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In this thesis an artificial enzyme cascade consisting of an ADH from Lactobacillus kefir, a CHMO from Acinetobacter sp. NCIMB 9871 and lipase A from Candida antarctica has been investigated for the biocatalytic synthesis of the bulk chemical ε-caprolactone as well as several derivatives for their direct utilization as polymer building blocks. Due to major limitations, which hamper such a biocatalytic route, the first addressed demand in this work was the improvement of the stability of the CHMO. By structure-guided engineering, distinctively improved variants concerning the resistance against oxidation as well as temperature stability without compromising the catalytic activity were successfully created. Due to the incomplete knowledge of the mechanisms that lead to thermal and/or oxidative inactivation of enzymes, this study illustrates that the selection of mutations for increased protein stability is still hard to predict. Thus, these results can serve as a basis for further stability studies on this enzyme class to give better insights into the underlying mechanisms, which determine the stability of an enzyme. Such a highly stabilized biocatalyst will pave the way for the successful use of flavin-dependent enzymes for industrial applications. A further aim of this thesis was dedicated to the second major hurdle en route to polyester precursors represented by the product inhibition and enzyme deactivation caused by ε-caprolactone, particularly at higher concentrations. To overcome this limitation, we developed an elegant solution in which the ε-caprolactone produced by the one-pot two-step enzymatic method is directly subjected to ring-opening polymerization using the unique lipase A from Candida antarctica. Applying this enzyme cascade in a whole cell biocatalysis in combination with an improved cofactor regeneration approach, the problem of product inhibition problem was efficiently solved leading to the formation of oligo-ε-caprolactone at more than 20 g/L when starting from 200 mM cyclohexanol. By a process development approach through solvent engineering it was found that biotransformations proceed much faster in an isooctane-containing biphasic solvent system when using free enzymes. Finally, the improved enzyme cascade was applied for the synthesis of chiral substrates and provided access to functionalized chiral compounds in high yields (up to >99%) and optical purities (up to >99%ee). By subsequent enzymatic enantioselective ring-opening of the enantiopure monomers, oligomeric lactones were successfully synthesized, which can be directly serve as building blocks for the polymer industry.
Die nicht-konventionelle, dimorphe, asexuelle und hemiascomycetale Hefe Blastobotrys (Arxula) adeninivorans wurde in den letzten Jahren in vielfältiger Weise eingesetzt und zahlreichen interessanten biotechnologischen Anwendungen unterzogen. Ein herausragendes Merkmal dieser Hefe ist das breite Substratspektrum, welches eine Vielzahl an Zuckern, Alkoholen sowie Purinen und Alkanen umfasst. In Folge der Genomsequenzierung des Stammes A. adeninivorans LS3 wurden drei putative Cutinase-Gene identifiziert. Cutinasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage sind, Cutin der pflanzlichen Cuticula abzubauen. Dies ermöglicht es beispielsweise pflanzenpathogenen Pilzen wie Fusarium solani f. sp. pisi, die durch Cutin geschützten Bereiche zu penetrieren, um in die Wirtspflanze einzudringen. Trotz der Isolation von A. adeninivorans Stämmen aus Holzhydrolysat in Sibirien sowie humusreichen Böden wurde diese Hefe bisher nicht als pflanzenpathogen beschrieben. Auch das Vorhandensein von Cutinasen oder Cutinase-ähnlichen Enzymen blieb bisher gänzlich unbemerkt. Cutinasen sind für ein breites Spektrum an technischen Anwendungen zum Beispiel im Bereich des Abbaus und des Recyclings von bioabbaubaren Kunststoffen interessant. Aus diesem Grund wurden die drei Gene ACUT1, ACUT2 und ACUT3 aus dem Genom von A. adeninivorans LS3 isoliert. Mittels Homologie-Modellierung und Sequenzvergleich mit bekannten und charakterisierten Cutinasen konnten die α/β-Hydrolase Struktur, die katalytisch aktive S-D-H Triade mit dem in das G-Y-S-Q-G Motiv eingebetteten nucleophilen Serin, die Substratbindeschleife sowie die sogenannte „Flap-Helix“ identifiziert werden. Außerdem wies Acut3p eine einzigartige C-terminale Glycin-Threonin-Serin reiche Sequenz (GTS-Sequenz) auf, die unabhängig von der katalytisch aktiven Domäne gefaltet ist. Unter Verwendung des Xplor®2 Transformations/Expressionssystems wurden rekombinante Varianten der drei putativen Cutinasen Acut1-6hp, Acut2-6hp und Acut3-6hp mit A. adeninivorans G1212 synthetisiert, im Kulturüberstand lokalisiert sowie über den 6xHistidin-Tag gereinigt. Die anschließende biochemische Charakterisierung ergab ein nahezu uniformes Verhalten bezüglich pH-Optimum (pH 5,0 – 5,5) und Temperatur-Optimum (20 – 30 °C). Darüber hinaus wurde eine Instabilität der drei Cutinasen unter optimalen pH Bedingungen festgestellt. Diese konnte jedoch durch Zugabe von Osmolyten wie PEG200 vollständig behoben werden. Das Substratspektrum wurde als entscheidender Parameter für die Einordnung der putativen Arxula-Cutinasen untersucht. Die höchste Aktivität bei Substraten mit vier bis acht C-Atomen in der Acylkette entsprach dem Verhalten bereits bekannter Cutinasen. Weiterhin konnte der Abbau des Modellpolyesters Polycaprolacton sowie die Degradation von Apfelcutin erfolgreich durchgeführt werden, womit A. adeninivorans LS3 die erste ascomycetale Hefe mit nachgewiesenen cutinolytischen Enzymen ist. Zusätzlich konnte die im Vergleich zu Acut1-6hp und Acut2-6hp erhöhte Temperaturstabilität von Acut3-6hp auf die GTS-Sequenz zurückgeführt werden. Als mögliche Ursache für diesen Effekt wurde eine starke Glykosylierung der GTS-Sequenz angenommen. Durch Übertragung der GTS-Sequenz auf Acut1-6hp konnte die Temperaturstabilität dieses Enzyms erhöht werden. Eine Übertragung auf die bereits stark glykosylierte Tannase 1 führte dagegen nicht zu einer Erhöhung der Stabilität gegenüber der Temperatur. Weiterhin wurden in zwei verschiedenen Fermentationsverfahren mit Fed-Batch-Betriebsweise bis zu 1.000.000 U L-1 (Acut2-6hp) im Medium akkumuliert. Dies stellte bereits einen ersten Hinweis auf das Potenzial für eine Anwendung im technischen Bereich dar. Dieses Potenzial konnte durch den erfolgreichen Abbau von Polyestern wie Polycaprolacton, Polybutylensuccinat, Polylactid, Poly[3-Hydroxybutyrat] sowie Poly[3-Hydroxybutyrat-Co-3-Hydroxyvalerat] verstärkt werden. In weiteren Schritten müssen nun konkrete Anwendungsfelder für die in dieser Arbeit untersuchten Arxula-Cutinasen erschlossen werden. Der Abbau von real anfallenden Kunststoffabfällen aus bioabbaubaren und nicht-abbaubaren Folien oder Behältern sowie die Rückgewinnung der aus der Hydrolyse erhaltenen Monomere sollten dabei überprüft werden. Auf der anderen Seite wäre eine Anpassung der Kultivierungsmedien für die Gewinnung der Cutinasen im Pilot-Maßstab angebracht, um eine Produktionskostenreduktion zu erreichen.