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Verschiedene Strategien sind heute in der Entwicklung, um mit Hilfe von RNA Molekülen die genetische Information auf Transkriptebene zu korrigieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Twinribozyme durch den Austausch kleiner RNA Fragmente das Potential zur RNA Reparatur und ortsspezifischen RNA Funktionalisierung besitzen. Das Hairpinribozym katalysiert je nach Stabilität des Ribozym-Substrat-Komplexes die Spaltung bzw. die Ligation seines Substrats. Twinribozyme wurden durch Verknüpfung von zwei Hairpinribozymeinheiten entwickelt. Die Spaltung eines RNA Substrates an den zwei katalytischen Stellen produziert drei Fragmente: beide äußeren binden fest an das Twinribozym, während die Bindung des mittleren Fragments durch einen Vier-Nukleotid-Loop im Ribozymstrang destabilisiert wird. Dies fördert dessen Dissoziation gegenüber dessen Rückligation. Die Zugabe eines so genannten Reparaturoligonukleotids, das stabil an das Twinribozym anstelle des mittleren Fragments bindet, begünstigt dessen Assoziation zum Ribozym und dessen Ligation zu den übrigen Substratfragmenten. Das Ergebnis ist ein um vier Nukleotide verlängertes Reparaturprodukt. Dies stellt ein Modell für die Reparatur einer Vier-Nukleotid-Deletion auf mRNA Ebene dar. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die bestehende Reaktion kinetisch und thermodynamisch zu charakterisieren. Weiter wurde das Potential von Twinribozymen für die Reparatur anderer RNA Defekte und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung untersucht. Schließlich wurde die Twinribozym vermittelte Reparaturreaktion in Zellkulturen getestet. Beim ursprünglichen Vier-Nukleotid-Deletionsmodell wurden unter äquimolaren Konzentrationen aller Fragmente und bei 10 mM Magnesiumchlorid und 37 °C 35 % Reparaturprodukt erhalten. Kinetische Untersuchungen jeder Einzelreaktion konnten zeigen, dass die Tamdemkonfiguration des Twinribozyms die Spalt- und Ligationseigenschaften nicht beeinträchtigt. In thermodynamischen und kinetischen Bindungsuntersuchungen von Modellduplexen, die der Austauschregion ähneln, wurde gezeigt, dass die Struktur des Ribozym-Substrat-Komplexes den Austausch der mittleren Fragmente stark fördert. Eine Voraussetzung zur biophysikalischen und biochemischen Untersuchungen von RNA Molekülen ist ihre ortsspezifische Markierung. Dies wird für bis zu 80 Nukleotide lange RNA Stränge durch chemische Synthese erreicht. Längere modifizierte RNA Moleküle werden mühsam durch Ligation mehrerer Stränge synthetisiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, native RNAs durch in situ Hybridisierung zu markieren. Keine Methode steht somit zur Verfügung, um in vitro Transkripte oder native RNAs intern und kovalent zu modifizieren. Ein synthetisches Substrat konnte ohne Ausbeuteverluste mit verschiedenen Fluoreszenzmolekülen, die chemisch in das Reparaturoligonukleotid eingebaut wurden, mit dem Twinribozym markiert werden. Verschiedene Transkripte wurden ebenfalls erfolgreich mit dem Twinribozym funktionalisiert. Drei verschiedene Modelle wurden untersucht: die Markierung der Transkripte resultierte entweder in einer Verlängerung um vier Nukleotide, in der Einführung von drei Einzelbasenmutationen oder in gar keinem Sequenzunterschied. Um die Ribozymzugänglichkeit der Zielsequenzen zu verbessern wurden erhöhte Temperaturen sowie DNA Oligonukleotide verwendet, die an das Transkript im Bereich der Flanken zur Ribozymbindungssequenz binden. Markierungsausbeuten von jeweils 53, 47 und 11 % wurden erzielt. Die potentielle Anwendung von Twinribozymen für die therapeutische RNA Reparatur erfordert eine effektive Zellaktivität. In vitro Versuche konnten zeigen, dass Twinribozyme unter zellähnlichen Bedingungen aktiv sind. Ein Versuch, die bestehende in vitro Reaktion in menschlichen Zellkulturen durchzuführen und das Reparaturprodukt nach Zelllyse nachzuweisen, scheiterte, da das Ribozym während der Analyse nicht deaktiviert werden konnte. Weiter wurde ein Luciferasereportergen durch die Einführung verschiedener Mutationen so deaktiviert, dass ein neues entwickeltes Twinribozym die Fehler auf mRNA Ebene reparieren sollte. In vitro Versuche mit kurzen synthetischen Substraten zeigten, dass das Ribozym die Fehler effizient prozessiert. Reparaturansätze mit den mutierten Transkripten lieferten aber Reparaturausbeuten unter 1 %, möglicherweise wegen der schlechten Ribozymzugänglichkeit der langen Transkripten. Durch Lumineszenzzellversuche konnte leider keine RNA Reparatur nachgewiesen werden. Twinribozyme erlauben den Austausch kurzer RNA Fragmente innerhalb synthetischer RNAs und Transkripte und akzeptieren dabei modifizierte Sequenzen. Dies öffnet Twinribozymen den Weg als molekulares Werkzeug für die RNA Reparatur und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung. Die Erarbeitung von Möglichkeiten, die schlechte Zugänglichkeit der Zielsequenzen zu umgehen, sowie der Erhalt positiver Zellversuche werden über die Verwendung dieses potentialreichen RNA Werkzeugs entscheiden.
Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Strukturen, die unter anderem in viralen Satelliten-RNAs entdeckt wurden, wo sie durch reversible Spaltung des Phosphatrückgrates die virale Replikation unterstützen. Durch gezielte strukturelle Manipulation von Ribozymen entstehen wertvolle Werkzeuge, die in vielen bioanalytischen, biotechnologischen und gentherapeutischen Bereichen Anwendung finden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem funktionalen Design von verschiedenen Ribozymmotiven, deren kinetische und strukturelle Charakterisierung sowie deren potentielle Anwendung. In einem ersten Projekt sollten durch rationales Design RNA-Schalter, sogenannte Riboswitches, entwickelt werden. Die Aktivität dieser schaltbaren Ribozyme hängt von einem externen Kofaktor ab. Solche Konstrukte können durch gezielte Kombination einer natürlichen Ribozymdomäne mit einer Aptamerdomäne, die spezifisch einen Kofaktor (darunter Nukleinsäuren, Peptide, organische Moleküle und Metallionen) binden kann, gewonnen werden. Durch Bindung dieses Kofaktors wird eine konformelle Änderung innerhalb der Ribozymstruktur erzwungen die einen Anstieg- oder Abfall der katalytischen Aktivität zur Folge hat. Derartige Systeme besitzen biosensorisches Potential. Betrachtet man den Kofaktor als Analyten, kann das Bindungsereignis, also die Detektion, über ein Spaltereignis beobachtet werden. Die Reversibilität solcher Detektionssysteme konnte bisher nicht demonstriert werden, würde aber deren Attraktivität und Anwendungspotential erhöhen. In dieser Arbeit wurden Ribozyme auf Basis des Hairpin-Motivs entwickelt, die in Abhängigkeit von Flavinmononukleotid (FMN) aktiv sind. Um die Reversibilität des Prozesses zu gestatten, müsste FMN beliebig aus der Aptamerdomäne entfernt und in diese wieder eingelagert werden können. Dies sollte über die Kontrolle der Molekülgeometrie des Kofaktors erfolgen. Durch chemische Reduktion von FMN werden strukturelle und elektronische Veränderungen innerhalb des Moleküls hervorgerufen, die die Bindungsaffinität verringern sollten. Versuche mit Reduktionsmitteln konnten die Reversibilität des Schaltvorganges in einem ersten Ansatz demonstrieren. Um ein mehrmaliges, kontrolliertes Schalten zu gestatten, wurde zur gezielten Manipulation des Oxidationszustandes von FMN eine elektrochemische Zelle entwickelt. Dazu musste das klassische Drei-Elektroden-System dem hier vorliegenden System angepasst werden. Zum einen muss die quantitative Reduktion/Oxidation von FMN in einem kleinen Probenvolumen von einigen Mikrolitern gewährleistet werden, zum anderen sollte unter Sauerstoffausschluss gearbeitet werden, um unerwünschte Reoxidationsprozesse zu verhindern. Mit der entwickelten Zelle konnte in einem Spaltexperiment ansatzweise die Verringerung der Ribozymaktivität durch elektrochemische Reduktion des Kofaktors demonstriert werden. Schnelles und präzises Schalten des Systems wurde durch Diffusionsprozesse der reagierenden Spezies zur Elektrodenoberfläche limitiert und konnte mit dieser Anordnung nicht demonstriert werden. Neben kinetischen Studien sollten strukturelle Untersuchungen die Charakterisierung des RNA-Schalters vervollständigen. Hierbei wurden die konformellen Änderungen innerhalb des Ribozyms bei Bindung des Kofaktors ESR-spektroskopisch studiert. Allgemein müssen dazu Nukleinsäuren mit paramagnetischen Spinsonden markiert werden. In diesem Zusammenhang wurden Synthese- und Markierungsmethoden zum Erhalt spinmarkierter Oligonukleotide etabliert. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit der Entwicklung von Reparatursystemen auf Basis kleiner katalytischer RNA-Motive. Die in diesem Zusammenhang entwickelten Twinribozyme besitzen großes Potential zur Reparatur von Gendefekten auf RNA-Ebene. Hierbei wird ein kurzer Sequenzabschnitt innerhalb eines RNA-Stranges gegen eine alternative Sequenz durch doppelte Spaltung und Ligation ausgetauscht. Diese Methode sollte es ermöglichen, mutierte Sequenzbereiche auf mRNA-Ebene gegen die entsprechend korrekte Sequenz zu ersetzen und Gendefekte zu beheben. Twinribozyme entstehen durch Duplikation zweier katalytischer Motive und wurden als erstes unter Verwendung des Hairpinribozymmotivs entwickelt. Da nicht alle Substratsequenzen vom Hairpinribozym toleriert werden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung eines Hammerheadribozyms zur Entwicklung eines Twinribozyms überprüft, um die Palette derartiger Werkzeuge zu erweitern. Gezeigt werden konnte, dass der Austausch einer Sequenz zwar katalysiert wird, die geringe Produktausbeute von nur 3% eine gentherapeutische Anwendung zunächst noch in Frage stellt. Hier sollten strukturelle Optimierungen des Systems zu einem besseren Ergebnis führen. Insgesamt konnte demonstriert werden, dass die Aktivität von RNA-Enzymen gezielt durch die Einführung von charakteristischen Strukturelementen manipuliert und kontrolliert werden kann und somit Systeme mit hohem Anwendungspotential geschaffen wurden.
Diese Arbeit beschreibt den Aufbau eines Assays zur Selektion eines Ribozyms, welches die Desaminierung von Adenosin zu Inosin katalysiert. Diese Reaktion spielt im Organismus, wo sie proteinkatalysiert abläuft, eine wichtige Rolle (Nukleotidmetabolismus, RNA-Editing). Zusätzlich besitzt ein solches Ribozym das Potenzial zur gezielten Veränderung von RNA-Sequenzen. Das Projekt hat somit evolutionstheoretische (RNA-Welt-Hypothese) als auch gentherapeutische Relevanz. Zentraler Punkt des vorgestellten Assays ist die Markierung einer Mischung verschiedener RNA-Sequenzen (= Bibliothek) mit dem Substrat Adenosin. Dieses trägt an der exozyklischen Aminogruppe eine Biotinfunktion. Wird diese Bibliothek auf einer festen Phase über die Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung immobilisiert und den Selektionsbedingungen unterworfen, werden Spezies mit der gewünschten Aktivität in Lösung entlassen. Diese können eluiert und über RT-PCR angereichert werden. Die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek geschieht am 5’-Ende jeder Sequenz durch Transkriptionspriming aus einer chemisch synthetisierten DNA-Bibliothek in Gegenwart der vier NTPs und eines Guanosin-5’-monophosphatderivats, dem „Initiator“. Letzteres ist über die 5’-Phosphatfunktion mit dem biotinylierten Substrat Adenosin verknüpft. Das Initiatormolekül wurde in zwei Strategien synthetisiert. Die erste Strategie fand an der festen Phase unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens statt und lieferte Initiator in nanomolarem Maßstab. Die zweite Strategie bestand aus einer 17-stufigen Synthese in Lösung und ergab fast identisches Initiatormolekül in µmolarem Maßstab. Beide Initiatormoleküle wurden erfolgreich zur Funktionalisierung einer RNA eingesetzt. Zur qualitativen Dokumentation des Einbaus des Initiators wurde eine auf Chemilumineszenzdetektion basierende Methode entwickelt. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf eine Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin inkubiert, welches spezifisch den Biotinrest bindet. Durch Zugabe eines möglichen Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemilumineszenzsignal erzeugt, was über einen Röntgenfilm dokumentiert wurde. Dieser qualitative Nachweis wurde erweitert, um die Einbaueffizienz zu quantifizieren. Dazu wurde eine RNA, welche zu 100% mit dem Initiatormolekül markiert war, mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens hergestellt. Diese als Standard fungierende RNA wurde in definierter Menge zusammen mit definierten Mengen an statistisch funktionalisierten Primingprodukt geblottet. Die Quantifizierung der Chemilumineszenz der Proben erfolgte mit Hilfe eines Photosystems und durch Integration der Signalintensitäten. Dadurch konnte der Anteil der in den durchgeführten Primingreaktionen mit Initiator markierten RNA zu maximal 3 % bestimmt werden. Obwohl eine Erhöhung dieses Wertes z.B. durch Optimierung der Initiatorstruktur wünschenswert ist, ist damit die Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek in einer für die Selektion ausreichenden Menge durchaus möglich. Zur Evaluation des Assays wurde der Selektionsschritt simuliert, in welchem ein über das Initiatormolekül festphasengebundenes Ribozym spezifisch zur Selbstspaltung aktiviert wird. Zu diesem Zweck wurden ein Hammerheadriboyzm, ein Hairpinribozym sowie ein DNAzym untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Spaltaktivität aller drei Systeme durch Funktionalisierung mit dem Initiator in Lösung fast vollständig inhibiert wird, unmarkierte Spezies unter identischen Bedingungen jedoch uneingeschränkte Spaltaktivität zeigen. Die beobachtete Inhibierung beruht auf einem intramolekularen Effekt, der möglicherweise zu einer Verschiebung des Konformerengleichgewichts der Testsysteme hin zu spaltinaktiven Konformeren führt. Zusätzlich wurde die Spaltaktivität des mit Initiator markierten und an einer Festphase immobilisierten Hairpinribozyms untersucht. Auch hier war eine stark verringerte Spaltaktivität zu beobachten, welche jedoch in unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Festphase und Ribozym begründet liegen könnten. Die verwendeten Systeme eignen sich offenbar nicht zur Evaluierung des Assays, was jedoch die Möglichkeit offen lässt, dass im geplanten Assay selektierte RNA-Sequenzen die Funktionalisierung mit Initiator tolerieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben den Schluss, dass die gewählte Strategie zur Selektion der Adenosindesaminase einige Punkte beinhaltet, welche nach Möglichkeit optimiert werden müssen, um eine effizientere Selektion durchführen zu können. Prinzipiell ist die Vorraussetzung für die Selektion der Adenosindesaminase durch die beschriebene Methode jedoch geschaffen und kann basierend auf den vorgestellten Ergebnissen in zukünftigen Studien durchgeführt werden.
Twinribozyme vermitteln den Austausch eines internen Teilfragments gegen ein extern hinzugefügtes Reparaturoligonukleotid abweichender Sequenz innerhalb einer RNA Sequenz durch ortsspezifische Katalyse zweier Spalt- und Ligationsereignisse. Eine twinribozymvermittelte RNA Sequenzmanipulation kann deshalb zur spezifischen Reparatur genetischer Dispositionen auf mRNA-Ebene verwendet werden. Das Potential von Twinribozymen zur Reparatur kurzer Deletionsmutationen wurde bereits an Modellsystemen erfolgreich demonstriert. Zur Erweiterung der Twinribozym-Strategie hinsichtlich therapeutischer Applikationen wurde ein Twinribozym durch rationales Design mit kombinierter Mutagenese entwickelt, welches die Reparatur einer in frame Deletion eines UCU343-345 Codons innerhalb der onkogenen CTNNB1 mRNA Zielsequenz vermittelt. Mehr als 23% der mutierten CTNNB1 mRNA Zielsequenz konnten in die entsprechende Wildtyp-Sequenz in vitro überführt werden. Eine Twinribozym-vermittelte Reparatur der β-Catenin kodierenden CTNNB1-mRNA könnte deshalb eine Wnt-Liganden abhängige Regulation der Proliferation, Mobilität und Differenzierung von Zellen wiederherstellen.
Ribozymes for Aminoacylation
(2012)
Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are at the heart of modern translation, catalyzing the accurate biosynthesis of aminoacyl-tRNAs. According to the RNA world hypothesis, the early translation system should have aminoacylation ribozymes for RNA aminoacylation. For this, an aaRS ribozyme system, consisting of the KK13 ribozyme and the C3a ribozyme was successfully designed, which can perform both amino acid activation and aminoacyl transfer reaction. Generation of such aminoacylation ribozyme system would fill up the gap between the RNA world and the modern biological world. In addition, two types of diversified aminoacylation ribozymes, symmetrical ribozymes and self-assembling ribozymes were successfully developed, which may have great meaning in the origin of life.
Das Hairpin-Ribozym-basierte System CRZ-2 wurde verwendet, um Selbst-Prozessierungsprodukte nach Ribozym-Reaktion zu untersuchen. Inter- und intramolekulare Ribozym-Reaktionen sollten mit CRZ-2 und dem entsprechenden linearen 83mer (l-83mer) durchgeführt und Oligomere und zyklisierte RNAs nachgewiesen werden. Über die Bildung der intermediären Spaltprodukte und des finalen Spaltproduktes konnte der Ablauf der Spalt-Kaskade komplett gezeigt werden. Dies war insbesondere durch vergleichende Verwendung von Test-Systemen im denaturierenden Polyacrylamid-Gel möglich, da eines der Systeme eine eindeutige Separation der Produkte im Gel zulässt. Weiter konnten die zwei erwarteten Spalt-Produkte (83mer und 92mer) über Sequenzierung ihrer komplementären DNAs nachgewiesen werden. Um zwischen zyklischen und linearen Reaktionsprodukten unterscheiden zu können, wurden folgende Methoden herangezogen: i) 2D-PAGE ii) exonukleolytischer Abbau von RNA in Lösung und im Gel, iii) Vergleich des Laufverhaltens eines inaktiven RNA-Monomers mit dem Reaktionsgemisch des l-83mer nach Ligationsreaktion, iv) AFM und v) Ferguson-Plot. Es zeigte sich, dass das CRZ-2 nach Ribozym-Reaktion ausschließlich lineare Produkte und Oligomere bis zum Trimer hervorbringt, während das l-83mer nach Ligationsreaktion auch einen Ring, das zyklische 83mer, hervorbringt. Das Wissen um die Art der Reaktionsprodukte von CRZ-2 und dem l-83mer ermöglichten es, diese beiden RNAs als Referenz-Systeme zu benutzen, um Hairpin-Ribozym-basierte Varianten zu untersuchen. Die bioinformatische Entwicklung neuer Varianten erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Ivo Hofacker (Universität Wien). Dabei wurde ein wahrscheinlichkeitsbasierter Entwurf (probability based design, kurz: PBD) für RNA-Sekundärstrukturen mittels Programm Switch.pl aus dem Vienna RNA package 2.0 verwendet. Die für die katalytische Aktivität der Hairpin-Ribozym-Varianten essentiellen Basenfolgen in den Loops wurden beibehalten. Alle Test-Systeme waren bistabil, denn sie zeigten indirekt, das die für CRZ-2 übliche Spalt-Kaskade durchlaufen wurde, indem das jeweilige zyklische 83mer über 2D-PAGE nachgewiesen wurde. Wie erwartet, waren die Varianten insgesamt aktiver als das Referenzsystem CRZ-2 und sie unterschieden sich, wie bioinformatisch charakterisiert, in ihrem Zirkularisationsverhalten bezüglich der Monomere. Bioinformatisch unerwartet war das Zyklisierungsverhalten der Dimere. Ausschließlich bei Test-System 4 könnten gemäß 2D-PAGE und AFM Analyse unter anderem auch dimere RNA-Ring entstanden sein. PBD4 ist das System, bei welchem die geringste Dimer-Zyklisierungstendenz angenommen wurde. Eine erste Evaluierung der PBD-Methode ergibt somit, dass die Erwartungen für die bioinformatische Charakterisierung des Ablaufs der Spalt-Kaskade bis zur Monomerzyklisierung erfüllt wurden. Für die bioinformatisch nicht vorausgesagten experimentellen Ergebnisse, z.B. bei der Dimerzyklisierung, könnten verstärkt tertiäre Interaktionen relevant sein, die mit der PBD-Methode zur Sekundärstrukturvorhersage nicht berücksichtigt werden. Sequenz-Alignments der Test-Systeme zu CRZ-2 ließen Rückschlüsse auf die Funktionen einzelner Basen zu. Vier Basen traten zusätzlich zu den vorgegebenen Sequenzen auf. Diese befinden sich in einer Helix und könnten kritisch für das Zustandekommen dieser Helix als wichtiges Strukturelement im bistabilen Ribozym sein. Dieser Aspekt könnte in weiterführenden Arbeiten mit rationalem Design z.B. über Einfach- oder Doppelmutation weiter untersucht und die Auswirkungen auf die Selbst-Prozessierungsereignisse analysiert werden. Interessant sind auch die eingeführten Mutationen im superstabilen Tetraloop der Hairpin-Ribozym-Varianten. Im Sequenz-Alignment zeigte sich, dass sich PBD3 und 4 nur um zwei sich im Tetraloop befindlichen Basen unterscheiden (Positionen 1 und 3). Da sich die beiden Systeme bezüglich ihrer Oligomerisierungs- und Zyklisierungstendenz unterscheiden, sind diese beiden Positionen für die Funktionen essentiell.
Das Forschungsgebiet des RNA-Engineerings beschäftigt sich u.a. mit der Entwicklung von Ribozymen mit neuen oder verbesserten Eigenschaften. Es umfasst nicht nur den Entwurf neuer Ribozyme mittels in-vitro-Selektion oder rationalem Design, sondern auch die Validierung der entworfenen Systeme mit Hilfe von Aktivitätstests oder strukturellen Untersuchungen. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Methoden des RNA-Engineerings verschiedene Hairpinribozymvarianten generiert werden, die eine ortsspezifische RNA-Sequenzveränderung innerhalb geeigneter RNA-Substrate erlauben. Dabei war sowohl die potenzielle Anwendung dieser Ribozyme in der molekularen Medizin als auch deren Rolle als RNA-Rekombinasen in einer möglichen RNA-Welt von Interesse. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag hierbei in der Entwicklung eines Reportersystems, welches den direkten Nachweis einer twinribozymvermittelten Reparaturreaktion in Zellen erlaubt. Das Reportersystem basiert auf der Reparatur einer Vierbasendeletion innerhalb der EGFP-mRNA. Durch rationales Design wurde ein Twinribozym generiert, das die Reparatur mit einer Reparaturproduktausbeute von 32 % katalysiert. Das erfolgreich entwickelte Reportersystem steht somit für Experimente unter Zellkulturbedingungen zur Verfügung und eröffnet außerdem den Weg, die Twinribozymstrategie in der Zelle zu adaptieren und zu optimieren, um sie später intrazellulär für gewünschte Ziel-RNAs anwenden zu können. Ausgehend von der den Twinribozymen eigenen Aktivität zur Katalyse eines RNA-Fragmentaustauschs wurde darüber hinaus im Kontext der RNA-Welt-Hypothese ein Hairpinribozym entwickelt, welches durch Rekombination zweier nicht-funktioneller RNA-Substrate ein funktionelles RNA-Molekül generiert. Hierbei führte die hairpinribozymvermittelte Spaltung zweier geeigneter Substrate, Rekombination der Spaltfragmente und Ligation der neuangeordneten Fragmente mit einer Rekombinationsproduktausbeute von 76% zur Generierung eines funktionsfähigen Hammerheadribozyms.