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Introduction
Proteasome inhibition is first line therapy in multiple myeloma (MM). The immunological potential of cell death triggered by defects of the ubiquitin-proteasome system (UPS) and subsequent perturbations of protein homeostasis is, however, less well defined.
Methods
In this paper, we applied the protein homeostasis disruptors bortezomib (BTZ), ONX0914, RA190 and PR619 to various MM cell lines and primary patient samples to investigate their ability to induce immunogenic cell death (ICD).
Results
Our data show that while BTZ treatment triggers sterile type I interferon (IFN) responses, exposure of the cells to ONX0914 or RA190 was mostly immunologically silent. Interestingly, inhibition of protein de-ubiquitination by PR619 was associated with the acquisition of a strong type I IFN gene signature which relied on key components of the unfolded protein and integrated stress responses including inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), protein kinase R (PKR) and general control nonderepressible 2 (GCN2). The immunological relevance of blocking de-ubiquitination in MM was further reflected by the ability of PR619-induced apoptotic cells to facilitate dendritic cell (DC) maturation via type I IFN-dependent mechanisms.
Conclusion
Altogether, our findings identify de-ubiquitination inhibition as a promising strategy for inducing ICD of MM to expand current available treatments.
Mutations in genes coding for proteasome subunits and/or proteasome assembly helpers typically cause recurring autoinflammation referred to as chronic atypical neutrophilic dermatosis with lipodystrophy and elevated temperatures (CANDLE) or proteasome-associated autoinflammatory syndrome (PRAAS). Patients with CANDLE/PRAAS present with mostly chronically elevated type I interferon scores that emerge as a consequence of increased proteotoxic stress by mechanisms that are not fully understood. Here, we report on five unrelated patients with CANDLE/PRAAS carrying novel inherited proteasome missense and/or nonsense variants. Four patients were compound heterozygous for novel pathogenic variants in the known CANDLE/PRAAS associated genes, PSMB8 and PSMB10, whereas one patient showed additive loss-of-function mutations in PSMB8. Variants in two previously not associated proteasome genes, PSMA5 and PSMC5, were found in a patient who also carried the PSMB8 founder mutation, p.T75M. All newly identified mutations substantially impact the steady-state expression of the affected proteasome subunits and/or their incorporation into mature 26S proteasomes. Our observations expand the spectrum of PRAAS-associated genetic variants and improve a molecular diagnosis and genetic counseling of patients with sterile autoinflammation.
Tissue sections, which are widely used in research and diagnostic laboratories and have already been examined by immunohistochemistry (IHC), may subsequently provide a resource for proteomic studies, even though only small amount of protein is available. Therefore, we established a workflow for tandem mass spectrometry-based protein profiling of IHC specimens and characterized defined brain area sections. We investigated the CA1 region of the hippocampus dissected from brain slices of adult C57BL/6J mice. The workflow contains detailed information on sample preparation from brain slices, including removal of antibodies and cover matrices, dissection of region(s) of interest, protein extraction and digestion, mass spectrometry measurement, and data analysis. The Gene Ontology (GO) knowledge base was used for further annotation. Literature searches and Gene Ontology annotation of the detected proteins verify the applicability of this method for global protein profiling using formalin-fixed and embedded material and previously used IHC slides.
Despite the extensive ongoing research, there still exist plenty of diseases whose mechanisms have not yet been fully understood, one such example being proteasome-related disorders. Over the last few years, an increasing number of studies have been initiated
to elucidate their driving pathophysiological mechanisms. Determining the systematic effects of genomic alterations occurring in genes encoding 19S proteasome subunits is a key to comprehend the molecular basis of syndromic intellectual disability (ID) pathogenesis and
the subsequent design of new targeted therapies. Therefore, the main objective of my research was to contribute to the identification of potential drivers of syndromic ID, and thereby pave the way for the development of new targeted therapy approaches. In this regard, my aim was to characterize tissue, proteomic and metabolomic changes in cells from patients with PSMC5 mutations and uncover a potential dysregulation of various biochemical and/or inflammatory pathways.
To this end, I undertook a comparative examination of control and patient T cells expanded from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). First, I assessed the proteasome composition in these samples (both in its denaturized and native form), by means of
SDS-PAGE, native PAGE and western-blotting. Moreover, I determined proteasome chymotrypsin-like activity by measure of Suc-LLVY-AMC peptidase activity assay. In addition, I analysed the activation status of the ER stress and mTOR pathway by RT-PCR and SDS-PAGE /western-blotting prior to a subsequent analysis of T-cell markers.
The data show that the investigated p.(Pro320Arg) and p.(Arg201Trp) de novo heterozygous missense mutations in the PSMC5 gene do not cause haploinsufficiency as the steady-state expression level of the PSMC5/Rpt6 full-length protein does not vary between control and patient cells. Further analysis of control and patient T cells under non-reducing conditions revealed that PSMC5/Rpt6 mutants were less efficiently incorporated into 26S proteasome complexes than their wild-type counterparts. The failure to assemble PSMC5/Rpt6 into fully mature proteasomes was associated with a reduced proteasome chymotrypsin-like activity in patient T cells, as determined by in-plate assays. These data unambiguously demonstrate that both of the p.(Pro320Arg) and p.(Arg201Trp) PSMC5 mutations identified in patients suffering from syndromic ID are loss-of-function mutations. Interestingly, my data further show that proteasome dysfunction in these patients was accompanied by abnormalities in mTOR signalling and T-cell differentiation, as determined by western-blotting and flow cytometry, respectively.
Altogether, our data identified for the first time PSMC5 as a disease-causing gene for
a syndromic form of ID. How proteasome dysfunction caused by PSMC5 variants contributes to disease pathogenesis, remains to be fully determined.
Vorhofflimmern (VHF) ist die häufigste Herzrhythmusstörung im Erwachsenenalter. In den kommenden Jahren und Jahrzehnten werden die Prävalenz und Inzidenz von Vorhofflimmern weiter zunehmen. Die VHF-assoziierten Pathomechanismen sind nicht vollständig geklärt. Derzeitige Therapieansätze sind oft nur zeitlich begrenzt wirksam, mit starken Nebenwirkungen behaftet und können aktuelle Beschwerden der Patienten zwar eindämmen, ein Fortschreiten der Krankheit aber nicht aufhalten. Daher ist es notwendig, weitere Untersuchungen auf Ebene der Zellregulation und Zellkommunikation zu fördern, um das Wissen über Entwicklung, Progression und Reversibilität von VHF-assoziierten Remodeling-Prozessen zu erweitern und neue therapeutische Interventionspunkte zu identifizieren.
VHF-induzierte atriale Remodeling-Prozesse werden maßgeblich und zum Teil ursächlich durch reversible Veränderungen der Protein-Phosphorylierung verursacht. In vorherigen Arbeiten des Labors konnten bereits im Rahmen von Phosphoproteom-Analysen Proteine in HL-1 Zellen detektiert werden, die nach Rapid Pacing (RP) auffällig differentiell reguliert waren. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Analyse und Verifizierung dieser Proteine nach kontinuierlichem und Intervall-RP von HL-1 Zellen auf mRNA- und Proteinebene. Der Vergleich der im HL-1-Modell erhaltenen Daten mit denen, die aus atrialem Gewebe von Patienten in SR und VHF gewonnen wurden, soll Rückschlüsse auf klinisch und therapeutisch potenziell relevante Signalwege und Pathomechanismen bei VHF geben. Es stellte sich heraus, dass RP keinen Einfluss auf die mRNA-Expression von DDR2, OBSCN, SGK223, MARK2 und eingeschränkt auf JPH2 und GPX1 in HL-1 Zellen hatte. Lediglich nach Intervall-RP war die mRNA-Menge von JPH2 erhöht und von GPX1 reduziert. Sowohl nach kontinuierlichem als auch nach Intervall-RP war die Genexpression der Proteine SNIP1 und SBK2 stark reduziert. Gleichzeitig stellte sich eine ebenso stark reduzierte SBK2 Proteinexpression sowohl in den HL-1 Zellen als auch im humanen Vorhofgewebe bei VHF dar. In der immunhistochemischen Untersuchung atrialer Gewebeschnitte präsentierte sich SBK2 im Zytoplasma, entlang der Zellmembran und vesikelartig im perinukleären Raum der humanen Kardiomyozyten. RP und VHF hatten keinen Einfluss auf die Gen- und Proteinexpression von MARK2 in den HL-1 Zellen und im humanen Vorhofgewebe. In der Untersuchung der Protein-Phosphorylierung von MARK2 an Thr208 ergaben sich allerdings Diskrepanzen zwischen den murinen und humanen Zellen. Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde in den humanen Kardiomyozyten für MARK2 eine regelmäßige Anordnung in longitudinaler Ausrichtung und zwischen den Z-Linien nachgewiesen. Eine VHF-abhängige durch Phosphorylierung vermittelte subzelluläre Translokation von MARK2 konnte ausgeschlossen werden. Diese RP-assoziierten Veränderungen im Phosphoproteom sind am atrialen Remodeling, bei der Erhöhung des oxidativen Stresses und der Aktivierung des TGF-β- und NF-κB-Signalwegs involviert. Des Weiteren wird ein Zusammenhang zwischen MARK2 und dem Wnt-Signalweg vermutet.
In weiterführenden Arbeiten sollten Untersuchungen der spezifischen Effekte von Protein-Phosphorylierungen und der Protein-Protein-Interaktionen erfolgen. Da zu den kardialen Funktionen von SBK2 keine Daten vorliegen, könnten mithilfe des Knock-outs von SBK2 (Knock-out Maus oder CRISPR-Cas9 Knock-out in HL-1 Zellen) grundlegende Aussagen zu dessen Rolle im gesunden Herzen oder bei VHF erhalten werden.
Cancer stem cells (CSCs) represent a small subset of slowly dividing cells with tumor-initiating ability. They can self-renew and differentiate into all the distinct cell populations within a tumor. CSCs are naturally resistant to chemotherapy or radiotherapy. CSCs, thus, can repopulate a tumor after therapy and are responsible for recurrence of disease. Stemness manifests itself through, among other things, the expression of stem cell markers, the ability to induce sphere formation and tumor growth in vivo, and resistance to chemotherapeutics and irradiation. Stemness is maintained by keeping levels of reactive oxygen species (ROS) low, which is achieved by enhanced activity of antioxidant pathways. Here, cellular sources of ROS, antioxidant pathways employed by CSCs, and underlying mechanisms to overcome resistance are discussed.
Reduction and oxidation reactions are essential for biochemical processes. They are part of metabolic pathways and signal transduction. Reactive oxygen species (ROS) as second messengers and oxidative modifications of cysteinyl (Cys) residues are key to transduce and translate intracellular and intercellular signals. Dysregulation of cellular redox signaling is known as oxidative distress, which has been linked to various pathologies, including neurodegeneration. Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative pathology linked to both, abnormal amyloid precursor protein (APP) processing, generating Aβ peptide, and Tau hyperphosphorylation and aggregation. Signs of oxidative distress in AD include: increase of ROS (H2O2, O2•−), decrease of the levels or activities of antioxidant enzymes, abnormal oxidation of macromolecules related to elevated Aβ production, and changes in mitochondrial homeostasis linked to Tau phosphorylation. Interestingly, Cys residues present in APP form disulfide bonds that are important for intermolecular interactions and might be involved in the aggregation of Aβ. Moreover, two Cys residues in some Tau isoforms have been shown to be essential for Tau stabilization and its interaction with microtubules. Future research will show the complexities of Tau, its interactome, and the role that Cys residues play in the progression of AD. The specific modification of cysteinyl residues in redox signaling is also tightly connected to the regulation of various metabolic pathways. Many of these pathways have been found to be altered in AD, even at very early stages. In order to analyze the complex changes and underlying mechanisms, several AD models have been developed, including animal models, 2D and 3D cell culture, and ex-vivo studies of patient samples. The use of these models along with innovative, new redox analysis techniques are key to further understand the importance of the redox component in Alzheimer's disease and the identification of new therapeutic targets in the future.
Proteostasis, a portmanteau of the words protein and homeostasis, refers to the ability of
eukaryotic cells to maintain a stable proteome by acting on protein synthesis, quality control and/or
degradation. Over the last two decades, an increasing number of disorders caused by proteostasis
perturbations have been identified. Depending on their molecular etiology, such diseases may be
classified into ribosomopathies, proteinopathies and proteasomopathies. Strikingly, most—if not
all—of these syndromes exhibit an autoinflammatory component, implying a direct cause-and-effect
relationship between proteostasis disruption and the initiation of innate immune responses. In this
review, we provide a comprehensive overview of the molecular pathogenesis of these disorders and
summarize current knowledge of the various mechanisms by which impaired proteostasis promotes
autoinflammation. We particularly focus our discussion on the notion of how cells sense and integrate
proteostasis perturbations as danger signals in the context of autoinflammatory diseases to provide
insights into the complex and multiple facets of sterile inflammation.
Macrophages are cells of the innate immune system and represent an important component of the first-line defense against pathogens and tumor cells. Here, their diverse functions in inflammation and tumor defense are described, and the mechanisms, tools, and activation pathways and states applied are presented. The main focus is on the role and origin of reactive oxygen species (ROS), the important signal pathways TLR/NF-κB, and the M1/M2 polarization of macrophages.
Zusammenfassung
Im Rahmen immunologischer Erkrankungen, wie Autoimmun- oder inflammatorischer Erkrankungen, Erkrankungen des zentralen Nervensystems oder Krebserkrankungen spielen Peptidasen eine wichtige Rolle [1, 2]. Die Exopeptidasen Membran-Alanyl-Aminopeptidase N (APN/CD13) und Dipeptidylpeptidase IV (DP IV/CD26) sind essentiell für die Regulation vieler biologischer Prozesse, insbesondere für die Autoimmunität und die Inflammation [3-5]. Literaturdaten und Vorarbeiten verschiedener Arbeitsgruppen belegen immunmodulatorische Eigenschaften von Inhibitoren der enzymatischen Aktivität der APN. Sowohl in vitro als auch in verschiedenen Krankheitsmodellen der Maus in vivo, zeigten sich therapeutisch relevante immunsuppressive Effekte dieser Inhibitoren [7, 11]. Mechanistisch liegen diesen positiven Wirkungen unter anderem eine Hemmung der Produktion und Sekretion proinflammatorischer Zytokine, sowie die Verstärkung der Produktion und Sekretion immunsuppressiver Zytokine zu Grunde [5]. Die Inhibitoren scheinen auch einen immunmodulatorischen Einfluss auf den Wnt Signalweg zu haben, der als Signaltransduktionsweg wichtige Aufgaben in der Regulation von Zellmigration, Polarität, interzellulärer Kontakte und für die frühe Embryonalentwicklung übernimmt [47]. Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl der Einfluss verschiedener Inhibitoren der APN als auch des genetischen CD13-Knockouts in Mäusen auf die Aktivierung verschiedener Mikrogliazellpopulationen und auf die Expression von Komponenten des Wnt Signalweges untersucht. In Abhängigkeit von der Aktivierung war sowohl eine gesteigerte Expression proinflammatorischer Zytokine, als auch eine Hemmung der Komponenten des Wnt Signalweges in BV2 Mikrogliazellen zu beobachten. In BV2 Mikrogliazellen konnten keine signifikanten Einflüsse durch die Inhibitoren A1.002 und IP10.C9 detektiert werden. Lediglich durch den CD13-Antikörper My 7 konnten immunsuppressive Effekte in aktivierten BV2 Mikrgoliazellen beobachtet werden. In CD13-Knockout Mäusen konnte eine signifikante Reduktion der Wnt 10b positiven Mikrogliazellen gezeigt werden. In der Zusammenschau aller Ergebnisse lassen sich regulatorische Zusammenhänge zwischen der Aktivität der Mikrogliazellen, sowie der APN und dem Wnt Signalweg aufzeigen. Daher erscheinen weiterführende Analysen in primären isolierten Mikrogliazellen sinnvoll, um die Bedeutung von Inhibitoren der APN in neuronalen Zellen zu ermitteln. Dabei spielen nicht nur die Inhibitoren selbst, sondern auch deren Inkubationsbedingungen im Verhältnis zur LPS-vermittelten Zellaktivierung eine entscheidende Rolle.
Survival, development, and function of cells depend on numerous signaling pathways or-
chestrating the response to external and internal stimuli. Besides the well-established signaling through reversible phosphorylation, the concept of specific, spatio-temporal redox modifi-
cations of protein cysteinyl and methionyl side chains that regulate the biological function of these proteins is supported by an overwhelming amount of data. Although the specific reduction of protein redox modifications has been studied intensively, the oxidation of protein side chains was thought to be a result of so-called ‘oxidative stress’. However, this term has been increasingly challenged, since signaling pathways depend on specific, spatio-temporal oxidation of target proteins, most likely catalyzed by specific enzymes. The discovery of MICAL (molecule interacting with CasL) proteins evinced
the first examples of specific oxidases in signal transduction in the redox regulation of cellular functions.As part of the semaphorin signaling pathway, MICAL proteins were characterized to stereospecifically oxidize methionyl residues in actin, thereby regulating actin deolymerization, a process important in neurogenesis and cell migration. This oxidation can be reversed by the specific methionine-R-sulfoxide eductase B1. Besides the regulation of actin dynamics, MICALs are involved in the regulation of cell proliferation and
apoptosis, and the production of hydrogen peroxide may qualify them as specific oxidases also for cysteinyl residues.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes und die Inzidenz nimmt seit fast drei Jahrzehnten stetig zu. Moderne Therapieverfahren führen zu einem längeren Überleben der Patienten, durchaus auch mit kompletter Remission. Dennoch können im Rahmen der Therapie, insbesondere unter der Hormonentzugstherapie, weitere Veränderungen des Tumors zu einer Progression der Erkrankung führen. Durch den Verlust der Androgenabhängigkeit des Tumors bezeichnet man dies als kastrationsresistentes Prostatakarzinom. Dieser Progress ist häufig mit einer Zunahme von neuroendokrinen Zellen assoziiert, die im Rahmen einer sog. Neuroendokrinen Transdifferenzierung (NETD) aus den Drüsenzellen des Adenokarzinoms entstehen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine solche Differenzierung durch die Kultivierung der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP in Gegenwart von IL-6 simuliert. Diese experimentell erzeugte NETD konnte sowohl durch die Überexpression typischer Markerproteine, als auch durch die charakteristische Veränderung der Zellmorphologie nachgewiesen werden.
Um die molekularbiologischen Mechanismen im Rahmen der NETD besser zu verstehen, wurde das Proteom der differenzierten Zellen mit dem von Kontrollzellen verglichen. Differentiell exprimierte Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert.
Die Proteine Gelsolin, Septin 7 und PC1 wurden in weiterführenden Experimenten validiert. Im Kontext der NETD erwies sich Gelsolin aufgrund seiner bekannten Funktionen als besonders interessant. Daher wurde dessen Expression mittels RNA- Interferenz moduliert und die Auswirkungen auf Zellfunktion und Morphologie untersucht. Gelsolin ist ein multifunktionelles Protein, welches sowohl Zytoskelett- modulierend wirkt, als auch in die Regulation der Apoptose involviert ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Gelsolin knockdown eine deutliche Expressionserhöhung der aktivierten Caspase 3 bewirkt, was mit einer erhöhten Apoptoserate korreliert. Naheliegend war es auch der Frage nachzugehen, ob Gelsolin an der Ausprägung der charakteristischen morphologischen Veränderungen im Zuge der NETD beteiligt ist. Der begleitend zur IL-6-Behandlung durchgeführte knockdown ergab jedoch keinen relevanten Einfluss auf die Ausbildung von Zellausläufern.
Eine auf immunzytochemischer Färbetechnik basierende Analyse zeigte eine Kolokalisation von Gelsolin mit den Proteinen VDAC1 und PC1. Beide sind als Stabilisatoren des mitochondrialen Membranpotenzials bekannt. Somit könnte Gelsolin als Adapterprotein im Rahmen der Apoptoseregulation fungieren.
Die vorliegende Arbeit hat differentiell exprimierte Proteine identifiziert, die im Kontext einer NETD erstmals beschrieben wurden und somit den Weg bereitet, den Erkenntnisgewinn zu molekularbiologischen Abläufen bei der Entwicklung eines kastrationsresistenten Prostatakarzinoms auszuweiten.
The human pathogen Clostridioides difficile has evolved into the leading cause of nosocomial diarrhea. The bacterium is capable of spore formation, which even allows survival of antibiotic treatment. Although C. difficile features an anaerobic lifestyle, we determined a remarkably high oxygen tolerance of the laboratory reference strain 630Δerm. A mutation of a single nucleotide (single nucleotide polymorphism [SNP]) in the DNA sequence (A to G) of the gene encoding the regulatory protein PerR results in an amino acid substitution (Thr to Ala) in one of the helices of the helix-turn-helix DNA binding domain of this transcriptional repressor in C. difficile 630Δerm. PerR is a sensor protein for hydrogen peroxide and controls the expression of genes involved in the oxidative stress response. We show that PerR of C. difficile 630Δerm has lost its ability to bind the promoter region of PerR-controlled genes. This results in a constitutive derepression of genes encoding oxidative stress proteins such as a rubrerythrin (rbr1) whose mRNA abundance under anaerobic conditions was increased by a factor of about 7 compared to its parental strain C. difficile 630. Rubrerythrin repression in strain 630Δerm could be restored by the introduction of PerR from strain 630. The permanent oxidative stress response of C. difficile 630Δerm observed here should be considered in physiological and pathophysiological investigations based on this widely used model strain.
IMPORTANCE The intestinal pathogen Clostridioides difficile is one of the major challenges in medical facilities nowadays. In order to better combat the bacterium, detailed knowledge of its physiology is mandatory. C. difficile strain 630Δerm was generated in a laboratory from the patient-isolated strain C. difficile 630 and represents a reference strain for many researchers in the field, serving as the basis for the construction of insertional gene knockout mutants. In our work, we demonstrate that this strain is characterized by an uncontrolled oxidative stress response as a result of a single-base-pair substitution in the sequence of a transcriptional regulator. C. difficile researchers working with model strain 630Δerm should be aware of this permanent stress response.
Chagas’ disease (CD), caused by the hemoflagellate protozoan, Trypanosoma cruzi, is endemic in most countries of Latin America. Heart failure (HF) is often a late manifestation of chronic CD, and is associated with high morbidity and mortality. Inflammatory processes mediated by cytokines play a key role in the pathogenesis and progression of CD. Keeping in view the inflammatory nature of CD, this study investigated the possible role of 21 different inflammatory cytokines as biomarkers for prediction and prognosis of CD. The plasma concentration of these cytokines was measured in a group of patients with CD (n = 94), and then compared with those measured in patients with dilated cardiomyopathy (DCM) from idiopathic causes (n = 48), and with control subjects (n = 25). Monovariately, plasma levels of cytokines such as stem cell growth factor beta (SCGF beta), hepatocyte growth factor (HGF), monokine induced by interferon gamma (CXCL9), and macrophage inhibitory factor (MIF) were significantly increased in CD patients with advanced HF compared to control group. None of the cytokines could demonstrate any prognostic potency in CD patients, and only MIF and stromal derived factor-1 alpha (CXCL12) showed significance in predicting mortality and necessity for heart transplant in DCM patients. However, multivariate analysis prognosticated a large proportion of CD and DCM patients. In CD patients, HGF and Interleukin-12p40 (IL-12p40) together separated 81.9% of 3-year survivors from the deceased, while in DCM patients, CXCL12, stem cell factor (SCF), and CXCL9 together discriminated 77.1% of survivors from the deceased. The significant increase in plasma concentrations of cytokines such as HGF and CXCL9 in CD patients, and the ability of these cytokines to prognosticate a large proportion of CD and DCM patients multivariately, encourages further studies to clarify the diagnostic and prognostic potential of cytokines in such patients.
Abstract
G‐quadruplexes have attracted growing interest in recent years due to their occurrence in vivo and their possible biological functions. In addition to being promising targets for drug design, these four‐stranded nucleic acid structures have also been recognized as versatile tools for various technological applications. Whereas a large number of studies have yielded insight into their remarkable structural diversity, our current knowledge on G‐quadruplex stabilities as a function of sequence and environmental factors only gradually emerges with an expanding collection of thermodynamic data. This minireview provides an overview of general rules that may be used to better evaluate quadruplex thermodynamic stabilities but also discusses present challenges in predicting most stable folds for a given sequence and environment.
Zusammenfassung:
Zielstellung dieser Arbeit war es, den Einfluss von „lone atrial fibrillation“ auf die extrazelluläre und intrazelluläre Signaltransduktion des TGF-beta1-Signalweges zu untersuchen. Dazu wurde das Modell des „acute rapid pacing“ unter Verwendung muriner HL-1-Zellen genutzt. Weiterhin wurde die Einflussnahme von Irbesartan auf die festgestellten Veränderungen geprüft.
„Acute rapid pacing“ führte zu einer erhöhten mRNA-Expression profibrotischer Faktoren wie CTGF, SGK1 und TGF-beta1. Marker für kardiale Schädigung wie MSTN und FSTL3 zeigten ebenfalls eine Erhöhung des mRNA-Gehaltes nach „acute rapid pacing“. Kardial protektive Faktoren wie FSTL1 fanden sich im mRNA-Gehalt dagegen erniedrigt. Auf Proteinebene zeigte sich eine Mehrexpression des Stressmarkers GSK. Die Verwendung von Irbesartan beim „acute rapid pacing“ führte zu einer Reduktion der elevierten mRNA-Gehalte der profibrotischen Faktoren CTGF, SGK1 und TGF-beta1. Gleichfalls sank durch Irbesartan der erhöhte mRNA-Gehalt der kardialen Schädigungsmarker MSTN und FSTL3. Auf den mRNA-Gehalt des kardioprotektiven FSTL1 hatte Irbesartan keinen bedeutenden Einfluss. Auf Proteinebene konnte eine Minderexpression des Stressmarkers GSK festgestellt werden, wenn „rapidly paced“ Zellen mit Irbesartan inkubiert worden waren. Für andere untersuchte, mutmaßliche Modifikatoren wie Endoglin und FSTL5 lassen sich keine relevanten Aussagen ableiten.
In Bezug auf den weiteren Signalweg sprechen die Ergebnisse der mRNA-Werte von ALK1 (Acvrl1), ALK2 (Acvr1) und ALK5 (Tgfbr1) nach „acute rapid pacing“ für eine Aktivierung des Phospho-Smad-1/-5/-8-Schenkels. Die Ergebnisse der Proteinexpression von Phospho-Smad-1/-5/-8 und phospho-Smad-2 nach „acute rapid pacing“ bzw. Inkubation mit TGF-beta1 stützen diese These.
Tgfbr2-mRNA konnte in HL-1-Zellen wiederholt nicht nachgewiesen werden, wurde jedoch in Kardiozyten von Mus musculus detektiert. Dies spricht für relevante Unterschiede im kanonischen TGF-beta-Signalweg zwischen HL-1-Zellen und nativem Mausgewebe.
Die untersuchten Zielgene des TGF-beta-Signalwegs – ID1, ID2 und ID3 – zeigten in Bezug auf ihre mRNA nach „acute rapid pacing“ ein differenziertes Verhalten mit Anstieg von ID1 und Absenkung von ID2 und ID3, was zum Prozess eines Remodelings passt. Irbesartan führte in Bezug auf die mRNA der genannten Zielgene nach „acute rapid pacing“ zu keiner signifikanten Änderung.
Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung des Menschen. Die Generierung neuen Wissens über Prozesse der Zellregulation und Zellkommunikation kann unser Verständnis über zugrundeliegende Pathomechanismen dieser Erkrankung erweitern und bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen. Diese Phosphoproteom-Analyse beschreibt Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Proteinen in HL-1 Kardiomyozyten in Abhängigkeit verschiedener Rapid Atrial Pacing (RAP) Stimulationsprotokolle. Um den Einfluss von Regenerationsphasen, wie es sie z. B. auch beim paroxysmalen Vorhofflimmern gibt, auf den Phosphorylierungsstatus von Proteinen zu untersuchen, wurden die Zellen nicht nur kontinuierlich, sondern auch in Intervallen RAP-stimuliert. Insgesamt konnten in dieser Arbeit 9626 Phosphorylierungen in 3463 Proteinen identifiziert werden, von denen 295 Phosphorylierungen in 261 Proteinen signifikant verändert waren. Stark veränderte Phosphorylierungen konnten z. B. in den Proteinen DOCK7 und MARK2 für kontinuierlich stimulierte HL-1 Zellen und OBSCN und JPH2 für Intervall-stimulierte HL-1 Zellen gefunden werden. Neben spezifisch regulierten Proteinphosphorylierungen konnten auch solche beschrieben werden, deren Regulation für kontinuierliches bzw. Intervall-RAP identisch waren (Overlap). Vertreter dieser Gruppe waren z. B. Phosphorylierungen der Proteine KCNH2 und ABLIM3. Eine Vielzahl beobachteter Unterschiede bezüglich der Richtung und Stärke der Regulation von Proteinphosphorylierungen zwischen kontinuierlich und Intervall- stimulierten HL-1 Zellen ist dabei ein deutliches Indiz für einen bestehenden Einfluss der Regenerationsphasen auf die Modulation zellulärer Signalwege. Bei der Zuordnung veränderter Protein-Phosphorylierungen zu definierten Signalwegen zeigte sich das Netrin-Signaling als signifikantes Beispiel für Signalwege, die sowohl bei kontinuierlich als auch bei Intervall-stimulierten HL-1 Zellen einer Modulation unterliegen. Veränderungen in der Regulation der Proteinphosphorylierung bzw. der Proteinexpression konnten dabei vor allem in einem bestimmten Teil des Signalweges identifiziert werden, an dem die Proteine Netrin, DCC-Rezeptor, NCK, RAC und ABLIM beteiligt sind.