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Bei dem gramnegativen Pathogen Burkholderia pseudomallei, auch bekannt als Erreger der ‘Melioidose’, handelt es sich um einen saprophytischen Bodenbewohner, der in den tropischen und subtropischen Regionen Südostasiens und Nordaustraliens endemisch verbreitet ist. Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist B. pseudomallei neben einer Vielzahl nicht phagozytierender Zellen auch in professionellen Phagozyten zur Replikation fähig. In Makrophagen sind cytosolische NOD-like Rezeptoren (NLR) als Bestandteil der angeborenen Immunabwehr maßgeblich an der Erkennung intrazellulärer Gefahrensignale beteiligt. Bei entsprechender Signalgebung wird durch Assemblierung eines als ‘Inflammasom’ bezeichneten Multiproteinkomplexes die Rekrutierung und nachfolgende Autoaktivierung von Caspase-1 bewirkt. Nach Infektion mit B. pseudomallei geht die Aktivierung von Caspase-1 in Verbindung mit dem NOD-like Rezeptor Nlrp3 mit der Prozessierung und Sekretion der Cytokine IL-1β und IL-18 einher, wohingegen der Sensor Nlrc4 in erster Linie für die Induktion einer inflammatorischen Form des Zelltodes namens ‘Pyroptose’ verantwortlich ist. Da der Knockout von Caspase-1 bei muriner Melioidose einen signifikanten Anstieg der Mortalitätsrate nach sich zieht, sollten in der vorliegenden Arbeit Caspase-1-vermittelte Effektormechanismen gegenüber B. pseudomallei näher untersucht werden. Infolge der Infektion muriner C57BL/6 Makrophagen mit B. pseudomallei wurde bereits 60 Minuten post infectionem eine Caspase-1 und -9-abhängige Prozessierung von Caspase-7 sowie des DNA-Reparaturenzyms PARP deutlich. Als verantwortlicher Sensor ist hierbei der NOD-like Rezeptor Nlrc4 identifiziert worden. Obwohl in Caspase-1/11 knockout Makrophagen während der Frühphase der Infektion keine Spaltprodukte der drei genannten Caspasen vertreten waren, konnte zu späteren Zeitpunkten eine massive Aktivierung der apoptotischen Caspasen-8, -9, -3 und -7 sowie der Stress-induzierten MAP-Kinasen JNK und p38 beobachtet werden. Vergleichende Proteomanalysen B. pseudomallei-infizierter C57BL/6 Makrophagen ließen ebenfalls eine verstärkte Expression proapoptotischer und proinflammatorischer Signalmoleküle in Caspasen-1/11-defizienten Makrophagen erkennen. Im Gegensatz dazu wies der Knockout von Caspase-7 nach Infektion mit B. pseudomallei weder in vitro noch in vivo einen charakteristischen Phänotyp auf. Im Vergleich zu B. pseudomallei konnte durch die Infektion mit der avirulenten Spezies Burkholderia thailandensis erst bei verhältnismäßig hohen Infektionsdosen eine sichtbare Prozessierung der Caspasen-1, -9 und -7 in C57BL/6 Makrophagen erreicht werden. Darüber hinaus wurde trotz einem mit B. pseudomallei vergleichbaren Replikationsvermögen, ein geringeres Maß an Pyroptose in B. thailandensis - infizierten Makrophagen nachgewiesen. Zur Identifizierung, welche bakteriellen Komponenten von B. pseudomallei für die Aktivierung von Caspase-1 verantwortlich sind, wurden zwei Deletionsmutanten der Bsa T3SS-Proteine BopE und BsaK hergestellt. Dem Bsa T3SS konnte in vorausgehenden Studien eine wesentliche Funktion für die Virulenz von B. pseudomallei im Tiermodell zugeschrieben werden und dessen Bestandteile weisen Homologien zu den Inv/Mxi-Spa-Sekretionssystemen von S. typhimurium und S. flexneri auf. Die Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 sowie die Spaltung von PARP wurde durch die Infektion muriner Makrophagen mit der Mutante des ‘inner rod proteins’ BsaK vollständig aufgehoben, wohingegen die Mutagenese des Effektors BopE keinen Einfluss ausübte. Neben einer verminderten Freisetzung von LDH und IL-1β konnte dabei auch ein Anstieg der intrazellulären Keimzahl in ΔBsaK-infizierten Makrophagen verzeichnet werden. Demgegenüber führte die Verwendung einer Flagellin-Transposonmutante lediglich zu einer Reduktion der B. pseudomallei-induzierten Prozessierung der Caspase-1, -9 und -7 sowie der Spaltung von PARP. Mittels Überexpressionsstudien in HEK-293 Zellen konnte ferner die potentielle Fähigkeit des Bsa T3SS-Effektors BopE zur Aktivierung von Caspase-1 in Abhängigkeit von der Funktionalität der BopE-eigenen GEF-Domäne demonstriert werden. In verschiedenen in vivo Experimenten wurde gezeigt, dass ΔBsaK-infizierte BALB/c Mäuse im Vergleich zum Wildtyp und in Verbindung mit geringen Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz durch eine signifikant verminderte Mortalitätsrate sowie eine Reduktion proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet sind. Insgesamt betrachtet zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass BsaK, als strukturelle Komponente des Bsa Typ-III-Sekretionsapparates, in murinen Makrophagen sowohl für die B. pseudomallei-induzierte Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 durch das Nlrc4-Inflammasom als auch den nachfolgenden pyroptotischen Zelltod verantwortlich ist. Durch die Attenuierung der BsaK-Mutante im Mausmodell wird gleichzeitig die Bedeutung von Typ-III-Sekretionssystemen für die Virulenz pathogener Bakterien unterstrichen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung eines neu entdeckten Renintranskriptes für das Überleben kardialer Zellen nach Ischämie-relevanten Bedingungen wie der Glukosedepletion, Anoxie sowie Blockierung der Atmungskette mit Rotenon untersucht. Dabei zeigte sich durch Überexpression des zytosolischen Renins eine verbesserte Toleranz der H9c2-Zellen gegenüber den Stressfaktoren, da deren Überexpression sich protektiv auf den ATP-Gehalt und den Zelltod auswirkte. Seit der nach vorangegangenem Myokardinfarkt beobachteten selektiven Hochregulierung eines 1999 neuentdeckten alternativen Renintranskriptes, des Exon(1A-9)Renin-Transkriptes, vermutet man seine Funktion im Rahmen ischämischer Prozesse am Herzen. Das Exon(1A-9)Renin stellt dabei ein verkürztes Transkript dar, das ein nicht-sekretorisches, zytosolisches Protein kodiert. Weitergehende Untersuchungen in vitro weisen auf eine kardioprotektive Funktion des alternativen Renintranskriptes hin. Ferner belegen ex-vivo-Untersuchungen eine signifikant reduzierte Infarktgröße von Herzen transgener Exon(2 9)Renin-überexprimierten Ratten im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die zentrale Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass die Hochregulation des alternativen Exon(1A 9)Renin-Transkriptes mit einer protektiven Funktion des entstehenden Renins assoziiert ist. So konnte zunächst molekularbiologisch eine 5 fach zur Basalbedingung erhöhte Expression des Exon(1A 9)Renin-Transkriptes unter Ischämie-relevanten Faktoren wie der 24-stündigen Hypoxie und Glukosedepletion nachgewiesen werden. Des Weiteren erwiesen die H9c2-Zellen durch Überexpression des zytosolischen Renins eine verbesserte Toleranz gegenüber Ischämie-relevanten Bedingungen, denn es zeigte sich eine Aufrechterhaltung des ATP-Gehaltes sowie eine Reduktion des Zellunterganges unter den Stressbedingungen. Dabei konnte vor allem der nekrotische Zelltod verhindert werden, der bekanntlich mit einer Entzündungsreaktion einhergeht und erhebliche Konsequenzen für das folgende Remodelling des Gewebes aufweist. Ferner konnte eine schützende Funktion des zytosolischen Renins im Rahmen des oxidativen Bursts detektiert werden, da ein Anstieg der zytosolisch lokalisierten ROS, der unter Glukosedepletion und Anoxie nachweisbar war, durch die Überexpression des Renins verhindert werden konnte. Die Arbeit weist nach, dass das zytosolische Renin im Gegensatz zum sekretorischen Renin bei Glukosemangel, Hypoxie und oxidativen Stress weiterreichende protektive Wirkungen hat, die möglicherweise zukünftig in der Therapie des Herzinfarktes und Herzinsuffienz ausgenutzt werden könnten.
Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen, überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt. Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest (Sytox-Assay) und mittels Immunfluoreszenzfärbung analysiert. Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen: (1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft. Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose, Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden. (2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass der Zelltod durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern. Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden basierte.