der Gattung Ornithodoros oder durch Kontakt mit kontaminiertem Material übertragen. Während die Krankheit bei Warzenschweinen und Buschschweinen im Allgemeinen asymptomatisch verläuft, verursacht die ASP eine hohe Mortalität bei Hausschweinen und Wildschweinen. Daher ist die jüngste Ausbreitung von ASP in Europa eine ernste Bedrohung für die Schweinehaltung in der EU. Bis heute ist keine wirksame Behandlung oder Impfung verfügbar. Und es liegen nur wenige Informationen über Virus-Wirt-Wechselwirkungen vor, die als Grundlage für die Etablierung antiviraler Strategien verwendet werden könnten.
Das Virus der afrikanischen Schweinepest (African swine fever virus, ASFV) ist der einzige bekannte Vertreter der Familie der Asfarviridae. Das DNA-Genom des ASFV kodiert für über 150 Gene. Über die Expressionsprodukte ist wenig bekannt, nur wenige virale Proteine sind bisher funktionell charakterisiert. Die Morphogenese von ASFV ist sehr komplex. So entstehen neben den zweifach umhüllten reifen extrazellulären Virionen auch einfach umhüllte intrazelluläre Partikel, die die die Präparation reiner extrazellulären Virionen erschweren.
In früheren in vitro Studien wurde die Zusammensetzung der extrazellulären Viruspartikel mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert. Die Reinigung erfolgte über ein im Jahre 1985 veröffentlichtes Reinigungsprotokoll, welches auf einer Percolldichtegradientenzentrifugation und einer Gelchromatographie basierte. Das Protokoll wurde für die Reinigung des auf Vero-zellen adaptierten Virusstamm Ba-71V etabliert. In einer frühen MS Studie wurden 54 Proteine in ASFV Partikeln detektiert, 15 davon Wirtsproteine. Der Einbau von Aktin, α-Tubulin und β-Tubulin ins Virion konnte ebenfalls bestätigt werden. Systematische massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der ASF Virionen lagen zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht vor, erst während der Anfertigung des Manuskripts wurde eine solche Studie durch Alejo et al. veröffentlicht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf einer Dichtegradientenzentrifugation ohne nachfolgende Gelchromatographie beruhendes Reinigungsprotokoll entwickelt und die Zusammensetzung reifer ASF Viruspartikel mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie analysiert. Zur Anzucht einer GFP-positiven ASFV OUR T88/3 Mutante wurde die vom Wildschwein abstammende Zelllinie WSL-HP verwendet. Wesentliche Schritte der Reinigung waren eine niedertourige Zentrifugation zur Entfernung zellulärer Verunreinigungen, gefolgt von einer Sedimentation des Virus durch ein Saccharosekissen und einem Proteaseverdau. Final wurde die Präparation über einen selbstgenerierenden Optiprep™ Dichtegradienten gereinigt. Die Titerausbeute lag zwischen 30 und 70 %, die spezifische Infektiosität bei 2,4 x 109 TCID50/mg. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Präparation zwar Virionen enthielt, aber auch, dass die Fixierung mit Glutaraldehyd die Stabilität der Virionen beeinträchtigt.
In der massenspektrometrischen Analyse wurden 29 der 33 bekannten ASFV Strukturproteine bestätigt. Von den neu identifizierten Strukturproteinen konnten vier (pK145R, pC129R, pE146L und pI73R) in allen drei Replikaten und sechs in zwei von drei Replikaten (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L und M2248R) bestätigt werden. Ein weiteres bis dato nicht charakterisiertes Protein, p285L, konnte als mögliches neues Strukturprotein identifiziert werden. 152 Wirtsproteine wurden im Virion detektiert, darunter hauptsächlich Membranproteine oder Proteine des Zytoskeletts. Daneben wurde eine Reihe an phospholipidbindenden Proteine gefunden. Unter den identifizierten Proteinen waren fünf aus dem glatten ER und einige Vertreter der Hitzeschockproteine.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das intrazelluläre Proteom des ASFV identifiziert werden.
Für diese Untersuchungen wurden drei empfänglichen Zelllinien verwendet, die vom Wildschwein abstammenden Linie WSL-HP, Vero Zellen, die in der Vergangenheit für viele Studien herangezogen wurde und die menschliche Linie HEK-293, die aus einem weiteren nicht empfänglichen Wirt stammt.
Der in dieser Studie verwendete Virusstamm ASFV OUR T88/3 besitzt 157 ORFs. In früheren Studien konnte die Existenz eines Proteins für 44 ORFs bestätigt werden. Für weitere 69 ORFs wurden Transkripte, nicht aber die korrespondierenden Proteine, beschrieben, sodass für 44 ORFs kein Nachweis der Expression vorlag.
In der massenspektrometrischen Analyse wurden je Wirtszelle rund 1000 Proteine identifiziert. Insgesamt belief sich die Zahl der identifizierten ASFV Proteine auf 94, davon 88 in WSL-HP, 83 in Vero und 57 in HEK-293 Zellen. 54 ASFV Proteine wurden in allen drei Zelllinien detektiert. Für 34 der identifizierten ASFV Proteine war bisher nur die Existenz des Transkripts beschrieben, für 23 weitere weder die Existenz eines Proteins noch eines Transkripts. Für 44 der 94 identifizierten Proteine wurde das N-terminales Peptid detektiert. Bei fünf der MGF-110 Proteinen (1L, 2L, 4L, 5L und 14L) und den Proteinen pI329L und pCP123L wurde die Abspaltung der vorhergesagten Signalsequenz experimentell bestätigt.
Die MS Analysen wurden unter Verwendung des emPAI auch quantitativ ausgewertet.
Die geringe Zahl detektierter ASFV Proteine in HEK-293 Zellen korrelierte mit dem geringeren Anteil an ASFV Proteinen im Gesamtproteingehalt der Zelle (6,3 Mol%). Allerdings wurden einige Proteine in HEK-293 Zellen ähnlich stark oder sogar stärker exprimiert als in Vero bzw. WSL-HP Zellen. Die Abundanz einzelner ASFV Proteine variierte in den verschiedenen Zelllinien. Einige wurden jedoch durchgehend stark exprimiert wie z.B. das Strukturprotein p11.5. Einige bisher nicht charakterisierte Proteine, wie z.B. pK145R, pI73R und pC129R, wurden überraschenderweise ebenfalls in allen Zellen stark exprimiert und sind somit möglicherweise Träger wichtiger viraler Funktionen, die weiter untersucht werden sollten.
Herstellung sicherer und wirksamer Lebendvakzine gegen die Koi Herpesvirus Infektion von Karpfen
(2019)
Das Koi Herpesvirus (KHV, Cyprinid herpesvirus 3) verursacht eine tödliche Erkrankung bei Kois und Karpfen. Um sichere und wirksame Lebendvirusimpfstoffe zu erhalten, haben wir Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von KHV erzeugt, aus deren Genom die für die beiden Nukleotidstoffwechselenzyme Thymidinkinase (TK, ORF55) und Desoxyuridin-Triphosphatase (DUT, ORF123) codierenden Leserahmen gezielt entfernt worden waren. Die Mutationen wurden durch homologe Rekombination in den zellkulturadaptierten aber noch virulenten Stamm KHV-T eingeführt. Umfangreiche in vitro Tests zeigten, dass die Deletion der TK- und DUT- Gene die KHV-Replikation in Zellkultur (CCB Zellen) nicht erkennbar beeinträchtigt. In vivo Tests an Jungkarpfen zeigten jedoch eine im Vergleich zum Ausgangsvirus signifikant reduzierte Virulenz der Einzelgen-Deletionsmutanten eine fast vollständige Attenuierung der Doppelmutante. Dennoch waren alle immunisierten Karpfen gegen eine letale Belastungsinfektion mit virulentem KHV geschützt. Mittels einer neu entwickelten Triplex-Real-Time-PCR und aus Kiementupferproben isolierter DNA war es möglich, mit TK-negativem KHV immunisierte und Wildtyp- infizierte Karpfen zu differenzieren. Daher könnte die Doppelmutante KHV- TΔDUT/TK als genetischer Marker-Impfstoff geeignet sein.
In einer zweiten Studie wurde die Funktion von vier immunogenen Hüllglykoproteinen der ORF25-Genfamilie (ORF25, ORF65, ORF148 und ORF149) von KHV untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass alle vier Gene für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Während die Deletion von ORF65 keinen erkennbaren Einfluss auf die Virusvermehrung hatte, führte die Deletion von ORF148 sogar zu einer leicht erhöhten Replikationsrate. Im Gegensatz dazu bewirkten Deletionen von ORF25 oder ORF149 einen verzögerten Eintritt in die Wirtszellen und damit auch eine verlangsamte Vermehrung und Ausbreitung der Viren. Interessanterweise führte die gemeinsame Deletion der Gene ORF148 und
ORF149 zu einem wildtypähnlichen Wachstumsverhalten, das auf gegensätzlicher Funktionen der beiden Proteine hindeutete. Elektronenmikroskopische Untersuchungen von CCB-Zellen, die mit den verschiedenen Glykoproteindeletionsmutanten infiziert waren, zeigten keine Auswirkungen auf die Bildung und Reifung der Virionen im Zellkern oder im Zytoplasma, oder die Virusfreisetzung. Im Tierversuch erwiesen sich KHV-Mutanten mit Deletionen der Gene ORF148 und/oder ORF149 als geringfügig, aber für eine Verwendung als Lebendvirus-Impfstoff nicht ausreichend abgeschwächt. Überlebende Fische waren jedoch gegen Belastungsinfektionen ebenso gut geschützt wie Wildtyp-infizierte Karpfen, so dass die Deletion dieser antikörperinduzierenden Proteine zur Entwicklung von KHV-Markerimpfstoffen beitragen könnte, die eine serologische Differenzierung von Wildtyp-infizierten und geimpften Fischen erlauben (DIVA- Prinzip). In einer dritten Studie wurden durch serielle Zellkulturpassage von virulentem KHV und anschließende in vivo Infektionsversuche Hinweise darauf gefunden, dass das bislang nicht näher charakterisierte, neben dem ORF149 Gen lokalisierte ORF150 für einen weiteren Virulenzfaktor von KHV codiert. Möglicherweise könnte also durch eine kombinierte Deletion der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten KHV-Gene ein sicherer und wirksamer, genetisch und serologisch differenzierbarer Markerimpfstoff hergestellt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene grundlegende Ansätze zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest entwickelt und teilweise evaluiert. Die ersten beiden befassten sich mit der Impfstoffentwicklung, wobei einerseits eine vektorbasierte Strategie verfolgt und zum anderen auf eine attenuierte ASPV Lebendvakzine hingearbeitet wurde. Die dritte Herangehensweise war auf die Inhibierung der viralen Replikation in Schweinezellen mittels CRISPR/Cas9 fokussiert, um Hinweise auf die generelle Anwendbarkeit des Systems in transgenen Schweinen zu gewinnen.
Der Pseudorabies-Virus Impfstamm Bartha (PrV-Ba) wurde als potenzieller Vektor für die Expression von ASPV-Antigenen im Schwein gewählt. Dazu wurde zunächst eine Methode etabliert, mit der PrV-Rekombinanten effizient generiert werden konnten. Dabei erwies sich die Verwendung eines artifiziellen bakteriellen Chromosoms (BAC), welches das infektiöse PrV-Genom enthielt, als hilfreich. In diesem wurde ein essentielles PrV-Gen inaktiviert, dass dann durch homologe Rekombination mit einem Transferplasmid in co-transfizierten Säugerzellen rekonstituiert werden konnte. Durch gleichzeitiges CRISPR/Cas9-vermitteltes Schneiden der BAC-DNA am gewünschten Insertionsort konnte die Rekombinationsrate weiter gesteigert werden. Diese Strategie wurde anschließend für die Insertion verschiedener ASPV Gene in das PrV-Genom genutzt, wobei unterschiedliche Promotoren und Kodonoptimierungen getestet wurden. In den meisten Fällen konnten durch Verwendung des CAG-Promotors und eine Kodonadaptation an porcine Gene die höchsten Expressionsraten erreicht werden. Somit wurde eine Methode entwickelt, mit der prinzipiell alle ASPV Gene im PrV Vektorsystem exprimiert und in Impfstudien getestet werden könnten.
In der zweiten Untersuchung wurden zwei Proteine des ASPV mittels monospezifischer Antiseren näher charakterisiert und ASPV-Deletionsmutanten generiert, um Hinweise auf die Funktionen der Proteine zu erhalten. Bei diesen Proteinen handelte es sich um p285L und pK145R. Sie wurden anhand von Daten aus einer vorhergehenden Proteomanalyse von Keßler et al. (2018) ausgewählt, da sie in großen Mengen in ASPV infizierten Zellen nachgewiesen wurden und deshalb wichtige Funktionen (beispielweise auch Virulenz-determinierende Funktionen) haben könnten. Bei p285L handelt es sich um ein früh exprimiertes Virionprotein, das zunächst in den sogenannten Virusfabriken infizierter Wildschweinlungenzellen (WSL) akkumuliert. pK145R ist ein spätes ASPV Protein, das in Virionen nicht nachweisbar ist und eine diffuse Verteilung im Zytoplasma infizierter Zellen zeigt. Beide Proteine sind für die Virusreplikation nicht essentiell, und ihre Deletion führte zu keiner (285L) oder einer nur mäßigen (K145R) Titerreduktion in infizierten WSL Zellen oder primären Blutzellkulturen (PBMC). Durch in vivo Analysen der Deletionsmutanten muss nun geklärt werden, ob p285L und pK145R für die Virulenz bzw. die Wechselwirkung von ASPV mit dem Wirtsimmunsystem wichtig sind und ob sich die Mutanten deshalb als lebend attenuierte Impfstoffe eignen könnten.
In der dritten Studie wurde untersucht, ob das CRISPR/Cas9 System zur Inhibition der ASPV Infektion in vitro geeignet ist. Dazu wurden WSL-Zelllinien generiert, die Cas9 und verschiedene sgRNAs konstitutiv exprimierten. Durch die Expression einer sgRNA gegen das Gen des ASPV Phosphoproteins p30 (CP204L) wurde die Virusreplikation nahezu komplett inhibiert. Die Spezifität des Effektes konnte durch parallele Versuche mit einem Virusisolat, dessen Zielsequenz nicht mit der genutzten sgRNA Sequenz übereinstimmte, gezeigt werden. Dieses ASPV Isolat konnte im Gegensatz zum Virus mit der passenden Zielsequenz in den rekombinanten Zellen genauso gut replizieren, wie in nicht modifizierten Zellen. Zudem wurde die Spezifität durch die Analyse von sporadisch auftretenden Escape-Mutanten bestätigt, die verschiedene Basenaustausche in der Zielsequenz aufwiesen. Somit konnte gezeigt werden, dass das CRISPR/Cas9 System eine effiziente Inhibition der ASPV Replikation in Zellkultur bewirken kann und deshalb möglicherweise auch in entsprechenden transgenen Schweinen eine Resistenz gegen letale ASPV-Infektionen vermitteln könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen drei Studien grundlegende Experimente erfolgreich durchgeführt wurden, die zur Prävention der Afrikanischen Schweinepest beitragen können.
Die Spezies Kuhpockenvirus (CPXV), ein Mitglied des Genus Orthopoxvirus, ist endemisch in weiten Teilen Europas und Asien verbreitet. CPXV besitzt ein sehr breites Wirtsspektrum und zählt zu den zoonotischen Erregern. Phylogenetische Analysen deuten darauf hin, dass CPXV polyphyletisch ist. Die bisher definierten Kladen wurden in vorliegender Arbeit bestätigt. Die 20 neu gewonnenen CPXV-Stämme verschiedenster Wirtsspezies gruppieren vorrangig in die CPXV-like 1 und CPXV-like 2 Kladen. Ein CPXV-Stamm, isoliert von einem Neuweltaffen, erscheint jedoch als single branch und lässt sich keiner bisher bekannten Klade zuordnen.
Gegenwärtig ist über die Rolle der Wühlmäuse, die als Reservoirwirt der Kuhpockenviren betrachtet werden, wenig bekannt. In vorliegender Arbeit sollte deshalb das aus einer Feldmaus (Microtus arvalis) stammende CPXV-Isolat FM2292 eingehend charakterisiert werden. CPXV FM2292 weist das bisher längste CPXV-Genom auf, das in die CPXV-like 1 Klade clustert. Neben der Sequenzanalyse sollten vergleichende experimentelle Infektionsstudien in Feldmäusen und Wistar-Ratten durchgeführt werden. Der Krankheitsverlauf nach intranasaler CPXV FM2292-Infektion bei Feldmäusen verlief subklinisch; Wistar-Ratten hingegen zeigten ausgeprägte klinische Symptome. Im Gegensatz dazu verursachte die Infektion mit einem aus einer Schmuseratte isolierten CPXV-Stamm bei den Feldmäusen eine starke Klinik. Daraus lässt sich schließen, dass Feldmäuse gegenüber Wühlmaus-assoziierten Stämmen, wie CPXV FM2292, eine Adaptation entwickelt haben. Die nachgewiesene Virusausscheidung weist auf eine Tröpfchen-basierte Übertragung hin.
Neben Feldmäusen sollten auch Rötelmäuse im Tierversuch näher betrachtet werden. Unabhängig vom eingesetzten CPXV-Stamm resultierten die experimentellen CPXV-Infektionsstudien in Rötelmäusen (Myodes glaerolus) in subklinischen Verläufen. Eine nasale Virusausscheidung konnte nicht detektiert werden, was im starken Kontrast zu den Ergebnissen aus experimentell infizierten Feldmäusen steht. Dennoch deuteten die Serokonversionsraten der Rötelmäuse darauf hin, dass eine Replikation im Wirt stattgefunden hat. Zudem entwickelten zwei Kontakttiere ebenfalls OPV-spezifische Antikörper, was auf eine Übertragung des Virus schließen lässt.
Wühlmäuse als Reservoirwirt dienen der Übertragung des Kuhpockenvirus auf akzidentielle Wirtsspezies wie Hauskatzen oder Nutztiere. Der in dieser Arbeit betrachtete Fallbericht eines mit CPXV-infizierten Fohlens zeigt, dass CPXV-Infektionen bei akzidentiellen Wirten mit stark ausgeprägter Klinik verbunden sein können. Zudem wird die wachsende Gefahr der Übertragung von CPXV auf Nutztiere und Menschen deutlich.
Zusammenfassend unterstreicht die in der vorliegenden Arbeit verwendete phylogenetische Betrachtung die genetische Variabilität der Spezies CPXV. Zudem konnten neue Erkenntnisse zu Feldmäusen und Rötelmäusen als Reservoirwirtsspezies gewonnen werden. CPXV-Infektionen von Wühlmäusen verlaufen subklinisch, im Gegensatz zu dem hier ebenfalls beschriebenen, lethal endenden CPXV-Infektionsverlauf eines akzidentiellen Wirts, eines abortierten Fohlens.
Das gram-negative Stäbchenbakterium Burkholderia pseudomallei, Erreger der Melioidose, ist ein fakultativ intrazelluläres Pathogen. Ein detailliertes Wissen über das Proteom dieses Pathogens liefert eine wichtige Grundlage für das Verständnis der Pathomechanismen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden detailierte „reference maps“ des intra- und extrazellulären Proteoms von B. pseudomallei Stamm E8 erstellt. Es wurden hierbei insgesamt 353 intrazelluläre und 154 extrazelluläre Proteine identifiziert und anschließend einer funktionellen Klassifizierung unterzogen. Die „reference maps“ stellen ein wichtiges Werkzeug für weitere vergleichende Proteomanalysen dar. In weiterführenden Experimenten wurde das Proteom dreier Wildtypstämme verglichen. Hierbei zeigten sich insgesamt nur geringe Unterschiede zwischen den drei analysierten Stämmen E8, E212 und K96423. Die Proteomanalysen bestätigten die Ergebnisse der Genotypisierung – beide Ansätze ergaben eine engere Verwandtschaft der Stämme E212 und K96423 als mit Stamm E8.
Im Infektionsverlauf von B. pseudomallei ist das sonst aerob lebende Bakterium in der Lage sich auch unter anaroben Bedingungen auszubreiten. Über die anaerobe Physiologie von B. pseudomallei ist bisher wenig bekannt. Es konnte ein Screeningsystem entwickelt werden, mit dem aus insgesamt 2344 Transposonmutanten 16 Mutanten mit reduziertem Wachtum unter anaeroben Bedingungen identifiziert wurden. Die vier Mutanten mit dem am stärksten verringerten Wachstum wurden für weitere Analysen im Rahmen dieser Arbeit ausgewählt. Drei der Mutanten hatten Molybdän bezogene Gendefekte und bei einer Mutante betraf der Gendefekt eine putative Sensor-Kinase. Die untersuchten Mutanten konnten erfolgreich komplementiert werden und somit polare Effekte ausgeschlossen werden. Die Komplentanten wiesen wieder dem Wildtyp entsprechendes anaerobes Wachstum auf und wiesen auch bei allen weiteren Experimenten, wie z.B. Infektionsversuchen, die Eigenschaften des Wildtyps auf. Dass unter den 2344 gescreenten Transposon Mutanten drei der vier auffälligsten Mutanten Molybdän bezogene Gendefekte aufwiesen, unterstreicht die Wichtigkeit von Molybdän und im Zusammenhang damit der anaeroben Nitratreduktase. Die Attenuierung der drei Mutanten im C57BL/6-Maus-Infektionsmodell deutet auf die Wichtigkeit des anaeroben Stoffwechsels bei chronischen Infektionsverläufen von B. pseudomallei hin. Bei der weiteren näher untersuchten Mutante liegt ein Defekt einer putativen Sensorkinase vor. Diese gehört zu einem Zwei-KomponentenSignaltransduktionssystem, welches Homologien zum RegB-RegA-System aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass die hier untersuchte Sensorkinase einen entscheidenen Einfluss auf die Virulenz von B. pseudomallei hat. Der exakte Mechanismus der Attenuierung durch die Mutation von BPSL0201 bleibt vorerst jedoch noch ungeklärt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dem hier entwickelten Screeningsystem erfolgreich Transposonmutanten identifiziert werden konnten, welche ein reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen aufweisen. Durch die anschließende Charakterisierung konnten tiefere Einblicke in den anaeroben Lebensstil von B. pseudomallei gewonnen werden. Die Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit des anaeroben Wachstums von
B. pseudomallei und der vollen Virulenz hin. Die gewonnenen Erkenntnisse stimulieren weitere Untersuchungen im Hinblick auf den Einfluss des anaeroben Wachstums von B. pseudomallei bei der Pathogenese der Melioidose.
Das Nipahvirus (NiV) ist ein Paramyxovirus, welches im Menschen eine tödliche Enzephalitis mit einer hohen Letalität von bis zu 100% und im Schwein vorwiegend eine schwerwiegende Atemwegserkrankung mit hoher Morbidität hervorruft. Es gibt bis heute keine zugelassene antivirale Therapie oder Vakzine. Da neben den neutralisierenden Antikörpern zunehmend auch die Bedeutung einer zellulären Immunabwehr gegenüber einer Henipavirus Infektion diskutiert wird, rücken vor allem Vakzinen in den Fokus, die in der Lage sind, beides zu induzieren. Virus-ähnliche Partikel (VLPs) stellen als nicht-replizierende Systeme eine sehr sichere Vakzine und durch ihren Virion-ähnlichen Aufbau mit repetitiven Strukturen sehr potente Immunogene dar.
In dieser Arbeit wurde die Immunogenität von Henipa VLPs (bestehend aus NiV G, NiV F und Hendravirus (HeV) M) bezüglich der Aktivierung des adaptiven Immunsystems zunächst im Kleintiermodell Maus und anschließend in einer Großtierstudie im natürlichen Wirt Schwein untersucht, um Rückschlüsse auf das Potenzial von Henipa VLPs als Vakzine ziehen zu können.
Durch die Immunisierung mit Henipa VLPs wurde sowohl in C57BL/6 als auch in BALB/c Mäusen eine humorale Immunantwort mit anti-Henipavirus-spezifischen Antikörpern als auch mit NiV neutralisierenden Antikörpern induziert. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Henipa VLPs in einem Mausstamm mit einer genetisch bedingten verstärkten Ausprägung einer Th1 Immunantwort (C57BL/6 Mäusen) in der Lage waren, eine zelluläre adaptive Immunantwort zu stimulieren. So konnte eine direkte Antigen-spezifische Proliferation und IFN-γ Expression in den CD8+ T-Zellen sowie die Th1 Zytokine IFN-γ, TNF-α und IL-2 in den Milzzellüberständen Henipa VLP-immunisierter C57BL/6 Mäuse nach homologer Restimulation nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass alle drei inkorporierten Proteine CD8+ T-Zell Epitope aufweisen. Die Kombination der drei Proteine in den Henipa VLPs führte zu einer stärkeren Reaktivierung der CD8+ T-Zellen. Im Rahmen der Immunisierung mit Henipa VLPs bildeten sich Gedächtnis CD8+ T-Zellen aus, die auch bei dreimaliger Applikation des Antigens und einer zusätzlichen Restimulation nicht in den funktionseingeschränkten Zustand der Erschöpfung oder Seneszenz übergingen.
Aufgrund der vielseitigen Immunogenität der Henipa VLPs im Mausmodell, wurde anschließend ihre Fähigkeit zur Induktion des adaptiven Immunsystems im natürlichen Wirt Schwein untersucht. Auch in Schweinen induzierten die Henipa VLPs eine Gedächtnis B-Zellantwort mit anti-Henipavirus-spezifischen Antikörpern und NiV neutralisierenden Antikörpern. Hinzu kam die Stimulation einer MHC-abhängigen als auch der schnelleren, MHC-unabhängigen zellulären Immunantwort. Hierbei waren es vor allem die MHC-unabhängigen γδT-Zellen, die auf eine Henipa VLP Restimulation hin proliferierten und antivirale Zytokine wie IFN γ und TNF α exprimierten. Von den MHC-abhängigen T-Zellen waren es die CD4+ T-Zellen, die die eben genannten löslichen Mediatoren exprimierten. Die CD8α+CD8β+ T-Zellen (klassische CTL) blieben hingegen nahezu unbeeinflusst. Die sowohl in CD8α+ γδT-Zellen als auch in CD8α+CD4+ T-Zellen nachgewiesene Multifunktionalität in Form einer IFN-γ und TNF-α Koexpression deutet auf die Generierung einer zellulären Gedächtnis T-Zellantwort in Schweinen durch die Mehrfachimmunisierung mit Henipa VLPs hin.
In dieser Arbeit konnte das vielversprechende Potenzial von Henipa VLPs als Vakzine durch die Induktion sowohl einer humoralen als auch einer zellulären Immunantwort in Mäusen und zum ersten Mal auch in Schweinen herausgestellt werden. In zukünftigen Infektionsversuchen unter BSL-4 Bedingungen muss geklärt werden, inwieweit diese Henipa VLPs in der Lage sind, einen Schutz und eine sterile Immunität gegenüber einer Henipavirus Infektion zu vermitteln.
Dendritische Zellen (DCs) und die von ihnen geprimten T-Zellen besitzen eine zentrale Funktion in der anti-chlamydialen Immunantwort. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe gelang unter Verwendung von immortalisierten murinen DCs (JAWSII-Zellen) und dem Chlamydienstamm C. psittaci (DC15) die erstmalige Identifizierung eines zellautonomen Abwehrweges in infizierten DCs. Diese zelluläre Selbstverteidigung ist dadurch charakterisiert, dass Chlamydien aus strukturell desintegrierten Inklusionen dem Autophagieweg zugeführt werden und es zur Generierung von Antigenen kommt, die mithilfe von MHCI-Molekülen auf der Zelloberfläche von DCs entsprechenden CD8+ T-Zellen präsentiert werden.
Die exakten zellulären Prozesse und biochemischen Abläufe der Desintegration und Autophagie chlamydialer Inklusionen in DCs wurden bisher noch nicht eingehend untersucht. Ziel dieser Arbeit war es daher, unter Einsatz des zuvor etablierten murinen Infektionssystems sowie C. psittaci (DC15), den xenophagosomalen Mechanismus der Chlamydienbekämpfung infizierter DCs aufzuklären und weitere, hieran gekoppelte Folgeprozesse und funktionale Interaktionen mit anderen Immunzellen zu charakterisieren.
Die hier in Kombination mit zellbiologischen und biochemischen Assays durchgeführten siRNA-Studien belegen eine funktionale Schlüsselrolle der Phospholipase cPLA2 in der anti-chlamydialen Abwehr infizierter DCs. Des Weiteren sprechen die Resultate dafür, dass es durch die Wirkung der von ihr synthetisierten Arachidonsäure zu einer defekten OXPHOS und verminderten ATP-Produktion der Mitochondrien kommt und dies destruktive Auswirkungen auf die energieparasitären Chlamydien hat. Der Verlust der mitochondrialen Funktion sowie der damit verbundene Vitalitätsverlust der Chlamydien scheinen unmittelbar durch den TNF-α/cPLA2-Signalweg kontrolliert zu werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse der Arbeit folgern, dass die Chlamydieninfektion mit einer metabolischen Umprogrammierung von der OXPHOS zur aeroben Glykolyse in DCs einhergeht. Durch die erhöhte Glykolyserate scheinen die infizierten DCs, den durch die geschädigten Mitochondrien entstehenden Energieverlust, kompensieren zu können.
Die Assoziation der Inklusionen mit stabilen, acetylierten Mikrotubuli spielt eine entscheidende Rolle sowohl für die erfolgreiche Etablierung der Chlamydien als auch deren vesikuläre Versorgung. Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigen in infizierten DCs eine HDAC6-vermittelte Deacetylierung von Mikrotubuli. Dies führt zu einem Verlust des peri-nukleären Transports bakterieller Vakuolen zum Golgi-Apparat und einer weiteren strukturellen Desintegration der chlamydialen Kompartimente. Der Vorgang ermöglicht es infizierten DCs, die durch cPLA2/Arachidonsäure beeinträchtigen Inklusionen von der vesikulären Versorgung abzukoppeln und durch weitere intrazelluläre Mechanismen zu eliminieren. Die durchgeführten Untersuchungen zum intrazellulären Abbaumechanismus weisen auf eine Aggresomen-vermittelte Xenophagie der bakteriellen Strukturen hin. Massenspektrometrische Analysen der Aggresomen aus DCs sowie die gefundene Beteiligung der mitophagosomalen Schlüsselkomponenten HDAC6, Parkin, Pink-1 sowie p62 und Ubiquitin belegen einen simultanen auto-/xenophagosomalen Abbau defekter Mitochondrien und desintegrierter Chlamydien. Eine vergleichbare intrazelluläre anti-chlamydiale Abwehr konnte ebenfalls in primären Maus- aber auch humanen DCs bestätigt werden.
Während des Infektionsverlaufs in DCs kommt es parallel zur Auto-/Xenophagie zu einer vermehrten Bildung von Multivesikularkörperchen (MVBs) und einer daran gekoppelten Formation exosomaler Membranvesikel (iDexosomen), die massiv zur Induktion der IFN-γ-Sekretion benachbarter NK-Zellen und so zur Aktivierung einer NK-Zellantwort während der Chlamydieninfektion beitragen. Weitere Untersuchungen zeigen, dass das TNF-α infizierter DCs in Kombination mit dem durch iDexosomen induzierten IFN-γ von NK-Zellen zu einer erhöhten Apoptoseinduktion nicht-infizierter aber auch Chlamydien-infizierter Epithelzellen führt. Dies deutet darauf hin, dass die chlamydiale Subversion der Apoptose infizierter Zellen zu einem gewissen Teil durch eine kombinatorische Wirkung von Exosomen, IFN-γ und TNF-α „ausgehebelt“ werden kann.
Abschließend wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und in welchem Maße die mit DCs kooperierenden NK-Zellen zelluläre Mechanismen besitzen, die eine zelluläre Chlamydieninfektion direkt bekämpfen. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass es bei infizierten NK-Zellen zu keinem Zeitpunkt zu einer erfolgreichen chlamydialen Etablierung und zu keiner zyklusvermittelten EB-RB-Differenzierung kommt. Interessanterweise zeigen die infizierten NK-Zellen eine funktionale Reifung, die durch eine erhöhte IFN-γ-Sekretion, CD146-Induktion, PKC-θ-Aktivierung und Granula-Ausschüttung charakterisiert ist und mit einer Freisetzung von nicht-infektiösen EBs einhergeht. Diese Ausschleusung von Chlamydien konnte hier sowohl für immortalisierte als auch primäre NK-Zellen der Maus gezeigt werden und lässt sich durch die pharmakologische Blockierung zellulärer Exozytoseprozesse inhibieren. Chlamydiale Strukturen innerhalb der NK-Zellen weisen in der Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie eine ausgeprägte Co-Lokalisierung mit sekretorischen Granula auf. Es scheint, dass das Granula-lokalisierte und ausgeschüttete Granzym B verantwortlich für den beobachteten Infektionsverlust, der durch NK-Zellen freigesetzten EBs, ist. Die chlamydiale Infektion und Ausschleusung von EBs hat keinen detektierbaren negativen Einfluss auf die Funktion der NK-Zellen. Sie können nach einer Erstinfektion den chlamydialen Infektions- und Ausschüttungsvorgang in einer weiteren Reaktion reproduzieren und besitzen eine zytotoxische Aktivität, die denen nicht-infizierter NK-Zellen entspricht oder sogar leicht erhöht ist. Die von NK-Zellen freigesetzten nicht-infektiösen Chlamydien zeigen eine nachweisbare Immunogenität, die laut IgG-Subklassen-Charakterisierung immunisierter Mäuse zu einer IgG2c-/IgG2b-dominierten Th1-Antwort führt. Die während der Immunisierung generierten anti-chlamydialen Antikörper besitzen zudem die Fähigkeit zur Infektionsneutralisierung bei der Verwendung epithelialer Wirtszellen als Modelsystem.
Im Résumé geben die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit neue und vertiefende Einblicke in die zellulären und molekularen Abwehrmechanismen Chlamydien-infizierter DCs und NK-Zellen sowie in deren funktionale wechselseitige Kooperation während der anti-chlamydialen Immunreaktion durch iDexosomen, TNF-α und IFN-γ.
Das durch Gnitzen übertragene Schmallenberg-Virus (SBV) wurde erstmals im Herbst 2011 nahe der deutsch-niederländischen Grenze nachgewiesen und hat sich in der Folge rasant in Europa ausgebreitet. SBV gehört zur Simbu-Serogruppe innerhalb des Genus Orthobunyavirus, Familie Bunyaviridae, und stellt das erste in Europa nachgewiesene Virus dieser Serogruppe dar. SBV infiziert hauptsächlich Wiederkäuer, in denen schwere fetale Missbildungen und Aborte ausgelöst werden können, wenn naive Muttertiere in einem kritischen Zeitfenster während der Trächtigkeit infiziert werden. Effiziente Lebendimpfstoffe gegen SBV oder verwandte Simbuviren sind bisher nicht verfügbar.
Für die molekularbiologische Charakterisierung des neu aufgetretenen Virus wurde im Rahmen dieser Arbeit ein reverses genetisches System entwickelt, welches unter anderem für die Generierung von geeigneten attenuierten Lebendvakzinen genutzt werden sollte. In Anlehnung an einen sicheren und effizienten Impfstoffkandidaten gegen das Bunyavirus Rift Valley Fever-Virus wurden SBV-Mutanten mit Deletionen der Nichtstrukturproteine NSs und NSm generiert. Dabei zeigte sich, dass beide Nichtstrukturproteine von SBV für die Entstehung infektiöser Virionen nicht essentiell sind. In einer Impfstudie wurde gezeigt, dass eine einmalige Vakzinierung mit der ΔNSs/ΔNSm-Doppelmutante eine effiziente Immunantwort in Rindern induziert und zum vollständigen Schutz vor einer SBV-Belastungs-Infektion führt. Damit bietet die Doppel-Deletionsmutante eine Basis für die Entwicklung sicherer und effizienter SBV-Lebendimpfstoffe und könnte auch als Modell für weitere Viren der Simbu-Serogruppe und verwandte Orthobunyaviren dienen.
Mit Hilfe zahlreicher neu generierter NSm-Deletionsmutanten wurde das NSm, dessen Funktion bei Orthobunyaviren weitestgehend ungeklärt ist, näher charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass das reife NSm (Domäne II bis V) für das Viruswachstum in Mammalia-Zellkulturen nicht essentiell ist und dass Domäne I die Signalsequenz von Domäne V ersetzen kann.
Mit dem im Rahmen dieser Arbeit etablierten SBV-spezifischen NSm-Antikörper konnte erstmals das NSm eines Virus der Simbu-Serogruppe intrazellulär nachgewiesen werden. Dabei wurde eine Lokalisation des NSm im endoplasmatischen Retikulum und eine von Domäne IV abhängige Ko-lokalisation von SBV-NSm mit dem Glykoprotein Gc im Golgi-Apparat beobachtet