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Die neonatale sympathische Denervierung steigert die Agonist-induzierte Gefäßkontraktion. Dieser Effekt kommt möglicherweise durch modifizierte Signaltransduktionsmechanismen zustande. Dazu könnten Veränderungen in Rho-Kinase(ROCK)- und L-Typ-Ca2+-Kanalabhängigen Signalwegen gehören, welche den Rezeptoren der vasoaktiven Agonisten nachgeschaltet sind. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die verstärkte
Aktivierung der ROCK und/oder L-Typ-Ca2+-Kanäle zur gesteigerten
Noradrenalin(NA)-induzierten Gefäßkontraktion bei renalen Widerstandsgefäßen neonatal sympathektomierter Ratten beitragen. Für die experimentellen Untersuchungen wurden normotensive männliche Wistar-Ratten (Crl:Wi) verwendet. Diese wurden neonatal sympathektomiert oder scheinsympathektomiert. Es folgte die Untersuchung isolierter renaler
Widerstandsarterien 9 bis 12 Wochen alter Tiere mittels Small-Vessel-Myographie. Die Expression der L-Typ-Ca2+-Kanäle isolierter renaler Widerstandsgefäße wurde mittels Western-Blot untersucht. Zusätzlich wurde das Ruhemembranpotential der glatten Gefäßmuskelzellen mittels Mikroelektroden registriert. Die neonasale sympathische Denervierung führte im Vergleich zur Scheinsympathektomie zu einer gesteigerten NA-Sensitivität bei Gefäßen normotensiver Ratten. Sowohl die Inhibition der ROCK als auch die Blockade von L-Typ-Ca2+-Kanälen führte zur Rechtsverschiebung der NA-Konzentrations-Wirkungs-Kurve. Diese Effekte waren bei Gefäßen sympathektomierter Tiere im Vergleich zu scheinbehandelten Kontrollen deutlicher ausgeprägt. L-Typ-Ca2+-Kanalaktivierung mittels
S-(-)-BayK8644 löste bei Nierenarterien sympathektomierter Ratten starke
Gefäßkontraktionen aus. Die Gefäße der Kontrollen reagierten hingegen nur schwach auf S-(-)-BayK8644. Der Proteingehalt der a1-Untereinheit der L-Typ-Ca2+-Kanäle glatter Gefäßmuskelzellen unterschied sich nicht zwischen beiden Gruppen. Das Ruhemembranpotential glatter Gefäßmuskelzellen unterschied sich statistisch signifikant zwischen beiden Gruppen (p < 0,05) und betrug –57,5 ± 2,2 mV bei renalen Widerstandsgefäßen sympathektomierter Tiere und –64,3 ± 0,3 mV bei Kontrollen. Die Depolarisation der glattmuskulären Zellmembran durch kaliumreiche Organbadlösung steigerte die S-(-)-BayK8644-induzierte Kontraktion der Gefäße sympathektomierter Tiere und löste Kontraktionen bei Gefäßen der Kontrolltiere aus. Die Aktivierung von KATP-Kanälen führte zum vollständigen Verschwinden der S-(-)-BayK8644-induzierten Kontraktion bei Gefäßen
sympathektomierter Tiere. Diese Befunde zeigen, dass die sympathische Denervierung renaler Gefäße zu einer Depolarisation des Membranpotentials der Gefäßmuskelzellen führt, die zu einer gesteigerten Aktivierbarkeit L-Typ-Ca2+-Kanal-abhängiger Signalwege beiträgt.
In vorrausgegangen Studien konnte gezeigt werden, dass neonatale Sympathektomie bei SHR eine Senkung des arteriellen Mitteldrucks hervorruft. Es zeigte sich bei renalen Widerstandsgefäßen sympathektomierter SHR eine gesteigerte Noradrenalin-Sensitivität und eine vermehrte Vasokonstriktion nach spezifischer L-Typ-Ca2+-Kanalaktivierung. Die Mechanismen der Noradrenalin-Supersensitivität nach neonataler Sympathektomie sind Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Ziel der durchgeführten Experimente war es, mögliche Veränderungen nach neonataler Sympathektomie in renalen und mesenterialen Widerstandsgefäßen zu charakterisieren und dabei auf eine Abhängigkeit vom Gefäßbett und Geschlecht zu untersuchen. Es wurden normotensive Wistar-Ratten verwendet, welche per Guanethidin-Injektionen und bilateralen Entfernung des Nebennierenmarks sympathisch denerviert worden und schein-sympathektomierte Kontrollen. Im Alter von 11-14 Wochen erfolgte die myographische Untersuchung der proximalen Widerstandsarterien von Niere und Mesenterium. Dafür wurden die distalen Interlobararterien der Niere und die 3. Generation von Aufzweigungen der Arteria mesenterica superior beider Geschlechter verwendet. Zusätzlich wurden diese Gefäße per real-time PCR auf die Expression verschiedener Gene untersucht. Die entnommenen isolierten Segmente der renalen und mesenterialen Widerstandsgefäße wurden zunächst hinsichtlich ihres Kontraktionsverhaltens myographisch untersucht. Dafür erstellten wir kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurven unter Gabe von Noradrenalin. Es zeigte sich bei renalen und mesenterialen Arterien der sympathektomierten Tiere eine signifikante Linksverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve als Ausdruck einer gesteigerten Sensitivität der Gefäße auf Noradrenalin nach neonataler Sympathektomie. In einem zweiten myographischen Experiment untersuchten wir die Veränderungen der Gefäßantwort auf kumulative Stimulation mittels Noradrenalin unter L-Typ-Ca2+-Hemmung mittels Nifedipin. In diesem Experiment zeigte sich bei den renalen Arterien der sympathektomierten Tiere eine Rechtsverschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurven. Dieser Effekt war an den mesenterialen Arterien nicht nachzuweisen. Im dritten Experiment untersuchten wir die Gefäße auf ihr Kontraktionsverhalten nach selektiver L-Typ-Ca2+-Aktivierung mittels S-(-)-BayK8644. Wir konnten dabei bei den renalen, aber nicht in den mesenterialen Arterien eine signifikante Vasokonstriktion bei den sympathektomierten Tieren nachweisen. Zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die zu dieser Noradrenalin-Supersensitivität führen, wurden im letzten Experiment Konzentrations-Wirkungs-Kurven für Noradrenalin unter ROCK-Inhibition mittels Y27632 erstellt. Es zeigte sich bei den renalen Arterien der sympathektomierten Gruppe eine signifikante Rechtsverschiebung der NA Konzentrations-Wirkungs-Kurven durch die Inhibition der ROCK. Dieser Effekt konnte für die mesenterialen Arterien nicht nachgewiesen werden. In den beschriebenen myographischen Experimenten ließen sich keine geschlechtsspezifische Unterschiede feststellen. Die renalen und mesenterialen Gefäße wurden anschließend noch in einer real-time PCR auf die Expression der ROCK-I, ROCK-II und der Cav1.2-Kanäle hin untersucht und auf die Haushaltsgene β-Actin und PBGD normiert. Es zeigte sich in der Gruppe der weiblichen sympathektomierten Tiere eine signifikant gesteigerte Expression der Cav1.2-Kanäle in den untersuchten Nierenarterien. In der Gruppe der männlich-sympathektomierten und den Mesenterialarterien beider Geschlechter zeigten sich keine Veränderungen in der Expression der ROCK oder der Cav1.2-Kanäle. Aus den Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass neonatale Sympathektomie bei normotensiven Ratten zu einer gesteigerten Noradrenalin-Sensitivität der glatten Muskelzellen von renalen und mesenterialen Widerstandsarterien führt. Diese Noradrenalin-Supersensitivität zeigt eine Abhängigkeit vom Gefäßbett. In den renalen Arterien der sympathektomierten Tiere ließ sich eine gesteigerte Abhängigkeit der Noradrenalin-induzierten Vasokonstriktion von der ROCK und der Funktion der Cav1.2-Kanäle nachweisen. Hinweise auf geschlechtsspezifische Unterschiede nach neonataler Sympathektomie zeigten sich in der Expression der Cav1.2-Kanäle, welche in der Gruppe der weiblich sympathektomierten Tiere gesteigert waren.
Das sympathische Nervensystem ist an der Regulation des Herz-Kreislaufsystems beteiligt und beeinflusst die Struktur und Funktion von Widerstandsgefäßen. Die Arbeit untersucht chronische Effekte der sympathischen Innervation auf die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies und deren Regulation des Gefäßtonus anhand des Modells der neonatalen Sympathektomie. Untersucht wurde Gewebe von 11-14 Wochen alten Wistar-Ratten. Es erfolgten pharmakologische und physiologische Untersuchungen isolierter mesenterialer und intrarenaler Widerstandsarteriensegmente sowie aortaler Gefäßsegmente mit Hilfe der Small-Vessel-Draht-Myographie sowie Untersuchungen zur vaskulären NADPH-Oxidase-mRNA-Expression und NADPH-Oxidaseaktivität mittels real-time-RT-PCR und Lucigenin-verstärkter Chemilumineszenz. Zur Beurteilung von Geschlechtsdi-morphismen hinsichtlich der untersuchten Prozesse wurden Tiere beider Geschlechter in die Studie einbezogen. Die Kalium-induzierte Vasokonstriktion zeigt sich durch chronische Sympathektomie bei mesenterialen Gefäßsegmenten erniedrigt, was auf geringeren Gehalt an kontraktilem Gewebe infolge der Sympathektomie hindeutet. Weitere Untersuchungen zeigten neben einer Noradrenalin-Supersensitivität renaler Gefäßsegmente chronisch sympathektomierter männlicher Tiere, an der sowohl Alpha1- wie auch Alpha2-Adrenorezeptor-vermittelte Prozesse beteiligt sind, auch eine Noradrenalin-Supersensitivität renaler Gefäßsegmente weiblicher Tiere und mesenterialer Gefäßsegmente, die unter anderem Alpha1-Adrenorezeptor, nicht aber Alpha2-Adrenorezeptor getragen ist. Die endothelvermittelte und endothelunabhängige Vasodilatation wurden unter Applikation von Acetylcholin und Nitroprussidnatrium untersucht und zeigte sich durch chronische Sympathektomie unbeeinflusst. Weitere Small-Vessel-Myographie-Experimente erfolgten zur Beurteilung der Bedeutung von ROS für die Modulation Agonist-induzierter Vasokonstriktion und -dilatation von Widerstandsarterien chronisch sympathektomierter Wistar-Ratten. Der Einsatz des Radikalfängers Tiron lässt jedoch keine allgemeingültigen Aussagen zur ROS-abhängigen Modulation der Gefäßfunktion zu. Lediglich bei renalen Gefäßsegmenten männlicher und mesenterialen Gefäßsegmenten weiblicher sympathektomierter Tiere schwächte sich nach Tirongabe bei erstgenannter Gruppe die maximale Kontraktionsantwort, bei zweitgenannter Gruppe die endothelunabhängige Vasodilatation leicht ab. Experimente zu Veränderungen des Gefäßtonus durch H2O2 zeigten sowohl eine direkte durch H2O2 ausgelöste Kontraktion, als auch die Verstärkung prokontraktiler Mechanismen durch H2O2, wobei die Empfindlichkeit der Gefäße gegenüber H2O2 nicht durch chronische Sympathektomie beeinflusst wurde. Die Untersuchungen zum Einfluss chronischer Sympathektomie auf die NADPH-Oxidaseaktivität zeigten weder an renalen, mesenterialen, noch aortalen Gefäßsegmenten unter Inhibierung anderer ROS-produzierender Systeme mit Rotenon, Allopurinol und L-NAME, Veränderungen in der NADPH-Oxidaseaktivität durch chronische Sympathektomie. Auch hatte chronische Denervierung keinen eindeutigen Einfluss auf die NADPH-Oxidase-Expression, lediglich der NOX2-mRNA-Gehalt intrarenaler Arteriensegmente weiblicher sympathektomierter Tiere war niedriger als der scheinbehandelter Kontrollen. Die differenzierte Betrachtung der Ergebnisse lässt zwischen beiden Geschlechtern bezüglich der Gefäßfunktion keine globalen Aussagen zu. Vergrößert, gegenüber der weiblichen Versuchsgruppe, war die Kalium-induzierte Vasokonstriktion mesenterialer Gefäßsegmente scheinsympathektomierter männlicher Tiere, vermindert die maximale Noradrenalin-induzierte Vasokonstriktion renaler Gefäßsegmente sympathektomierter männlicher Tiere im Vergleich zu weiblichen. Außerdem war die NADPH-Oxidase-abhängige Superoxidbildung in Aortengewebe männlicher Tiere und der NOX2-mRNA-Gehalt bei renalen Gefäßsegmenten scheinsympathektomierter männlicher gegenüber weiblicher Tiere verringert. Aus den Ergebnissen lassen sich Hinweise ableiten, dass chronisch sympath-ektomierte Tiere möglicherweise einen geringeren Gehalt an kontraktilem Gewebe der Gefäßmuskulatur aufweisen. Außerdem beruht die bekannte Noradrenalin-Supersensitivität chronisch denervierter renaler Gefäßsegmente männlicher Tiere, auf Alpha1- wie auch Alpha2-Adrenorezeptor-vermittelten Prozessen, die von chronisch denervierten renalen Gefäßen weiblicher Tiere und mesenterialen Gefäßen unter anderem auf Alpha2-, nicht aber auf Alpha1-Adrenorezeptoren-vermittelten Prozessen. Der eher diskrete Einfluss des Radikalfängers Tiron auf die Gefäßfunktion, der geringe, wenn überhaupt vorhandene Einfluss der Sympathektomie auf die Expression der NADPH-Oxidase-Isoformen und die fehlenden Effekte der Sympathektomie auf die NADPH-Oxidaseaktivität sprechen dafür, dass ROS-abhängige Prozesse, wenn überhaupt nur eine untergeordnete Bedeutung für die Denervierungssupersensitivität kleiner Widerstandsarterien haben.
Den Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit bilden Versuche, in denen bei spontan hypertensiven Ratten durch neonatale Sympathektomie eine Senkung des arteriellen Mitteldrucks hervorgerufen wurde. Durch Nierentransplantation und bilaterale Nephrektomie konnte diese Blutdrucksenkung auf bis dahin unbehandelte Empfängertiere übertragen werden. Der renale Gefäßwiderstand der sympathektomierten SHR war dabei im Vergleich zu scheinbehandelten Kontrolltieren reduziert. Das Ziel der von uns durchgeführten Studie war es deshalb, mögliche Veränderungen in der Funktionsweise arterieller, renaler Widerstandsgefäße zu charakterisieren, die bei spontan hypertensiven Ratten an der Blutdrucksenkung durch neonatale Sympathektomie beteiligt sein können. Mit der Methode der Small-Vessel-Drahtmyographie wurde dazu das Konstriktions- und Dilatationsverhalten isolierter Segmente der distalen Interlobararterien ex vivo untersucht. Diese Gefäße entsprechen mit einem Durchmesser von etwa 150 µm den proximalen renalen Widerstandsarterien der spontan hypertensiven Ratten. Das Untersuchungsmaterial ist männlichen SHR im Alter von 12 Wochen entnommen worden. Die Tiere waren bis dahin einem von drei Vorbehandlungsschemata zugeordnet. Sie wurden entweder neonatal sympathektomiert, scheinsympathektomiert und mit Hydralazin antihypertensiv behandelt oder ausschließlich scheinsympathektomiert. Die entnommenen, isolierten Segmente der renalen Widerstandsgefäße wurden zunächst hinsichtlich ihrer Antwort auf die Depolarisation des Membranpotentials untersucht. Diese bestand in allen Vorbehandlungsgruppen aus einer Vasokonstriktion ähnlichen Ausmaßes. Kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurven für die physiologischen Vasokonstriktoren Noradrenalin, Vasopressin und Endothelin-1 ergaben keine verminderte Reaktivität der distalen Interlobararterien nach Sympathektomie. Die Gefäßsegmente der sympathektomierten SHR verhielten sich supersensitiv gegenüber Noradrenalin und konstringierten nach Endothelin 1-Gabe stärker als die entsprechenden Gefäße der scheinbehandelten Tiere. Die Empfindlichkeit der Noradrenalin-induzierten Vasokonstriktion gegenüber extrazellulärem Kalzium war in der sympathektomierten Gruppe und bei den Kontrolltieren gleich groß. Auf die Aktivierung der L Typ-Kalziumkanäle mit S( ) BayK8644 reagierten die untersuchten Arterienabschnitte nach Sympathektomie und nach Hydralazin-Behandlung sensitiver als nach alleiniger Scheinbehandlung. Die endothelvermittelte, mit Acetylcholin ausgelöste Vasodilatation und die endothelunabhängige Relaxation der distalen Interlobararterien mit Nitroprussidnatrium zeigten bei den Tieren aller Vorbehandlungsgruppen ähnliche Ausmaße. Versuche mit L NAME und Indomethacin stehen im Einklang mit Befunden, die auf die Existenz eines endothelialen, Zyklooxygenase-abhängigen Konstriktionsfaktors und auf das Vorhandensein eines endothelialen, Zyklooxygenase- und Stickstoffmonoxidsynthase-unabhängigen relaxatierend wirkenden Faktors hindeuten. Die Wirkungen dieser Faktoren in den untersuchten Gefäßsegmenten der SHR wurden durch die neonatale Sympathektomie nicht beeinflusst. Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass die Senkung des renalen Gefäßwiderstandes nach neonataler Sympathektomie bei SHR wahrscheinlich nicht auf einer geringeren Reaktivität der distalen Interlobararterien gegenüber den untersuchten Vasokonstriktoren, nicht auf einer vergrößerten Fähigkeit dieser Gefäße zur Vasodilatation und nicht auf einem verminderten Einfluss extrazellulärer Kalziumionen auf die Vasokonstriktion beruht. In den durchgeführten Versuchen waren keine Veränderungen in der Funktion der proximalen renalen Widerstandsgefäße nachweisbar, die zur Erklärung der antihypertensiven Wirkung der Nierentransplantate sympathektomierter spontan hypertensiver Ratten herangezogen werden können.