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Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Reaktion primärer dermaler Fibroblasten, die für die Versuche aus SKH1-Mäusen isoliert wurden, auf eine Kaltplasma-Behandlung mittels des Argon-betriebenen Plasmajets „kINPen MED“ hinsichtlich ihrer Reaktion auf oxidativen Stress, ihrer interzellulären Kommunikation über Gap Junctions (GJ) und der Organisation ihres Aktin-Zytoskeletts untersucht werden. Die Plasmabehandlung erfolgte dabei stets indirekt, also durch die Behandlung von Zellkulturmedium, in dem die Zellen anschließend inkubiert wurden. Es ergab sich für die angewendeten Versuchsmodalitäten keine signifikante Induktion von Apoptose durch die indirekte Plasmabehandlung von 20 s bis 180 s, wohingegen die metabolische Aktivität der Zellen bei längeren Behandlungszeiten bis 72 h nach der Plasmabehandlung signifikant reduziert wurde. Dies zeigt die von der Behandlungszeit abhängige Beanspruchung der Fibroblasten durch die Plasmabehandlung und gleichzeitig ihre Kompensationsfähigkeit, die die Zellen auch bei 180 s Behandlungszeit vor dem vermehrten Auftreten von Apoptose schützen konnte.
Nach einer Plasmabehandlung konnte die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs nachgewiesen werden, der als zellulärer Schutzmechanismus gegen oxidativen Stress fungiert. So wurde sowohl in den Fibroblasten als auch im Primärgewebe eine Translozierung des Nrf2 in den Zellkern gezeigt. Hierbei wurde auch die Aktivierung des Redox-Sensors Keap1 nachgewiesen, der unter physiologischen Bedingungen Nrf2 bindet und dessen Abbau im Proteasom vermittelt.
Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag in der Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation, die vor allem über funktionale GJ-Kanäle erfolgt. Dabei wurde in einem SLDT Assay die Zunahme funktionaler GJ-Kanäle in plasmabehandelten Fibroblasten festgestellt. Außerdem ergab sich eine Tendenz zum Anstieg der Gen- und Proteinexpression von Connexin 43, was unter physiologischen Bedingungen in dermalen Fibroblasten während der Frühphase der Wundheilung beschrieben wurde.
Die Plasmabehandlungen induzierten außerdem strukturelle Veränderungen am Aktin-Zytoskelett in den dermalen Fibroblasten. Solche dynamischen Veränderungen des Zytoskeletts sind während der Wundheilung ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da sie die interzelluläre Adhäsion und damit die Migration von Fibroblasten ermöglichen.
Die hier beobachteten Veränderungen zeigten sich vor allem bei kürzeren Behandlungs- und Inkubationszeiten, während gleichzeitig keine signifikante Zunahme apoptotischer Zellen festgestellt wurde. Dies legt nahe, dass durch kurze Plasmabehandlungszeiten in primären Fibroblasten ein Hormesis-Effekt induziert wird, also dass die zeitlich begrenzte Aktivierung zellulärer Schutzmechanismen als Reaktion auf den Stress einer Plasmabehandlung (Radikalbildung, UV-Strahlung) günstige, die Wundheilung fördernde Effekte bewirkt.
On the aqueous phase chemistry of atmospheric-pressure plasma jets for biomedical applications
(2021)
Cold atmospheric-pressure plasmas are candidate biomedical tools proposed for various applications, such as biological decontamination, cancer regression, and promotion of wound healing. Plasmas, which are in the fourth state of matter, can be generated using inert gases (e.g., argon, helium, ambient air) and different source concepts. Together with the applied parameters, the source design defines the chemical-physical characteristics of the resulting plasma, leading in turn to variable biochemical effects on biological matter. The medical effectiveness of cold plasmas has been proven in vitro and in vivo, also in clinical trials for wound healing in patients using two certified plasmas sources, the kINPen MED and the PlasmaDerm. However, molecular mechanisms leading to those effects are unclear. In the same way, it must be studied if the modulation of plasma properties could improve the specificity of biological effects. These findings are needed to define the concept of plasma dose to be optimized in targeting peculiar pathologic conditions. The present thesis consisting of five peer-reviewed publications has investigated these aspects of plasma research.
In the gaseous phase of cold plasmas, various components with biological activity are produced, such as radiation (e.g., vacuum UV, UV) and reactive species (e.g., •O, 1O2, •OH, •NO, •NO2, O3). As most gaseous species are short-lived, liquid compartments surrounding cells and molecular structures could mediate their transformation and/or the production of other aqueous species. For this reason, plasma-induced aqueous chemistry has been mainly investigated in this thesis. The reaction pathways of reactive oxygen and nitrogen species in liquid were analyzed by monitoring the oxidative modifications induced on tyrosine and cysteine, which are biological structures essential in cellular protein functioning. Liquid chromatography and mass spectrometry-based strategies have been elaborated to elucidate structural changes and characterize the oxidative pattern occurring on the tracers after treatment with plasmas.
As a first result, it could be shown that the oxidative pattern induced on tyrosine or cysteine variated qualitatively and quantitatively with the applied conditions, reflecting the action of differently produced/deposited species in liquid. Biologically relevant structures were identified and in part quantified (e.g., cystine, sulfonic acid, sulfinic acid, S-sulfonate, S-nitrosocysteine, nitrotyrosine, nitrosotyrosine). By using isotopically labeled oxygen or nitrogen in the gas plasma, or labeled oxygen in the target liquid, the incorporation of gaseous or aqueous species in the tracer’s structures was monitored via mass spectrometry. With this strategy, the reaction mechanisms involving gaseous oxygen and nitrogen species at the liquid interface were clarified, as well as the de novo production of reactive species in liquid. Short-lived gaseous oxygen species such as atomic and singlet oxygen (•O, 1O2), predominantly formed in conditions with oxygen in the plasma gas, were able to modify the cysteine structures in highly oxidized derivatives, such as cysteine sulfonic acid. Due to their half-life, however, their activity occurred mainly at the interface. Vacuum UV radiation and •O also led to the formation in liquid of hydroxyl radicals (•OH) and hydrogen peroxide (H2O2), due to water photolysis and homolysis. Water-derived species were responsible for the formation of reversible modifications, such as cysteine S-sulfonate, cystine, and cystine sulfoxides. Nitrosative modifications (e.g., S-nitrosocysteine, nitrosotyrosine, nitrotyrosine) could be observed only in conditions with both nitrogen and oxygen in the plasma gas, and further optimization occurred in presence of water molecules in the gas. In this case, the formation and action of peroxynitrite (ONOO-) in generating nitrotyrosine was proven by using a scavenger molecule for ONOO-.
Finally, the cysteine product pattern was applied as a tool to characterize and compare the overall chemistry generated in liquid by different plasma sources and applied parameters. These findings aim to support and contribute to the definition of plasma dose for plasma medicine, through the standardization, control, tuning, and optimization of plasma parameters and plasma liquid chemistry. These results may be applied in the future to improve the specificity and selectivity of the biological effects generated by the described atmospheric-pressure plasma jets.
Das Porphyrin-Derivat 5,10,15,20-tetra(m-Hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC, Temoporfin), in Europa zugelassen unter dem Handelsnamen Foscan®, stellt einen der vielversprechendsten Photosensibilisatoren (PS) in der Photodynamischen Therapie (PDT) dar. Während einige Publikationen über die Aktivität von Temoporfin in einzelnen Krebszelllinien in der Fachliteratur erschienen sind, fehlen systematische Studien über die Temoporfin-basierte PDT, die mithilfe eines Sets aus mehreren Krebszelllinien durchgeführt wurden. In der vorliegenden Dissertation wurden fünf humane, adhärente Krebszelllinien aus dem Kopf-Hals-Bereich und weiteren PDT-relevanten Geweben eingesetzt, um die Auslösung von oxidativem Stress und die zugrundeliegenden Zelltodmechanismen der Temoporfin-basierten PDT in vitro zu untersuchen. Dafür wurde zunächst die Viabilität der Zellen nach Temoporfin-Behandlung (0,001–5,0 µmol/L) und Bestrahlung mit einer LED-basierter Apparatur (0,2–5,5 J/cm2) im MTT-Test ermittelt und Konzentrations-Wirkungskurven zur Bestimmung von IC50- und IC90-Werten aufgenommen. Zur Untersuchung und zum Vergleich der Zelltodmechanismen in den Zelllinien wurden diese anschließend mit äquitoxischen Konzentrationen des Temoporfins behandelt und mit vorrangig mit einer Lichtdosis von 1,8 J/cm2 (vereinzelt auch 3,5 oder 7,0 J/cm2) bestrahlt. Die Analytik der Zellen erfolgte direkt, 6, 24, oder 48 h nach der Bestrahlung. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation bestätigen die Auslösung von oxidativem Stress nach der Temoporfin-PDT durch die Detektion eines Totalverlustes des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) sowie einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Eine Lipidperoxidation (LPO) sowie die Beteiligung einer Nekrose am Zelltod spielen hingegen in den meisten Zelllinien eine untergeordnete Rolle. Vor allem die ausbleibende Nekrose nach einer hochdosierten PDT mit Temoporfin steht dabei in Kontrast zu den Resultaten vieler publizierter Studien. Als vorherrschender Zelltodmechanismus wurde nach Temoporfin-vermittelter PDT stattdessen über eine Phosphatidylserin-Externalisierung, eine Caspase 3-Aktivierung und eine PARP-Spaltung eine Auslösung von Apoptose identifiziert. Zudem kann parallel zur Apoptose eine Autophagie ausgelöst werden bzw. kann diese zunächst sogar dominieren, bevor sie zu einer Autophagie-assoziierten Apoptose führt. Als Anzeichen der späten Phase einer Apoptose ist zudem früher oder später eine DNA-Fragmentierung nachweisbar, und der Zelltod wird in einigen Fällen von einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase begleitet.
Neben der Auswertung der Zelltodmechanismen wurde ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation auf den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen, identisch behandelten Zelllinien gelegt. Obwohl die Zellen unter äquitoxischen Bedingungen behandelt wurden und die PDT über eine vergleichsweise unspezifische Bildung von ROS wirkt, wurden sehr heterogene Resultate in den unterschiedlichen Zelllinien erhalten. Die vorliegende Untersuchung zeigt deshalb außerdem, dass generelle Schlussfolgerungen nach einer PDT eine Analytik in mehreren unterschiedlichen Zelllinien benötigt, um verlässlich zu sein. Dieser Umstand ist in der Vergangenheit in In-vitro-Studien zur PDT jedoch viel zu häufig ignoriert worden.
Die Pt(II)-Komplexe Carboplatin (CBDCA), Cisplatin (CDDP) und Oxaliplatin (1-OHP) werden als Zytostatika in einer Vielzahl chemotherapeutischer Verfahren eingesetzt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Pt(II)-Komplexe CBDCA, CDDP, oder 1-OHP in fünf humanen, adhärenten Krebszelllinien mit einer Temoporfin-basierten PDT kombiniert. Die Zellviabilität wurde im MTT-Test bestimmt und synergistische Effekte der Kombination mithilfe der Berechnung von Combination Indices (CI) ermittelt. Synergismus wurde dabei nach einigen Kombinationen, z.B. mit 1-OHP in drei der fünf getesteten Zelllinien, beobachtet, aber auch antagonistische Effekte wurden für einige Kombinationen in bestimmten Zelllinien detektiert. Im Fall einer Synergie wurden erhöhte ROS-Level nachgewiesen, jedoch wurde die Auslösung von Apoptose im Vergleich zu einer Behandlung mit den Pt(II)-Komplexen bzw. der PDT allein dadurch nicht notwendigerweise verstärkt. Eine Analyse der Zellzyklusverteilung ergab, dass nach kombinierter Behandlung sub-G1-Populationen mit fragmentierter DNA, die für eine späte Phase der Apoptose charakteristisch sind, gebildet werden, und zudem S-Phase und G2/M-Arreste vorliegen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Behandlung mit einer Temoporfin-basierten PDT das Potential besitzt, einige Typen von Tumorzellen gegenüber Pt(II)-Komplexen, vor allem 1-OHP, zu sensibilisieren und so besser für die Tumortherapie zugänglich zu machen. Das Erreichen synergistischer Effekte hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab und es können sogar antagonistische Effekte auftreten.
Die Glutathionperoxidase 1 (GPX1) kann bei einer Überexpression in Tumorzellen zu einer Inhibition von Apoptose führen, was zum Überleben der Tumorzellen beiträgt. Zudem kann eine erhöhte GPX-Aktivität zu einer Resistenzentwicklung gegenüber oxidativen Schäden beitragen, was den Tumor z.B. vor Chemotherapeutika schützen kann. Potential in der Tumortherapie besitzen deshalb GPX-Inhibitoren, die einer Überexpression der GPX1 durch Verringerung der Gesamtaktivität entgegen¬wirken. In Kombination mit Chemotherapeutika führten GPX-Inhibitoren so bereits zu einer Re-Sensibilisierung Zytostatika-resistenter Zelllinien. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Kombination der GPX-Inhibitoren 9-Chlor-6-ethyl-6H-[1,2,3,4,5]pentathiepino[6,7-b]indol (CEPI), ein kürzlich synthetisiertes trizyklisches Pentathiepin, oder Mercaptobernsteinsäure (MBS), der klassische Inhibitor der GPX in vielen veröffentlichten Studien, mit einer Temoporfin-PDT eingesetzt, um durch die Blockierung eines effektiven Abbauweges für H2O2 eine vermehrte Akkumulation von ROS zu erzeugen und so den phototoxischen Effekt des Temoporfins zu verstärken. Synergismus wurde dabei nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren, jedoch nicht in allen fünf Zelllinien, beobachtet. Auf der anderen Seite wurden mit beiden Inhibitoren auch antagonistische Effekte in bestimmten Zelllinien detektiert. Die ROS-Level konnten nach kombinierter Behandlung mit CEPI, nicht jedoch mit MBS, in einigen Zelllinien gesteigert werden, was darauf hindeutet, dass die Inhibition der GPX durch CEPI tatsächlich zu einer zusätzlichen Akkumulation von ROS führt. Beide Inhibitoren erzeugen allein keine Steigerung der ROS-Spiegel. Überraschenderweise wurde eine vermehrte Apoptoseauslösung anschließend jedoch nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien erreicht, was darauf schließen lässt, dass weitere Faktoren die Induktion von Apoptose fördern, z.B. eine Autophagie-assoziierter Zelltodmechanismus oder eine Ferroptose, die durch LPO nach Verlust der GPX4-Aktivität eingeleitet wird. Die erhöhte Apoptoseauslösung wurde zudem in der Zellzyklusanalyse bestätigt, in der nach kombinierter Behandlung mit beiden GPX1-Inhibitoren erhöhte Anteile apoptotischer sub-G1-Frak¬tionen mit fragmentierter DNA nachweisbar waren. Zudem wurde die DNA-Fragmentierung nach Kombination mit MBS von einem gesteigerten G2/M-Arrest begleitet.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Kombination von Inhibitoren der GPX mit einer Temoporfin-basierten PDT zu synergistischen Effekten führen kann, wodurch eine Verstärkung der Phototoxizität möglich ist. Da die Inhibitoren in nicht-toxischen Konzentrationen eingesetzt werden, werden zudem keine zusätzlichen Nebenwirkungen erwartet. Der Erfolg des kombinierten Ansatzes hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab, aber auch antagonistische Effekte können auftreten.
The term diabetes mellitus comprises a group of metabolic diseases all distinguished by their main characteristic hyperglycaemia. With a steadily increasing prevalence diabetes displays an enormous burden for patients and health systems and is therefore of special interest for research. The development of the two main types of diabetes, type 1 and type 2, is closely linked to the formation of reactive species, especially hydrogen peroxide, inside different compartments of pancreatic beta cells. However, these cells are especially vulnerable towards oxidative stress mediated by hydrogen peroxide due to a low expression of antioxidative enzymes.
The main aims of the present thesis were to analyse the intracellular generation and to enable the site-specific detection of hydrogen peroxide to evaluate its role in the delicate equilibrium between redox signalling and oxidative stress under certain pathophysiological conditions, and moreover to monitor its movement through compartments and subcellular membranes of insulin-producing cells. Additionally, a new methodology for an artificial site-specific generation of hydrogen peroxide inside living cells was developed.
Hintergrund: Die Phototherapie hat sich bereits in den Leitlinien zur Therapie entzündlicher und immunvermittelter dermatologischer Erkrankungen wie Psoriasis oder dem atopischen Ekzem etabliert. Eine neuere Anwendung ist die intranasale Phototherapie mit mUV/VIS (70 % sichtbares Licht, 25 % UVA, 5 % UVB) zur Behandlung der allergischen Rhinitis. Verschiedene Arbeiten zeigen eine Reduktion der Symptome der allergischen Rhinitis durch mUV/VIS. In der vorliegenden Arbeit wurden die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und Veränderungen auf Proteomebene in humanen respiratorische S9-Epithelzellen untersucht. Methoden: Respiratorische S9-Epithelzellen wurden mit mUV/VIS für 4 min bestrahlt und nach 0, 30 und 60 min (Kurzzeitbereich) sowie nach 24, 48 und 72 h (Langzeitbereich) geerntet. Zum Vergleich unterschiedlicher Dosen wurden zusätzlich Zellen für 2 und 6 min bestrahlt und nach 24, 48 und 72 h geerntet. Die Proteine der Proben wurden extrahiert und mittels 2D-DIGE aufgetrennt. Die resultierenden Gel-Bilder wurden mittels Delta2D-Software analysiert, die detektierten Spots ausgestanzt und mit Trypsin proteolytisch verdaut. Anschließend konnten sie mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und dem Datenbankvergleich mit virtuell verdauten Proteinen identifiziert werden. Ergebnisse: Von 1665 detektierten Spots wurden 897 identifiziert und weiter statistisch analysiert. Für die weiteren Analysen wurden nur die im Vergleich zur Kontrolle signifikant veränderten Proteine berücksichtigt (p ≤ 0,05 und Fold Change ≥ 1,5). Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Induktion von oxidativem Stress nach mUV/VIS. Dies konnte dosisabhängig mit der Induktion des Nrf2-Pathways, der Hitzeschockproteine und der Induktion der Thioredoxinreduktase 1 nachgewiesen werden. Proteinschäden und Proteinreparatur konnten anhand der Induktion von Hitzeschockproteinen und der Induktion von Proteinen, die mit der Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Degradation fehlgefalteter Proteine assoziiert sind, gezeigt werden. Dosisabhängig werden direkt und indirekt durch oxidativen Stress DNA-Schäden induziert. Dies bestätigte sich anhand der dosisabhängigen Induktion von DNA-Reparaturmechanismen (NER). Die Induktion der Apoptose bei massiven Schäden wurde mittels Ingenuity Pathway Analyse (IPA) nachgewiesen. Die Induktion der Tumorgenese ist anhand der dosisabhängig induzierten Anzahl der Tumor-assoziierten Proteine und der induzierten Protoonkogene wie CRK oder des Tumorantigens p53 nachweisbar. In IPA zeigt sich eine dosisabhängige Beeinflussung immunologischer/inflammatorischer Prozesse wie der Psoriasis oder des atopischen Ekzems. Im Zeitverlauf kommt es zum Anstieg der Proteine, die mit solchen Erkrankungen assoziiert sind. Es zeigte sich auch eine dosisabhängige Induktion von Proteinen, die mit Mechanismen der Virusfreisetzung aus der Wirtszelle assoziiert sind. Dies könnte einige klinische Berichte über eine Herpes simplex Virusreaktivierung nach einer mUV/VIS-Bestrahlung erklären. Fazit: Eine Beeinflussung immunologisch/inflammatorischer Prozesse konnte bestätigt werden. Somit ist mUV/VIS zur Therapie der allergischen Rhinitis einsetzbar. Nach aktueller Literatur scheint die Rhinophototherapie nicht für die Karzinogenese zu prädisponieren. Aber es fehlen bisher Langzeit-Studien, die dies bestätigen. Aufgrund der genannten Veränderungen sollte eine mUV/VIS-Behandlung nur nach sorgfältiger Nutzen- und Risikoanalyse erfolgen.
Pentathiepine sind siebengliedrige, heterocyclische Polysulfane. Sie gehören damit zur Gruppe organischer Polysulfide und somit zu einer Stoffklasse, die in den letzten Jahren wachsendes Interesse hinsichtlich pharmazeutisch/medizinisch nutzbarer Eigenschaften geweckt hat. Sie besitzen unterschiedliche biologische Wirkungen, die möglicherweise auf die Aktivierung durch Thiole, wie zum Beispiel Glutathion (GSH), zurückzuführen sind. Dazu gehören die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies und die oxidative Fragmentierung von DNA.
Pentathiepine zeigen sich als gelbe, schwer lösliche Feststoffe und sind in sauren Lösungen sehr stabil. In Lösungen, die Basen oder Nukleophile enthielten, nahm der Gehalt an Pentathiepinen jedoch sehr schnell ab. In dieser Arbeit sollte hauptsächlich untersucht werden, inwieweit sich die Stabilität der Pentathiepine auf die biologischen Eigenschaften auswirkt. Neben der Ermittlung der Verteilungskoeffizienten 23 verschiedener Pentathiepine, wurden auch enzymbasierte Assays durchgeführt.
Dazu gehörte die Bestimmung der Reversibilität der Hemmung an boviner Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) sowie der Einfluss unterschiedlicher Inkubationsbedingungen auf die inhibitorische Wirkung. Dabei wurde für das untersuchte Pentathiepin mittels jump dilution keine irreversible Hemmung an boviner GPx-1 gefunden. Eine irreversible Inhibierung konnte jedoch für Mercaptobernsteinsäure gezeigt werden. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Inkubationsbedingungen erlauben die Schlussfolgerung, dass der intakte Pentathiepinring wahrscheinlich nicht an der Hemmung der GPx-1 beteiligt ist, sondern die aus der Reaktion mit GSH gebildeten Abbauprodukte. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass der Pentathiepinring mindestens als „Schwefeltransporter“ benötigt wird. Ein Übertrag des GPx-Assays auf die HPLC konnte als prinzipiell möglich, für die Pentathiepine jedoch als nicht geeignet gezeigt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden sechs Pentathiepine mit vier unterschiedlichen Grundgerüsten hinsichtlich ihrer Stabilität in Gegenwart von GSH untersucht. Dabei gab es hinsichtlich der Reaktivität der Pentathiepine sehr starke Unterschiede. Trotz dieser großen Unterschiede konnten keine Unterschiede hinsichtlich der GPx-Hemmung und der antiproliferativen Eigenschaften beobachtet werden. Auch eine Absenkung der intrazellulären GSH-Konzentration durch Inkubation mit DL-Buthioninsulfoximin in drei humanen Krebszelllinien mit unterschiedlichem Glutathiongehalt ergab keine Unterschiede zwischen den getesteten Substanzen. Sie waren nach Vorinkubation der Zellen durchgehend aktiver.
Aufgrund der vergleichsweise hohen Reaktivität in Gegenwart von GSH sollte ein Pentathiepin in einem proof of concept in Liposomen formuliert werden. Diese Formulierung sollte einerseits das Pentathiepin vor Reaktionen mit Thiolen wie GSH schützen, andererseits die Wasserlöslichkeit erhöhen. Dabei ergab sich, dass die Wasserlöslichkeit der Pentathiepine durch Formulierung in DOPC-Liposomen von unter 3 μM auf über 400 μM erhöht werden konnte. In Hinsicht auf die Stabilität ergab sich eine erhöhte Stabilität des untersuchten Pentathiepins in Anwesenheit von 10 mM GSH um den Faktor 4 in der Zeit bis zum vollständigen Abbau. Hinsichtlich der antiproliferativen Eigenschaften ergab sich keine Abnahme der Wirkung des Pentathiepins durch Formulierung in Liposomen.
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive und Katalase-negative humanspezifische Kommensalen der oberen und unteren Atemwege. Diese Bakterien sind andererseits auch als schwere Krankheitserreger bekannt und verursachen bei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, wie beispielsweise Kindern, Älteren und immungeschwächten Personen sowohl Atemwegs- als auch lebensbedrohliche invasive Erkrankungen wie eine ambulant erworbene Pneumonie, Meningitis und Sepsis. Pneumokokken haben aufgrund ihrer Besiedelung des Respirationstraktes effiziente Mechanismen entwickelt, um in einer sauerstoffreichen Nische überleben zu können. Dabei richten sich die Mechanismen vor allem gegen reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Spezies, ROS), die einerseits als Abwehrfunktion des Wirts (oxidative burst) vom angeborenen Immunsystem und andererseits von den Pneumokokken selbst produziert werden, um als chemische Waffe zur Bekämpfung bakterieller Konkurrenten in ihrem Habitat eingesetzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein hochkonserviertes Zwei-Operon-System, das für die extrazelluläre oxidative Stress-Resistenz in S. pneumoniae verantwortlich ist, identifiziert und auf pathophysiologischer sowie struktureller Ebene charakterisiert. Dieses komplexe System besteht aus zwei integralen Cytochrom C-ähnlichen Membranproteinen (CcdA1 und CcdA2), zwei Thioredoxin-ähnlichen Lipoproteinen (Etrx1 und Etrx2) und einer Methioninsulfoxid-Reduktase AB2 (MsrAB2). Die Etrx-Proteine werden zwar in zwei räumlich voneinander getrennten Operonen kodiert, sind aber funktionell miteinander verbunden. Der Einfluss des Systems auf die Pathogenese der Pneumokokken wurde in Maus-Virulenz-Studien und Untersuchungen der Phagozytose unter Verwendung von isogenen Mutanten gezeigt. Sowohl in den in vivo als auch den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Funktion beider Etrx-Proteine beziehungsweise der Methioninsulfoxid-Reduktase MsrAB2 die Virulenz der Pneumokokken stark reduziert. Hieraus resultierte eine erheblich verringerte Letalität des Wirts, eine beschleunigte bakterielle Aufnahme durch die Makrophagen sowie ein schnelleres Abtöten der Pneumokokken durch eine oxidative Schädigung von Oberflächen-lokalisierten Proteinen mittels Wasserstoffperoxid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Etrx2 die Abwesenheit von Etrx1 und umgekehrt Etrx1 das Defizit von Etrx2 kompensieren kann. Durch Strukturaufklärung der beiden Thioredoxin-ähnlichen Proteine Etrx1 und Etrx2 sowie der Modellierung der beteiligten Komponenten CcdA und MsrAB2 konnte die Rolle jedes einzelnen Proteins dieses Systems (CcdA-Etrx-MsrAB2-System) bei der Reparatur beschädigter Oberflächen-lokalisierter Proteine in einem Modell dargestellt werden. Das postulierte Modell konnte über in vivo und in vitro Untersuchungen des Elektronentransfers innerhalb dieses Systems bestätigt werden. Mit der Bestimmung der Standardredoxpotentiale der rekombinanten Proteine Etrx1, Etrx2 und der Einzeldomänen MsrA2 und MsrB2 konnte in vitro gezeigt werden, dass der Elektronenfluss in Richtung von Etrx1 und Etrx2 zu MsrAB2 erfolgen muss. Die direkte Elektronenübertragung zwischen diesen Proteinen konnte in kinetischen Experimenten gezeigt werden. Die Messungen ergaben, dass Etrx1 bevorzugt mit der MsrA2-Untereinheit interagiert beziehungsweise Etrx2 sowohl mit der MsrA2-Untereinheit als auch mit der MsrB2-Untereinheit in Wechselwirkung treten kann. Der in vivo Redoxzustand von MsrAB2 wurde unter Verwendung der nicht-reduzierenden/reduzierenden „2D-Diagonal“-SDS-PAGE in den isogenen ccdA- und etrx-Mutanten bestimmt. Hierbei konnte ein Unterschied im Redoxzustand von MsrAB2 in den isogenen Einzelmutanten und Doppelmutanten von ccdA und etrx beobachtet werden. Während in den Einzelmutanten der Elektronenfluss innerhalb des CcdA-Etrx-MsrAB2-Systems unverändert war, zeigte sich in den Doppelmutanten ccdA1/ccdA2 und etrx1/etrx2 eine deutliche Beeinträchtigung der Elektronenübertragung auf MsrAB2, welche sich in der Zunahme der oxidierten Form von MsrAB2 deutlich machte. Somit konnte der Elektronenfluss von sowohl von CcdA1 über Etrx1 zu MsrAB2 als auch von CcdA2 über Etrx2 zu MsrAB2 in vivo betätigt werden. In Anbetracht der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das hochkonservierte CcdA-Etrx-MsrAB2-System der extrazellulären oxidativen Stress-Resistenz von S. pneumoniae zur Entwicklung proteinbasierter Pneumokokken-Impfstoffe und zum Angriffspunkt für Behandlungen gegen diese wichtigen humanpathogenen Erreger beitragen.
Aufgrund der Erschöpfung des antioxidativen Abwehrsystems des Organismus entstehen während einer Sepsis schwere Zell- und Organschäden durch die unkontrollierte Freisetzung von ROS. Da bisher wenig über die Regulation und Funktion antioxidativer Enzyme bei mikrobiellen Infektionen bekannt ist, sollten die Stressproteine Peroxiredoxin 6 (Prx 6) und Hämoxygenase-1 (HO-1) sowie die Metabolite des Häm-Abbaus Kohlenstoffmonoxid (CO) und Eisen am Beispiel von Infektionen mit Burkholderia pseudomallei, dem fakultativ intrazellulär lebenden Gram negativen Erreger der Melioidose, charakterisiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Genexpression von Prx 6 als Antwort auf eine Infektion mit B. pseudomallei in Knochenmarkmakrophagen (BMM) und Organen von C57BL/6-Mäusen differenziell reguliert wird. Obwohl weder der Knockout noch die Überexpression von Prx 6 einen Einfluss auf das intrazelluläre Überleben und die zytotoxische Wirkung von B. pseudomallei in BMM ausübte, deuten die Ergebnisse auf eine Beteiligung von Prx 6 bei der Regulation der Zytokinexpression nach der Infektion hin. In einem pulmonalen sowie systemischen Mausmodell konnte belegt werden, dass die Überexpression von Prx 6 einen Überlebensvorteil infizierter Mäuse darstellt, welcher mit reduzierten Keimlasten in Organen sowie Änderungen im Zytokinprofil einherging. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Überexpression von Prx 6 an der Eingrenzung der proinflammatorischen Antwort nach einer Infektion mit B. pseudomallei beteiligt ist und dadurch zum Schutz des Wirtes beitragen kann. Im zweiten Teil der Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Genexpression des ebenfalls häufig im Zusammenhang mit dem Zellschutz beschriebenen Enzyms HO-1 durch eine Infektion mit B. pseudomallei in BMM sowie Lunge, Leber und Milz von C57BL/6-Mäusen induziert wird. Die pharmakologische Induktion der HO-1 resultierte in einer Reduktion der proinflammatorischen Antwort von BMM, wodurch das intrazelluläre Überleben von B. pseudomallei und die damit verbundene Zellschädigung begünstigt wurden. In vivo führte die Induktion der HO-1 zur Einschränkung der Pathogenkontrolle, was sich in einem früheren Versterben, erhöhten Keimlasten am Infektionsherd und den peripheren Organen sowie einer erhöhten Zytokinfreisetzung und Zellschädigung infizierter Tiere äußerte. Auch der Einsatz eines CO-freisetzenden Moleküls schränkte die Abwehr gegenüber B. pseudomallei in BMM und in vivo ein. Im dritten Teil der Arbeit deuten die Ergebnisse zum Einfluss von Eisen, als weiteren Häm-Metaboliten, darauf hin, dass die Erhöhung der Verfügbarkeit des für den Wirt und das Pathogen essentiellen Metalls teilweise für die schädigende Wirkung der HO-1-Induktion bei muriner Melioidose verantwortlich gemacht werden kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Genexpression des Peptidhormons Hepcidin und des Eisenspeicherproteins Ferritin durch die Infektion von BMM mit B. pseudomallei, bei gleichzeitiger Reduktion der Transkription des Eisenexprotproteins Ferroportin, induziert wird. Die exogene Erhöhung der Eisenverfügbarkeit in BMM führte zu einer verstärkten intrazellulären Replikation, während die Depletion dieses Elements das Überleben von B. pseudomallei reduzierte. Infolge einer intranasalen Infektion mit B. pseudomallei war die Genexpression von Ferroportin in der Leber reduziert, was die Einlagerung von Eisen in die Leber erhöhte. Verursacht durch erhöhte Genexpressionsraten von Hepcidin stieg dessen systemische Konzentration, wodurch es zur Etablierung hypoferrämischer Bedingungen im Serum infizierter Mäuse kam. Auch im Mausmodell begünstigte die Erhöhung der Eisenverfügbarkeit das bakterielle Wachstum in Organen, die proinflammatorische Antwort des Wirtes sowie die Hepicidinkonzentration im Serum. Im Gegensatz dazu führte die Chelation von Eisen zur Reduktion der bakteriellen Ausbreitung und einem verbesserten Überleben infizierter Tiere. Die Verfügbarkeit von Eisen begünstigt demnach nicht nur das Überleben von B. pseudomallei in der Umwelt und die Bildung von Biofilmen, sondern ist auch im Rahmen muriner Melioidose ein kritischer Faktor für die Pathogenese.
An Serin139 phosphoryliertes gamma Histon H2A.X (γH2A.X) hat sich über die Jahrzehnte als sensitiver Surrogat-Endpunkt Strahlen-induzierter DNA-Schäden, insbesondere von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) etabliert. Daher wurde γH2A.X in seiner biomedizinischen Anwendung als geeigneter Marker und genereller Indikator direkter DNA-Schäden anderer Agenzien, beispielsweise niedrig konzentrierter primär exogener reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), deren intrazelluläre Effekte weniger direkt auf eine DNA-Oxidation oder das Einfügen von Strangbrüchen abzielen, angesehen. Nicht-thermisches physikalisches Plasma (NTPP), ein teilweise ionisiertes Gas, dessen biochemische Wirkung in vitro hauptsächlich über Freisetzung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) in der flüssigen Phase der Zellumgebung vermittelt wird, setzt lebende Systeme dosisabhängig oxidativem Stress aus und wird therapeutisch in der Wundbehandlung sowie Krebsbehandlung angewendet. Die γH2A.X Quantifizierung wurde häufig zur Beurteilung der Genotoxizität in Plasma-behandelten Zellen verwendet, wobei die NTPP-Exposition in vitro bereits häufig einen γH2A.X Anstieg zeigte, was zu der Hypothese führte, dass ein (oxidativer) DNA-Schaden die direkte Konsequenz Plasma-generierter ROS sei. Darüber hinaus tritt γH2A.X auch während der Apoptose auf, die wiederum selbst mit der NTPP- und ROS-Exposition assoziiert ist. Die vorliegende Arbeit untersuchte die γH2A.X-Induktion in einer Lymphoblasten-Zelllinie bei ROS-Exposition (NTPP, H2O2 oder HOCl) bzw. Behandlung mit UVB-Licht. Durch Verwendung von Antioxidantien wurden sowohl die Zytotoxizität als auch die γH2A.X-Induktion bei allen Arten der ROS-Quellen außer bei UVB-Strahlung aufgehoben. Inhibition der Signalwege für oxidativen Stress (p38-MAPK) und Apoptose (Pan-Caspase) hemmten signifikant die γH2A.X-Induktion bei ROS, jedoch nicht bei UVB-Licht. Letztlich und trotz H2A.X Phosphorylierung führte die UVB-Licht- und eben nicht die NTPP-Exposition zu einer signifikanten Bildung von Mikronuklei (MN), die einen funktionellen Endpunkt genotoxischer DSBs darstellen, sodass trotz der γH2A.X Präsenz kein nachhaltiges mutagenes Potential der medizinischen Plasmabehandlung identifiziert werden konnte. Im Gegensatz zu Strahlen- oder Chemotherapeutika- induziertem und somit DNA-Schaden-assoziiertem γH2A.X zeigen die Daten dieser Arbeit die H2A.X Phosphorylierung weniger als Folge eines ROS-vermittelten primären DNA-Schadens, sondern vielmehr im Licht redox-sensitiver Signalwege der Apoptose, sodass künftige γH2A.X Messungen im medizinischen Bereich, insbesondere in der Plasmamedizin und Redoxbiologie einer sorgfältigen Interpretation bedürfen.
Infektionserkrankungen können im Wirt oxidativen Stress hervorrufen, da dieser zur gezielten Abwehr von Mikroorganismen mithilfe bestimmter Immunzellen erhebliche Mengen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies produziert. Dabei wird v. a. der Aktivität der NADPH-Oxidase, und weniger der induzierbaren NO-Synthase, eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von B. pseudomallei zugeschrieben (Utaisincharoen et al. 2001; Breitbach et al. 2006), was sich wiederum toxisch auf körpereigenes Gewebe auswirken kann. Unter diesen Umständen ist ein gut funktionierendes, antioxidatives Schutzsystem der Zellen von essentieller Bedeutung. In dem Zusammenhang sollte zum einen die antioxidative Funktion des Transkriptionsfaktors Nrf2, und zum anderen die Bedeutung des Glutathion-Redoxsystems bei Infektionen mit dem Gram-negativen, fakultativ intrazellulären Erreger der Melioidose, Burkholderia pseudomallei, geklärt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Infektion von Makrophagen und Hepatomzellen mit B. pseudomallei zur nukleären Translokation von Nrf2 und somit dessen Aktivierung beiträgt. Die infektionsbedingte Induktion von Nrf2 auf Genexpressionsebene wurde in Makrophagen, jedoch nicht in Hepatomzellen, festgestellt. Darüber hinaus wurde die Genexpression des Transkriptionsfaktors in den Organen von infizierten C57BL/6-Mäusen unterschiedlich reguliert. Die Anwesenheit von Nrf2 in Nrf2+/+-Makrophagen bzw. die Aktivierung von Nrf2 durch Stimulatoren verbesserten das intrazelluläre Überleben von B. pseudomallei in den Immunzellen, wohingegen in infizierten Hepatomzellen das Replikationsvermögen des Pathogens durch Nrf2 eingeschränkt wurde. In vitro-Infektionsversuche mit anderen Bakterien wiesen zudem auf einen Erreger-spezifischen Einfluss von Nrf2 hin. Des Weiteren war die proinflammatorische Antwort von Makrophagen durch Nrf2 tendenziell, aber nicht signifikant, erhöht. Im pulmonalen in vivo-Infektionsmodell hatte Nrf2 weder einen Einfluss auf das Wachstum von B. pseudomallei in Leber, Lunge und Milz infizierter Tiere, noch auf die Sekretion inflammatorischer Mediatoren im Serum. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nrf2 weniger durch die Modulation der proinflammatorischen Immunantwort, als vielmehr durch die Regulation ARE-abhängiger, antioxidativer Proteine unterschiedlich auf die mikrobielle Abwehr in vitro und in vivo einwirkt. Im zweiten Teil der Arbeit sollte daher die Rolle von Glutathion (GSH) und den an seiner Biosynthese bzw. Regeneration beteiligten Enzymen, Glutamatcysteinligase (Gcl) sowie Glutathionreduktase (Gsr), bei der Infektion mit B. pseudomallei untersucht werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Genexpression der Gcl und Gsr in Abhängigkeit von der infektionsbedingten Nrf2-Induktion durch B. pseudomallei in Makrophagen erhöht war, wohingegen die Enzyme in den Organen infizierter Mäuse unterschiedlich induziert wurden. Die Inhibition der Gcl führte sowohl in Makrophagen als auch in Hepatomzellen zu einer Reduktion des intrazellulären Gesamt-GSH-Gehaltes, was sich jedoch unterschiedlich auf das Wachstumverhalten von B. pseudomallei in den jeweiligen Zellen auswirkte. Die eingeschränkte GSH-Biosynthese verbesserte zum einen die Pathogenkontrolle in den Makrophagen und im Mausmodell, begünstigte jedoch zum anderen die Replikation des Erregers in Hepatomzellen. Die Hemmung der Regeneration von GSH aus GSSG führte ebenfalls zu zelltypabhängigen, kontroversen Ergebnissen. Einerseits wirkten sich die Inhibition der Gsr und der damit verbundene GSH-Mangel positiv auf das Überleben von B. pseudomallei in Makrophagen aus. Andererseits führte die Gsr-Inhibition in Hepatomzellen zu einem Anstieg des intrazellulären GSH-Gehaltes, was sich in reduzierten Keimzahlen äußerte. Wurde GSH direkt mithilfe eines bestimmten Konjugationspartners, der aber auch für seine Nrf2-induzierende Wirkung bekannt ist, depletiert, so wurde das bakterielle Wachstum in beiden Zelltypen und in den Organen von Mäusen begünstigt. Da der GSH-Gehalt in unseren Infektionsmodellen keinen signifikanten Einfluss auf proinflammatorische Mediatoren hatte, ist anzunehmen, dass die wirtsvermittelten Immunmechanismen eine untergeordnete Rolle bei der Pathogenkontrolle spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die in der Literatur bereits kontrovers beschriebenen Funktionen von Nrf2 und GSH bei mikrobiellen Infektionen. Es ist anzunehmen, dass sowohl der Nrf2-Signalweg als auch die Nrf2-abhängige Regulation des GSH-Stoffwechsels vorwiegend dem Schutz der Wirtszelle dienen, indem sie das durch eine Infektion hervorgerufene, gestörte Gleichgewicht zwischen ROS und Antioxidantien wiederherstellen. Jedoch konnte auch gezeigt werden, dass beide Faktoren unter bestimmten Bedingungen zugunsten des bakteriellen Wachstums genutzt werden können, indem das Pathogen die Schutzmechanismen des Wirtes umgeht.
In an aerobic environment the occurrence of reactive oxygen species (ROS) is a common phenomenon. The diverse roles of ROS in cellular function and in diseases make them a target of interest in many research areas. Substances capable of directly or indirectly reducing the (harmful) effects of ROS are referred to as “antioxidants”. However, the term is applied miscellaneously in the chemical and the biological context to describe different attributes of a substance. In this work the potential of an electrochemical assay to detect different ROS in-vitro was explored. The method was optimized to investigate the radical scavenging activities (antioxidant potential) of trolox and different plant compounds (ascorbic acid, caffeic acid, epigallocatechin gallate, ferulic acid, kaempferol, quercetin, rutin, and Gynostemma pentaphyllum extract) in-vitro. The obtained data was compared to established antioxidant in-vitro assays. Further, the impact of the plant substances on cellular parameters was evaluated with the electrochemical assay and established cell assays.
The optimization of the electrochemical assay allowed the reproducible detection of ROS. The sensor electrode proved differently sensitive towards individual ROS species. The highest sensitivity was recorded for hydroxyl radicals while superoxide and hydrogen peroxide had little impact on the sensor. Extracellular ROS concentrations could be detected from cell lines releasing elevated ROS into the extracellular space. The antioxidant activity of the investigated plant substances could be demonstrated with all in-vitro assays applied. However, the absolute as well as the relative activity of the individual substances varied depending on the experimental parameters of the assays (pH, radical species, phase, detection method).
The plant compounds modified redox related intracellular parameters in different cell lines. However, a direct correlation between intracellular and extracellular effects of the plant compounds could not be established.
The work demonstrates the feasibility to use the electrochemical assay to sense ROS as well as to evaluate the radical scavenging activity of molecules. The in-vitro antioxidant activities demonstrated for the individual plant substances are not reliable to predict the cellular effects of the molecules.
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.
Pentathiepins are cyclic polysulfides that exert antiproliferative and cytotoxic activity in cancer cells, induce oxidative stress and apoptosis, and potently inhibit GPx1. These properties render this class of compounds promising candidates for the development of anticancer drugs. However, the biological effects and how they intertwine to promote high cytotoxicity have not been systematically assessed throughout a panel of cancer cell lines from distinct tissues of origin. In this thesis, six novel pentathiepins were analyzed and constitute the second generation of compounds with additional properties such as fluorescence or improved water solubility to facilitate cellular testing. All compounds underwent extensive biological evaluation in 14 human cancer cell lines. These studies included investigations of the inhibitory potential with regards to GPx1 and cell proliferation, examined the cytotoxicity in human cancer cell lines, as well as the induction of oxidative stress and DNA strand breaks. Furthermore, selected hallmarks of apoptosis, ferroptosis, and autophagy were studied. Experimental approaches regarding these cellular mechanisms included observing morphological changes, detecting phosphatidyl serine exposure and caspase activity, and quantifying cleaved PARP1 and levels of LC3B II. In addition, the analysis of the cell cycle aimed to identify aberrations or arrests in cell division.
Five of the six tested pentathiepins proved to be potent inhibitors of the GPx1, while all six exerted high cytotoxic and antiproliferative activity, although to different extents. There was a clear connection observed between the potential to provoke oxidative stress and damage to DNA in the form of single- and double-strand breaks both extra- and intracellularly. Furthermore, various experiments supported apoptosis but not ferroptosis as the mechanism of cell death in four different cell lines. In particular, the externalization of PS, the detection of activated caspases, and the cleavage of PARP1 corroborated this conclusion. Additionally, indications for autophagy were found, but more investigations are required to verify the current data. The findings of this dissertation are mainly in line with the postulated mechanism of action proposed for pentathiepins and a previous publication from our group that described their biological activity. However, the influence of modulators such as oxygen and GSH on the biological effects was ambiguous and dependent on the compound. The expression profile of the cell lines concerning GPx1 and CAT did not influence the cellular response toward the treatment, whereas the cell doubling time correlated with the cytotoxicity.
As the various pentathiepins give rise to different biological responses, modulation of the biological effects depends on the distinct chemical structures fused to the sulfur ring. This may allow for future optimization of the anticancer activity of pentathiepins. An analysis of the structure-activity relationships revealed that the piperazine scaffold was associated with superior biological activity compared to the pyrrolo-pyrazine backbone. Furthermore, substituents with electron-withdrawing properties or those providing a free electron pair, such as fluorine or morpholine, were advantageous. These findings should help design and synthesize the next generation of pentathiepins, thereby expanding the library of compounds, allowing for the further deduction of structure-activity relationships and an improved understanding of their mechanism of action.